Summary
Nós apresentamos uma aproximação para purificar o mRNA ribosome-ligado das pilhas endothelial vasculares (ECS) diretamente no cérebro do rato, nos tecidos do pulmão e do coração através do Tag genético EC-specific da proteína verde aumentada da fluorescência (EGFP) nos ribossomas em combinação com a purificação do RNA .
Abstract
Muitos estudos têm sido limitados ao uso de ensaios celulares in vitro e tecidos inteiros ou isolando tipos de células específicas de animais para análise in vitro de transcriptoma e expressão gênica por sequenciamento de qPCR e RNA. O transcriptoma detalhado e a análise da expressão de gene de tipos específicos da pilha em tecidos e em órgãos complexos serão críticos compreender os mecanismos celulares e moleculars por que os genes são regulados e sua associação com a homeostase e o órgão do tecido Funções. Neste artigo, nós Demonstramos a metodologia para a isolação do RNA ribosome-ligado diretamente in vivo no endothelia vascular de pulmões animais como um exemplo. Os materiais e os procedimentos específicos para o processamento do tecido e a purificação do RNA serão descritos, incluindo a avaliação da qualidade e do rendimento do RNA assim como qPCR do tempo real para ensaios arteriogênica do gene. Esta aproximação, conhecida como traduzindo a técnica Ribossoma da purificação da afinidade (armadilha), pode ser utilizada para a caracterização da expressão de gene e da análise do transcriptoma de determinados tipos da pilha diretamente in vivo em todo o tipo específico em tecidos complexos.
Introduction
Em tecidos complexos, como o cérebro de mamíferos, coração e pulmão, os altos níveis de heterogeneidade celular complicam a análise dos dados de expressão gênica derivados de amostras de tecidos inteiros. Para observar os perfis de expressão gênica em um determinado tipo de célula in vivo, uma nova metodologia foi desenvolvida recentemente, o que permite a interrogação de todo o complemento traduzido de mRNA de qualquer tipo de célula geneticamente definida. Essa metodologia é conhecida como a técnica de conversão de afinidade Ribossome (Trap)1,2. É uma ferramenta útil para estudar a biologia e a angiogênese de células endoteliais quando combinada com a manipulação genética de outros genes associados à angiogênese em animais.
Nós mostramos que a sinalização angiogênica de PKD-1 e a transcrição do gene angiogénico CD36 são críticas para a diferenciação da pilha endothelial (EC) e a angiogênese funcional3,4,5,6. Para determinar os mecanismos moleculares da sinalização angiogênica e metabólica na transcrição genética e na transdiferenciação CE, criamos camundongos TRAP geneticamente modificados com genes angiogênicos especificamente excluídos com base na técnica TRAP1 , 2. Além disso, em nossos animais Trap, não só eles têm deficiência de gene PKD-1 ou CD36 no endothelia vascular ou apagamento global do gene CD36 , mas uma proteína de fluorescência verde reforçada (EGFP) também é geneticamente marcada para A EC está traduzindo ribossomas. A armadilha permite a purificação da afinidade do mRNA ribosome-ligado diretamente do endothelia vascular de tecidos alvejados, permitindo a análise da expressão de gene e da identificação de transcriptoma novos que são associados com a diferenciação e angiogênese diretamente condições in vivo. Nós isolamos com sucesso o RNA ribosome-ligado do endothelia nestes animais genetically projetados. O RNA purificado pode ser utilizado para a caracterização de genes angiogênicos ou arteriogênicos na regulação da diferenciação e funções da CE. Este protocolo fornece um guia passo a passo para implementar a abordagem TRAP para o isolamento de mRNA em ECs diretamente in vivo.
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Protocol
Para experimentos com animais, todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da faculdade de medicina de Wisconsin.
1. Prepare os reagentes
- Prepare o tampão de Lise para concentrações de 10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mm dtt, 100 mg/ml cicloheximida, inibidores da protease e inibidores de RNase recombinantes para concentrações como descrito abaixo.
- Adicione os seguintes reagentes a 500 mL de água desionizada livre de RNase: 1,19 g de HEPES, 5,59 g de KCl, 0,24 g de MgCl2, 35 mg de dtt, 0,5 ml de cicloheximida, e NaOH conforme necessário até pH 7,4, inibidores da protease livre de EDTA (um mini comprimido por 10 ml) e inibidor de RNase (1 0 μL/mL).
- Armazene em um refrigerador de 4 ° c por até 1 mês.
- Prepare um tampão de lavagem polysome do elevado-sal às concentrações de 10 milímetros HEPES, pH 7,4, 350 milímetro KCl, 5 milímetros MgCl2, 1% Vol/Vol CA-630, 0,5 milímetro DTT, e 100 mg/ml cycloheximide.
- Adicionar os seguintes reagentes a 500 mL de água desionizada livre de RNase: 1,19 g de HEPES, 13, 5 g de KCl, 0,24 g de MgCl2,5 ml de detergente não iônico, não desnaturante, 5 de 7,7 mg de tdt e 0,5 ml de cicloheximida, e NaOH conforme necessário até o pH 7,4.
- Armazene no refrigerador de 4 ° c por até 1 mês.
- Associe o anticorpo anti-GFP às esferas magnéticas da proteína G antes de começar a experimentação.
- Adicionar 10 mg de anticorpo anti-GFP diluído em 200 mL de PBS para grânulos de proteína G.
- Incubar com extremidade sobre a rotação da extremidade por 10 minutos na temperatura ambiente.
- Coloque as contas em um rack magnético e retire o sobrenadante.
- Suspenda os grânulos em 200 mL de PBS e armazene no refrigerador de 4 ° c por até 1 semana.
- Prepare a PBS gelada com 100 mg/mL de cicloheximida.
- Adicione 1 volume de solução de cicloheximida (100 mg/mL) a 99 volumes de PBS gelada.
2. isolar e lise os tecidos desejados
- Eutanizar camundongos por injeção de IP de cetamina (500 mg/kg/peso corporal) e xilazina (10 mg/kg/peso corporal) e isolar os tecidos desejados (isto é, coração, pulmão). Prossiga imediatamente para o próximo passo.
- Coloque os tecidos desejados em 500 mL de PBS gelada com 100 mg/mL de cicloheximida.
- Mince o tecido em uma suspensão da pilha com um homogeneizador motor-conduzido ou um homogeneizador de vidro da pequeno-folga. Se usando um homogeneizador motor-conduzido, limite a homogeneização a menos de 1 minuto na baixa freqüência (< 15000 hertz) para evitar a desnaturação do RNA.
- Suspender o pellet de células em 200 mL de tampão de Lise por pipetagem e redesenho de buffer várias vezes. Homogeneizar ainda mais a suspensão celular com 10 cursos em um homogeneizador de vidro de pequena folga ou por 15 segundos em baixa frequência (< 15000 Hz) em um homogeneizador acionado por motor.
- O centrifugador homogeneates por 10 minutos em 2.000 x g em 4 ° c aos núcleos da pelota e aos grandes restos da pilha, e mantem o sobrenadante.
- Adicione o detergente nonionic, não-desnaturando a 1% Vol/Vol e DHPC a 30 milímetros ao sobrenadante. Incubar no gelo por 5 min.
- Centrifugue o lisado por 10 minutos em 16.000 x g ao material insolúvel da pelota. Transfira e mantenha 15% do lisado desobstruído como a entrada para etapas futuras.
3. isolar complexos ribosalguns/mRNA
- Adicionar 50 mL de grânulos ligados a anticorpos ao sobrenadante de lisado de células e incubar a mistura a 4 ° c com rotação final por 30 min. Isto é o lugar onde os anticorpos do anti-GFP amarrarão os ribosomes GFP-etiquetados, permitindo que nós isolem mais o RNA destes ribossomas.
- Colete grânulos em uma cremalheira magnética e lave 5 vezes com tampão de lavagem polysome do elevado-sal.
- Elabore e descarte o líquido uma vez que os grânulos coletaram na parte lateral do tubo. Em seguida, pipete e redesenhe 200 mL de tampão de lavagem de polysome de alto sal várias vezes. Repita esta etapa 5 vezes e descarte todos os buffer após a repetição final. Prossiga imediatamente para o próximo passo.
4. isolar mRNA
- Coloque as contas no buffer RLT. As etapas a seguir são tomadas diretamente do protocolo RNeasy mini kit e não foram expandidas em qualquer forma.
PRECAUÇÃO: o tampão RLT contém sais de guanidina; Não misture com lixívia. - Centrifugue o lisado por 3 minutos na velocidade máxima 13.000 rpm ou 16.000 g em 4 ° c. Retire cuidadosamente o sobrenadante de 350 ml introduzindo pipetagem e transfira-o para um novo tubo de microcentrífuga. Use somente este sobrenadante (lisado) em etapas subsequentes.
- Adicione um volume igual de 70% de etanol no tubo de microcentrífuga.
- Transfira até 700 mL da amostra, incluindo qualquer precipitado que possa ter formado, a uma coluna de rotação colocada em um tubo de coleta de 2 mL. Feche a tampa suavemente e centrifugue por 15 s a ≥ 8.000 x g para lavar a membrana da coluna de centrifugação. Descarte o fluxo.
- Adicione 350 mL de buffer RW1 à coluna de rotação. Feche a tampa suavemente e centrifugue por 15 s a ≥ 8.000 x g para lavar a membrana da coluna de centrifugação. Descarte o fluxo e reutilize o tubo de coleta na próxima etapa.
PRECAUÇÃO: o tampão RW1 contém sais de guanidina; Não misture com lixívia. - Adicione 350 mL de buffer RW1 à coluna de rotação. Fechar a tampa suavemente e centrifugar por 15 s a ≥ 8.000 x g. Descarte o fluxo.
- Adicione 500 mL do buffer RPE à coluna de rotação. Feche a tampa suavemente e centrifugue por 15 s a ≥ 8.000 x g para lavar a membrana da coluna de centrifugação. Descarte o fluxo.
- Adicione 500 mL do buffer RPE à coluna de rotação. Feche a tampa suavemente e centrifugue durante 2 min a ≥ 8.000 x g para lavar a membrana da coluna de centrifugação. Em seguida , remova cuidadosamente a coluna de rotação do tubo de coleta, assegurando que a coluna não entre em contato com o fluxo.
- Coloque a coluna de rotação em um novo tubo de coleta de 2 mL e descarte o tubo antigo com o fluxo. Feche a tampa suavemente e centrifugue a velocidade máxima durante 1 min para remover o tampão residual.
- Coloque a coluna de rotação em um novo tubo de coleta de 1,5 mL. Adicione 30-50 mL de água RNase-livre diretamente à membrana da coluna da rotação. Feche a tampa suavemente e centrifugue durante 1 min a ≥ 8.000 x g para Eluir o RNA.
- Se o rendimento de RNA esperado for de > 30 mg, repita o passo 4,10 com outro 30-50 ml de água sem RNase, ou usando eluir da etapa 4,10 (se for necessário alto [RNA]). Reutilizar tubo de coleta da etapa 4,10.
- Use RNA purificado para análise a jusante, incluindo sequenciamento de RNA ou PCR quantitativo em tempo real ou RNA de loja dissolvido em H2O at-80 ° c RNase livre por até 1 ano.
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Representative Results
Nossos estudos precedentes4,7 sugerem que CD36 possa funcionar como um interruptor para a diferenciação arteriolar e a arterialização capilar através da via de sinalização de LPA/PKD-1. Para estudar se o eixo de sinalização LPA/PKD-1-CD36 é essencial para a arteriogênese in vivo, estabelecemos as novas linhas TRAP que não só têm deficiência global de CD36 ou deficiência endotelial-específica-CD36-ou PKD-1, mas também permitem o isolamento seletivo do RNA ribosome-ligado das linhagens de pilha CRE-marcadas por GFP, e são úteis como um repórter fluorescente CRE-ativado2.
Ao realizar a genotipagem, observamos que o gene CD36 foi excluído globalmente ou no endothelia vascular para camundongos nulos CD36 específicos endoteliais (dados não mostrados), e o gene PKD-1 também foi excluído no endothelia vascular. A Figura 1 é um resultado representativo que mostra o TRAP global CD36 criado ou a linha de mouse PKD-1 TRAP específica endotelial. Utilizando microscopia de imunofluorescência, demonstramos que um GFP aprimorado é geneticamente marcado para os ribossomas das células endoteliais in vivo (Figura 2). Em seguida, isolamos o mRNA de Ribossome vinculado diretamente in vivo e obteve com sucesso o RNA de qualidade, como demonstrado pela medida da proporção de 260 nm e 230 nm (Figura 3). Uma análise mais adicional que usa o qPCR tempo real demonstrou que a expressão de determinados genes arteriogênica estêve upregulated no endothelia do pulmão de CD36 ratos nulos (Figura 4), indicando que o RNA isolado diretamente in vivo no endothelia vascular usando a armadilha tecnologia são qualificados para estudos a jusante. Esses estudos incluem a análise da expressão gênica em níveis de mRNA e a identificação de novos transcriptomas em condições fisiológicas e patológicas, que são essenciais para a compreensão da regulação da diferenciação celular endotelial vascular e angiogênese funcional.
Figura 1: um exemplo de genotipagem para camundongos Trap geneticamente modificados. Resultados representativos para genotipagem de ratos CD36 nulos globais da armadilha ou de ratos PKD-1 nulos condicionais específicos do tecido. Camundongos transgênicos VEC-CRE expressam recombinase CRE o controle de um promotor Cdh5 B6; 129-TG (Cdh5-CRE) 1Spe/J camundongos foram pão com B 6.129 S4-gt (rosa) 26Sor TM1(CAG-EGFP/Rpl10a,-Bira) WTP/j, e mais com b 6.129 S1tm1Mfe-CD36 /j ou PKD-1loxp/loxp. Os camundongos Double Mutant CD36 Trap (a) e PKD-1 Trap (B) foram obtidos, nos quais um GFP aprimorado é marcado para L10A do Ribossome em células endoteliais vasculares, e o gene CD36 é excluído globalmente e Gene PKD-1 especificamente no endothelia vascular. As caudas do rato foram coletadas para a extração do ADN usando um jogo e baseado na instrução do fabricante, e o ADN em todas as amostras foi amplificado pela reacção em cadeia do polymerase (PCR), e avaliado então pela electroforese do agarose-gel de 1-2%. As fotografias são a imagem do gel do agarose que mostra os resultados da amplificação dos mutantes de CD36 ou de PKD-1 com/sem armadilha ou ratos do tipo selvagem (WT). Painel do genótipo Ado rato: pista 1, CD36-/-; TRAP+/-; pista 2, TRAP+/+; Lane 3, CD36-/-; TRAP+/+; Cdh5+/-; Lane 4, TRAP+/+; Cdh5+/-; Lane 5, CD36-/-; TRAP+/+; Cdh5+/-; Lane 6, CD36-/-; TRAP+/-; Cdh5+/-; Lane 7, TRAP+/+; Cdh5+/-; Lane 8, TRAP+/-; pista 9, escada de DNA. Painel Bdo genótipo do rato: pista 1, PKD-1fl/-; TRAP+/-; Cdh5+/-; pista 2, PKD-1fl/FL; TRAP+/+; Cdh5+/-; pista 3, PKD-1fl/-; TRAP +/+; pista 4, PKD-1fl/FL; TRAP +/+; Cdh5+/-; pista 5, PKD-1fl/FL; TRAP+/+; Cdh5+/-; pista 6, PKD-1fl/-; pista 7, escada de DNA. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: um exemplo da expressão GFP reforçada endotelial-específica o microscópio de fluorescência. O endothelia vascular do sangue nos tecidos do pulmão de ratos da armadilha de cd36 Knockout era EGFP positivo (cor verde, painel superior) o microscópio da imunofluorescência. Faltar o anticorpo preliminar de GFP foi usado como um controle negativo (painel inferior). Os tecidos do rato foram corados usando anticorpos GFP e CD31 com anticorpos secundários apropriados da fluorescência (cor vermelha). Imagens representativas adquiridas usando um sistema de imagem por microscopia de fluorescência. Bar = 200 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: a qualidade e a quantidade de mRNA ribossômico-Bound de células endoteliais purificadas e diretamente extraídas de tecidos de camundongos Trap. Um exemplo para a qualidade e a concentração de RNA purified dos tecidos do pulmão em um CD36 derruba o rato da armadilha. Utilizou-se espectrofotômetro para avaliação da quantidade e pureza do RNA extraído. Como mostrado nesta figura, a concentração de RNA é 51,2 ng/μL. A proporção de absorbância a 260 nm e 280 nm é de 1,87, enquanto a proporção de 260 nm e 230 nm é de 2,40, indicando a pureza das amostras de RNA extraídas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: um exemplo de expressão de genes angiogênicos e ligantes de entalhe no RNA ligado ao Ribossome de células endoteliais por ensaios de qPCR em tempo real. O mRNA isolado do Ribossome endotelial do pulmão no controle da armadilha e em ratos CD36 deficientes EC-específicos da armadilha foi sujeitado aos ensaios do qPCR do tempo real, usando os primers comprados de uma empresa de biotecnologia que inclui Hey2, efrina B2, e Delta como o ligante 4 (DLL4). A casa que mantem genes PPIA foi usada para a normalização. Para análise estatística utilizou-se o teste tde Student. *P < 0, 5; * *P < 0,01.
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Discussion
A angiogênese é um processo complexo de múltiplas etapas, no qual a transcrição e expressão do gene angiogênico específico da CE desempenham um papel essencial na diferenciação da CE e na reprogramação angiogênica3,4. Para superar as barreiras da diversidade celular e da complexidade arquitetônica para melhor compreender a função do sistema vascular de mamíferos em nível molecular in vivo, criamos camundongos TRAP específicos da CE, acompanhados por CD36 , Deficiência de PKD-1 específica para EC ou deficiência global de CD36 usando um modelo de mouse de armadilha de FLOXED versátil ou EGFP-Trap gerado no laboratório de PU2 em combinação com outras linhas de mouse geneticamente projetadas. Isto permitirá a examinação do complemento traduzido inteiro do mRNA de ECs vascular dos tecidos intactos in vivo o EC-específico em PKD-1 ou a deficiência global na expressão8do gene CD36 , que é crítico para a investigação em transcrição gênica associada à angiogênese fisiológica e patológica4,7,9,10. Consistente com outros estudos1,2, nossa abordagem ao isolamento de mRNA EC-specific não precisa de fixação tecidual, dissociação de tecidos, ou isolamento de células isoladas de tecidos e, assim, evita os artefatos potenciais que resultado destes tratamentos. Também fomos capazes de realizar purificações TRAP e extrair mRNA de qualidade Ribossome ligado dos tecidos congelados. Adicionalmente, o que foi purificado é o conteúdo de mRNA traduzido de ECs diretamente in vivo, que representará melhor o teor de proteínas em comparação com o uso do RNA total para o perfil de expressão gênica. Além disso, o transgene da armadilha etiqueta genetically os ECS com EGFP, igualmente permitindo não somente para a extração do mRNA ribosome-ligado mas igualmente para o visualização em estudos immunohistochemical ou eletrofisiológicos.
Entretanto, a aproximação mostrou baixos rendimentos do RNA, especial com o mRNA purified dos tecidos do coração ou dos tecidos previamente congelados. Assim, precisamos otimizar as condições para aumentar os rendimentos. No entanto, observamos em camundongos deficientes CD36 específicos da CE, os níveis de ephrina B2 e DLL4 aumentaram significativamente tanto na endothelia pulmonar (Figura 4) quanto no coração (dados não mostrados), quando comparados com o controle. Estes resultados foram consistentes com os nossos estudos in vitro anteriores3,4, o que sugere que a qualidade do RNA é suficiente para a análise a jusante. O rendimento foi baixo possivelmente devido às condições estritas. Para superar esta limitação e melhorar o rendimento, é crítico estabelecer uma zona de trabalho RNase-livre e descontaminar superfícies e equipamento do trabalho que podem começ contaminados com RNase e trocar luvas freqüentemente a fim extrair o RNA da qualidade. Também é fundamental encontrar concentrações adequadas de anticorpos GFP na matriz de afinidade e usar concentrações apropriadas de inibidor de RNase no tampão de Lise tecidual. O uso de mercadorias e de reagentes plásticos RNase-livres é benéfico para a extração do RNA dos ribossomas endothelial dos tecidos alvejados.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm conflito de interesses.
Acknowledgments
O trabalho do Dr. Ren é apoiado pela associação americana do coração (13SDG14800019; BR), a Fundação Ann ' s Hope (FP00011709; BR), a sociedade americana do câncer (86-004-26; o MCW Cancer Center para BR), e o Instituto Nacional de saúde (HL136423; BR); Jordan Palmer é apoiado pelo 2018 MCW CTSI 500 Stars programa de estágio; P. Moran é apoiado por uma subvenção de formação de investigação institucional da NHLBI (5T35 HL072483-34).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer with Nanochips and Picochips | Agilent | G2939AA, 5067-1511 & 5067-1513 | |
| Cell scrapers | Sarstedt | 83.1832 | |
| Homogenizers | Fisher Scientific | K8855100020 | |
| Magnet (Dynamag-2) | Invitrogen | 123-21D | Will depend on purification scale; samples in 1.5-mL tubes can be concentrated on a DynaMag-2 |
| Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| NanoDrop 2000C spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000C | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5430R | with rotor for 1.5-mL microcentrifuge tubes |
| RNase-free 1.5mL microcentrifuge tubes | Applied Biosystems | AM12450 | |
| Rnase-free 50-mL conical tubes | Applied Biosystems | AM12501 | |
| RNase-free 1000-μl filter tips | Rainin | RT-1000F | |
| RNase-free 200-μl filter tips | Rainin | RT-200F | |
| RNase-free 20-μl filter tips | Rainin | RT-20F | |
| Rotor for homogenizers | Yamato | LT-400D | |
| Tube rotator, Labquake brand | Thermo Fisher | 13-687-12Q |
References
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