Methodenartikel

Übersetzen von Ribososomen-Affinitätsreinigung (TRAP) zur RNA-Isolierung von Endothelzellen In vivo

DOI:

10.3791/59624

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25. Mai 2019

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1Blood Research Institute, Blood Center of Wisconsin, 2Department of Medicine, Medical College of Wisconsin, 3Department of Surgery, The University of Alabama at Birmingham, 4Department of Biomedical Engineering, The University of Alabama at Birmingham, 5GBS Program, Graduate School, The University of Alabama at Birmingham

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir präsentieren einen Ansatz zur Reinigung ribossomengebundener mRNA aus vaskulären Endothelzellen (ECs) direkt im Gehirn, der Lunge und im Herzgewebe der Maus über das EC-spezifische genetische Tag des verbesserten grünen Fluoreszenzproteins (EGFP) in Ribosomen in Kombination mit RNA-Reinigung .

Zusammenfassung

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Viele Studien beschränkten sich auf die Verwendung von in vitro zellulären Assays und ganzen Geweben oder die Isolierung bestimmter Zelltypen von Tieren zur In-vitro-Analyse von Transkriptom und Genexpression durch qPCR- und RNA-Sequenzierung. Umfassende Transkriptom- und Genexpressionsanalyse spezifischer Zelltypen in komplexen Geweben und Organen wird entscheidend sein, um zelluläre und molekulare Mechanismen zu verstehen, durch die Gene reguliert werden, und ihre Assoziation mit Gewebehomöostase und Organ Funktionen. In diesem Artikel zeigen wir als Beispiel die Methodik zur Isolierung ribosomgebundener RNA direkt in vivo in der vaskulären Endothelie der Tierlunge. Die spezifischen Materialien und Verfahren für die Gewebeverarbeitung und RNA-Reinigung werden beschrieben, einschließlich der Bewertung der RNA-Qualität und -Ausbeute sowie der Echtzeit-qPCR für arteriogene Gen-Assays. Dieser Ansatz, der als Übersetzung der Ribosomen-Affinitätsreinigung (TRAP)-Technik bekannt ist, kann zur Charakterisierung der Genexpression und Transkriptomanalyse bestimmter Zelltypen direkt in vivo in jedem spezifischen Typ in komplexen Geweben verwendet werden.

Einleitung

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In komplexen Geweben wie Gehirn, Herz und Lunge erschweren die hohen Zellheterogenitätdien die Analyse von Genexpressionsdaten aus ganzen Gewebeproben. Um Genexpressionsprofile in einem bestimmten Zelltyp in vivo zu beobachten, wurde kürzlich eine neue Methodik entwickelt, die die Abfrage der gesamten übersetzten mRNA-Ergänzung eines genetisch definierten Zelltyps ermöglicht. Diese Methode wird als die übersetzende Ribosome Affinitätsreinigung (TRAP) Technik1,2bekannt. Es ist ein nützliches Werkzeug, um Endothelzellbiologie und Angiogenese in Kombination mit genetisch manipulierender anderer Angiogenese-assoziierter Gene bei Tieren zu untersuchen.

Wir haben gezeigt, dass angiogene PKD-1-Signalisierung und die Transkription des angiogenen Gens CD36 für die Endothelzelldifferenzierung (EC) und funktionelle Angiogenese3,4,5,6entscheidend sind. Um molekulare Mechanismen der angiogenen und metabolischen Signalisierung in der Gentranskription und der EG-Transdifferenzierung zu bestimmen, haben wir gentechnisch veränderte TRAP-Mäuse mit speziell gelöschten angiogenen Genen auf der Grundlage der TRAP-Technik1 erstellt. , 2. Darüber hinaus haben sie bei unseren TRAP-Tieren nicht nur pkd-1- oder cd36-Genmangel in der vaskulären Endothelie oder die globale Deletion des cd36-Gens, sondern ein verbessertes grünes Fluoreszenzprotein (EGFP) ist auch genetisch auf Die übersetzenden Ribosomen der EG. TRAP ermöglicht die Affinitätsreinigung von ribosomgebundener mRNA direkt aus der vaskulären Endothelie von Zielgeweben, was die Analyse der Genexpression und die Identifizierung neuer Transkriptome ermöglicht, die mit der EG-Differenzierung und Angiogenese direkt unter in vivo-Bedingungen. Wir haben bei diesen gentechnisch veränderten Tieren erfolgreich ribosomgebundene RNA aus der Endothelie isoliert. Die gereinigte RNA kann zur weiteren Charakterisierung angiogener oder arteriogener Gene bei der Regulation von EG-Differenzierung und -Funktionen verwendet werden. Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Implementierung des TRAP-Ansatzes zur Isolierung von mRNA in ECs direkt in vivo.

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Protokoll

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Für Tierversuche wurden alle hier beschriebenen Methoden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Medical College of Wisconsin genehmigt.

1. Reagenzien vorbereiten

  1. Bereiten Sie Lysepuffer auf Konzentrationen von 10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 100 mg/ml Cycloheximid, Proteaseinhibitoren und rekombinanten RNase-Inhibitoren auf Konzentrationen wie unten beschrieben vor.
    1. Folgende Reagenzien zu 500 ml RNase-freiem deionisiertem Wasser hinzufügen: 1,19 g HEPES, 5,59 g KCl, 0,24 g MgCl2, 35 mg DTT, 0,5 ml Cycloheximid und NaOH nach Bedarf bis pH 7,4, EDTA-freie Proteaseinhibitoren (eine Minitablette pro 10 ml) und RNase-Hemmer (1 0 l/ml).
    2. Bis zu 1 Monat in einem 4 °C-Kühlschrank aufbewahren.
  2. Bereiten Sie einen hochsalzigen Polysomen-Waschpuffer auf Konzentrationen von 10 mM HEPES, pH 7,4, 350 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1% vol/vol CA-630, 0,5 mM DTT und 100 mg/ml Cycloheximid vor.
    1. Folgende Reagenzien zu 500 ml RNase-freiem deionisiertem Wasser hinzufügen: 1,19 g HEPES, 13,05 g KCl, 0,24 g MgCl2, 5 ml nichtionisches, nicht denatierendes Reinigungsmittel, 5 von 7,7 mg DTT-Röhrchen und 0,5 ml Cycloheximid und NaOH bei Bedarf bis pH 7,4.
    2. In 4 °C Kühlschrank für bis zu 1 Monat aufbewahren.
  3. Binden Sie Anti-GFP-Antikörper an Protein G magnetische Perlen vor Beginn des Experiments.
    1. Fügen Sie 10 mg Anti-GFP-Antikörper in 200 ml PBS zu Protein G Perlen verdünnt.
    2. Mit End-over-End-Rotation 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
    3. Legen Sie die Perlen auf ein magnetisches Rack und entfernen Sie den Überstand.
    4. Die Perlen in 200 ml PBS aufhängen und bis zu 1 Woche im 4 °C-Kühlschrank aufbewahren.
  4. Eiskalte PBS mit 100 mg/ml Cycloheximid vorbereiten.
    1. Fügen Sie 1 Volumen Cycloheximidlösung (100 mg/ml) zu 99 Volumen eiskaltem PBS hinzu.

2. Isolieren und lysieren gewünschte Gewebe

  1. Euthanisieren Sie Mäuse durch IP-Injektion von Ketamin (500 mg/kg/Körpergewicht) und Xylazin (10 mg/kg/Körpergewicht) und isolieren Sie gewünschte Gewebe (z. B. Herz, Lunge). Fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort.
  2. Gewünschte Gewebe in 500 ml eiskaltes PBS mit 100 mg/ml Cycloheximid geben.
  3. Hackgewebe in eine Zellsuspension mit einem motorgetriebenen Homogenisator oder einem Kleinglashomogenisator. Wenn Sie einen motorisch angetriebenen Homogenisator verwenden, begrenzen Sie die Homogenisierung bei niedriger Frequenz (<15.000 Hz) auf weniger als 1 Minute, um eine RNA-Denaturierung zu vermeiden.
  4. Zellpellet in 200 ml Lysepuffer durch Pipettieren und Neuziehen des Puffers mehrmals aussetzen. Zellsuspension mit 10 Hubs in einem Kleinglashomogenisator oder 15 Sekunden bei niederfrequentem (<15.000 Hz) in einem motorgetriebenen Homogenisator weiter homogenisieren.
  5. Zentrifugen homogenisieren für 10 min bei 2.000 x g bei 4 °C zu Pelletkernen und großen Zellablagerungen und halten den Überstand.
  6. Fügen Sie dem Überstand ein nicht-denaturierendes Reinigungsmittel zu 1% vol/vol und DHPC bis 30 mM hinzu. 5 min auf Eis bebrüten.
  7. Zentrifugenlysat für 10 min bei 16.000 x g zu Pellet unlöslichem Material. Übertragen und halten Sie 15% des klaren Lysats als Input für zukünftige Schritte.

3. Ribosom/mRNA-Komplexe isolieren

  1. Fügen Sie 50 ml antikörpergebundene Perlen zu zelllysaten überstand und inkubieren Mischung bei 4 °C mit End-over-End-Rotation für 30 min. Hier binden die Anti-GFP-Antikörper die GFP-markierten Ribosomen, so dass wir die RNA weiter von diesen Ribosomen isolieren können.
  2. Sammeln Sie Perlen auf einem magnetischen Rack und waschen Sie 5 Mal mit Hochsalz-Polysomen-Waschpuffer.
    1. Nach dem Sammeln von Perlen an der Seite des Rohres flüssigkeitsauf- und entsorgen. Dann Pipette und ziehen Sie 200 ml Hochsalz-Polysomen-Waschpuffer mehrmals neu. Wiederholen Sie diesen Schritt 5 Mal, und verwerfen Sie den gesamten Puffer nach der letzten Wiederholung. Fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort.

4. isolieren mRNA

  1. Legen Sie Perlen in den RLT-Puffer. Die folgenden Schritte werden direkt aus dem RNeasy Mini Kit Protokoll ausgeführt und in keiner Weise erweitert.
    VORSICHT: RLT-Puffer enthält Guanidinsalze; NICHT mit Bleichmittel mischen.
  2. Zentrifugenlysat für 3 min bei voller Geschwindigkeit 13.000 U/min oder 16.000 g bei 4 °C. Entfernen Sie vorsichtig Überstand von 350 ml durch Pipettieren und übertragen Sie es auf ein neues Mikrofugenrohr. Verwenden Sie nur diesen Überstand (Lysat) in den nachfolgenden Schritten.
  3. Fügen Sie ein gleiches Volumen von 70% Ethanol in das Mikrofugenrohr.
  4. Übertragen Sie bis zu 700 ml der Probe, einschließlich aller möglicherweise gebildeten Ausfällungsmittel, in eine Spinsäule, die in einem 2 ml Sammelrohr platziert ist. Schließen Sie den Deckel vorsichtig und Zentrifugen für 15 s bei 8.000 x g, um die Spinsäulenmembran zu waschen. Entsorgen Sie den Durchfluss.
  5. Fügen Sie der Spinspalte 350 ml Puffer RW1 hinzu. Schließen Sie den Deckel vorsichtig und Zentrifugen für 15 s bei 8.000 x g, um die Spinsäulenmembran zu waschen. Verwerfen Sie den Durchfluss und verwenden Sie das Sammelrohr im nächsten Schritt wieder.
    VORSICHT: Puffer RW1 enthält Guanidinsalze; NICHT mit Bleichmittel mischen.
  6. Fügen Sie der Spinspalte 350 ml Puffer RW1 hinzu. Schließen Sie den Deckel vorsichtig und Zentrifugen für 15 s bei 8.000 x g. Entsorgen Sie den Durchfluss.
  7. Fügen Sie der Spin-Spalte 500 ml Puffer-RPE hinzu. Schließen Sie den Deckel vorsichtig und Zentrifugen für 15 s bei 8.000 x g, um die Spinsäulenmembran zu waschen. Entsorgen Sie den Durchfluss.
  8. Fügen Sie der Spin-Spalte 500 ml Puffer-RPE hinzu. Schließen Sie den Deckel vorsichtig und zentrieren Sie 2 min bei 8.000 x g, um die Spinsäulenmembran zu waschen. Entfernen Sie dann vorsichtig die Spin-Spalte aus dem Sammelrohr, um sicherzustellen, dass die Spalte nicht mit dem Durchfluss in Berührungkommt.
  9. Legen Sie die Spin-Säule in ein neues 2 ml-Sammelrohr und entsorgen Sie das alte Rohr mit dem Durchfluss. Schließen Sie den Deckel vorsichtig und Zentrifugen mit voller Geschwindigkeit für 1 min, um Restpuffer zu entfernen.
  10. Platzieren Sie die Spin-Spalte in einem neuen 1,5 ml-Sammelrohr. Fügen Sie 30-50 ml RNase-freies Wasser direkt in die Spinsäulenmembran ein. Schließen Sie den Deckel vorsichtig und zentrieren Sie 1 min bei 8.000 x g, um die RNA zu vereiteln.
  11. Wenn die erwartete RNA-Ausbeute >30 mg beträgt, wiederholen Sie Schritt 4.10 mit weiteren 30-50 ml RNase-freiem Wasser oder verwenden Sie Elute aus Schritt 4.10 (wenn eine hohe [RNA] erforderlich ist). Sammelrohr aus Schritt 4.10 wiederverwenden.
  12. Verwenden Sie gereinigte RNA für die nachgeschaltete Analyse einschließlich RNA-Sequenzierung oder quantitative randquantitative rquantitative PCR in Echtzeit oder speichern Sie RNA, die in RNase-freiemH2O bei -80 °C für bis zu 1 Jahr gelöst ist.

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Ergebnisse

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Unsere früheren Studien4,7 deuten darauf hin, dass CD36 als Schalter für arteriolar Differenzierung und Kapillararterienarterienbildung über den LPA/PKD-1 Signalweg fungieren kann. Um zu untersuchen, ob die Signalachse LPA/PKD-1-CD36 für die Arteriogenese in vivo wesentlich ist, haben wir die neuartigen TRAP-Linien etabliert, die nicht nur einen globalen cd36-Mangel oder einen endothelialen-spezifischen-cd36- oder pkd-1-Mangel haben, sondern auch eine selektive I...

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Diskussion

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Die Angiogenese ist ein komplexer mehrstufiger Prozess, bei dem DIE EC-spezifische angiogene Gentranskription und -expression eine wesentliche Rolle bei der EG-Differenzierung und angiogenen Reprogrammierung3,4spielen. Um die Barrieren aus der zellulären Vielfalt und architektonischen Komplexität zu überwinden, um die Funktion des Säugetiergefäßsystems auf molekularer Ebene in vivo besser zu verstehen, haben wir EC-spezifische TRAP-Mäuse geschaffen, begleitet von...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.

Danksagungen

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Dr. Rens Arbeit wird von der American Heart Association (13SDG14800019; BR), der Ann es Hope Foundation (FP00011709; BR), die American Cancer Society (86-004-26; das MCW Cancer Center to BR) und das National Institute of Health (HL136423; BR); Jordan Palmer wird vom MCW CTSI 500 Stars Internship Program 2018 unterstützt; P. Moran wird von einem Institutional Research Training Grant von NHLBI (5T35 HL072483-34) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2100 Elektrophorese-Bioanalysator mit Nanochips und PicochipsAgilentG2939AA, 5067-1511 & 5067-1513
ZellschaberSarstedt83.1832
HomogenisatorenFisher ScientificK8855100020
Magnet (Dynamag-2)Invitrogen123-21DHängt vom Reinigungsmaßstab ab; Proben in 1,5-ml-Röhrchen können konzentriert werden eine DynaMag-2
MinizentrifugeFisher Scientific05-090-100
NanoDrop 2000C SpektralphotometerThermo ScientificND-2000C
KühlzentrifugeEppendorf5430Rmit Rotor für 1,5-mL Mikrozentrifugenröhrchen
RNasefreie 1,5 mL MikrozentrifugenröhrchenApplied Biosystems 
Rnasefreie konische 50-ml-RöhrchenApplied Biosystems 
RNase-frei 1000-μ l FilterspitzenRaininRT-1000F
RNasefrei 200-μ l FilterspitzenRainin RT-200F
RNase-frei 20-μ l FilterspitzenRainin RT-20F
Rotor für HomogenisatorenYamato LT-400D
Rohrrotator, Labquake MarkeThermo Fisher13-687-12Q
AM12450AM12501

Referenzen

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  1. Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).
  2. Zhou, P., et al. Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).
  3. Best, B., Moran, P., Ren, B. VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan. Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).
  4. Ren, B., et al. LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming. Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).
  5. Ren, B. Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37(2016).
  6. Ren, B. FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis? Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).
  7. Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model. Nucleic Acids Research. 42, e14(2014).
  8. Dong, L., et al. Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling. Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).
  9. Ren, B., et al. ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).
  10. Skuli, N., et al. Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes. Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).

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Schlagwörter

Isolierung von Endothelzell RNAIn vivo TranskriptomanalyseTRAP TechnikAufreinigung ribosomengebundener RNAGFP markierte Ribosomenmotorgetriebener HomogenisatorAnti GFP Antik rper BeadsRNA Qualit tsbeurteilungReal Time qPCR

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