Summary
نقدم نهجا ً لتنقية الرَّناة الرَّاقيزة المنوّجة الوعائية من الخلايا البطانية الوعائية (ECs) مباشرة في أنسجة الدماغ والرئة والقلب باستخدام الأنسجة الوراثية الخاصة بالجماعة الأوروبية للبروتين الفلوري الأخضر المعزز (EGFP) في ريبوسوسوم بالاشتراك مع تنقية الحمض النووي الريبي .
Abstract
وقد اقتصرت العديد من الدراسات على استخدام الاختبارات الخلوية في المختبر والأنسجة الكاملة أو عزل أنواع محددة من الخلايا عن الحيوانات لتحليل هامدة في المختبر للتعبير الجيني عن طريق تسلسل qPCR وRNA. تحليل شامل للنسخ والتعبير الجيني لأنواع محددة من الخلايا في الأنسجة والأعضاء المعقدة سيكون حاسما لفهم الآليات الخلوية والجزيئية التي يتم تنظيم الجينات وارتباطها مع التوازن الأنسجة والجهاز وظائف. في هذه المقالة، نقوم بتوضيح منهجية عزل الحمض النووي الريبي المرتبط مباشرة في الجسم الحي في بطانة الأوعية الدموية من الرئتين الحيوانية كمثال. وسيتم وصف المواد والإجراءات المحددة لمعالجة الأنسجة وتنقية الحمض النووي الريبي، بما في ذلك تقييم نوعية الحمض النووي الريبي والغلة، فضلا عن qPCR في الوقت الحقيقي لتجارب الجينات الشريانية. ويمكن استخدام هذا النهج، المعروف باسم ترجمة تقنية تنقية التقارب الريبوسوم (TRAP)، لتوصيف التعبير الجيني وتحليل النسخ لبعض أنواع الخلايا مباشرة في الجسم الحي في أي نوع محدد في الأنسجة المعقدة.
Introduction
في الأنسجة المعقدة مثل الدماغ الثدييات والقلب والرئة، والمستويات العالية من التباين الخلوي تعقيد تحليل بيانات التعبير الجيني المستمدة من عينات الأنسجة بأكملها. لمراقبة ملامح التعبير الجيني في نوع معين من الخلايا في الجسم الحي، تم تطوير منهجية جديدة مؤخرا، والتي تسمح باستجواب كامل mRNA المترجمة تكملة من أي نوع الخلية المعرفة وراثيا. وتعرف هذه المنهجية باسم ترجمة تنقية التقارب الريبوسم (TRAP) تقنية1،2. وهو أداة مفيدة لدراسة بيولوجيا الخلايا البطانية وتكوين الأوعية الدموية عند الجمع بين التلاعب وراثيا الجينات الأخرى المرتبطة بتكوين الأوعية الدموية في الحيوانات.
لقد أظهرنا أن إشارات PKD-1 الوعائية ونسخ الجينات الوعائية CD36 أمران حاسمان للتمايز في الخلايا البطانية (EC) وتكوين الأوعية الدموية الوظيفي3و4و5 و6. لتحديد الآليات الجزيئية للإشارات الوعائية والأيضية في نسخ الجينات والتحويل عبر EC، أنشأنا فئران TRAP المهندسة وراثيا مع الجينات الوعائية المحذوفة على وجه التحديد على أساس تقنية TRAP1 , 2.وعلاوة على ذلك، في الحيوانات TRAP لدينا، ليس فقط لديهم pkd-1 أو cd36 نقص الجينات في بطانة الأوعية الدموية أو الحذف العالمي للجين cd36، ولكن يتم أيضا وضع علامة وراثيا على بروتين الفلورة الخضراء المعززة (EGFP) وراثيا على المفوضية الأوروبية تترجم الريبوسوسوم. يسمح TRAP بتنقية الرصانة الرائية الريبوسومية مباشرة من بطانة الأوعية الدموية للأنسجة المستهدفة، مما يتيح تحليل التعبير الجيني وتحديد النسخ الجديدة المرتبطة بالتمايز مع الجماعة الأوروبية و تكوين الأوعية الدموية مباشرة تحت في ظروف الجسم الحي. لقد نجحنا في عزل الحمض النووي الريبي من بطانة الرحم في هذه الحيوانات المهندسة وراثيا. يمكن استخدام الحمض النووي الريبي النقي لمزيد من التوصيف للجينات الوعائية أو الشريانية في تنظيم تمايز الجماعة الأوروبية ووظائفها. يوفر هذا البروتوكول دليل خطوة بخطوة لتنفيذ نهج TRAP لعزل mRNA في ECs مباشرة في الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بالنسبة للتجارب الحيوانية، تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في كلية الطب في ويسكونسن.
1. إعداد الكواشف
- إعداد العازلة الليسيس لتركيزات 10 M HEPES، درجة الحموضة 7.4، 150 ملككل، 5 م مغكل 2، 0.5 م م DTT، 100 ملغ / مل سيكلوهيكسميد، مثبطات البروتياز، ومثبطات RNase المؤتلف إلى تركيزات كما هو موضح أدناه.
- إضافة الكواشف التالية إلى 500 مل من المياه منزوعة الأيونات خالية من RNase: 1.19 غرام من HEPES،5.59 غرام من KCl، 0.24 غرام من MgCl 2، 35 ملغ من DTT، 0.5 مل من سيكلوهيكسميد، وهيدروكسيد الصوديوم حسب الحاجة حتى درجة الحموضة 7.4، مثبطات البروتياز الخالية من EDTA (قرص صغير واحد لكل 10 مل) ومثبطات RNase (1 0 ميكرولتر / مل).
- يُحفظ في ثلاجة بزاوية 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
- إعداد حاجز غسل متعدد الجوانب عالي الملح لتركيزات 10 MHePES، ودرجة الحموضة 7.4، 350 مل كيلوكل، 5 مل مغكل2،1٪ vol/vol CA-630، 0.5 mM DTT، و 100 ملغ / مل سيكلوهيكسميد.
- إضافة الكواشف التالية إلى 500 مل من المياه منزوعة الأيونات الخالية من RNase: 1.19 غرام من HEPES، 13.05 غرام من KCl، 0.24 غرام من MgCl2، 5 مل من المنظفات غير الأيونية، غير denaturing، 5 من 7.7 ملغ أنابيب DTT، و 0.5 مل من cycloheximide، وهيدروكسيد الصوديوم حسب الحاجة حتى درجة الحموضة 7.4.
- يُحفظ في ثلاجة بزاوية 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
- ربط الأجسام المضادة للGFP إلى الخرز المغناطيسي البروتين G قبل بدء التجربة.
- إضافة 10 ملغ من الأجسام المضادة للGFP المخففة في 200 مل من PBS إلى الخرز G البروتين.
- الحضانة مع نهاية أكثر من نهاية التناوب لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- وضع الخرز على رف مغناطيسي وإزالة supernatant.
- تعليق الخرز في 200 مل من PBS وتخزينها في الثلاجة 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 أسبوع.
- إعداد الجليد الباردة PBS مع 100 ملغ / مل سيكلوهيكسميد.
- أضف مجلدًا واحدًا من محلول سيكلوهيكسميد (100 ملغم/مل) إلى 99 مجلدًا من PBS المثلج.
2. عزل وlyse الأنسجة المطلوبة
- قتل الفئران عن طريق حقن IP من الكيتامين (500 مغ/كغ/وزن الجسم) وزيلازين (10 مغ/كغ/وزن الجسم) وعزل الأنسجة المطلوبة (أي القلب والرئة). انتقل على الفور إلى الخطوة التالية.
- ضع الأنسجة المطلوبة في 500 مل من الـ PBS المثلج مع 100 ملغم/مل سيكلوهيكسميد.
- الأنسجة الرخوة في تعليق الخلية مع المجانسة التي يحركها المحرك أو المجانسة الزجاج إزالة صغيرة. إذا كنت تستخدم المجانسة التي يقودها المحرك، حد من التجانس إلى أقل من دقيقة واحدة عند التردد المنخفض (<15,000 هرتز) لتجنب إزالة الحمض النووي الريبي.
- تعليق بيليه الخلية في 200 مل من العازلة lysis عن طريق الأنابيب وإعادة رسم حتى العازلة عدة مرات. مزيد من التجانس تعليق الخلية مع 10 السكتات الدماغية في المجانسة الزجاج إزالة صغيرة أو لمدة 15 ثانية في تردد منخفض (<15,000 هرتز) في المجانسة محرك يحركها.
- تتجانس أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 2000 × ز عند 4 درجة مئوية إلى نواة بيليه وحطام الخلايا الكبيرة، والحفاظ على supernatant.
- إضافة المنظفات غير المنوّقة غير الناطورة إلى 1% vol/vol وDHPC إلى 30 mM إلى supernatant. حضانة على الجليد لمدة 5 دقائق.
- جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق في 16،000 × ز إلى بيليه المواد غير القابلة للذوبان. نقل والحفاظ على 15٪ من lysate واضحة كمدخلات للخطوات المستقبلية.
3. عزل مجمعات ريبوسم / ميرنا
- أضف 50 مل من الخرز المربوط بالأجسام المضادة إلى خليط الخلايا والحضانة عند درجة حرارة 4 درجة مئوية مع دوران نهاية النهاية لمدة 30 دقيقة. هذا هو المكان الذي سوف تربط الأجسام المضادة لGFP ريبوسوسومز ذات العلامات GFP، مما يسمح لنا بعزل الحمض النووي الريبي من هذه الريبوسوسوم.
- جمع الخرز على رف المغناطيسي وغسل 5 مرات مع عالية الملح متعدد الغطاء العازلة.
- رسم وتجاهل السائل مرة واحدة وقد جمعت الخرز على جانب الأنبوب. ثم ماصة وإعادة رسم ما يصل 200 مل من الملح العالي polysome غسل العازلة عدة مرات. كرر هذه الخطوة 5 مرات وتجاهل كافة المخزن المؤقت بعد التكرار النهائي. انتقل على الفور إلى الخطوة التالية.
4. عزل ميرنا
- وضع الخرز في المخزن المؤقت RLT. يتم اتخاذ الخطوات التالية مباشرة من بروتوكول مجموعة صغيرة RNeasy ولم يتم توسيعها بأي شكل من الأشكال.
تحذير: يحتوي المخزن المؤقت RLT على أملاح الغوانيدين. لا تخلط مع التبييض. - جهاز الطرد المركزي lysate لمدة 3 دقائق بأقصى سرعة 13,000 دورة في الدقيقة أو 16,000 غرام عند 4 درجة مئوية. إزالة بعناية supernatant من 350 مل عن طريق الأنابيب ونقلها إلى أنبوب ميكروفوج جديد. استخدم فقط هذا التراكب (lysate) في الخطوات اللاحقة.
- إضافة حجم متساو من الإيثانول 70٪ في أنبوب microfuge.
- نقل ما يصل إلى 700 مل من العينة، بما في ذلك أي عجل التي قد تكون شكلت، إلى عمود تدور وضعت في أنبوب جمع 2 مل. أغلق الغطاء بلطف والطرد المركزي لمدة 15 s في ≥ 8000 × ز لغسل غشاء عمود الدوران. تجاهل التدفق من خلال.
- إضافة 350 مل من المخزن المؤقت RW1 إلى عمود الدوران. أغلق الغطاء بلطف والطرد المركزي لمدة 15 s في ≥ 8000 × ز لغسل غشاء عمود الدوران. تجاهل التدفق من خلال وإعادة استخدام أنبوب جمع في الخطوة التالية.
تحذير: يحتوي BUFFER RW1 على أملاح الغوانيدين. لا تخلط مع التبييض. - إضافة 350 مل من المخزن المؤقت RW1 إلى عمود الدوران. أغلق الغطاء بلطف والطرد المركزي لمدة 15 s في ≥ 8000 × ز. تجاهل التدفق من خلال.
- إضافة 500 مل من RPE المخزن المؤقت إلى عمود الدوران. أغلق الغطاء بلطف والطرد المركزي لمدة 15 s في ≥ 8000 × ز لغسل غشاء عمود الدوران. تجاهل التدفق من خلال.
- إضافة 500 مل من RPE المخزن المؤقت إلى عمود الدوران. أغلق الغطاء بلطف والطرد المركزي لمدة دقيقتين عند ≥ 8000 × ز لغسل غشاء عمود الدوران. ثم إزالة بعناية العمود تدور من أنبوب جمع، وضمان أن العمود لا يتصل تدفق من خلال.
- ضع عمود الدوران في أنبوب تجميع جديد بـ 2 مل وتجاهل الأنبوب القديم مع التدفق من خلال. أغلق الغطاء بلطف والطرد المركزي بأقصى سرعة لمدة دقيقة واحدة لإزالة المخزن المؤقت المتبقي.
- ضع عمود الدوران في أنبوب تجميع جديد بـ 1.5 مل. إضافة 30-50 مل من المياه الخالية من RNase مباشرة إلى غشاء عمود تدور. أغلق الغطاء بلطف والطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة عند 8000 × ز لelute الحمض النووي الريبي.
- إذا كان العائد المتوقع من الحمض النووي الريبي >30 ملغ، كرر الخطوة 4.10 مع 30-50 مل أخرى من المياه الخالية من RNase، أو باستخدام elute من الخطوة 4.10 (إذا كان هناك حاجة عالية [RNA] ). إعادة استخدام أنبوب جمع من الخطوة 4.10.
- استخدام الحمض النووي الريبي النقي لتحليل المصب بما في ذلك تسلسل الحمض النووي الريبي أو PCR الكمية في الوقت الحقيقي أو تخزين الحمض النووي الريبي المذاب في RNase خالية H2O في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
دراساتنا السابقة4,7 تشير إلى أن CD36 قد تعمل كمفتاح للتمايز الشرياني والشرايين الشعرية عبر مسار الإشارات LPA /PKD-1. لدراسة ما إذا كان محور الإشارات LPA/PKD-1-CD36 ضروريًا للتكوين الشراييني في الجسم الحي، فقد أنشأنا خطوط TRAP الجديدة التي لا تحتوي فقط على نقص CD36 عالميأو نقص cd36-pkd-1 الخاص ببطانة الرحم، ولكن أيضًا تسمح بعزل انتقائي من الحمض النووي الريبي ملزمة من سلالات الخلايا cre ملحوظ من قبل GFP، ومفيدة كمراسل الفلورسنت cre-activated2.
من خلال إجراء النماذج الجينية، لاحظنا أن جين cd36 تم حذفه على الصعيد العالمي أو في بطانة الأوعية الدموية للفئران الفارغة cd36 الخاصة بالبطانة (لم تظهر البيانات)، كما تم حذف جين pkd-1 في بطانة الأوعية الدموية. الشكل 1 هو نتيجة تمثيلية تظهر منفذ CD36 العالمي الذي تم إنشاؤه أو خط الماوس PKd-1 TRAP الخاص بالبطانة. باستخدام الفحص المجهري المناعي، أثبتنا أن GFP المعزز يتم تمييزه وراثياً على ريبوسوسومات الخلايا البطانية في الجسم الحي (الشكل 2). نحن ثم عزل الريبوسوم ملزمة mRNA مباشرة في الجسم الحي وحصلت بنجاح الحمض النووي الريبي الجودة كما هو مبين من خلال قياس نسبة 260 نانومتر و 230 نانومتر (الشكل 3). وأظهر مزيد من التحليل باستخدام qPCR في الوقت الحقيقي أن التعبير عن بعض الجينات الشريانية تم تنظيمها في بطانة الرئة من الفئران فارغة cd36 (الشكل 4)، مما يشير إلى أن الحمض النووي الريبي معزولة مباشرة في الجسم الحي في بطانة الأوعية الدموية باستخدام TRAP التكنولوجيا مؤهلة للدراسات المصب. وتشمل هذه الدراسات تحليل التعبير الجيني على مستويات mRNA وتحديد النسخ الجديدة في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية، والتي هي ضرورية لفهم تنظيم تمايز الخلايا البطانية الوعائية وتكوين الأوعية الدموية الوظيفية.
الشكل 1: مثال على النماذج الجينية لفئران TRAP المهندسة وراثياً. النتائج التمثيلية للكتابة الجينية للفئران فارغة TRAP cd36 العالمية أو الفئران فارغة PKD-1 فارغة الأنسجة الشرطية. الفئران المعدلة وراثيا VEC-cre التعبير عن Cre recombinase تحت سيطرة المروج Cdh5 B6; 129-Tg (Cdh5-cre)1Spe/J الفئران كانت الخبز مع B6.129S4-GT(ROSA)26Sor tm1(CAG-EGFP/Rpl10a,-birA)Wtp/J,وأبعد من ذلك مع B6.129S1tm1Mfe-cd36 /J أو pkd-1loxP/loxP. تم الحصول على الفئران CD36 TRAP (A) وpkd-1 TRAP (B)، حيث يتم وضع علامة على GFP محسنة على L10a من ريبوسوم في الخلايا البطانية الوعائية، ويتم حذف الجين cd36 على الصعيد العالمي و pkd-1 الجينات على وجه التحديد في بطانة الأوعية الدموية. تم جمع ذيول الماوس لاستخراج الحمض النووي باستخدام عدة وبناء على تعليمات من الشركة المصنعة، وتم تضخيم الحمض النووي في جميع العينات من قبل تفاعل سلسلة بوليميراز (PCR)، ومن ثم تقييمها من قبل 1-2٪ agarose هلام الكهربائي. الصور الفوتوغرافية هي صورة هلام أغاروز تظهر نتائج تضخيم cd36 أو pkd-1 المسوخ مع / بدون TRAP أو الفئران نوع البرية (WT). الماوس لوحة النمط الجيني A: حارة 1, cd36-/-; فخ+/-; حارة 2، فخ+/+؛ حارة 3, cd36-/-; فخ+/+; Cdh5+/-; حارة 4، فخ+/+؛ Cdh5+/-; حارة 5, cd36-/-; فخ+/+; Cdh5+/-; حارة 6, cd36-/-; فخ+/-; Cdh5+/-; حارة 7، فخ+/+؛ Cdh5+/-; حارة 8، فخ+/-؛ الممر 9، سلم الحمض النووي. لوحة الماوس النمط الجيني B: حارة 1، pkd-1فلوريدا / -؛ فخ+/-; Cdh5+/-; حارة 2، pkd-1فلوريدا /فلوريدا؛ فخ+/+; Cdh5+/-; حارة 3، pkd-1فلوريدا / -؛ فخ +/+; حارة 4، pkd-1فلوريدا /فلوريدا؛ فخ +/+; Cdh5+/-; حارة 5، pkd-1فلوريدا /فلوريدا؛ فخ+/+; Cdh5+/-; حارة 6، pkd-1فلوريدا / -؛ الممر 7، سلم الحمض النووي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مثال على التعبير المعزز لإطار البطانية تحت المجهر الفلوري. وكان بطانة الدم الوعائية في أنسجة الرئة من الفئران فخ CD36 بالضربة القاضية EGFP إيجابية (اللون الأخضر، لوحة العلوي) تحت المجهر المناعي. في عداد المفقودين تم استخدام الأجسام المضادة GFP الأساسية كعنصر تحكم سلبي (لوحة أسفل). كانت أنسجة الماوس ملطخة بالمشاركة باستخدام الأجسام المضادة GFP وCD31 مع الأجسام المضادة الفلورية الثانوية المناسبة (اللون الأحمر). الصور التمثيلية التي تم الحصول عليها باستخدام نظام التصوير المجهري الفلوري. شريط = 200 درجة مئوية، يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: نوعية وكمية الميرنا الربوسوية المرتبطة بالخلايا البطانية المنقّحت والمستخرجة مباشرة من أنسجة فئران TRAP. مثال على جودة وتركيز الحمض النووي الريبي النقي من أنسجة الرئة في cd36 ضرب الماوس TRAP. وقد استخدم مقياس الطيف الضوئي لتقييم كمية ونقاء الحمض النووي الريبي المستخرج. وكما هو مبين في هذا الرقم، فإن تركيز الحمض النووي الريبي هو 51.2 نانوغرام/ميكرولتر. نسبة الامتصاص في 260 نانومتر و 280 نانومتر هي 1.87 في حين أن نسبة 260 نانومتر و 230 نانومتر هي 2.40، مما يشير إلى نقاء عينات الحمض النووي الريبي المستخرجة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مثال على التعبير عن الجينات الوعائية وأربطة الشق في الحمض النووي الريبي المرتبط بالخلايا البطانية عن طريق الاختبارات qPCR في الوقت الحقيقي. تعرضت الميرنا المعزولة من الريبوسوم البطانية للرئة في التحكم TRAP وCD36 الفئران فخ ناقصEC محددة لأسئلة qPCR في الوقت الحقيقي، وذلك باستخدام التمهيديات التي تم شراؤها من شركة التكنولوجيا الحيوية بما في ذلك Hey2، ephrin B2، ودلتا مثل ligand 4 (DLL4). تم استخدام الجينات حفظ المنزل PPIA للتطبيع. تم استخدام اختبار الطالب tللتحليل الإحصائي. *P < 0.05; **P <0.01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تكوين الأوعية الدموية هو عملية معقدة متعددة الخطوات، حيث النسخ الجيني الوعائي الخاص بالجماعة الأوروبية وتعبيره يلعب دورا أساسيا في تمايز الجماعة الأوروبية وإعادة برمجة الأوعية الدموية3،4. للتغلب على الحواجز الناجمة عن التنوع الخلوي والتعقيد المعماري لفهم أفضل لوظيفة نظام الأوعية الدموية الثدييات على المستوى الجزيئي في الجسم الحي، أنشأنا الفئران TRAP الخاصة بالجماعة الأوروبية، مصحوبة cd36 الخاصة بالجماعة الأوروبية ، نقص PKd-1 الخاص بالجماعة الأوروبية أو نقص cd36 العالمي باستخدام نموذج ماوس TRAP متعدد الاستخدامات أو EGFP-TRAP تم إنشاؤه في مختبر Pu2 مع خطوط ماوس أخرى تم هندستها وراثياً. وهذا سوف يسمح بفحص كامل mRNA المترجمة تكملة من الأنسجة الوعائية من الأنسجة السليمة في الجسم الحي تحت EC-Specific في pkd-1 أو نقص عالمي في التعبير الجيني cd36 8, وهو أمر بالغ الأهمية للتحقيق في نسخ الجينات المرتبطة الأوعية الفسيولوجية والمرضية4،7،9،10. بما يتفق مع الدراسات الأخرى1،2، نهجنا لعزل mRNA محددة EC لا يحتاج إلى تثبيت الأنسجة ، وتفكك الأنسجة ، أو عزل الخلايا الواحدة من الأنسجة ، وبالتالي يتجنب القطع الأثرية المحتملة التي نتيجة لهذه العلاجات. كنا قادرين أيضا على تنفيذ تنقية TRAP واستخراج نوعية ريبوسوم ملزمة mRNA من الأنسجة المجمدة. بالإضافة إلى ذلك، ما تم تنقيته هو محتوى mRNA المترجمة من ECs مباشرة في الجسم الحي، والتي سوف تمثل بشكل أفضل محتوى البروتين مقارنة باستخدام الحمض النووي الريبي الكلي لملف تعريف التعبير الجيني. وعلاوة على ذلك، فإن تراب transgene تسميات وراثيا ECs مع EGFP، كما يسمح ليس فقط لاستخراج الريبوسوم ملزمة mRNA ولكن أيضا للتصور في الدراسات المناعية الكيميائية أو الكهرولوجية.
ومع ذلك، أظهر النهج انخفاض غلة الحمض النووي الريبي، وخاصة مع mRNA النقية من أنسجة القلب أو من الأنسجة المجمدة سابقا. وبالتالي، فإننا بحاجة إلى تحسين الظروف لزيادة الغلة. ومع ذلك، لاحظنا في CD36 الفئران ناقص EC محددة، تم زيادة مستويات ephrin B2 و DLL4 بشكل ملحوظ في كل من الرئة (الشكل4) والقلب (البيانات لم تظهر) بطانة عند مقارنتها مع السيطرة. وكانت هذه النتائج متسقة مع دراساتنا السابقة في المختبر3،4، مما يشير إلى أن نوعية الحمض النووي الريبي كافية لتحليل المصب. وكان العائد منخفضا ربما بسبب الشروط الصارمة. وللتغلب على هذا القيد وتحسين الغلة، من الأهمية بمكان إنشاء منطقة عمل خالية من RNase وتطهير أسطح العمل والمعدات التي قد تكون ملوثة بRNase وتغيير القفازات في كثير من الأحيان من أجل استخراج الحمض النووي الريبي الجودة. ومن الأهمية بمكان أيضا العثور على تركيزات مناسبة من الأجسام المضادة GFP في مصفوفة التقارب واستخدام تركيزات مناسبة من مثبطات RNase في العازلة اللِصي للأنسجة. استخدام الأدوات البلاستيكية الخالية من RNase والكواشف مفيد لاستخراج الحمض النووي الريبي من ريبوسومات بطانة الرحم ة من الأنسجة المستهدفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ أنهما ليس لديهما أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ويدعم عمل الدكتور رين من قبل جمعية القلب الأمريكية (13SDG14800019; BR)، مؤسسة أمل آن (FP00011709؛ BR)، والجمعية الأمريكية للسرطان (86-004-26؛ ومركز السرطان MCW إلى BR)، والمعهد الوطني للصحة (HL136423؛ BR)؛ ويدعم الأردن بالمر من قبل 2018 MCW CTSI 500 نجوم برنامج التدريب; P. موران مدعوم من منحة التدريب على البحوث المؤسسية من NHLBI (5T35 HL072483-34).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer with Nanochips and Picochips | Agilent | G2939AA, 5067-1511 & 5067-1513 | |
| Cell scrapers | Sarstedt | 83.1832 | |
| Homogenizers | Fisher Scientific | K8855100020 | |
| Magnet (Dynamag-2) | Invitrogen | 123-21D | Will depend on purification scale; samples in 1.5-mL tubes can be concentrated on a DynaMag-2 |
| Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| NanoDrop 2000C spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000C | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5430R | with rotor for 1.5-mL microcentrifuge tubes |
| RNase-free 1.5mL microcentrifuge tubes | Applied Biosystems | AM12450 | |
| Rnase-free 50-mL conical tubes | Applied Biosystems | AM12501 | |
| RNase-free 1000-μl filter tips | Rainin | RT-1000F | |
| RNase-free 200-μl filter tips | Rainin | RT-200F | |
| RNase-free 20-μl filter tips | Rainin | RT-20F | |
| Rotor for homogenizers | Yamato | LT-400D | |
| Tube rotator, Labquake brand | Thermo Fisher | 13-687-12Q |
References
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).
- Zhou, P., et al. Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).
- Best, B., Moran, P., Ren, B. VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan. Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).
- Ren, B., et al. LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming. Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).
- Ren, B. Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37 (2016).
- Ren, B. FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis? Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).
- Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model. Nucleic Acids Research. 42, e14 (2014).
- Dong, L., et al. Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling. Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).
- Ren, B., et al. ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).
- Skuli, N., et al. Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes. Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).
