Analyse av kombinasjon miRNA behandlinger for å regulere cellen syklus og angiogenese
Summary
miRNA therapeutics har betydelig potensial i å regulere kreft progresjon. Demonstrert her brukes analytiske metoder for identifikasjon av aktiviteten til en kombinasjon miRNA behandling stanse cellen syklus og angiogenese.
Abstract
Lungekreft (Langbane) er den ledende årsaken til kreft-relaterte dødsfall over hele verden. Lik andre kreftceller, grunnleggende karakteristisk for LC celler er uregulert spredning og celledeling. Hemming av spredning ved å stoppe celle syklus progresjon har vist seg å være en lovende tilnærming til kreftbehandling, inkludert LC.
miRNA therapeutics har dukket opp som viktige post-transcriptional gene regulatorer og stadig blir undersøkt for bruk i kreftbehandling. I siste arbeid benyttet vi to miRNAs, miR-143 og miR-506, å regulere celle syklus progresjon. A549 ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) cellene var transfekterte gene expression endringer ble analysert og apoptotisk aktivitet på grunn av behandlingen var endelig analysert. Downregulation av cyclin-avhengige kinaser (CDKs) ble oppdaget (dvs. CDK1, CDK4 og CDK6), og celle syklus stoppet på G1/S og G2/M fase overgangene. Sti analyse indikerte potensielle antiangiogenic aktivitet av behandlingen, som endows tilnærming med mangefasettert aktivitet. Her beskrives er metodikkene som brukes til å identifisere miRNA aktivitet om cellen syklus hemming, induksjon av apoptose, og effekten av behandling på endotelceller ved hemming av angiogenese. Håpet er at metodene presenteres her vil støtte fremtidig forskning på miRNA legemiddelselskap og tilsvarende aktivitet og at datatypen representant vil lede andre forskere under eksperimentelle analyser.
Introduction
Cellen syklusen er en kombinasjon av flere regulatoriske hendelser som tillater duplisering av DNA og celle spredning gjennom mitotisk prosessen1. Cyclin-avhengige kinaser (CDKs) regulere og fremme cellen syklus2. Blant dem har mitotisk CDK (CDK1) og interphase CDKs (CDK2, CDK4 og CDK6) en avgjørende rolle i cellen syklus progresjon3. Retinoblastoma protein (Rb) er fosforylert av den CDK4/CDK6 kompleks at cellen syklus progresjon4, og CDK1 aktivisering er avgjørende for vellykket celledeling5. Mange CDK-hemmere er utviklet og evaluert i kliniske studier de siste tiårene, indikerer potensialet for målretting CDKs i kreftbehandling. Faktisk tre CDK-hemmere er godkjent for behandling av brystkreft nylig6,7,8,9,10. Dermed CDKs, og spesielt CDK1 og CDK4/6, er av stor interesse i å regulere kreft cellen progresjon.
miRNAs (miRs) er små, ikke-koding RNAs og post-transcriptional regulatorer av genuttrykk, regulere ca 30% av alle menneskelige gener11. Deres virksomhet er basert på translasjonsforskning undertrykkelse eller degradering av messenger RNAs (mRNAs)12. Illustrerende for deres biologisk betydning, mer enn 5000 miRNAs har blitt identifisert og et enkelt miRNA molekyl kan regulere flere gener11,13. Enda viktigere, er miRNA uttrykk tilknyttet ulike sykdommer og sykdom statuser, inkludert kreft13. Faktisk, miRNAs har vært preget som kreftfremkallende eller svulst suppressors, å være i stand til å fremme eller undertrykke tumor utvikling og progresjon14,15. Relativ uttrykk for miRNAs i sykt vev kan regulere sykdomsprogresjon; Dermed har eksogene levering av miRNAs terapeutiske potensial.
Lungekreft er den ledende årsaken til kreft dødsfall og større enn 60% av alle lunge malignancies er ikke liten celle lunge kreft16,17, med en 5-års overlevelse på mindre enn 20%18. Bruk av miR-143-3 p og miR-506-3 p ble nylig evaluert for målretting cellen sykluser hos lunge kreft celler11. miR-143 og miR-506 har sekvenser som komplementaritet CDK1 og CDK4/CDK6, og effekten av disse to miRs på A549 celler ble analysert. Eksperimentell detaljene er presentert og diskutert i denne artikkelen. Genuttrykk og celle syklus progresjon apoptose ble vurdert ved hjelp av forskjellige eksperimentell design og timepoints etter hva. Vi brukte sanntid kvantitative PCR (RT-qPCR) metoder med microarray analyse måle bestemt genekspresjon, og neste generasjons RNA sekvensering ble brukt til å bestemme globale genet feilregulering11. Sistnevnte identifiserer den relative overfloden av hver genet utskrift med høy følsomhet og reproduserbarhet, mens tusenvis av gener kan analyseres fra en enkelt eksperimentanalyse. I tillegg apoptotisk analyse på grunn av miRNA behandling ble utført og er beskrevet her. Bioinformatikk supplert sti analyse. Presenteres her brukes protokoller til analyse av den terapeutiske potensialet i kombinasjon miR-143 og miR-506.
Hovedformålet med denne protokollen er å identifisere effekten av miRNAs i celler, med fokus på cellen syklus. Ulike teknikker presenteres her spenn fra gene expression analyse før oversettelse (med qPCR) utdype og romanen teknikker for genet analyse på protein nivå, som microarray analyse. Håpet er at denne rapporten er nyttig for forskere interessert i å jobbe med miRNAs. I tillegg vises metodikk for flyt cytometric analyse av cellen syklus og apoptose celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
miRNAs kan fungere som målrettet terapi for kreftbehandling, erkjenner feilregulering av uttrykk i syke vs normalt vev. Denne studien som skulle avgjøre miRNAs som potensielt stoppe celle syklus progresjon i flere etapper. Det ble identifisert som miR-143 og miR-506 stoppe cellen syklus av kreftceller og presentert protokollene å forstå aktiviteten til denne kombinasjon miRNA behandlingen.
De beskrevne metodikkene gir en overordnet forståelse på funksjon av miRNAs. Utfordringene med å s…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ingen konflikter av interesse er deklarert.
Materials
| -80 °C Freezer | VWR | VWR40086A | |
| 96 well plate | CELLTREAT Scientific | 50-607-511 | |
| 96-well Microwell Plates | Thermo Scientific | 12-556-008 | |
| A549 Non Small Cell Lung Cancer Cells | ATCC | ATCC CCL-185 | |
| Agarose | VWR | 0710-25G | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938c | |
| Ambion Silencer Negative Control No. 1 siRNA | Ambion | AM4611 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| Antibody Array Assay Kit, 2 Reactions | Full Moon Bio | KAS02 | |
| Bright field microscope | Microscoptics | IV-900 | |
| Bright field microscope | New Star Environment LLC | ||
| Cell Cycle Antibody Array, 2 Slides | Full Moon Bio | ACC058 | |
| Cell Logic+ Biosafety Cabinate | Labconco | 342391100 | |
| Cellquest Pro | BD bioscience | Steps 5.14; 6.13: Used for calculating the population distrubution according to the cell cycle phase and for calculating the population distribution for the analysis of apoptosis | |
| CFX96 Real Time System | BioRad | CFX96 Optics Module | |
| Chemidoc Touch Imaging System | BioRad | Chemidoc Touch Imaging System | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | HERAcell 150i | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Trevigen | 3433-010-01 | |
| Digital Camera | AmScope | FMA050 | |
| DMEM 4.5 g/L Glucose, w/out Sodium Pyruvate, w/ L-Glutamine | VWR | VWRL0100-0500 | |
| DNAse I | Zymo Research | E1010 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | BD Biosciences | 356006 | |
| Eppendorf Pipette Pick-A-Pack Sets | Eppendrof | 05-403-152 | |
| Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, | Fisher BioReagents | BP2818500 | |
| Ethidium bromide | Alfa acar | L07462 | |
| F-12K Nutrient Mixture (Kaighn's Mod.) with L-glutamine, Corning | Corning | 45000-354 | |
| FACS Calibur Flowcytometer | Becton Dickinson | ||
| Fetal Bovine Serum – Premium | Antlanta Biologicals | S11150 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 10438026 | |
| Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes with Standard Snap Caps | Fisherbrand Basix | 02-682-002 | |
| Forma Series II water Jacket CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| Heparin Solution (5000 U/mL) | Hospira | NDC#63739-920-11 | |
| Horixontal Electrophoresis system | Benchtop lab system | BT102 | |
| hsa-miR-143-3p miRNA Mimic | ABM | MCH01315 | |
| hsa-miR-506-3p miRNA Mimic | ABM | MCH02824 | |
| Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) | Thermo Scientific | PHC9394 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Individual donors | IRB# A15-3891 | |
| HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | SH30256FS | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | Results: Used for bioinformatics pathway analysis | |
| Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen | 10-977-015 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11-668-027 | |
| Loading dye 10X | ward's science+ | 470024-814 | |
| Medium M199 (with Earle′s salts, L-glutamine and sodium bicarbonate) | Sigma Aldrich | M4530 | |
| Microscope Digital Camera | AmScope | MU130 | |
| Modfit LT | Verity Software | Step 5.15: Alternative software for analysis of cell cycle population distributions | |
| Nanodrop | Thermo Scientific | NanoDrop one C | |
| Opti-MEM | Gibco by life technologies | 31985-070 | |
| Penicillin-streptomycin 10/10 | Antlanta Biologicals | B21210 | |
| Power UP sybr green master mix | Applied Biosystems | A25780 | |
| Propidium Iodide | MP Biochemicals LLC | IC19545825 | |
| Proscanarray HT Microarray scanner | Perkin elmer | ASCNPHRG. We used excitation laser wavelength at 543 nm. | |
| q PCR optical adhesive cover | Applied Biosystems | 4360954 | |
| Quick-RNA Kits | Zymo Research | R1055 | |
| Ribonuclease A from Bovine pancreas | Sigma | R6513-50MG | |
| ScanArray Express | PerkinElmer | Step 7.33: Microarray analysis software | |
| Shaker | Thermo Scientific | 2314 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | ||
| SpectraTube Centrifuge Tubes 15ml | VWR | 470224-998 | |
| SpectraTube Centrifuge Tubes 50ml | VWR | 470225-004 | |
| TBS Buffer, 20x liquid | VWR | 10791-796 | |
| Temperature controlled centrifuge matchine | Thermo Scientific | ST16R | |
| Temperature controlled micro centrifuge matchine | Eppendrof | 5415R | |
| Thermo Scientific BioLite Cell Culture Treated Flasks | Thermo Scientific | 12-556-009 | |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Thermo Scientific | PI23225 | |
| Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Thermo Scientific | PI89900 | |
| Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted Plates | Thermo Scientific | AB0800WL | |
| Thermo Scientific Verso cDNA synthesis Kit (100 runs) | Thermo Scientific | AB1453B | |
| Ultra Low Range DNA Ladder | Invitrogen | 10597012 | |
| VWR standard solid door laboratory refrigerator | VWR |
Referenzen
- Schafer, K. A. The cell cycle: a review. Veternary Pathology. 35 (6), 461-478 (1998).
- Barnum, K. J., O’Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
- Malumbres, M., Barbacid, M. Cell cycle, CDKs and cancer: a changing paradigm. Nature Reviews Cancer. 9 (3), 153-166 (2009).
- Chen, Z., et al. Multiple CDK inhibitor dinaciclib suppresses neuroblastoma growth via inhibiting CDK2 and CDK9 activity. Science Repository. 6, 29090 (2016).
- Brown, N. R., et al. CDK1 structures reveal conserved and unique features of the essential cell cycle CDK. Nature Communications. 6, 6769 (2015).
- Sanchez-Martinez, C., Gelbert, L. M., Lallena, M. J., de Dios, A. Cyclin dependent kinase (CDK) inhibitors as anticancer drugs. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (17), 3420-3435 (2015).
- Shah, A., et al. FDA Approval: Ribociclib for the Treatment of Postmenopausal Women with Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Advanced or Metastatic Breast Cancer. Clinical Cancer Research. , (2018).
- Asghar, U., Witkiewicz, A. K., Turner, N. C., Knudsen, E. S. The history and future of targeting cyclin-dependent kinases in cancer therapy. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (2), 130-146 (2015).
- Mullard, A. FDA approves Novartis’s CDK4/6 inhibitor. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (4), 229 (2017).
- Walker, A. J., et al. FDA Approval of Palbociclib in Combination with Fulvestrant for the Treatment of Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Metastatic Breast Cancer. Clinical Cancer Research. 22 (20), 4968-4972 (2016).
- Hossian, A., Sajib, M. S., Tullar, P. E., Mikelis, C. M., Mattheolabakis, G. Multipronged activity of combinatorial miR-143 and miR-506 inhibits Lung Cancer cell cycle progression and angiogenesis in vitro. Science Repository. 8 (1), 10495 (2018).
- Inamura, K., Ishikawa, Y. MicroRNA In Lung Cancer: Novel Biomarkers and Potential Tools for Treatment. Journal of Clinical Medicine. 5 (3), (2016).
- Mizuno, K., et al. The microRNA expression signature of small cell lung cancer: tumor suppressors of miR-27a-5p and miR-34b-3p and their targeted oncogenes. Journal of Human Genetics. 62 (7), 671-678 (2017).
- Zhang, B., Pan, X., Cobb, G. P., Anderson, T. A. microRNAs as oncogenes and tumor suppressors. Entwicklungsbiologie. 302 (1), 1-12 (2007).
- Peng, Y., Croce, C. M. The role of MicroRNAs in human cancer. Signal Transduction and Targeted Therapy. 1, 15004 (2016).
- Wang, X., et al. Prediction of recurrence in early stage non-small cell lung cancer using computer extracted nuclear features from digital H&E images. Science Repository. 7 (1), 13543 (2017).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. . Cancer Statistics, 2017. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
- Saxon, J. A., et al. p52 expression enhances lung cancer progression. Science Repository. 8 (1), 6078 (2018).
- Carpentier, G. Angiogenesis Analyzer for ImageJ. ImageJ User and Developer Conference. , (2012).
- Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
- Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25 (2010).
- DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (91), e51312 (2014).
- Kong, D. H., Kim, M. R., Jang, J. H., Na, H. J., Lee, S. A Review of Anti-Angiogenic Targets for Monoclonal Antibody Cancer Therapy. International Journal of Molecular Science. 18 (8), (2017).
- Wong, P. P., Bodrug, N., Hodivala-Dilke, K. M. Exploring Novel Methods for Modulating Tumor Blood Vessels in Cancer Treatment. Current Biology. 26 (21), R1161-R1166 (2016).
- Evan, G. I., Brown, L., Whyte, M., Harrington, E. Apoptosis and the cell cycle. Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 825-834 (1995).
- Haab, B. B., Dunham, M. J., Brown, P. O. Protein microarrays for highly parallel detection and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solutions. Genome Biology. 2 (2), RESEARCH0004 (2001).
- Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. Overview of protein microarrays. Currrent Protocols in Protein Science. 27, 21 (2013).
- St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Science Repository. 3, 1860 (2013).
