Summary
En hög genomströmning protokoll för funktionell bedömning av HIV effektiv reaktivering och clearance av latent proviruses beskrivs och tillämpas genom att testa effekterna av interventioner på HIV transkription och skarvning. Representativa resultat av effekten av latens backning agenter på LTR-driven transkription och skarvning tillhandahålls.
Abstract
HIV fortfarande är obotlig på grund av förekomsten av en reservoar av celler som hamnar stabil och latent form av viruset, som förblir osynliga för immunförsvaret och riktar inte av den nuvarande antiretroviral kombinationsbehandling (cART). Transkription och skarvning har visat sig stärka HIV-1 latens i vilande CD4 + T-celler. Återföring av latens genom användning av latens återföring agenter (politikinsatserna) i metoden ”chock och döda” har studerats ingående i ett försök att rensa denna reservoar men har hittills inte visat någon framgång i kliniska prövningar på grund av avsaknaden av utveckling av adekvata små molekyler som kan effektivt stör denna reservoar. Det protokoll som presenteras här ger en metod för tillförlitligt och effektivt bedöma latens återföring agenter (politikinsatserna) på HIV transkription och skarvning. Denna strategi är baserad på användningen av en LTR-driven tvåfärgad reporter som samtidigt kan mäta effekten av en LRA på transkription och skarvning av flödescytometri. Protokollet beskrivs här är tillräcklig för vidhäftande celler liksom cellerna i suspension. Det är användbart för att testa ett stort antal läkemedel i ett högt genomflöde system. Metoden är tekniskt enkel att genomföra och kostnadseffektivt. Dessutom användningen av flödescytometri kan bedömningen av cellernas viabilitet och därmed drog toxicitet på samma gång.
Introduction
Trots effektiv långsiktig antiretroviral behandling kvarstår HIV i ett latent tillstånd som en integrerad provirus i minne CD4 + T celler1. Kromatinstruktur av HIV-1 5' länge terminal upprepa (LTR) arrangören och epigenetiska förändringar såsom Histon metylering och deacetylering av DNA-metyltransferaser (DNMT) och Histon deacetylases (HDAC) är viktiga mekanismer leder till transkriptionell förtryck och därmed efter integration latency2,3. En stor mängd latens vända agenter (politikinsatserna) har studerats för sin effekt att framkalla virus produktion in vitro- och in vivo från infekterade latent vilande CD4 + T celler4,5,6,7 ,8. Bland de lokala och regionala myndigheterna testade, HDACi (HDAC-hämmare) och BET bromodomain hämmare (BETis) inducera kromatin decondensation och frisättning av positiva transkription töjning faktor b (P-TEFb) respektive, leder till efterföljande lindra av den transkriptionell förtrycket på de 5' LTR och aktivering av HIV uttryck9,10,11,12,13. Omfattningen av reaktivering uppnås genom dessa politikinsatserna var dock begränsad då endast en blygsam ökning av cell-associerade Osplitsat HIV mRNA (oss RNA), vägledande av viral transkription, observerades ex vivo14,15. Ännu viktigare, kunnat dessa politikinsatserna heller framkalla en minskning av frekvensen av latent infekterade celler.
HIV uttryck kan begränsas ytterligare av ineffektiva skarvning16 samt defekter i kärnteknisk export av multiplicera skarvade HIV RNA (MS RNA)17. Således, identifiera nya klasser av lokala och regionala myndigheter som är mer potent och kan påverka olika aspekter av virus produktion efter integration behövs. Dessutom krävs utveckling av nya testmetoder som bidra till att definiera de optimala föreningarna för att effektivt vända latens.
Här presenteras ett protokoll, som utnyttjar en hög genomströmning strategi för funktionell bedömning av effekterna av interventioner på HIV LTR-driven transkription och skarvning. I korthet, en ny LTR-driven dual färg reporter systemet pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (figur 1) används för att bedöma HIV reaktivering av flödescytometri. I denna fluorescerande reporter leder uttrycket av Osplitsat HIV mRNA (4 kb) till förbättrad grönt fluorescerande protein (andra) uttryck, medan uttrycket av skarvade mRNA (2 kb) skulle leda till Discosoma sp. röd (DsRed) fluorescerande proteinuttryck. Kort, vi använde en fluorescerande Env-andra fusionsprotein, gp140unc. ANDRA, där den kodande sekvensen av andra placerades i ram med en un-klyvs och stympad form av kuvertet (Env). Förändringar infördes att ablatera webbplatsen klyvning förhindra dissociationen av Env gp120 och gp41-andra och att trunkera gp160 proteinet innan de transmembrana domän skapar en löslig Env analog, vilket underlättar den rätta vikningen och uttryck för andra. På uttrycket inom en cell, Rev lokaliserar till kärnan där det förmedlar kärn-Cytoplasmatisk export av 4 kb env mRNA via interaktion med elementet rev lyhörd (RRE). Trunkering av Env äventyrar inte den RRE, som ligger mellan gp120 och gp41 och A7 3' splice webbplatsen. I detta system, skarvning vid HIV-1 skarva givare 4 (SD4) och skarva acceptor 7 (SA7) resultat i produktionen av en 2 kb mRNA kodning en icke-funktionella Rev protein trunkeras efter aminosyra 38 smält till DsRed fluorescerande protein, RevΔ38-DsRed. Kort, DsRed infogades i de 2nd exon av Rev på aminosyran 38 av överlappning förlängning18. För att underlätta kärnteknisk export av Osplitsat mRNA, var en däggdjur uttryck vektor kodning Rev (pCMV-RevNL4.3) samtidig transfekterade med den fluorescerande reporter konstruktion (figur 2). Denna unika reporter konstruktion beskrivs här är användbar i hög genomströmning bedömning av HIV transkription och skarvning, utan att behöva använda virala vektorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Förfaranden för kloning, omvandling och sekvensering är diskuterat någon annanstans18,19. Protokoll som häri börja från transfection däggdjur uttryck vektorer (figur 3).
1. transfection av HEK293T celler med tvåfärgad Reporter konstruera
- Odla HEK293T celler i Dulbeccos modifierade örnens medium (DMEM) kompletteras med 10% (v/v) fetalt bovint serum (FBS), penicillin (100 U/mL) och streptomycin (100 μg/mL) i en 5% CO2 inkubator vid 37 ° C. Efter upptining, passage HEK293T celler 2 - 3 gånger innan du använder dem i transfection experiment. Detta skulle ge celler tid att återhämta sig från förfarandet för upptining.
Varning: Mycoplasma kontaminering av cellkulturer är fortfarande ett allvarligt problem. God laboratoriesed och rutinmässig testning av cellkulturer är nödvändiga för att minska risken för mycoplasma kontaminering och undvika diffusion20. - Dela celler 1:2 en dag före sådd och överföra dem till färska DMEM medium. Odla cellerna för 24 h i en 5% CO2 inkubator vid 37 ° C.
- Dagen innan transfection, ta bort mediet från kolven genom aspiration och tvätta cellerna med Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) lösning gratis av kalcium (Ca2 +) och magnesium (Mg2 +) för att avlägsna spår av serum.
- Dosera 5 mL trypsin-EDTA-lösning (0,05% - 10 mM i PBS) i kultur fartyget och placera den vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator för 2-5 min.
- När cellerna är fristående, tillsätt 5 mL av DMEM kompletteras med 10% (v/v) FBS ytterligare hämma aktiviteten trypsin som kan skada cellerna.
- Återsuspendera försiktigt genom pipettering cellsuspensionen upp och ned för att bryta upp klumpar.
- Späd cellerna 1:10 i trypan blå fläck (0,4%).
- Räkna de levande celler som inte tar upp trypan blå med hjälp av ett mikroskop (10 x mål) och en haemocytometer.
- Beräkna antalet livskraftiga celler per milliliter genom att ta medelvärdet av celltalet och att multipliceras med 10 000 och med spädningsfaktorn (1:10) från trypan blå fläckar.
- Tavla 2 x 104 celler i 100 μL av DMEM medium kompletteras med 10% FBS utan antibiotika i en 96-väl platt-bottenplatta för 24 h.
- För varje brunn, späd 400 ng av pLTR.gp140/EGFP. RevD38/DsRed, 20 ng pCMV-RevNL4.3 och 100 ng av pCMV-Tat101AD8-flagga DNA i 50 μl serum gratis medium. Blanda försiktigt. För experiment utan Tat, använda en matchade tom Tat vektor pcDNA3.1 (-).
Obs: Användningen av endotoxinfria DNA rekommenderas. För att förbereda endotoxinfria DNA med en midi eller maxiprep nukleinsyra rening kit. Bestämma den DNA-renheten genom att mäta förhållandet 260/280 OD, som bör vara mellan 1,7 och 1,9. - Blanda lipid reagens försiktigt före användning, sedan späd 0,65 μL i 50 μl serum gratis medium. Blanda försiktigt och inkubera i 5 min i rumstemperatur.
- Kombinera den utspädda DNA med utspädda lipid reagens.
- Blanda försiktigt och inkubera i 20 min i rumstemperatur. Lösningen kan vara grumliga.
Obs: Fortsätt till steg 1.15. inom 30 min. - Dispensera 100 μl per brunn av lipid reagens-DNA komplex drop-wise ovanpå cellerna.
- Blanda försiktigt genom att gunga plattan fram och tillbaka.
-
Inkubera plattan för 5 h i en 5% CO2 befuktade inkubator vid 37 ° C.
- Varje reaktionsblandning räcker en enda brunn (96 brunnar) transfection. Justera belopp och volym av komponenter enligt antalet läkemedel och kombination som skulle testas och konton för pipettering variationer. Alla villkor testas vanligtvis i exemplar.
- Transfect ytterligare brunnar med 100 ng av CMV-driven andra och DsRed-Express DNA plasmid för ersättning.
2. behandling av transfekterade HEK293T celler med latens backning agenter
Obs: Före varje analys, fastställa varje LRA fysiologiska tillstånd genom att mäta lönsamheten för cellerna efter exponering för hög och låg dos av läkemedlet med cell proliferation assay.
- Späd varje LRA i lämpliga arbets-koncentrationen med odlingsmedium (t.ex., 1 μM för JQ1(+)).
Varning: Bered de frystorkade drogerna med lämpligt lösningsmedel till en koncentration av 10 mM. Lagra all materiel politikinsatserna vid-80 ° C i en engångsbruk alikvot (5 μL varje) för att undvika upprepad frysning-upptining cykler. - Noggrant aspirera transfection medium med en flerkanals och ersätta med 100 μL medium som innehåller lämpliga LRA (tabell 1). Lägg till medium mycket försiktigt vid sidan av väggen i brunnen för att undvika ta loss de transfekterade HEK293T celler, som är kända för att lätt lossa från kultur platta yta.
- Inkubera plattan för 48 h i en 5% CO2 befuktade inkubator vid 37 ° C.
3. färgning av transfekterade celler med fastställbara livskraft färgämne för flödescytometri Flödesanalys
Varning: Ta bort döda celler och skräp är nödvändigt att eliminera falska positiva och få resultat av högsta kvalitet.
- Lossa cellerna i media använder 100 μL av fosfatbuffrad saltlösning (PBS) per brunn och försiktigt pipettering up-and-down (~ 5 gånger) med en flerkanals, samtidigt undvika skumbildning i media. Om det behövs, lossa cellerna från plattan med hjälp av 35 µL per brunn trypsin-EDTA-lösning (0,05% - 10 mM i PBS) och ruvning 5 min vid 37 ° C, före neutralisera med medium som innehåller serum.
- Överföra cellerna till en plattan med 96 brunnar i V-botten.
- Cellerna i 5 minuter vid 500 x g vid 4 ° C och sedan noggrant aspirera medium/PBS utan att vidröra cellerna.
- Tvätta cellerna minst 1 gång med 200 μL av protein/serum gratis PBS.
- Centrifugera vid 500 x g i 5 minuter vid 4 ° C och sedan Kassera supernatanten genom att luta plattan och ta bort tvättbuffert utan att vidröra cellerna.
- Förbereda en fungerande lösning av fastställbara livskraft färgämne genom att späda ut den livskraft dye 1: 1000 i protein/serum gratis PBS. Förbereda 50 µL utspädda fläcken per brunn.
Obs: Livskraft färgämnen finns i en rad färger lämpar sig för användning med blå, röd och violett Laser. Förbereda en stamlösning av fastställbara livskraft färgämne genom omblandning en injektionsflaska med frystorkade färgämnet (komponent A) med 50 μL vattenfri DMSO (komponent B). Förvaras vid-20 ° C i en enda användning alikvotens (1 μL varje), skyddas från ljus. - Tillsätt 50 μl utspädda livskraft färgämnet till varje brunn och blanda cellerna genom pipettering upp och ner med en flerkanals.
- Fläcken för 10-15 minuter vid 4 ° C, skyddas från ljus.
- Tvätta 1 - 2 gånger med 150 μL tvättbuffert (PBS med 1% bovint serumalbumin och 2 mM EDTA).
- Centrifugera vid 500 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten.
- Fixa cellerna med 100 μL av nylagade 1% formaldehyd i tvättbuffert för 10-15 minuter vid 4 ° C i mörker.
Varning: Formaldehyd är mycket giftigt. Bered 1% formaldehyd i ett dragskåp att undvika inandning samtidigt bär handskar och skyddsglasögon för skydd. - Tvätta cellerna 1 - 2 gånger med 100 μL tvättbuffert.
- Centrifugera vid 500 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten.
- Återsuspendera cellpelleten i 70 μL tvättbuffert.
Obs: Protokollet kan pausas här. Fast celler kunde lagras vid 4 ° C i mörker för analys nästa dag på en flödescytometer.
4. andra och DsRed mätningar av flödescytometri och dataanalys
Obs: Analysera HIV transkription (% andra) och skarvning (% DsRed) på en flödescytometer. Filtrera provet innan du kör med en 70 μm cell-SIL eller 100 μm nylon mesh att undvika igensättning upp munstycket.
- Starta upp cytometer och dator minst 10 min före användning att säkerställa lasrar värma upp.
- Innan du kör prover och påbörjas datainsamling, Fyll på vattenbehållaren med slida med 0,9% koksaltlösning och se till att en natriumhypoklorit tablett läggs till avfallstanken.
- Kontrollera cellen flöde för luftbubblor.
- Kontrollera att alla detektorer och filtrerar är lämpliga för experimentet.
Obs: För andra, Använd av blå laser (488 nm) och 530/30 bandpass, medan DsRed Express upptäcks optimalt med hjälp av den gula lasern (561 nm) och 610/20 bandpass. En blå laser (488 nm) och 610/20 bandpass kan också användas för att upptäcka DsRed uttryck. - Kontrollera cytometer prestanda och känslighet över detektorer genom att köra kalibrering pärlor.
- Justera framåt (FSC-A) och sida (SSC-A) scatter spänningar med ofärgade prov så att den stora befolkningen är på skärmen och tydligt urskiljbar.
Obs: FSC (framåtspritt ljus) är en mätning ljusets diffraktion i en platta vinkel, vilket beror på volymen av cellen (cell yta eller storlek), medan SSC (side-spritt ljus) är en mätning av ljus diffraktion i rät vinkel, som är proportionell mot cell granularitet och intern komplexitet. - Utföra manuell eller automatisk ersättning med singel-färgade proven säkerställer minimal spridningseffekter av andra + befolkningen in i DsRed detektor och vice versa.
Varning: För ersättning, Använd ett urval av celler som uttrycker var och en av de enda färg fluorescerande protein samt celler ensamma fläckade fastställbara livskraft färgämnet. Använd inte FITC och PE ersättning pärlor för andra och DsRed fluorescerande proteiner ersättningar på grund av olika spektrala egenskaper. Ersättning kontroller bör vara tillräckligt ljust för att lösa positiva och negativa befolkningen. - Skapa tomter och ange portar med hjälp av fluorescens minus en (FMO) kontroller.
- Förvärva och registrera minst 10.000 livskraftig cell evenemang per prov. Köra prover på medium eller låg hastighet för att undvika dubletter passerar genom skärningspunkt med laser. Använda puls geometri gating som SSC-A kontra SSC-H att eliminera dubletter. Kontrollera stabiliteten av körningen av plottning tid kontra SSC-A för att se hur även flödet är under körning.
- I slutet av körningen, rengör den flöde flödescytometri flödesteknik med koncentrerat rengöringsmedel sedan vatten i 5 min varje.
- Stänga av systemet, kassera avfall och åter fylla slida tanken efter förvärvet.
- Analysera data med hjälp av ett flöde flödescytometri data analys programvara. Utesluta cellfragment och klump (dubletter) baserat på framåt och side scatter och sedan eliminera döda celler använder livskraft dye fläcken (negativa befolkningen = levande celler). Identifiera de celler som uttrycker andra och DsRed (figur 4), samt andelen skarvade produkt DsRed /(DsRed + EGFP) (figur 5).
- Fastställa effekten av LRA på HIV transkription och skarvning genom att jämföra obehandlad celler och celler utsätts för individen eller en kombination av lokala och regionala myndigheter (figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa resultat visas i figur 5 för uttrycket av HIV-1 Osplitsat (andra) och skarvas (DsRed) produkter efter behandling med bromodomain hämmare JQ1. Både JQ1(+) och Tat avsevärt ökade andelen celler som uttrycker andra (2.18 och 4.13 FC över DMSO respektive; n = 3) vägledande av Osplitsat avskrifter. Dessutom JQ1(+) avsevärt ökade andelen celler som uttrycker DsRed (46,6 FC över DMSO) samt andelen av skarvade (7.37 FC över DMSO) till en liknande nivå som Tat (59,6 och 5.83 FC över DMSO, respektive) bekräftar förmågan hos JQ1(+) Aktivera HIV transkription och skarvning. Däremot, avskaffar behandling med stereoisomer kontroll JQ1(-) JQ1(+) effekt på HIV transkription och skarvning bekräftar framgången för protokollet.
I en senaste publikation, har vi visat genom RNA analys en ansamling av HIV skarvas avskrifter efter JQ1(+) behandling21. I själva verket visade våra data konsekvent förändringar i nivåerna av Osplitsat och skarvade avskrifter som var speglas av den andra och DsRed protein uttrycket i denna modell efter behandling med JQ1(+). Dessa resultat indikerar att andra och DsRed uttrycka celler återspeglar den bromodomain-hämmaren JQ1(+) förmåga att inducera HIV transkription och skarvning.
Sammanfattningsvis validerat vi användningen av pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed reporter i en hög genomströmning set-up för bedömning av effekten av politikinsatserna på HIV-1 transkription och skarvning. Optimal mängd LRA eller ökad toxicitet kan leda till scud resultat. Optimera mängden läkemedel som används samtidigt som cellernas viabilitet kan förbättra noggrannheten i resultaten.
Figur 1: Schematisk av den modell som används för att avgöra effekterna av latens backning agenter på LTR-driven transkription och skarvning. De LTR konstruera uttrycker antingen Osplitsat kuvertet (Env) protein smält till enhanced grönt fluorescerande protein (andra) eller skarvas Δ38rev protein med DsRed. Denna siffra har varit omtryckt från Khoury et al.21. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: konstruerar design. (A) pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed skarvning reporter tillåter uttrycket av kuvert smält till andra (gp140-andra) och icke-funktionella Rev protein trunkeras efter aminosyra 38 smält till DsRed fluorescerande protein (RevΔ38-DsRed). (B) pCMV-RevNL4.3 tillåter uttrycket av Rev protein. (C) pCMV-Tat101AD8-flagga tillåter uttrycket av Tat101(AD8) protein med en C-terminal flagga-tagg. De uttryck plasmidsna är konstruerade med hjälp av PCR-överlappningar och begränsning digest. Alla vektorkartor skapades med SnapGene programvara, version 4.1.9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Assay design för snabb bedömning av HIV latens backning agenter. Den nuvarande metoden för bedömning av effekten av politikinsatserna på HIV-1 transkription och skarvning ingår i) sådd av HEK293T celler en dag före ii) transfection med uttryck vektorer följt av iii) LRA behandling. IV) celler analyseras av flöde flödescytometri 48 h efter behandling. Användning av detta protokoll, kunde 32 (i tre exemplar) 96 villkor testas per platta. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: representativa exempel på plattan set-up och kontroller behövs. Kolumnerna 1 till 3 motsvarar negativa (-) kontroller med inga läkemedel och vätska bara (DMSO 1: 5000) samt positiva (+)-kontroller såsom Tat (100 ng), PMA/PHA = phorbol isopropylmyristat acetat/fytohemaglutinin (10 nM PMA, 10 μg/mL PHA), JQ1 (+/-) (1 μM), VOR = vorinostat ( 0,5 μM), och panorera = panobinostat (30 nM). Okänd politikinsatserna testas i tre exemplar över en serie koncentrationer (15.625 till 1000 nM). För ersättning, celler som uttrycker varje av enfärgad fluorescerande protein (andra + och DsRed +) samt cellerna färgas med livskraft färgämnet och ofärgade celler ingår i varje kör. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Figur 4: Gating strategi används i flödet flödescytometri analysen. Det första steget i strategin Usenets baseras på framåt och side scatter, vilket gör skillnaden av cellerna i ränta baserat på egenskaperna storlek och granularitet av dessa celler. Det rekommenderas att denna gating vara så generösa som möjligt att inkludera alla händelser och avlägsnar cellulära skräp och döda celler, som finns på det nedre vänstra hörnet av densitet tomten. Ta sedan bort midjekort jacka från den datamängd som använder puls geometri Usenets, SSC-A kontra SSC-H och ytterligare smala på levande celler använder livskraft färgämnet. Slutligen används en dump-kanal (violett) och andra eller DsRed för att definiera celler av intresse. Användning av fluorescens minus en (FMO) kontroller är kritiska definiera befolkningen av intresse och de frågor av spridningseffekter från en annan fluorokrom i kanalen av intresse. Efter förvärvet analyseras data med data mjukvara Flödesanalys flödescytometri. Denna siffra har varit omtryckt i anpassad form Khoury et al.21. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: representativa resultat för effekten av bromodomain-hämmare på HIV transkription och skarvning. (A) exempel på två-parametern dual färg fluorescens andra kontra DsRed densitet tomter från untransfected celler (-Tat), celler transfekterade med 100 ng av pCMV-Tat101AD8-flagga (+ Tat) och celler behandlas med DMSO, JQ1 (+) eller JQ1 (-). (B) Genomsnittligt andelen (%) celler som uttrycker andra, DsRed eller skarvade produkt (DsRed / DsRed + andra) från 3 oberoende experiment visas. Jämförelser av varje tillstånd till DMSO gjordes i 2-vägs ANOVA-test. Endast visas statistiskt signifikant jämförelser. p < 0,05; p < 0,01; p < 0,001. De svarta linjerna representerar den mean±SEM. DMSO (1: 5000), JQ1 (+) och JQ1(-) (1 μM). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med tanke på svårigheten att mäta virus reaktivering ex vivo, infekterade ett brett utbud av in vitro-modeller har utvecklats över tiden för att studera HIV latens inklusive latent T cell-linjer (J-Lats, ACH2, U1), primära modeller av latent infektion av vilande) O'Doherty, Lewin, Greene och Spina modeller) eller pre-aktiverat CD4 + T-celler (Sahu, Marini, Planelles, Siliciano, Karn modeller) med enda runda eller replikering behöriga reporter virus22. För att modellera de fysiologiska förhållandena av HIV latens i vilande CD4 + T-celler, följde dubbla fluorescerande reporter system såsom RGH (röd-grön-HIV) reportern utvecklats av Ivan Sadowskis grupp med en LTR-driven Gag-andra markör och en CMV-driven mCherry på plats Nef23. En liknande dubbel färg reporter virus, Duo-Fluo, utvecklades av E. Verdin laboratorium med ett LTR-driven andra uttryck och en mCherry fluorescerande markör drivs av en EF1α promotorn24. I detta system, sattes andra in på 3' ände provirus i stället för Nef. Borttagningen i kuvertet i båda dessa system förhindrar flera rundor av infektioner. Dessutom kombinationen av de två fluorescerande proteinerna kan påvisande av produktivt (andra + mCherry +) och latent (andra - mCherry +) infekterade celler. Flera brister av tvåfärgad reporter virus var dock märkbar i CD4 + T-celler som direkt infektion av latent infekterade celler är till stor del beroende av tillståndet cellulär aktivering av T-celler23,24. I själva verket mycket låga andelen infektion observerades med dessa två reporter virus i vilande CD4 + T-celler: 0,1% för RGH23 och 0,2% för DuoFluo25. Dessutom som CMV Arrangören har visat att uttryckas på lägre nivåer i icke-aktiverade celler26,27,28, en inaktiv CMV eller EF1α arrangören skulle leda till underskattning av den latent infekterade populationer.
Vi har genererats och kännetecknas en ny HIV reporter vektor för att studera inrättandet av latens och reaktivering av virus i en hög genomströmning-analys. Flera fördelar med att vår screeningmetod inkluderar (i) kostnadseffektiviteten med förmåga att bedöma transkription och skarvning samtidigt, (ii) möjligheten att testa ett stort antal läkemedel eller kombinationer i en enda experiment, iii) snabb bedömning av den effekten av lokala och regionala myndigheter genom flödescytometri (30-45 min typiska Läs tid för 96 väl tallrik oberoende av antalet fluorescerande parametrar), iv) stort dynamiskt omfång, v) lämplig för automatiserad hög genomströmning transfection och flödescytometri med robotarmar och HTS-plattformen, Vi) snabb härdning av data med hjälp av ett flöde flödescytometri arbetsytan mall, vii) optimal för upphängning och vidhäftande celler, viii) enkelhet av modellen och anpassningsförmåga till luminiscens och plate reader mätningar (dubbla luciferas Firefly och Renilla) och ix) skalbarhet (96 - och 384-väl pate format).
En LRA eller en kombination av lokala och regionala myndigheternas benägenhet att aktivera HIV LTR-driven transkription och skarvning således andra och DsRed fluorescerande proteiner uttryck kunde undersökas av flödescytometri med vår HIV skarvning reporter. Dock innan testning synergin av Roman politikinsatserna, rekommenderas det starkt att bestämma de fysiologiska förhållandena för varje LRA genom att mäta lönsamheten för cellerna efter exponering för en serie koncentrationer av enda drogen. Inklusive en markör för levande och döda celler är därför nödvändigt att eliminera falska positiva och få resultat av högsta kvalitet. En annan viktig aspekt av flödescytometri Flödesanalys är ersättning kontroller eller FMO. Det rekommenderas starkt att använda ensamma färgade prover säkerställa minimal spridningseffekter av andra + befolkningen in i DsRed och vice versa. Dessutom är det viktigt att konto för autofluorescens celler av inklusive ofärgade celler. Slutligen är en regelbunden kontroll av cytometer prestanda och känslighet över detektorerna kritiska mestadels vid mätning av prover för en studie som spänner över en lång tidsperiod.
Även om inte diskuteras i avsnittet protokollet, finns det flera begränsningar av vår skarvning reporter systemet. För en mer grundlig diskussion, se vår tidigare publikation (Khoury et al., 2018). Export av den delvis eller Osplitsat varianter av HIV mRNA underlättas av det virala proteinet Rev och dess samband med den Rev Responsive Element (RRE) i dessa mRNA arter29,30,31,32. Överuttryck av Rev i vårt system som tillät oss att kringgå den stora blocket av kärnkraft lagring av multiplicera skarvas och Osplitsat mRNA observerats i latent infekterade T celler17 och fokus på att förstå hur de lokala och regionala myndigheterna inducerar transkription och skarvning således virus reaktivering. Dessutom, med tanke på att vårt system kräver transfection av 3 plasmider, valde vi HEK293T celler eftersom hög transfection effektiviteten av dessa celler. På grund av olika tidsliga och rumsliga tillgängligheten av cellulära faktorer i T-celler jämfört med en cancer cellinje, är det viktigt att validera resultaten av skarvning reporter förvärvade i HEK293T celler i T-cellinjer och primära celler, som kan ge bra tekniska utmaningar på grund av sin begränsade transfectability. Därför, användningen av alternativa DNA leverans reagenser för transfection såsom DMRIE-C, som har visat sig vara särskilt effektivt för transfection suspension celler (t.ex. Jurkat) eller nucleofection metoder såsom Amaxa nucleofector eller Neon transfection system som har visat sig underlätta effektiv och tillförlitlig leverans av enstaka eller flera plasmider svårt-att-transfect celler inklusive primär CD4 + T-celler. Alternativt skulle det vara intressant att testa detta reporter system i samband med fullängds virus i en primär cell modell av latens med hjälp av ovannämnda transfection metoder. I själva verket kan skillnader i tillgången till värd transkription, töjning och skarvning faktorer i en rCD4 + T cell påverka en LRA förmåga att återaktivera den latenta provirus. Slutligen, vår modell behandlar inte huruvida LRA kan påverka transkription och skarvning av bystander celler och huruvida det kan framkalla replikering behöriga virus. Vi skulle dock misstänka att genom att mäta en ökning av cell-associerade HIV U.S. och MS RNA, skulle detta leda till produktion av replikering behöriga virus i kultur supernatanten. Detta kunde bekräftas genom att genomföra de guldmyntfot kvantitativa virus utväxt assay (QVOA)33.
På grund av den komplicerade karaktären av latens och säkerställa effektiv virus reaktivering, vara en mångfacetterad kombinatoriska strategi krävs34. Potentiell behandling behöver stimulera flera vägar inklusive transkription och skarvning, som tidigare har visats att spela avgörande roller i etableringen av latens16,35,36, 37. vår LTR-driven skarvning reporter skulle tillåta en hög genomströmning screening av läkemedel som kan optimalt rikta både steg, transkription och skarvning, ökar chansen att hitta molekyler som kan samverka effektivt, vilket skulle leda till en lägre dosnivåer och thus toxicitet av varje läkemedel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av projektbidrag APP1129320 och programmet grant APP1052979 från NHMRC av Australien. Vi tackar Dr. Adam Wheatley, Dr Marina Alexander, Dr. Jenny L. Anderson och Michelle Y. Lee för att ge grundläggande konstruktioner och råd för det framgångsrika slutförandet av detta arbete. Vi tackar också DMI Flow anläggning personal för deras råd och generösa hjälp att upprätthålla den flödescytometer som används i denna studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| HEK293T cells (Human Embryonic Kidney cells) | ATCC | CRL-3216 | Replicates vectors carrying the SV40 region of replication. |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I) | Gibco | 10569-010 | + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Sodium Pyruvate |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 10099-141 | Origin Australia |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4458 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| Trypan blue Stain, 0.4% | Gibco | 15250 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Lipid transfection reagent |
| Opti-MEM I (1x) reduced serum medium | Gibco | 31985-070 | Serum free medium |
| NucleoBond Xtra Maxi | Marcherey-Nagel | 740414.50 | |
| pEGFP-N1 plasmid | Clontech (TaKaRa) | 6085-1 | Expression of EGFP in mammalian cells, CMVIE promoter. |
| pDsRed-Express-N1 | Clontech (TaKaRa) | 632429 | Expression of DsRed-Express in mammalian cells, CMVIE promoter. |
| pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRed | Addgene | 115775 | |
| pCMV-RevNL4.3 | Addgene | 115776 | |
| pCMV-Tat101AD8-Flag | Addgene | 115777 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore | 67-68-5 | |
| JQ1(+) | Cayman Chemical | 11187 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM |
| JQ1(-) | Cayman Chemical | 11232 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM |
| Phorbol Myristate Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 16561-29-8 | Stock at 100 μg/mL in DMSO; working concentration 10 nM |
| Phytohaemagglutinin (PHA) | Remel | HA15/R30852701 | Stock at 1 μg/μL in PBS; working concentration 10 μg/mL |
| Vorinostat (VOR) | Cayman Chemical | 10009929 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 0.5 μM |
| Panobinostat (PAN) | TRC | P180500 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 30 nM |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | 63581 | |
| Venor GeM Classic | Minerva Biolabs | 11-1100 | Mycoplasma Detection Kit, PCR-based |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow cytometry reagents | |||
| LSR Fortessa | BD Biosciences | Flow cytometer (4 lasers-blue, red, violet and yellow) | |
| LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer (3 lasers-blue, red and violet) | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | L34976 | Viability dye: for 633 or 635 nm excitation, 400 assays. Component A and B are both provided in the kit. |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| EDTA 0.5M pH8 | Gibco | 15575-038 | |
| Formaldehyde Solution 37/10 (37%) | Chem-Supply | FA010 | |
| BD FACS Diva CS&T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Calibration beads |
| Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks) | BD Biosciences | 559123 | 3.0 - 3.4 mm |
| Sheath solution | Chem-Supply | SA046 | 90 g NaCl in 10 L water |
| HAZ-Tabs | Guest Medical | H8801 | Chlorine release tablets for disinfection |
| Decon 90 | Decon Laboratories Limited | N/A | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution Decon 90 5%. |
| Sodium Hypochlorite (12-13% Solution) | Labco | SODHYPO-5L | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution bleach 1%. |
| 7x | MPBio | IM76670 | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution 7x 1%. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Tissue culture flasks (75 cm2, canted neck, cap vented) | Corning | 430641U | |
| Tissue culture plates (96 well flat bottom with lid) | Costar | 3599 | |
| Tissue culture plates (96 well V-bottom without lid) | Costar | 3896 | |
| Centrifuge tubes (10 mL) | SARSTEDT | 62.9924.284 | 100x16 mm |
| Centrifuge tubes (50 mL) | CellStar | 227261 | 30x115 mm |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Corning Axygen | MCT-150-C | |
| Serological Pipette (25 mL), sterile | Corning | CLS4489-200EA | |
| Serological Pipette (10 mL), sterile | Corning | CLS4488-200EA | |
| Serological Pipette (5 mL), sterile | Corning | CLS4487-200EA | |
| Reagent reservoirs (50 mL), sterile | Corning | CLS4470-200EA | |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, with cell-strainer cap | Corning | 352235 | 12 x 75 mm style, 70 mm |
| Nylon Mesh | SEFAR | 03-100/32 | 100 mm |
| Titertube Micro test tubes, bulk | BIO-RAD | 2239391 | microfacs tubes |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, without cap | Corning | 352008 | 12x75 mm style |
| Snap Caps for 12x75 mm Test Tubes | Corning | 352032 | |
| Counting chamber, Neubauer improved double net ruling, bright-line (Haemocytometer, LO-Laboroptik) | ProSciTech | SVZ4NIOU | 3x3 large squares of 1 mm2; Depth 0.100 mm; volume 0.1 mL; area minimum 0.0025 mm2 |
| Coverslips (Menzel-Gläser) | Grale Scientific | HCS2026 | 20 x 26 mm |
| Microscope | Nikon TMS | 310528 | |
| Centrifuge 5810R refrigerated | Eppendorf | 5811000487 | with rotor A-4-81 including adapters for 15/50 mL conical tubes |
| FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech | N/A | Plate reader for cell proliferation assay. Filter 490 nm. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| FACS Diva | BD Biosciences | Flow cytometer data acquisition and analysis program, version 8.0.1 | |
| FlowJo | FlowJo | FlowJo 10.4.2 | Flow cytometer data analysis program, FlowJo Engine v3.05481 |
| Omega | BMG Labtech | FLUOstar multi-user reader control, version 5.11 | |
| Omega - Data Analysis | BMG Labtech | MARS | FLUOstar data analysis, version 3.20R2 |
| Microsoft Excel | Microsoft | Excel:mac 2011 | version 14.0.0 |
| Prism | GraphPad | Prism 7 | version 7.0c |
References
- Siliciano, J. D., et al. Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells. Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).
- Khoury, G., et al. Ch. 8. HIV vaccine and cure - The Path Towards Finding an Effective Cure and Vaccine. 1075, Springer Nature. Adv Exp Med Biol (2018).
- Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. HIV-1 transcription and latency: an update. Retrovirology. 10, 67 (2013).
- Archin, N. M., et al. HIV-1 Expression Within Resting CD4+ T Cells After Multiple Doses of Vorinostat. Journal of Infectious Diseases. 210, 728-735 (2014).
- Elliott, J. H., et al. Activation of HIV Transcription with Short-Course Vorinostat in HIV-Infected Patients on Suppressive Antiretroviral Therapy. PLoS Pathogens. 10, (2014).
- Leth, S., et al. Combined effect of Vacc-4x, recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor vaccination, and romidepsin on the HIV-1 reservoir (REDUC): a single-arm, phase 1B/2A trial. The Lancet HIV. 3, e463-e472 (2016).
- Rasmussen, T. A., et al. Panobinostat, a histone deacetylase inhibitor, for latent-virus reactivation in HIV-infected patients on suppressive antiretroviral therapy: a phase 1/2, single group, clinical trial. The Lancet HIV. 1, e13-e21 (2014).
- Søgaard, O. S., et al. The Depsipeptide Romidepsin Reverses HIV-1 Latency In Vivo. PLoS Pathogens. 11, (2015).
- Bartholomeeusen, K., Xiang, Y., Fujinaga, K., Peterlin, B. M. Bromodomain and extra-terminal (BET) bromodomain inhibition activate transcription via transient release of Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb) from 7SK small nuclear ribonucleoprotein. Journal of Biological Chemistry. 287, 36609-36616 (2012).
- Boehm, D., et al. BET bromodomain-targeting compounds reactivate HIV from latency via a Tat-independent mechanism. Cell Cycle. 12, 452-462 (2013).
- Contreras, X., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid reactivates HIV from latently infected cells. Journal of Biological Chemistry. 284 (11), 6782-6789 (2009).
- Rasmussen, T. A., et al. Comparison of HDAC inhibitors in clinical development: effect on HIV production in latently infected cells and T-cell activation. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9 (5), 993-1001 (2013).
- Wei, D. G., et al. Histone deacetylase inhibitor romidepsin induces HIV expression in CD4 T cells from patients on suppressive antiretroviral therapy at concentrations achieved by clinical dosing. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004071 (2014).
- Blazkova, J., et al. Effect of histone deacetylase inhibitors on HIV production in latently infected, resting CD4(+) T cells from infected individuals receiving effective antiretroviral therapy. Journal of Infectious Diseases. 206 (5), 765-769 (2012).
- Bullen, C. K., Laird, G. M., Durand, C. M., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. New ex vivo approaches distinguish effective and ineffective single agents for reversing HIV-1 latency in vivo. Nature Medicine. 20 (4), 425-429 (2014).
- Yukl, S. A., et al. HIV latency in isolated patient CD4+T cells may be due to blocks in HIV transcriptional elongation, completion, and splicing. Science Translational Medicine. 10, (2018).
- Lassen, K. G., Ramyar, K. X., Bailey, J. R., Zhou, Y., Siliciano, R. F. Nuclear retention of multiply spliced HIV-1 RNA in resting CD4+T cells. PLoS Pathogens. 2, 0650-0661 (2006).
- Alexander, M. R., Wheatley, A. K., Center, R. J., Purcell, D. F. J. Efficient transcription through an intron requires the binding of an Sm-type U1 snRNP with intact stem loop II to the splice donor. Nucleic Acids Research. 38, 3041-3053 (2010).
- Anderson, J. L., Johnson, A. T., Howard, J. L., Purcell, D. F. J. Both Linear and Discontinuous Ribosome Scanning Are Used for Translation Initiation from Bicistronic Human Immunodeficiency Virus Type 1 env mRNAs. Journal of Virology. 81, 4664-4676 (2007).
- Nikfarjam, L., Farzaneh, P. Prevention and detection of Mycoplasma contamination in cell culture. Cell J. 13 (4), 203-212 (2012).
- Khoury, G., et al. HIV latency reversing agents act through Tat post translational modifications. Retrovirology. 15 (1), 36 (2018).
- Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
- Dahabieh, M. S., et al. Direct non-productive HIV-1 infection in a T-cell line is driven by cellular activation state and NFkappaB. Retrovirology. 11, 17 (2014).
- Calvanese, V., Chavez, L., Laurent, T., Ding, S., Verdin, E. Dual-color HIV reporters trace a population of latently infected cells and enable their purification. Virology. 446 (1-2), 283-292 (2013).
- Chavez, L., Calvanese, V., Verdin, E. HIV Latency Is Established Directly and Early in Both Resting and Activated Primary CD4 T Cells. PLoS Pathogens. 11 (6), e1004955 (2015).
- Hunninghake, G. W., Monick, M. M., Liu, B., Stinski, M. F. The promoter-regulatory region of the major immediate-early gene of human cytomegalovirus responds to T-lymphocyte stimulation and contains functional cyclic AMP-response elements. Journal of Virology. 63 (7), 3026-3033 (1989).
- Reeves, M., Sinclair, J. Aspects of human cytomegalovirus latency and reactivation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 325, 297-313 (2008).
- Sambucetti, L. C., Cherrington, J. M., Wilkinson, G. W., Mocarski, E. S. NF-kappa B activation of the cytomegalovirus enhancer is mediated by a viral transactivator and by T cell stimulation. EMBO Journal. 8 (13), 4251-4258 (1989).
- Kula, A., et al. Characterization of the HIV-1 RNA associated proteome identifies Matrin 3 as a nuclear cofactor of Rev function. Retrovirology. 8, 60 (2011).
- Kula, A., Marcello, A. Dynamic Post-Transcriptional Regulation of HIV-1 Gene Expression. Biology (Basel). 1 (2), 116-133 (2012).
- Yedavalli, V. S., Jeang, K. T. Rev-ing up post-transcriptional HIV-1 RNA expression. RNA Biology. 8 (2), 195-199 (2011).
- Zolotukhin, A. S., et al. PSF acts through the human immunodeficiency virus type 1 mRNA instability elements to regulate virus expression. Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6618-6630 (2003).
- Laird, G. M., Rosenbloom, D. I., Lai, J., Siliciano, R. F., Siliciano, J. D. Measuring the Frequency of Latent HIV-1 in Resting CD4(+) T Cells Using a Limiting Dilution Coculture Assay. Methods in Molecular Biology. 1354, 239-253 (2016).
- Cary, D. C., Peterlin, B. M. Targeting the latent reservoir to achieve functional HIV cure. F1000Res. 5, (2016).
- Han, Y., et al. Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes. Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).
- Laird, G. M., et al. Ex vivo analysis identifies effective HIV-1 latency - reversing drug combinations. Journal of Clinical Investigation. 125, 1901-1912 (2015).
- Lenasi, T., Contreras, X., Peterlin, B. M. Transcriptional interference antagonizes proviral gene expression to promote HIV latency. Cell Host Microbe. 4 (2), 123-133 (2008).
