Summary
에이즈 효율적인 재 활성화의 기능 평가 및 잠재 proviruses의 높은 처리량 프로토콜 설명 이며 HIV 전사에 개입의 영향을 테스트 하 고 접합 하 여 적용 합니다. 대기 시간 반전 LTR 기반 전사에 에이전트와 접합의 효과의 대표적인 결과 제공 됩니다.
Abstract
HIV에 안정적이 고 잠재적인 바이러스, 면역 체계에 보이지 않는 유지 하 고 현재 항 레트로 바이러스 치료 (장바구니)에 의해 타겟이 되지 형태의 항구 셀의 저수지의 존재 때문에 불 치이 남아 있다. 전사 및 접합 CD4 + T 세포 휴식에서 HIV-1 대기 시간을 강화 하기 위해 표시 되었습니다. 대기 시간 대기 시간 반전 에이전트 (LRAs) "충격 및 죽이기" 접근의 사용에 의해의 반전이이 저수지를 제거 하기 위해에서 광범위 하 게 공부 하고있다 하지만 있다 지금까지 표시 되지 않습니다의 적절 한 개발의 부족으로 인해 임상 시험에 있는 성공 분자가이 저수지를 교란 효율적으로 수 있습니다. 여기에 제시 된 프로토콜에는 안정적이 고 효율적으로 HIV 전사에 대기 시간 반전 에이전트 (LRAs) 평가 및 접합 방법을 제공 한다. 이 방법은 LTR 기반 듀얼 컬러 기자 동시에 전사 및 접합에 아이라의 효과 측정할 수 있는의 사용 cytometry에 의해을 기반으로 합니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 부착 셀에에서 셀에 대 한 적절 한입니다. 그것은 높은 처리량의 시스템에서 약물의 많은 수를 테스트 하기 위한 유용 합니다. 메서드는 기술적으로 구현 하는 간단 하 고 비용 효율적인. 또한, cytometry 사용 세포 생존 능력의 평가 허용 하 고 따라서 동시에 독성 약물.
Introduction
효과적인 장기 투여 요법에도 불구 하 고 HIV 메모리 CD4 + T 세포1에 통합된 provirus로 숨겨진 상태로 유지 됩니다. 에이즈-1 5의 염색 질 구조 ' 긴 단말기 반복 (LTR) 발기인 및 히스톤 메 틸 화 등 DNA methyltransferases (DNMT) 및 히스톤 deacetylases (HDAC) deacetylation 후 성적인 수정은에 지도 하는 중요 한 메커니즘 transcriptional 억제 하며 따라서 사후 통합 대기 시간2,3 대기 시간 역전 에이전트 (LRAs)의 큰 다양 한 생체 외에서 바이러스 생산을 유도 하기 위해 그들의 효 험에 대 한 조사 및에서 vivo에서 latently 감염 휴식 CD4 + T 세포4,,56,7 ,8. LRAs 중 테스트, HDACi (HDAC 저 해제)와 내기 bromodomain 억제제 (베티스) 유도 chromatin decondensation 및 긍정적인 녹음 방송 신장 요인 b (P-TEFb)의 출시 각각,는 transcriptional의 완화 후속으로 이어지는 5' LTR 억압 고 에이즈 식9,10,11,,1213의 활성화. 그러나 Ex vivo14,15셀 관련 unspliced HIV mRNA (미국 RNA), 바이러스 성 전사의 지표에 겸손 한 증가 관찰 했다, 이러한 LRAs 여 재 활성화의 크기 제한 되었다. 중요 한 것은, 이러한 LRAs latently 감염 된 세포의 주파수에 있는 감소를 유도 하지 못했습니다.
에이즈 식 비효율적인 접합16 곱하기 접합된 HIV RNA (MS RNA)17의 핵 수출에서 결함에 의해 더 제한 될 수 있습니다. 따라서, 식별 새로운 유형의 LRAs 더 강력한 바이러스 생산 후 통합의 영향을 미칠 수 필요 합니다. 또한, 대기 시간을 효율적으로 반대로 최적의 화합물을 정의 하는 데 도움이 소설 분석 실험의 개발이 필요 합니다.
여기, 프로토콜 제공 됩니다, 에이즈 LTR 기반 전사 및 접합에 개입의 영향의 기능 평가 위한 높은 처리량 접근 활용. 간단 하 게, 새로운 LTR 기반 듀얼 컬러 기자 시스템 pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (그림 1) cytometry HIV 재 활성화를 평가 하기 위해 사용 됩니다. 이 형광 기자에서 unspliced HIV mRNA (4 kb)의 식 접합된 mRNA (2 kb)의 표현 Discosoma sp. 레드 (DsRed) 형광 단백질 표정으로 이어질 것 이라고 하는 동안 향상 된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 식에 지도 한다. 간단히, 형광 환경을 EGFP 융해 단백질, gp140unc를 사용 했습니다. EGFP, EGFP의 코딩 시퀀스 봉투 (Env) 유엔 쪼개진 고 잘린 형태의 프레임에 배치 했다 Ablate 분열 사이트에 gp120 그리고 gp41 EGFP 환경의 분리를 방지 하 고 올바른 접는 용이 하 게 하는 수용 성 환경을 아날로그 만드는 막 횡단 도메인 이전 gp160 단백질 자를 변경 도입 된 및 EGFP의 표현입니다. 셀 내에서 식에 따라 계 그것 4 kb 환경 을의 핵-세포질 수출을 중재 하는 핵에 localizes mRNA (RRE) 계 반응 요소와 상호 작용을 통해. Env의 잘림 gp120 그리고 gp41, A7 3' 스플라이스 사이트 사이 RRE 타협 하지 않습니다. 이 시스템에 V-1에 접합 기증자 4 (SD4)를 결합 하 고 acceptor 7 (SA7) 2 kb의 생산에 결과 mRNA 아미노산 38에서 잘린 기능 비 계 단백질 인코딩 융합 DsRed 형광 단백질, RevΔ38-DsRed. 간단히, DsRed 중첩 확장18아미노산 38에 레 브의 2nd exon에 삽입 되었다. Unspliced mRNA의 핵 수출을 촉진 하기 위하여 포유류 표정 벡터 계 (pCMV-레 브NL4.3) 인코딩 형광 기자 구조 (그림 2)와 페 공동 했다. 여기에 설명 된이 독특한 기자 구문 HIV 전사 및 접합, 바이러스 성 벡터를 사용 하지 않고도 높은 처리량 평가에 유용 합니다.
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Protocol
참고: 복제에 대 한 절차, 변환 및 시퀀싱은 다른18,19논의. 본 프로토콜 transfection 포유류 식 벡터 (그림 3)에서 시작합니다.
1. 듀얼 컬러 기자와 HEK293T 세포의 transfection 구성
- Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM) 10% (v/v) 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 페니실린 (100 U/mL)와 스 (100 μ g/mL) 37 ° c.에 5% CO2 배양 기에서 보충에 HEK293T 세포 배양 녹고, 후 2-3 회 transfection에 그들을 사용 하기 전에 통행 HEK293T 세포 실험. 이 녹고 절차에서 회복 하기 위해 세포 시간을 줄 것 이다.
주의: Mycoplasma 세포 배양의 오염 심각한 문제가 남아 있습니다. 좋은 실험실 연습 및 세포 배양의 일상적인 테스트 mycoplasma 오염의 위험을 감소 하 고 유포20방지에 필수적입니다. - 뿌리기 전에 1:2 1 일 셀을 분할 하 고 신선한 DMEM 매체에 그들을 전송. 37 ° c.에 5% CO2 배양 기에서 24 h에 대 한 셀을 육성
- Transfection, 전날 포부에 의해 플라스 크에서 매체를 제거 하 고 혈 청의 흔적을 제거 하려면 Dulbecco의 인산 염 버퍼 (DPBS) 염 칼슘 (캘리포니아2 +), 마그네슘 (마그네슘2 +)의 무료 셀을 세척.
- 문화 그릇에 트립 신-EDTA 용액 (0.05%-PBS에서 10 m m)의 5 mL을 분배 하 고 2 ~ 5 분 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 그것을 배치.
- 세포를 분리 하는 때 더 세포를 손상 시킬 수 있는 트립 신 활동을 억제 하기 위해 10% (v/v) FBS 보충 DMEM의 5 mL을 추가 합니다.
- 부드럽게 아래로 풀 헤어 셀 정지를 pipetting으로 resuspend.
- Trypan 푸른 얼룩 (0.4%)에 셀 1시 10분 희석.
- 할을 차지 하지 trypan 블루 현미경 (10 x 목표)는 haemocytometer을 사용 하 여 라이브 셀을 계산 합니다.
- 세포 수의 평균 10000 곱한 여 밀리 리터 당 가능한 셀의 수를 계산 하 고 얼룩 trypan 블루에서 희석 비율 (1:10).
- DMEM 매체 10% 보충의 100 μ 2 × 104 셀 접시 바닥이-96-잘 빠진 접시 24 h에 대 한 항생제 없이 FBS.
- 각 잘 희석 400 pLTR.gp140/EGFP의 ng. RevD38/DsRed, 20 pCMV 계NL4.3 및 100의 ng pCMV Tat101AD8의 ng-혈 청 자유로운 매체의 50 μ에 플래그 DNA. 부드럽게 혼합. 일치 빈 문신 벡터 pcDNA3.1 (-)을 사용 하 여 문신 없이 실험에 대 한 있습니다.
참고: 내 무료 DNA의 사용이 좋습니다. 그것을 위해 내 무료 DNA midi 또는 maxiprep 핵 산 정화 키트를 사용 하 여 준비 합니다. 1.7와 1.9 사이 여야 260/280 세 비율을 측정 하 여 DNA의 순도 결정 합니다. - 부드럽게 사용 하기 전에, 지질 시 약을 혼합 한 다음 희석 혈 청 자유로운 매체의 50 μ에 0.65 μ. 부드럽게 혼합 하 고 실 온에서 5 분 동안 품 어.
- 희석된 지질 시 약 희석된 DNA 결합 되어 있습니다.
- 부드럽게 혼합 하 고 실 온에서 20 분 동안 품 어. 솔루션은 흐린 나타날 수 있습니다.
참고: 1.15 단계를 진행 합니다. 30 분 이내 - 100 μ 셀 위에 drop-wise 지질 시 DNA 복합물의 당 분배.
- 접시와 락으로 부드럽게 혼합.
-
5 h 5% CO2 습도 인큐베이터에서 37 ° c.에 대 한 접시를 품 어
- 각 반응 혼합은 단일 잘 (96-잘) transfection에 대 한 충분 합니다. 조정 금액 및 약물 및 테스트, 조합 수에 따라 부품의 볼륨 및 pipetting 변형에 대 한 계정. 모든 조건 일반적으로 triplicates에서 테스트 합니다.
- 100 추가 우물 transfect CMV 구동 EGFP와 DsRed 익스프레스 DNA 플라스 미드 보상 목적의 ng.
2. Transfected HEK293T의 치료 대기 시간 반전 하는 에이전트와 세포
참고: 각 분석 결과 이전 셀 확산 분석 결과와 약물의 높은 복용량에 노출 된 후 세포의 생존 능력을 측정 하 여 각 아이라의 생리 상태를 결정 합니다.
- 각 아이라 성장 매체와 적절 한 작동 농도를 희석 (예:, JQ1(+))에 대 한 1 μ M.
주의: 10 m m의 농도를 적절 한 용 매로 동결 건조 된 약 reconstitute 동결-해 동 주기를 반복된을 피하기 위해-80 ° C에서 모든 재고 LRAs 단일 사용 약 수 (각 5 μ)에 저장 합니다. - 신중 하 게 transfection 매체는 멀티 채널으로 발음 하 고 적절 한 아이라 (표 1)를 포함 하는 100 μ 중간으로 바꿉니다. 매체 문화 플레이트 표면에서 쉽게 분리 알려져 있습니다 transfected HEK293T 셀을 분리 하지 않으려면 우물의 벽 함께 매우 부드럽게를 추가 합니다.
- 48 h 5% CO2 습도 인큐베이터에서 37 ° c.에 대 한 접시를 품 어
3. 교류 Cytometry 분석에 대 한 고칠 수 생존 염료와 Transfected 세포의 얼룩
주의: 죽은 세포와 파편 제거 가양성을 제거 하 고 최고 품질의 결과 얻기 위해 필수적 이다.
- 잘 당 고 부드럽게 pipetting 위아래 (~ 5 번)는 다중 채널와 미디어의 볼만 피하 면 서 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 100 μ를 사용 하 여 미디어에 셀을 분리 합니다. 필요한 경우, 트립 신-EDTA 용액 (0.05%-PBS에서 10 m m)의 당 35 µ L를 사용 하 여 혈 청을 포함 하는 매체와 중화 전에 37 ° C에서 5 분을 배양 접시에서 세포를 분리 합니다.
- 96-잘 V-하단 플레이트에 셀을 전송 합니다.
- 4 ° C에서 500 x g 에 5 분에 대 한 셀을 회전 다음 셀을 건드리지 않고 매체/PBS를 신중 하 게 발음 합니다.
- 워시 세포 단백질/혈 청 무료 PBS의 200 μ와 적어도 1 시간.
- 4 ° C에서 5 분 동안 500 x g 에서 centrifuge 다음는 상쾌한 접시를 기울이기 및 셀을 건드리지 않고 워시 버퍼를 제거 하 여 삭제 합니다.
- 단백질/혈 청 무료 PBS에 생존 염료 1:1000를 diluting 하 여 고칠 수 생존 염료의 작업 솔루션을 준비 합니다. 잘 당 희석된 얼룩의 50 µ L를 준비 합니다.
참고: 생존 염료 파란색, 빨간색, 보라색 레이저와 함께 사용 하기 위해 적합 한 색상의 범위에서 사용할 수 있습니다. Resuspending 50 μ 무수 DMSO (구성 요소 B)으로 동결 건조 된 염료 (구성 요소 A)의 한 유리병으로 고칠 수 생존 염료의 재고 솔루션을 준비 합니다. 단일 사용 하는 aliquot (1 μ 각),-20 ° C에 게는 빛 으로부터 보호. - 각 잘을 희석된 가능성 염료의 50 μ를 추가 하 고는 멀티 채널을 위아래로 pipetting으로 세포를 혼합.
- 얼룩 빛 으로부터 보호 4 ° C에서 10-15 분.
- 워시 버퍼 (1% 소 혈 청 알 부 민 및 2 mM EDTA와 PBS)의 150 μ 1-2 번 씻어.
- 4 ° c.에서 5 분 동안 500 x g 에서 원심 분리기 폐기는 상쾌한.
- 어둠 속에서 4 ° C에서 10-15 분에 대 한 워시 버퍼에서 갓된 1% 포름알데히드의 100 μ와 셀을 수정 합니다.
주의: 포름알데히드는 매우 독성이 있다. 피하기 위해 장갑과 보호를 위한 안전 유리를 착용 하는 동안 흡입 증기 두건에서 1% 포름알데히드 솔루션을 준비 합니다. - 워시 워시 버퍼의 100 μ로 1-2 번 셀.
- 4 ° c.에서 5 분 동안 500 x g 에서 원심 분리기 폐기는 상쾌한.
- 워시 버퍼의 70 μ에 셀 펠 릿을 resuspend.
참고: 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다. 고정된 셀 흐름 cytometer에 다음날 분석을 위해 어둠 속에서 4 ° C에서 저장 될 수 있습니다.
4. EGFP 및 DsRed Cytometry 및 데이터 분석에 의해 측정
참고: 교류 cytometer에 HIV 전사 (%EGFP) 및 접합 (DsRed %)를 분석 합니다. 70 μ m 세포-스 트레이너 또는 100 μ m 나일론 메쉬 노즐 막힘 방지를 실행 하기 전에 샘플을 필터링 합니다.
- 적어도 cytometer 및 컴퓨터를 시작 10 분 전에 워밍업 레이저를 사용 하 여.
- 샘플을 실행 하 고 데이터 수집을 시작, 이전에 칼 집 탱크 0.9% 식 염 수 솔루션와 염소 태블릿 폐기물 탱크에 추가 되도록.
- 기포의 흐름 셀을 확인 합니다.
- 탐지기와 필터는 실험에 대 한 적절 한 확인 합니다.
참고: EGFP, 블루 레이저의 사용 (488 nm) 및 530/30 대역, DsRed 익스프레스 최적으로 노란 레이저를 사용 하 여 검색 하는 동안 (561 nm) 및 610/20 대역. 블루 레이저 (488 nm) 610/20 대역 또한 DsRed 식 검색을 사용할 수 있습니다. - Cytometer 성능 및 감도 감지기에 걸쳐 교정 비즈를 실행 하 여 확인 합니다.
- 앞으로 조정 (FSC-A) 및 측면 (SSC-A) 분산형 전압으로는 주요 인구 화면 샘플 및 명확 하 게 뚜렷한 흠 없는.
참고: FSC (앞으로 흩어져 빛)은 빛의 측정 SSC (측면-흩어져 빛) 동안 셀 셀 면적 (크기)의 볼륨에 따라 평면 각도에서 회절은 비례 하는 직각에 광 회절 측정 셀 단위 그리고 내부 복잡성입니다. - 인구의 EGFP + DsRed 발견자와 반대로 최소 좀 보장 단일 스테인드 샘플을 사용 하 여 수동 또는 자동 보정을 수행 합니다.
주의: 보상으로 각 셀 단독으로 고칠 수 생존 염료와 스테인드 뿐만 아니라 단 하나 색깔 형광 성 단백질을 표현 하는 세포의 샘플을 사용 합니다. FITC와 PE 보상 구슬 EGFP 및 DsRed 형광 단백질 보상 다른 스펙트럼 특성 때문에 사용 하지 마십시오. 보상 제어 충분히 밝은 긍정적이 고 부정적인 인구를 해결 해야 합니다. - 플롯 만들고 게이츠 형광 마이너스 1 (FMO) 컨트롤을 사용 하 여 설정 합니다.
- 취득 하 고 샘플 당 10000 가능한 셀 이벤트의 최소. 남자 통과 레이저 요격을 피하기 위해 중간 또는 낮은 속도로 샘플을 실행 합니다. 펄스 형상 게이팅 같은 사용 SSC-A SSC-H 남자 제거 대. 안정성 확인 SSC-A 대 시간을 그려서 실행의 어떻게 볼 흐름은 실행 하는 동안.
- 실행의 끝에, 집중된 청소 에이전트와 교류 cytometry 응용 청소 다음 5 분 동안 물.
- 셧다운 시스템, 폐기물을 폐기 하 고 다시 취득 후 칼 집 탱크를 채우기.
- 교류 cytometry 데이터 분석 소프트웨어를 사용 하 여 데이터를 분석 합니다. 세포 파편과 덩어리 (남자) 앞으로 옆 분산형 기반 제외 다음 생존 색소 얼룩을 사용 하 여 죽은 세포를 제거 (부정 인구 라이브 셀에 =). 접합된 제품 DsRed의 비율 뿐만 아니라 EGFP와 DsRed (그림 4), 셀을 식별 /(DsRed + EGFP) (그림 5).
- HIV 전사 및 치료 세포와 개인 또는 LRAs (그림 5)의 조합에 노출 하는 셀을 비교 하 여 접합에 아이라의 효과 결정 합니다.
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Representative Results
에이즈-1의 표현 (EGFP) unspliced 및 bromodomain 억제제 JQ1와 치료 다음과 (DsRed) 제품을 접합에 대 한 대표적인 결과 그림 5 에 나와 있습니다. JQ1(+)와 문신 크게 EGFP 표현 세포의 비율 증가 (2.18 및 4.13 FC DMSO에 각각; n = 3) unspliced 성적 지표. 또한, JQ1(+) 크게 접합된 제품 (7.37 FC DMSO에) 문신으로 비슷한 레벨의 비율 뿐만 아니라 DsRed (46.6 FC DMSO에)를 표현 하는 세포의 백분율을 증가 (59.6 및 5.83 FC DMSO, 이상 각각) JQ1(+)의 능력을 확인 HIV 전사 및 접합 설정 하려면 다른 한편으로, stereoisomer 제어 JQ1(-)와 치료 곧 에이즈 전송 및 프로토콜의 성공을 확인 접합에 JQ1(+) 효과.
최근 간행물에서 우리는 RNA 분석 에이즈의 축적 접합 JQ1(+) 치료21다음 성적표에 의해 나타났습니다. 사실, 우리의 데이터가 모델 JQ1(+)와 치료 다음과 EGFP 및 DsRed 단백질 표정에 의해 미러 했다 unspliced 및 접합 성적 수준에 일관 된 변화를 밝혔다. 이 결과 EGFP 및 DsRed 세포 표현 반영 HIV 전사 및 접합을 유도 하는 bromodomain 억제 물 JQ1(+)의 기능을 나타냅니다.
요약 하자면, 우리는 pLTR.gp140/EGFP 사용 하 여 유효성 검사. 에이즈-1 전사 및 접합에 LRAs의 효과의 평가 대 한 높은 처리량 설정에서 RevΔ38/DsRed 기자. 아이라 또는 증가 독성의 최적의 금액 스커드 결과 발생할 수 있습니다. 세포 생존 능력을 유지 하면서 사용 하는 약물의 양을 최적화 결과의 정확도 높일 수 있습니다.
그림 1: 대기 시간 반전 LTR 기반 전사에 에이전트와 접합의 효과 결정 하는 데 사용 하는 모델의 도식. LTR 구문 표현 중 unspliced 봉투 (Env) 단백질을 융합 녹색 형광 단백질 (EGFP)를 강화 또는 접합 DsRed와 Δ38rev 단백질. 이 그림 Khoury 외.21에서 재 인 쇄 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 디자인 생성. (A) pLTR.gp140/EGFP입니다. RevΔ38/DsRed 접합 기자 EGFP (gp140-EGFP) 및 기능 비 계 단백질을 융합 하는 봉투의 식을 아미노산 38 DsRed 형광 성 단백질 (RevΔ38-DsRed)에 융합에서 잘릴 수 있습니다. (B) pCMV-레 브NL4.3 Rev 단백질의 표현 수 있습니다. (C) pCMV-Tat101AD8-플래그를 사용 하면 C 터미널 플래그-태그와 Tat101(AD8) 단백질의 표정. 식 플라스 미드 PCR 오버랩 및 제한 다이제스트를 사용 하 여 구성 됩니다. 모든 벡터 지도 버전 4.1.9 SnapGene 소프트웨어를 사용 하 여 만들어졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 분석 결과 에이즈 대기 시간 반전 하는 에이전트의 신속한 평가 위한 디자인. 에이즈-1 전사 및 접합에 LRAs의 효과의 평가 대 한 현재 메서드 i) 시드 HEK293T 세포의 transfection ii) 이전 1 일 뒤에 iii) 아이라 치료 식 벡터와 함께 포함 되어 있습니다. iv) 셀 흐름 cytometry 48 h 후 처리에 의해 분석 된다. 이 프로토콜을 사용 하 여, 96 조건 (3 중)에 32 접시 당 테스트 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
표 1: 플레이트 설치 및 필요한 컨트롤의 대표적인 예. 문신 같은 긍정 (+) 컨트롤 뿐만 아니라 아무 약물 및 솔벤트만 (DMSO 1: 5000)와 네거티브 (-) 컨트롤에 해당 하는 열 1 ~ 3 (100 ng), PMA/PHA phorbol myristate 아세테이트/phytohaemagglutinin = (10 nM PMA, 10 μ g/mL PHA), JQ1 (+) (1 μ M), 포 vorinostat (= 0.5 μ M), 팬 및 panobinostat = (30 nM). 알 수 없는 LRAs 농도 (1000 nm 15.625)의 범위 3 중에서 테스트 합니다. 보상 목적 세포 뿐만 아니라 각 단 하나 색깔 형광 성 단백질 (EGFP +와 DsRed +)을 표현 하는 세포 생존 염료와 스테인드 하 고 흠 없는 세포 각 실행에 포함 됩니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 교류 cytometry 분석에 사용 하는 전략을 게이팅. 제어 전략의 첫 번째 단계가이 세포의 크기와 단위 속성에 따라 관심의 세포의 구별을 허용 하 고 측면 분산형을 기반으로 합니다. 게이팅이 된다는 세포 파편과 밀도 플롯의 왼쪽된 하단에 있는 죽은 세포를 제거 하는 동안 모든 이벤트를 포함 하도록 최대한 관대 하는 것이 좋습니다. 펄스 형상 제어, SSC-A SSC-H 대 및 더 좁은 생존 염료를 사용 하 여 라이브 셀에 사용 하 여 데이터 집합에서 제거 하 고 남자. 마지막으로, 덤프 채널 (바이올렛)와 EGFP 또는 DsRed 관심의 셀을 정의 하 사용 된다. 1 (FMO) 컨트롤 마이너스 형광의 사용은 관심의 인구를 정의 하 고 관심의 채널에서 다른 형광 색소에서 유출의 문제 해결에 중요 합니다. 취득, 후 데이터 흐름 cytometry 데이터 분석 소프트웨어를 사용 하 여 분석 된다. 이 그림 적응된 양식 Khoury 외.21에서 재 인 쇄 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: HIV 전사 및 접합에 bromodomain 억제제의 효과의 대표적인 결과. (A) 예제 2-매개 변수 듀얼의 색상 형광 EGFP 밀도 플롯 untransfected 세포에서 DsRed 대 (-문신), 셀 100 페 pCMV Tat101AD8의 ng-플래그 (+ 문신)와 셀 DMSO, JQ1 처리 (+) 또는 JQ1 (-). EGFP, DsRed 또는 접합된 제품을 표현 하는 셀의 (B) 평균 백분율 (%) (DsRed / DsRed + EGFP) 3 독립적인 실험에서 표시 됩니다. DMSO에 각 조건의 비교 2-웨이 ANOVA 테스트를 사용 하 여 만들어졌다. 통계적 비교에만 표시 됩니다. p < 0.05; p < 0.01; p < 0.001입니다. 블랙 라인 대표는 mean±SEM. DMSO (1: 5000), JQ1 (+) 및 JQ1(-) (1 μ M). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
Ex vivo 바이러스 재 활성화를 측정에 어려움을 감안할 때, 모델 시간 내내 latently 포함 HIV 대기 시간을 공부 하기 위하여 개발 되었다 생체 외에서 다양 한 범위의 감염 T 세포-라인 (J-라트, ACH2, u 1), (휴식의 잠재 감염의 기본 모델 O'Doherty, Lewin, 그린 및 Spina 모델) 또는 미리 활성화 된 CD4 + T 세포 (Sahu, 마리니, Planelles, Siliciano, 깐 모델) 단일 라운드 또는 복제 유능한 기자 바이러스22. HIV CD4 + T 세포 휴식에서 대기 하는 시간의 생리 적 상태를, 듀얼 형광 기자 시스템 LTR 기반 개 그-eGFP 마커 및 장소에 CMV 구동 mCherry 이반 사도 스키의 그룹에 의해 개발 된 RGH (빨강-녹색-HIV) 기자 등 일어 났 죠 Nef23의. 비슷한 컬러 듀얼 기자 바이러스, 듀오-Fluo, LTR 구동 EGFP 식와 EF1α 발기인24에 의해 구동 mCherry 형광 마커 E. Verdin 연구소에 의해 개발 되었다. 이 시스템에는 EGFP Nef 대신 provirus의 3' 끝에 삽입 되었다. 이러한 두 시스템에서 봉투에 삭제 감염의 여러 라운드를 방지할 수 있습니다. 또한, 두 가지 형광 단백질의 조합 생산의 탐지 수 (eGFP + mCherry +) latently (eGFP-mCherry +) 감염 세포. 그러나, 듀얼 컬러 기자 바이러스의 몇 가지 단점 latently 감염 된 세포의 직접 감염 T-세포23,24의 세포 활성화 상태에 크게 의존으로 CD4 + T 세포에 눈에 띄는 했다. 사실, 감염의 매우 낮은 속도 CD4 + T 세포 휴식에서이 두 기자 바이러스를 사용 하 여 관찰 되었다: RGH23 0.1%, 0.2% DuoFluo25. 또한,는 CMV로 발기인 활성화 되지 않은 셀26,,2728, 비활성 CMV 하위 수준에서 표현 될 표시 되었습니다 또는 EF1α 발기인 latently 감염의 과소 이어질 것 이다 인구입니다.
우리는 생성 하 고 대기 시간 및 높은 처리량 분석 결과에 바이러스 재 활성화의 설립을 연구 하는 새로운 에이즈 기자 벡터 특징. 우리의 심사 방법에 몇 가지 장점을 포함 i) 비용 효과 전사 및 접합 동시에, ii) 하나의 실험의 3) 빠른 평가에서 많은 수의 약물 또는 조합을 테스트 하는 능력을 평가 하는 cytometry (30-45 분 일반 읽기 시간 96 잘 접시 형광 매개 변수 수의 독립에 대 한)에 의해 LRAs의 효과 iv) 높은 동적 범위, v) 높은 처리량 transfection 그리고 cytometry 로봇 팔, HTS 플랫폼을 사용 하 여 자동화에 적합 6) 빠른 흐름 cytometry 작업 영역 서식 파일, 7 세를 사용 하 여 데이터의 치료) 서 스 펜 션 및 부착 세포, 8 세에 대 한 최적의) 모델과 발광 및 플레이트 리더 측정 (듀얼 luciferase 반딧불 및 Renilla), 및 ix 적응성의 단순) 확장성 (96-384-잘 페이트 형식).
HIV LTR 기반 전사 및 따라서 EGFP 및 DsRed 형광 단백질 식 접합을 활성화 하는 아이라의 또는 조합 LRAs의 성향 cytometry 우리의 HIV 접합 기자를 사용 하 여 검사 수 있습니다. 그러나, 소설 LRAs의 시너지 효과 테스트 하기 전에 그것은 좋습니다 다양 한 단일 약물의 농도에 노출 된 후 세포의 생존 능력을 측정 하 여 각 아이라의 생리 상태를 확인 하. 따라서, 라이브 및 죽은 세포의 마커를 포함 하 여 가양성을 제거 하 고 최고 품질의 결과 얻기 위해 필수적 이다. 교류 cytometry 분석의 다른 중요 한 측면은 보상 컨트롤 또는 FMO. 그것은 인구의 EGFP + DsRed와 반대로 최소한의 파급을 보장 하는 단독으로 얼룩진된 샘플을 사용 하 여 좋습니다. 또한, 흠 없는 세포를 포함 하 여 셀의 autofluorescence에 대 한 계정에 필수적 이다. 마지막으로, cytometer 성능 및 감지기에 걸쳐 감도의 일반적인 컨트롤은 대부분 때 오랜 기간에 걸친 연구에 대 한 샘플 측정 중요 합니다.
프로토콜 섹션에 설명 하지, 하지만 우리의 접합 기자 시스템의 몇 가지 제한이 있습니다. 더 철저 한 토론에 대 한 우리의 이전 발행물 (Khoury 외., 2018)를 참조 하십시오. 수출에서 부분적으로 또는 HIV mRNA의 unspliced 변종 바이러스 성 단백질 계와의 그것의 협회와는 계 반응 요소 (RRE)이 mRNA 종29,30,,3132에 의해 촉진 된다. 곱하기의 핵 보유의 주요 블록을 우회 하는 우리의 시스템에 레 브의 overexpression 접합 및 unspliced mRNAs latently 감염 된 T 세포17 에 LRAs 전사 및 접합을 유도 하는 어떻게 이해에 집중 관찰 따라서 바이러스 재 활성화입니다. 또한, 우리의 시스템에 필요한 3 플라스 미드의 transfection는 우리 선택 HEK293T 세포 때문에이 세포의 높은 transfection 효율. T 세포는 암 세포 라인에 비해 세포 요소의 다른 시간적 및 공간 가용성 때문에, 접합 기자 HEK293T T-셀 라인 좋은 제공할 수 있는 1 차 셀 셀에 취득의 결과 확인 하는 것이 중요 하다 때문에 그들의 제한 된 transfectability 기술 과제입니다. 따라서, transfection는 현 탁 액 셀 (예를 들어, Jurkat)의 transfection 위해 특히 효과적 이기 위하여 보였다, DMRIE C 등 또는 네온 등 Amaxa nucleofector nucleofection 방법에 대 한 대체 DNA 배달 시 약의 사용 transfection 어려운 transfect 세포 주 CD4 + T 세포를 포함 하 여 단일 또는 여러 개의 플라스 미드의 효율적이 고 안정적인 납품을 촉진 하기 위하여 입증 된 시스템. 또는, 그것은 상기 transfection 방법을 사용 하 여 대기 시간의 1 차 셀 모델에 전체 바이러스의 맥락에서이 기자 시스템 테스트 흥미로울 것입니다. 사실, 호스트 전사, 신장 및 rCD4 + T 세포에서 접합의 가용성에 차이 영향을 하는 잠재 provirus 활성화 하는 아이라의 용량 수 있습니다. 마지막으로, 우리의 모델은 아이라 전사 및 방관자 세포의 접합에 영향을 미칠 수 있습니다 그리고 그것은 복제 유능한 바이러스를 일으킬 수 있다 주소 하지 않습니다. 그러나, 우리는 셀 관련 HIV 미국와 MS RNA의 증가 측정 하 여이 문화 상쾌한에 복제 유능한 바이러스의 생산으로 이어질 것 용의자 것 이다. 이 황금 표준 양적 바이러스 파생물 시험 (QVOA)33을 실시 하 여 확인 될 수 없었다.
특성상 복잡 한 대기 시간 및 효율적인 바이러스 재 활성화 되도록, 다각적인 조합 전략 필요34수 있습니다. 잠재적인 치료 필요 및 접합, 전사를 포함 하 여 여러 경로 자극 하는 이전 대기16,,3536, 의 설립에 필수적인 역할을 보여줘 왔다 37. 접합 기자 우리의 LTR 구동 시키는데 모두 단계, 전사 및 접합, 최적의 대상 약물의 높은 처리량 검열 찾는 분자의 효율적으로 synergize 수 낮은 초래할 기회 증가 수준 및 따라서 각 약물의 독성 복용량.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품 프로젝트 그랜트 APP1129320 및 호주의 NHMRC에서 프로그램 그랜트 APP1052979에 의해 지원 되었다. 우리가이 작업의 성공적인 완료를 위한 필수 구문 및 통보를 제공 하기 위한 박사 아담 틀리는, 박사 마리나 알렉산더, 박사 제니 L. 앤더슨과 미셸 Y.이 감사 합니다. 우리는 또한 그들의 조언과이 연구에 사용 된 교류 cytometer 유지에 관대 한 지원에 대 한 DMI 흐름 시설 직원을 감사 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| HEK293T cells (Human Embryonic Kidney cells) | ATCC | CRL-3216 | Replicates vectors carrying the SV40 region of replication. |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I) | Gibco | 10569-010 | + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Sodium Pyruvate |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 10099-141 | Origin Australia |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4458 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| Trypan blue Stain, 0.4% | Gibco | 15250 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Lipid transfection reagent |
| Opti-MEM I (1x) reduced serum medium | Gibco | 31985-070 | Serum free medium |
| NucleoBond Xtra Maxi | Marcherey-Nagel | 740414.50 | |
| pEGFP-N1 plasmid | Clontech (TaKaRa) | 6085-1 | Expression of EGFP in mammalian cells, CMVIE promoter. |
| pDsRed-Express-N1 | Clontech (TaKaRa) | 632429 | Expression of DsRed-Express in mammalian cells, CMVIE promoter. |
| pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRed | Addgene | 115775 | |
| pCMV-RevNL4.3 | Addgene | 115776 | |
| pCMV-Tat101AD8-Flag | Addgene | 115777 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore | 67-68-5 | |
| JQ1(+) | Cayman Chemical | 11187 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM |
| JQ1(-) | Cayman Chemical | 11232 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM |
| Phorbol Myristate Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 16561-29-8 | Stock at 100 μg/mL in DMSO; working concentration 10 nM |
| Phytohaemagglutinin (PHA) | Remel | HA15/R30852701 | Stock at 1 μg/μL in PBS; working concentration 10 μg/mL |
| Vorinostat (VOR) | Cayman Chemical | 10009929 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 0.5 μM |
| Panobinostat (PAN) | TRC | P180500 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 30 nM |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | 63581 | |
| Venor GeM Classic | Minerva Biolabs | 11-1100 | Mycoplasma Detection Kit, PCR-based |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow cytometry reagents | |||
| LSR Fortessa | BD Biosciences | Flow cytometer (4 lasers-blue, red, violet and yellow) | |
| LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer (3 lasers-blue, red and violet) | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | L34976 | Viability dye: for 633 or 635 nm excitation, 400 assays. Component A and B are both provided in the kit. |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| EDTA 0.5M pH8 | Gibco | 15575-038 | |
| Formaldehyde Solution 37/10 (37%) | Chem-Supply | FA010 | |
| BD FACS Diva CS&T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Calibration beads |
| Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks) | BD Biosciences | 559123 | 3.0 - 3.4 mm |
| Sheath solution | Chem-Supply | SA046 | 90 g NaCl in 10 L water |
| HAZ-Tabs | Guest Medical | H8801 | Chlorine release tablets for disinfection |
| Decon 90 | Decon Laboratories Limited | N/A | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution Decon 90 5%. |
| Sodium Hypochlorite (12-13% Solution) | Labco | SODHYPO-5L | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution bleach 1%. |
| 7x | MPBio | IM76670 | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution 7x 1%. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Tissue culture flasks (75 cm2, canted neck, cap vented) | Corning | 430641U | |
| Tissue culture plates (96 well flat bottom with lid) | Costar | 3599 | |
| Tissue culture plates (96 well V-bottom without lid) | Costar | 3896 | |
| Centrifuge tubes (10 mL) | SARSTEDT | 62.9924.284 | 100x16 mm |
| Centrifuge tubes (50 mL) | CellStar | 227261 | 30x115 mm |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Corning Axygen | MCT-150-C | |
| Serological Pipette (25 mL), sterile | Corning | CLS4489-200EA | |
| Serological Pipette (10 mL), sterile | Corning | CLS4488-200EA | |
| Serological Pipette (5 mL), sterile | Corning | CLS4487-200EA | |
| Reagent reservoirs (50 mL), sterile | Corning | CLS4470-200EA | |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, with cell-strainer cap | Corning | 352235 | 12 x 75 mm style, 70 mm |
| Nylon Mesh | SEFAR | 03-100/32 | 100 mm |
| Titertube Micro test tubes, bulk | BIO-RAD | 2239391 | microfacs tubes |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, without cap | Corning | 352008 | 12x75 mm style |
| Snap Caps for 12x75 mm Test Tubes | Corning | 352032 | |
| Counting chamber, Neubauer improved double net ruling, bright-line (Haemocytometer, LO-Laboroptik) | ProSciTech | SVZ4NIOU | 3x3 large squares of 1 mm2; Depth 0.100 mm; volume 0.1 mL; area minimum 0.0025 mm2 |
| Coverslips (Menzel-Gläser) | Grale Scientific | HCS2026 | 20 x 26 mm |
| Microscope | Nikon TMS | 310528 | |
| Centrifuge 5810R refrigerated | Eppendorf | 5811000487 | with rotor A-4-81 including adapters for 15/50 mL conical tubes |
| FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech | N/A | Plate reader for cell proliferation assay. Filter 490 nm. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| FACS Diva | BD Biosciences | Flow cytometer data acquisition and analysis program, version 8.0.1 | |
| FlowJo | FlowJo | FlowJo 10.4.2 | Flow cytometer data analysis program, FlowJo Engine v3.05481 |
| Omega | BMG Labtech | FLUOstar multi-user reader control, version 5.11 | |
| Omega - Data Analysis | BMG Labtech | MARS | FLUOstar data analysis, version 3.20R2 |
| Microsoft Excel | Microsoft | Excel:mac 2011 | version 14.0.0 |
| Prism | GraphPad | Prism 7 | version 7.0c |
References
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