Summary
Vi præsenterer en tilgang til at rense ribosome-bundet mRNA fra vaskulære endotelceller (ECs) direkte i mus hjerne, lunge og hjerte væv via EF-specifik genetisk tag af forstærket grønt fluorescens protein (EGFP) i ribosomer i kombination med RNA rensning .
Abstract
Mange undersøgelser har været begrænset til at anvende in vitro cellulære assays og hele væv eller isolering af specifikke celletyper fra dyr til in vitro-analyse af transkriptomer og genekspression ved qPCR og RNA Sequencing. Omfattende transkriptomer og analyse af genekspression af specifikke celletyper i komplekse væv og organer vil være afgørende for at forstå cellulære og molekylære mekanismer, hvorved gener reguleres, og deres tilknytning til vævs homøostase og organ Funktioner. I denne artikel viser vi metoden til isolering af ribosome-bundet RNA direkte in vivo i den vaskulære endotelas af dyre lunger som et eksempel. De specifikke materialer og procedurer for vævs behandling og RNA-rensning vil blive beskrevet, herunder vurdering af RNA-kvalitet og-udbytte samt realtids qPCR for arteriogene gen-assays. Denne fremgangsmåde, kendt som at oversætte ribosom affinitets rensning (Trap) teknik, kan udnyttes til karakterisering af genekspression og transkriptomanalyse af visse celletyper direkte in vivo i enhver specifik type i komplekse væv.
Introduction
I komplekse væv som pattedyr hjernen, hjertet og lungerne komplicerer de høje niveauer af cellulær heterogenitet analysen af data fra Gen-ekspression, som stammer fra hele vævsprøver. For at observere profiler for genekspression i en bestemt celletype in vivo er der for nylig udviklet en ny metodologi, som gør det muligt at forhør hele det oversatte mRNA-komplement af enhver genetisk defineret celletype. Denne metode er kendt som oversætte ribosom affinitet rensning (fælde) teknik1,2. Det er et nyttigt værktøj til at studere endotel cellebiologi og angiogenese, når det kombineres med genetisk manipulerende andre angiogenese-associerede gener i dyr.
Vi har vist, at angiogen PKD-1 signalering og transkriptionen af angiogen gen CD36 er afgørende for endotelcelle (EC) differentiering og funktionelle angiogenese3,4,5,6. For at bestemme molekylære mekanismer af angiogen og metabolisk signalering i gentransskription og EF-Trans differentiering har vi skabt genetisk manipulerede FÆLDE mus med specifikt slettede angiogene gener på grundlag af TRAP Technique1 , 2. Desuden, i vores fælde dyr, ikke kun har de PKD-1 eller CD36 gen mangel i den vaskulære endothelia eller global sletning af CD36 gen, men et forbedret grønt fluorescens protein (egfp) er også genetisk tagget på EF'S oversættelse af ribosomer. TRAP tillader affinitet rensning af ribosome-bundet mRNA direkte fra den vaskulære endothelia af målrettede væv, muliggør analyse af genekspression og identifikation af nye transkriptomer, der er forbundet med EF-differentiering og angiogenese direkte under in vivo-betingelser. Vi har med succes isoleret ribosome-bundet RNA fra endothelia i disse genetisk manipulerede dyr. Det rensede RNA kan anvendes til yderligere karakterisering af angiogene eller arteriogene gener i reguleringen af EF-differentiering og-funktioner. Denne protokol giver en trinvis vejledning til gennemførelse af FÆLDEN tilgang til isolering af mRNA i ECs direkte in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
For dyreforsøg, alle metoder, der er beskrevet her er blevet godkendt af den institutionelle Animal Care og brug Udvalget af Medical College of Wisconsin.
1. Forbered reagenser
- Forbered lyse buffer til koncentrationer af 10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mm dtt, 100 mg/ml cycloheximid, proteasehæmmere og rekombinante rnasehæmmere til koncentrationer som beskrevet nedenfor.
- Tilsæt følgende reagenser til 500 mL RNase-frit deioniseret vand: 1,19 g HEPES, 5,59 g KCl, 0,24 g MgCl2, 35 mg dtt, 0,5 ml cycloheximid og NaOH efter behov indtil pH 7,4, EDTA-frie proteasehæmmere (en mini tablet pr. 10 ml) og rnasehæmmer (1 0 μL/mL).
- Opbevares i et 4 °C-køleskab i op til 1 måned.
- Forbered en høj-salt polysome vask buffer til koncentrationer af 10 mM HEPES, pH 7,4, 350 mM KCl, 5 mM MgCl1,2% Vol/Vol CA-630, 0,5 mm DTT, og 100 mg/ml cycloheximide.
- Tilsæt følgende reagenser til 500 mL RNase-frit deioniseret vand: 1,19 g HEPES, 13,05 g KCl, 0,24 g MgCl2,5 ml nonionisk, ikke-denatureringsmiddel, 5 af 7,7 mg DTT-rør og 0,5 ml cycloheximide og NaOH efter behov indtil pH 7,4.
- Opbevares i 4 °C køleskab i op til 1 måned.
- Binde anti-GFP-antistoffer til protein G magnetiske perler før påbegyndelse af forsøget.
- Tilsæt 10 mg ANTIGFP antistof fortyndet i 200 mL PBS til protein G perler.
- Inkuber med end-slut-rotation i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Placer perlerne på et magnetisk stativ og Fjern supernatanten.
- Perlerne suspenderes i 200 mL PBS og opbevares i 4 °C i køleskab i op til 1 uge.
- Forbered iskold PBS med 100 mg/mL cycloheximide.
- Tilsæt 1 volumen cycloheximide opløsning (100 mg/mL) til 99 mængder iskold PBS.
2. Isoler og lysere det ønskede væv
- Euthanize mus ved IP injektion af ketamin (500 mg/kg/legemsvægt) og xylazin (10 mg/kg/legemsvægt) og isolere ønskede væv (dvs., hjerte, lunge). Fortsæt straks til næste trin.
- Placer det ønskede væv i 500 mL iskold PBS med 100 mg/mL cycloheximid.
- Hakket væv i en cellesuspension med en motordreven homogenisator eller en lille clearance glas homogenisator. Hvis der anvendes en motordreven homogenisator, begrænses homogenisering til mindre end 1 minut ved lav frekvens (< 15000 Hz) for at undgå RNA-denaturering.
- Stop celle pellet i 200 mL lysis buffer ved pipettering og genoptegning af buffer flere gange. Yderligere homogeniserer cellesuspensionen med 10 slag i en lille clearance af glas homogenisator eller i 15 sekunder ved lav frekvens (< 15000 Hz) i en motordreven homogenisator.
- Centrifuge-homogenater i 10 min ved 2.000 x g ved 4 °c til pellet kerner og store cellerester, og holde supernatanten.
- Tilsæt det nonioniske, ikke-denaturerende rengøringsmiddel til 1% vol/vol og DHPC til 30 mM til supernatanten. Inkuber på is i 5 minutter.
- Centrifuge lysat i 10 min ved 16.000 x g til pellet uopløseligt materiale. Overfør og hold 15% af Clear lysat som input til fremtidige trin.
3. Isoler ribosome/mRNA komplekser
- Tilsæt 50 ml antistof-bundne perler til celle-lysat supernatanten og der inkuberes ved blanding ved 4 °c med end-over-end-rotation i 30 min. Det er her, anti-GFP antistoffer vil binde GFP-mærkede ribosomer, så vi kan yderligere isolere RNA fra disse ribosomer.
- Saml perler på en magnetisk rack og vask 5 gange med høj-salt polysome vaskebuffer.
- Træk og kassér væske, når perlerne er samlet på siden af røret. Derefter pipetter og genudstedelse 200 ml højsalt polysome vaskebuffer flere gange. Gentag dette trin 5 gange, og Kassér alle buffer efter den endelige gentagelse. Fortsæt straks til næste trin.
4. Isoler mRNA
- Placer perler i RLT buffer. Følgende trin er taget direkte fra RNeasy mini kit-protokollen og blev ikke udvidet på nogen måde.
Forsigtig: RLT buffer indeholder guanidinsalte; Bland ikke med blegemiddel. - Centrifuge lysat i 3 minutter ved fuld hastighed 13.000 rpm eller 16.000 g ved 4 °C. Fjern forsigtigt supernatanten på 350 mL ved pipettering, og overfør den til et nyt Micro fuge-rør. Brug kun denne supernatanten (lysate) i de efterfølgende trin.
- Tilsæt et tilsvarende volumen på 70% ethanol i mikrofuge røret.
- Der overføres op til 700 mL af prøven, herunder eventuelle bundfælde, som kan være dannet, til en spin kolonne anbragt i et 2 mL opsamlings glas. Luk låget forsigtigt og centrifugeres i 15 s ved ≥ 8.000 x g for at vaske spin kolonne membranen. Kassér gennemstrømnings strømmen.
- Tilsæt 350 mL buffer RW1 til spin kolonnen. Luk låget forsigtigt og centrifugeres i 15 s ved ≥ 8.000 x g for at vaske spin kolonne membranen. Kassér gennemstrømnings-og genbrug indsamlings røret i næste trin.
Forsigtig: buffer RW1 indeholder guanidinsalte; Bland ikke med blegemiddel. - Tilsæt 350 mL buffer RW1 til spin kolonnen. Luk låget forsigtigt og centrifugeres i 15 s ved ≥ 8.000 x g. Kassér gennemstrømnings strømmen.
- Tilsæt 500 mL buffer RPE til spin kolonnen. Luk låget forsigtigt og centrifugeres i 15 s ved ≥ 8.000 x g for at vaske spin kolonne membranen. Kassér gennemstrømnings strømmen.
- Tilsæt 500 mL buffer RPE til spin kolonnen. Luk låget forsigtigt og centrifugeres i 2 min ved ≥ 8.000 x g for at vaske spin-kolonne membranen. Fjern derefter forsigtigt spin kolonnen fra opsamlingsrøret, hvilket sikrer, at kolonnen ikke kontakter gennemstrømningen.
- Placer spin søjlen i et nyt 2 mL opsamlings glas, og kassér det gamle rør med gennemstrømnings røret. Luk låget forsigtigt og centrifugeres ved fuld hastighed i 1 min. for at fjerne rest bufferen.
- Placer spin søjlen i et nyt 1,5 mL opsamlings glas. Tilsæt 30-50 mL RNase-frit vand direkte til spin kolonne membranen. Luk låget forsigtigt og centrifugeres i 1 min ved ≥ 8.000 x g for at elueres RNA.
- Hvis det forventede RNA-udbytte er > 30 mg, gentages trin 4,10 med endnu et 30-50 ml RNase-frit vand eller ved hjælp af elueres fra trin 4,10 (hvis der kræves høj [RNA]). Genbrug indsamlings røret fra trin 4,10.
- Brug renset RNA til downstream-analyse, herunder RNA-sekventering eller realtids kvantitativ PCR eller Opbevar RNA opløst i RNase-fri H2O ved-80 °c i op til 1 år.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vores tidligere undersøgelser4,7 tyder på, at CD36 kan fungere som en switch for arteriolær differentiering og kapillar arterialisering via LPA/PKD-1 signalering pathway. For at undersøge, om LPA/PKD-1-CD36 signalering-aksen er essentiel for arteriogenesis in vivo, har vi etableret de nye FÆLDNINGS linjer, der ikke kun har global CD36-mangel eller Endothelial-specifik-CD36-eller PKD-1-mangel, men også tillader selektiv isolation af ribosome-bundet RNA fra CRE-mærkede celle nedstamningens af gfp, og er nyttige som en CRE-aktiveret fluorescerende reporter2.
Ved at udføre genotypebestemmelse bemærkede vi, at CD36-genet blev slettet globalt eller i den vaskulære endothelia for endotelspecifikke CD36 null-mus (data ikke vist), og PKD-1-genet blev også slettet i den vaskulære endothelia. Figur 1 er et repræsentativt resultat, der viser den oprettede globale CD36 TRAP eller Endothelial-specifikke PKD-1 TRAP Mouse linje. Ved hjælp af immunofluorescens mikroskopi viste vi, at en forbedret GFP er genetisk mærket på ribosomerne i endotelcellerne in vivo (figur 2). Vi derefter isoleret ribosom bundet mRNA direkte in vivo og med succes opnået kvalitet RNA som vist ved måling af forholdet mellem 260 nm og 230 nm (figur 3). Yderligere analyse ved hjælp af realtids qPCR viste, at ekspression af visse arteriogene gener var upregulated i lunge endothelia af CD36 null-mus (figur 4), hvilket indikerer, at det isolerede RNA direkte in vivo i den vaskulære endothelia ved hjælp af FÆLDEN teknologi er kvalificeret til downstream-studier. Disse undersøgelser omfatter analyse af genekspression på mRNA-niveauer og identifikation af nye transkriptomer under fysiologiske og patologiske forhold, som er afgørende for forståelsen af reguleringen af vaskulær endotelcelle differentiering og funktionel angiogenesis.
Figur 1: et eksempel på genotypebestemmelse for genetisk manipulerede trapmus. Repræsentative resultater for genotypebestemmelse af globale CD36 null TRAP-mus eller betingede vævsspecifikke PKD-1 null Trap-mus. VEC-CRE- Transgene-mus udtrykker CRE rekombinase under kontrol af en Cdh5 Promoter B6; 129-TG (Cdh5-CRE) 1Spe/J mus var brød med B 6.129 S4-gt (Rosa) 26Sor tm1(CAG-egfp/Rpl10a,-BirA) wtp/j, og yderligere med b 6.129 S1tm1Mfe-CD36 /j eller PKD-1loxp/loxp. Den dobbelte mutant CD36 Trap (A) og PKD-1 Trap (B) mus blev opnået, hvor en forbedret gfp er tagget på L10a af ribosom i vaskulære endotelceller, og CD36 genet slettes globalt og PKD-1- genet specifikt i den vaskulære endothelia. Mus haler blev indsamlet til DNA ekstraktion ved hjælp af et kit og baseret på instruktion fra producenten, og DNA i alle prøver blev forstærket af polymerase kædereaktion (PCR), og derefter evalueret af 1-2% agopstået-gel elektroforese. Fotografier er det agrose gel-billede, der viser resultaterne af forstærkning af CD36 -eller PKD-1- mutanter med/uden diffuse Rings-eller vildtype-mus (WT). Mus genotype panel A: Lane 1, CD36-/-; TRAP+/-; Lane 2, TRAP+/+; Lane 3, CD36-/-; TRAP+/+; Cdh5+/-; Lane 4, TRAP+/+; Cdh5+/-; Lane 5, CD36-/-; TRAP+/+; Cdh5+/-; Lane 6, CD36-/-; TRAP+/-; Cdh5+/-; Lane 7, TRAP+/+; Cdh5+/-; Lane 8, TRAP+/-; Lane 9, DNA stigen. Mus genotype panel B: Lane 1, PKD-1fl/-; TRAP+/-; Cdh5+/-; Lane 2, PKD-1fl/fl; TRAP+/+; Cdh5+/-; Lane 3, PKD-1fl/-; TRAP +/+; Lane 4, PKD-1fl/fl; TRAP +/+; Cdh5+/-; Lane 5, PKD-1fl/fl; TRAP+/+; Cdh5+/-; Lane 6, PKD-1fl/-; Lane 7, DNA stigen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: et eksempel på Endothelial-specifikt forbedret GFP-udtryk under fluorescens mikroskop. Blod vaskulære endothelia i lungevævet af cd36 knockout fælde mus var egfp positiv (grøn farve, øvre panel) under immunofluorescens mikroskop. Manglende den primære GFP antistof blev brugt som en negativ kontrol (nederste panel). Musevæv blev co-plettet ved hjælp af GFP og CD31 antistoffer med passende sekundære fluorescens antistoffer (rød farve). Repræsentative billeder, der er erhvervet ved hjælp af et Fluorescens mikroskopi-billedbehandlingssystem. Bar = 200 μm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: kvalitet og mængde af ribosomal-bundet mRNA af endotelceller renset og direkte udvundet fra væv af fælde mus. Et eksempel på kvalitet og koncentration af renset RNA fra lungevævet i en CD36 knock out fælde mus. Der blev anvendt et spektrofotometer til vurdering af mængden og renheden af det ekstraherede RNA. Som vist i dette tal er koncentrationen af RNA 51,2 ng/μL. Forholdet mellem absorbans ved 260 nm og 280 Nm er 1,87, hvorimod forholdet mellem 260 nm og 230 nm er 2,40, hvilket indikerer renheden af de ekstraherede RNA-prøver. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: et eksempel på udtryk for angiogene gener og notch ligander i ribosome-bundet RNA af endotelceller af realtid qPCR assays. Den isolerede mRNA fra endotel ribosom af lungerne i fælde kontrol og EF-specifikke CD36 mangelfulde Trap mus blev udsat for real-time qPCR assays, ved hjælp af primere købt fra et biotekselskab, herunder Hey2, ephrin B2, og Delta som ligand 4, STK. DLL4. Huset holder gener PPIA blev brugt til normalisering. Den studerende t-test blev brugt til statistisk analyse. *P < 0,05; * *P < 0,01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Angiogenese er en kompleks flertrinsproces, hvor EF-specifik angiogen gen transskription og udtryk spiller en væsentlig rolle i EF-differentiering og angiogen omprogrammering3,4. For at overvinde barriererne fra den cellulære mangfoldighed og arkitektoniske kompleksitet for bedre at forstå funktionen af det pattedyrs vaskulære system på molekylært niveau in vivo, har vi skabt EF-specifikke TRAP-mus, ledsaget af EF-specifikke CD36 , EF-specifik PKD-1- mangel eller global CD36 -mangel ved hjælp af en alsidig floxed fælde musemodel eller Egfp-Trap genereret i pu-laboratoriet2 i kombination med andre genetisk manipulerede muse linjer. Dette vil gøre det muligt at undersøge hele det oversatte mRNA-supplement af vaskulære ECs fra intakte væv in vivo under EF-specifik i PKD-1 eller Global mangel i CD36 genekspression8, hvilket er afgørende for undersøgelse af gen transkriptionen forbundet med fysiologisk og patologisk angiogenese4,7,9,10. I overensstemmelse med andre undersøgelser1,2har vores tilgang til isolering af EF-specifik mRNA ikke brug for vævs fiksering, dissociation af væv eller isolering af enkeltceller fra væv og undgår dermed de potentielle artefakter, der resultatet af disse behandlinger. Vi var også i stand til at udføre FÆLDE rensninger og ekstraktkvalitet ribosome-bundet mRNA fra det frosne væv. Desuden er det, der blev renset, det oversatte mRNA-indhold i ECs direkte in vivo, som bedre repræsenterer proteinindholdet sammenlignet med brugen af den totale RNA for genekspressions profil. Desuden er fælgen transgen genetisk etiketter ECs med egfp, også tillader ikke kun for udvinding af ribosome-bundet mRNA, men også for visualisering i immunhistokemiske eller elektrofysiologiske undersøgelser.
Tilgangen viste imidlertid lave RNA-udbytter, især med renset mRNA fra hjertets væv eller fra tidligere frosne væv. Vi har således brug for at optimere betingelserne for at øge udbyttet. Men vi observerede i EF-specifikke CD36 mangelfulde mus, niveauerne af ephrin B2 og DLL4 blev signifikant forøget i både lunge (figur 4) og hjerte (data ikke vist) endothelia sammenlignet med kontrol. Disse resultater var i overensstemmelse med vores tidligere in vitro-studier3,4, hvilket tyder på, at RNA-kvaliteten er tilstrækkelig til downstream-analyse. Afkastet var lavt muligvis på grund af de strenge betingelser. For at overvinde denne begrænsning og forbedre udbyttet, er det afgørende at oprette en RNase-fri arbejdszone og dekontaminere arbejdsflader og udstyr, der kan blive forurenet med RNase og skifte handsker ofte for at udtrække kvalitet RNA. Det er også afgørende at finde passende koncentrationer af GFP-antistoffer i affinitets matrixen og anvende passende koncentrationer af Rnasehæmmer i vævs lyse bufferen. Brug af RNase-fri plastik ware og reagenser er gavnlig for RNA-ekstraktion fra endotelribosomer af målvævet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dr Ren's arbejde er støttet af American Heart Association (13SDG14800019; BR), ann's Hope Foundation (FP00011709; BR), American Cancer Society (86-004-26; MCW Cancer Center til BR), og National Institute of Health (HL136423; BR); Jordan palmer understøttes af 2018 MCW CTSI 500 Stars Internship-programmet; P. Moran understøttes af et institutionelt forsknings uddannelses stipendium fra NHLBI (5T35 HL072483-34).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer with Nanochips and Picochips | Agilent | G2939AA, 5067-1511 & 5067-1513 | |
| Cell scrapers | Sarstedt | 83.1832 | |
| Homogenizers | Fisher Scientific | K8855100020 | |
| Magnet (Dynamag-2) | Invitrogen | 123-21D | Will depend on purification scale; samples in 1.5-mL tubes can be concentrated on a DynaMag-2 |
| Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| NanoDrop 2000C spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000C | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5430R | with rotor for 1.5-mL microcentrifuge tubes |
| RNase-free 1.5mL microcentrifuge tubes | Applied Biosystems | AM12450 | |
| Rnase-free 50-mL conical tubes | Applied Biosystems | AM12501 | |
| RNase-free 1000-μl filter tips | Rainin | RT-1000F | |
| RNase-free 200-μl filter tips | Rainin | RT-200F | |
| RNase-free 20-μl filter tips | Rainin | RT-20F | |
| Rotor for homogenizers | Yamato | LT-400D | |
| Tube rotator, Labquake brand | Thermo Fisher | 13-687-12Q |
References
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).
- Zhou, P., et al. Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).
- Best, B., Moran, P., Ren, B. VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan. Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).
- Ren, B., et al. LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming. Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).
- Ren, B. Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37 (2016).
- Ren, B. FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis? Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).
- Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model. Nucleic Acids Research. 42, e14 (2014).
- Dong, L., et al. Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling. Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).
- Ren, B., et al. ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).
- Skuli, N., et al. Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes. Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).
