Wir präsentieren einen Ansatz zur Reinigung ribossomengebundener mRNA aus vaskulären Endothelzellen (ECs) direkt im Gehirn, der Lunge und im Herzgewebe der Maus über das EC-spezifische genetische Tag des verbesserten grünen Fluoreszenzproteins (EGFP) in Ribosomen in Kombination mit RNA-Reinigung .
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Methodenartikel
Übersetzen von Ribososomen-Affinitätsreinigung (TRAP) zur RNA-Isolierung von Endothelzellen In vivo
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Viele Studien beschränkten sich auf die Verwendung von in vitro zellulären Assays und ganzen Geweben oder die Isolierung bestimmter Zelltypen von Tieren zur In-vitro-Analyse von Transkriptom und Genexpression durch qPCR- und RNA-Sequenzierung. Umfassende Transkriptom- und Genexpressionsanalyse spezifischer Zelltypen in komplexen Geweben und Organen wird entscheidend sein, um zelluläre und molekulare Mechanismen zu verstehen, durch die Gene reguliert werden, und ihre Assoziation mit Gewebehomöostase und Organ Funktionen. In diesem Artikel zeigen wir als Beispiel die Methodik zur Isolierung ribosomgebundener RNA direkt in vivo in der vaskulären Endothelie der Tierlunge. Die spezifischen Materialien und Verfahren für die Gewebeverarbeitung und RNA-Reinigung werden beschrieben, einschließlich der Bewertung der RNA-Qualität und -Ausbeute sowie der Echtzeit-qPCR für arteriogene Gen-Assays. Dieser Ansatz, der als Übersetzung der Ribosomen-Affinitätsreinigung (TRAP)-Technik bekannt ist, kann zur Charakterisierung der Genexpression und Transkriptomanalyse bestimmter Zelltypen direkt in vivo in jedem spezifischen Typ in komplexen Geweben verwendet werden.
Einleitung
In komplexen Geweben wie Gehirn, Herz und Lunge erschweren die hohen Zellheterogenitätdien die Analyse von Genexpressionsdaten aus ganzen Gewebeproben. Um Genexpressionsprofile in einem bestimmten Zelltyp in vivo zu beobachten, wurde kürzlich eine neue Methodik entwickelt, die die Abfrage der gesamten übersetzten mRNA-Ergänzung eines genetisch definierten Zelltyps ermöglicht. Diese Methode wird als die übersetzende Ribosome Affinitätsreinigung (TRAP) Technik1,2bekannt. Es ist ein nützliches Werkzeug, um Endothelzellbiologie und Angiogenese in Kombination mit genetisch manipulierender anderer Angiogenese-assozi....
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Protokoll
Für Tierversuche wurden alle hier beschriebenen Methoden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Medical College of Wisconsin genehmigt.
1. Reagenzien vorbereiten
- Bereiten Sie Lysepuffer auf Konzentrationen von 10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 100 mg/ml Cycloheximid, Proteaseinhibitoren und rekombinanten RNase-Inhibitoren auf Konzentrationen wie unten beschrieben vor.
- Folgende Reagenzien zu 500 ml RNase-freiem deionisiertem Wasser hinzufügen: 1,19 g HEPES, 5,59 g KCl, 0,24 g MgCl2, 35 mg DTT, 0,5 ml Cycloheximid und NaOH nach Bedarf bis pH 7,4, EDTA-freie Proteasein....
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Ergebnisse
Unsere früheren Studien4,7 deuten darauf hin, dass CD36 als Schalter für arteriolar Differenzierung und Kapillararterienarterienbildung über den LPA/PKD-1 Signalweg fungieren kann. Um zu untersuchen, ob die Signalachse LPA/PKD-1-CD36 für die Arteriogenese in vivo wesentlich ist, haben wir die neuartigen TRAP-Linien etabliert, die nicht nur einen globalen cd36-Mangel oder einen endothelialen-spezifischen-cd36- oder pkd-1-Mangel haben, sondern auch eine selektive I.......
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Diskussion
Die Angiogenese ist ein komplexer mehrstufiger Prozess, bei dem DIE EC-spezifische angiogene Gentranskription und -expression eine wesentliche Rolle bei der EG-Differenzierung und angiogenen Reprogrammierung3,4spielen. Um die Barrieren aus der zellulären Vielfalt und architektonischen Komplexität zu überwinden, um die Funktion des Säugetiergefäßsystems auf molekularer Ebene in vivo besser zu verstehen, haben wir EC-spezifische TRAP-Mäuse geschaffen, begleitet von.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.
Danksagungen
Dr. Rens Arbeit wird von der American Heart Association (13SDG14800019; BR), der Ann es Hope Foundation (FP00011709; BR), die American Cancer Society (86-004-26; das MCW Cancer Center to BR) und das National Institute of Health (HL136423; BR); Jordan Palmer wird vom MCW CTSI 500 Stars Internship Program 2018 unterstützt; P. Moran wird von einem Institutional Research Training Grant von NHLBI (5T35 HL072483-34) unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 2100 Elektrophorese-Bioanalysator mit Nanochips und Picochips | Agilent | G2939AA, 5067-1511 & 5067-1513 | |
| Zellschaber | Sarstedt | 83.1832 | |
| Homogenisatoren | Fisher Scientific | K8855100020 | |
| Magnet (Dynamag-2) | Invitrogen | 123-21D | Hängt vom Reinigungsmaßstab ab; Proben in 1,5-ml-Röhrchen können konzentriert werden eine DynaMag-2 |
| Minizentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| NanoDrop 2000C Spektralphotometer | Thermo Scientific | ND-2000C | |
| Kühlzentrifuge | Eppendorf | 5430R | mit Rotor für 1,5-mL Mikrozentrifugenröhrchen |
| RNasefreie 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen | Applied Biosystems | ||
| Rnasefreie konische 50-ml-Röhrchen | Applied Biosystems | ||
| RNase-frei 1000-μ l Filterspitzen | Rainin | RT-1000F | |
| RNasefrei 200-μ l Filterspitzen | Rainin | RT-200F | |
| RNase-frei 20-μ l Filterspitzen | Rainin | RT-20F | |
| Rotor für Homogenisatoren | Yamato | LT-400D | |
| Rohrrotator, Labquake Marke | Thermo Fisher | 13-687-12Q |
Referenzen
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).
- Zhou, P., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
