Summary
我々は、RNA精製と組み合わせてリボソーム中の増強された緑色蛍光タンパク質(EGFP)のEC特異的遺伝的タグを介して、マウス脳、肺および心臓組織における血管内皮細胞(EC)からリボソーム結合mRNAを精製するアプローチを提示する。.
Abstract
多くの研究は、qPCRおよびRNAシーケンシングによる転写物および遺伝子発現のインビトロ分析のために、インビトロ細胞アッセイおよび全組織または動物からの特定の細胞型の単離に限定されている。複雑な組織や臓器における特定の細胞型の包括的な転写物および遺伝子発現解析は、遺伝子が調節される細胞および分子機構と組織恒常性および器官との関連を理解するために重要である。関数。本稿では、動物肺の血管内皮におけるリボソーム結合RNAを生体内で直接単離する方法論を例として示す。組織処理およびRNA精製のための具体的な材料および手順について説明し、RNAの品質と収量の評価、ならびに動脈系遺伝子アッセイのためのリアルタイムqPCRを含む。このアプローチは、リボソーム親和性精製(TRAP)技術の翻訳として知られており、複雑な組織における任意の特定のタイプの生体内で直接生体内の特定の細胞タイプの遺伝子発現およびトランスクリプトーム分析の特性評価に利用することができる。
Introduction
哺乳類の脳、心臓、肺などの複雑な組織では、細胞の不均一性の高いレベルは、組織サンプル全体から得られる遺伝子発現データの分析を複雑にします。生体内の特定の細胞型における遺伝子発現プロファイルを観察するために、最近新しい方法論が開発され、遺伝子決定された任意の細胞型の翻訳されたmRNA補体全体の尋問が可能になった。この方法論は、翻訳リボソーム親和性精製(TRAP)技術1、2として知られている。これは、動物の他の血管新生関連遺伝子を遺伝的に操作する場合、内皮細胞生物学と血管新生を研究するのに有用なツールです。
血管新生PKD-1シグナル伝達および血管新生遺伝子CD36の転写は、内皮細胞(EC)分化および機能血管新生3、4、5、6に重要であることを示した。遺伝子転写およびECトランス分化における血管新生および代謝シグナル伝達の分子機構を決定するために、TRAP技術1に基づいて特異的に削除された血管新生遺伝子を用いた遺伝子組み換えTRAPマウスを作成した。,2.さらに、TRAP動物では、血管内皮またはcd36遺伝子の世界的な欠失にpkd-1またはcd36遺伝子欠損があるだけでなく、増強された緑色蛍光タンパク質(EGFP)も遺伝的にタグ付けされています。ECのリボソームの翻訳TRAPは、標的組織の血管内皮から直接リボソーム結合mRNAの親和性精製を可能にし、遺伝子発現の解析とEC分化に関連する新しい転写物の同定を可能にし、生体内条件下で直接血管新生。これらの遺伝子組み換え動物では、内皮からリボソーム結合RNAを単離することに成功しました。精製されたRNAは、EC分化および機能の調節における血管新生または動脈系遺伝子のさらなる特徴付けに使用することができる。このプロトコルは、生体内で直接IC内のmRNAを単離するためのTRAPアプローチを実装するためのステップバイステップガイドを提供します。
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Protocol
動物実験のために、ここに記載されているすべての方法は、ウィスコンシン医科大学の機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されています。
1. 試薬の準備
- 10mM HEPES、pH 7.4、150mM KCl、5mM MgCl 2、0.5 mM DTT、100mg/mLシクロヘキシミド、プロテアーゼ阻害剤、および組換えRNase阻害剤の濃度に対するリシスバッファーを以下に説明する。
- RNaseフリー脱イオン水の500 mLに以下の試薬を追加:HEPESの1.19グラム、 KClの5.59g、MgCl2の0.24g、DTTの35mg、シクロヘキシミドの0.5 mL、およびNaOHはpH 7.4まで必要に応じて、EDTAフリープロテアーゼ阻害剤(10mLあたり1つのミニ錠剤)およびRNase阻害剤(10 μL/mL)。
- 4°Cの冷蔵庫に最大1ヶ月間保存してください。
- 10 mM HEPES、pH 7.4、350 mM KCl、5 mM MgCl 2、1%vol/vol CA-630、0.5 mM DTT、および 100 mg/mL シクロヘキシミドの濃度に高塩ポリソーム洗浄バッファーを調製します。
- RNaseフリー脱イオン水の500 mLに以下の試薬を添加する:HEPESの1.19g、KClの13.05g、MgCl2の0.24g、ニオニティック、非脱帰性洗剤の5mL、DTTの7.7mgチューブの5、および7.5mLのシメフロフが必要になるまで。
- 4°Cの冷蔵庫に最大1ヶ月間保存してください。
- 実験開始前にタンパク質G磁気ビーズに抗GFP抗体を結合する。
- タンパク質Gビーズに200mLのPBSで希釈した抗GFP抗体を10mg添加する。
- 室温で10分間エンドオーバー回転でインキュベートします。
- ビーズを磁気ラックに置き、上清を取り除きます。
- ビーズを200mLのPBSで一時停止し、最大1週間4°Cの冷蔵庫に保存します。
- 100 mg/mL シクロヘキシミドで氷冷PBSを調製します。
- 99体の氷冷PBSに1体のシクロヘキシミド溶液(100mg/mL)を添加する。
2. 所望の組織を分離し、lyseする
- ケタミン(500mg/kg/体重)とキシラジン(10mg/kg/体重)のIP注射によりマウスを安楽死させ、所望の組織(すなわち、心臓、肺)を分離する。すぐに次の手順に進みます。
- 100 mg/mL シクロヘキシミドを使用して、所望の組織を 500 mL の氷冷 PBS に入れます。
- モータ駆動ホモジナイザーまたは小クリアランスガラスホモジナイザーを用いた細胞懸濁液に組織をミンチする。モータ駆動ホモジナイザーを使用する場合は、RNAの不飽和を避けるために、低周波(<15,000 Hz)で均質化を1分未満に制限します。
- ピペッティングとバッファの再描画により、200 mLのリシスバッファーで細胞ペレットを中断します。さらに、小クリアランスガラスホモジナイザーで10ストローク、またはモータ駆動ホモジナイザーで低周波(<15,000 Hz)で15秒間セルサスペンションを均質化します。
- 遠心分離機は、4°Cで2,000 x gで10分間均質化し、ペレット核と大きな細胞の破片にし、上清を保ちます。
- 上清に1%vol/volおよびDHPCに非変性の非変性洗剤を30mMに加える。氷の上で5分間インキュベートします。
- 遠心分離機は、ペレット不溶性材料に16,000 x gで10分間溶解します。転送し、将来のステップのための入力としてクリアリサートの15%を維持します。
3. リボソーム/mRNA複合体の単離
- 細胞リサート上清に50mLの抗体結合ビーズを加え、4°Cで混合物を30分間エンドオーバー回転でインキュベートします。これは、抗GFP抗体がGFPタグ付きリボソームに結合し、これらのリボソームからRNAをさらに単離することを可能にする場所です。
- 磁気ラックにビーズを集め、高塩ポリソーム洗浄バッファーで5回洗います。
- チューブの側面にビーズが集まったら、液体を引き上げて捨てます。次にピペットを入れ直し、200mLの高塩ポリソーム洗浄バッファーを数回再描画する。この手順を 5 回繰り返し、最終的な繰り返しに続くすべてのバッファーを破棄します。すぐに次の手順に進みます。
4. mRNAの単離
- ビーズを RLT バッファーに配置します。次の手順は、RNeasy ミニ キット プロトコルから直接実行され、展開されませんでした。
注意: RLT バッファーにはグアニジン塩が含まれています。漂白剤と混ぜないでください。 - 遠心分離機は、フルスピード13,000 rpmまたは4°Cで16,000gで3分間リザートします。ピペッティングにより350mLの上清を慎重に取り除き、新しいマイクロフュージチューブに移します。後続の手順では、この上清 (リサート) のみを使用します。
- マイクロフュージチューブに70%エタノールを同量に加えます。
- 2 mL回収管に入れられたスピンカラムに、形成された可能性のある沈殿物を含む試料の最大700 mLを転送する。蓋をそっと閉じ、遠心分離機を15sで15sで閉じ、スピンカラム膜を洗います。フロースルーを破棄します。
- 350 mL のバッファ RW1 をスピンカラムに追加します。蓋をそっと閉じ、遠心分離機を15sで15sで閉じ、スピンカラム膜を洗います。フロースルーを破棄し、次のステップで収集チューブを再利用します。
注意: バッファ RW1 にはグアニジン塩が含まれています。漂白剤と混ぜないでください。 - 350 mL のバッファ RW1 をスピンカラムに追加します。蓋をそっと閉じ、遠心分離機を15sで15~8,000 x gで閉じます。フロースルーを破棄します。
- スピンカラムに500 mLのバッファRPEを追加します。蓋をそっと閉じ、遠心分離機を15sで15sで閉じ、スピンカラム膜を洗います。フロースルーを破棄します。
- スピンカラムに500 mLのバッファRPEを追加します。蓋をそっと閉じ、遠心分離機を2分間≥8,000 x gで閉じ、スピンカラム膜を洗います。次に、コレクション チューブからスピン カラムを慎重に取り外し、列がフロースルーに接触しないようにします。
- 新しい2 mLコレクションチューブにスピンカラムを配置し、フロースルーで古いチューブを廃棄します。蓋を軽く閉じ、遠心分離機を全速力で1分間閉じ、残留バッファーを取り除きます。
- スピンカラムを新しい1.5 mLコレクションチューブに入れます。スピンカラム膜に直接RNaseフリー水の30-50 mLを追加します。蓋をそっと閉じ、遠心分離機を1分間≥8,000 x gで閉じてRNAを溶出します。
- 予想されるRNA収率が>30 mgの場合は、RNaseフリー水の別の30-50 mLでステップ4.10を繰り返すか、ステップ4.10から溶出を使用します(高い[RNA]が必要な場合)。ステップ 4.10 からコレクション チューブを再利用します。
- 精製RNAを使用して、RNAシーケンシングまたはリアルタイム定量PCRを含む下流分析に使用するか、またはRNaseフリーH2Oに溶解した保存RNAを最大1年間-80°Cで保存します。
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Representative Results
我々の以前の研究4,7は、CD36がLPA/PKD-1シグナル伝達経路を介した動脈分化および毛細血管動脈化のスイッチとして機能する可能性があることを示唆している。LPA/PKD-1-CD36シグナル伝達軸が生体内の動脈形成に不可欠であるかどうかを調べるために、我々は、グローバルCD36欠乏症または内皮特異的CD36-またはpkd-1欠乏症を有するだけでなく、選択的分離を可能にする新しいTRAPラインを確立した。GFPによるクレマークされた細胞系統からのリボソーム結合RNAの、およびクレ活性化蛍光レポーター2として有用である。
ジェノタイピングを行うことにより、cd36遺伝子が世界的に、または内皮特異的cd36ヌルマウス(データを示さない)の血管内皮内で削除され、pkd-1遺伝子も血管内皮で削除されたことが観察された。図1は、作成されたグローバルcd36 TRAPまたは内皮特異的pkd-1 TRAPマウスラインを示す代表的な結果である。免疫蛍光顕微鏡を用いて、強化されたGFPが生体内細胞のリボソームに遺伝的にタグ付けされていることが実証されました(図2)。次いでリボソーム結合mRNAを生体内で直接単離し、260nmと230nmの比の測定により得られた品質RNAを得た(図3)。リアルタイムqPCRを用いたさらなる分析は、特定の動脈生遺伝子の発現がcd36ヌルマウスの肺内皮において上方に調節されたことを示した(図4)。技術は下流の研究のために修飾される。これらの研究には、mRNAレベルでの遺伝子発現の解析と、血管内皮細胞分化の調節を理解するために不可欠な生理学的および病理学的条件下での新規転写物の同定が含まれる。そして機能的血管新生。
図1:遺伝子組み換えTRAPマウスのジェノタイピングの一例。グローバルcd36ヌルTRAPマウスまたは条件付組織特異的pkd-1ヌルTRAPマウスのジェノタイピングに関する代表的な結果。VEC-creトランスジェニックマウスは、Cdh5プロモーターB6の制御下でCre組換ベニアゼを発現する。129-Tg(Cdh5-cre)1Spe/JマウスはB6.129S4-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-EGFP/Rpl10a、-birA)Wtp/J、さらにB6.129S1tm1Mfe-cd36 /Jまたはpkd-1lox.を有する。 二重変異型CD36 TRAP(A)およびpkd-1 TRAP(B)マウスを得た。 血管内皮に特異的にpkd-1遺伝子。マウステールをキットを用いてDNA抽出用に採取し、メーカーの指示に基づいて採取し、全ての試料中のDNAをポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅し、その後1-2%アガロースゲル電気泳動で評価した。写真は、TRAPまたは野生型(WT)マウスを含む/ないcd36またはpkd-1変異体の増幅の結果を示すアガロースゲル画像である。 マウス遺伝子型パネルA:レーン1、cd36-/-; トラップ+/-;レーン 2, トラップ+/+;レーン 3, cd36-/-;トラップ+/+;Cdh5+/-;レーン 4, トラップ+/+;Cdh5+/-;レーン 5, cd36-/-;トラップ+/+;Cdh5+/-;レーン 6, cd36-/-;トラップ+/-;Cdh5+/-;レーン 7, トラップ+/+;Cdh5+/-;レーン 8, トラップ+/-;レーン9、DNAはしご。マウス遺伝子型パネルB:レーン1、pkd-1fl/-; トラップ+/-;Cdh5+/-;レーン 2, pkd-1fl/fl;トラップ+/+;Cdh5+/-;レーン 3, pkd-1fl/-;トラップ+/+;レーン 4, pkd-1fl/fl;トラップ+/+;Cdh5+/-;レーン 5, pkd-1fl/fl;トラップ+/+;Cdh5+/-;レーン 6, pkd-1fl/-;レーン7、DNAはしご。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:蛍光顕微鏡下での内皮特異的増強GFP発現の一例。cd36ノックアウトTRAPマウスの肺組織における血液血管内皮は、免疫蛍光顕微鏡下でEGFP陽性(緑色、上パネル)であった。一次GFP抗体が欠損し、陰性対照(下パネル)として用いた。マウス組織は、適切な二次蛍光抗体(赤色)とGFPおよびCD31抗体を用いて共染色した。蛍光顕微鏡イメージングシステムを用いて取得した代表的な画像。Bar = 200 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:TRAPマウスの組織から精製し、直接抽出した内皮細胞のリボソーム結合mRNAの質および量。cd36における肺組織からの精製RNAの品質および濃度の例はTRAPマウスをノックアウトする。分光光度計を用いて抽出したRNAの量と純度を評価した。この図に示すように、RNAの濃度は51.2 ng/μLです。260nmおよび280 nmの吸光度の比率は1.87であるのに対し、260nmおよび230 nmの比率は2.40であり、抽出されたRNAサンプルの純度を示す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:リアルタイムqPCRアッセイによる内皮細胞のリボソーム結合RNAにおける血管新生遺伝子およびノッチリガンドの発現の一例。TRAPコントロールおよびEC特異的CD36欠損トラップマウスにおける肺の内皮リボソームから単離されたmRNAを、Hey2、エフリンB2、およびリガンドのようなデルタを含むバイオテクノロジー企業から購入したプライマーを用いて、リアルタイムqPCRアッセイを行った。4 (DLL4)。ハウスキーピング遺伝子PPIAは、正常化のために使用された。学生t-testは統計分析に用いられた。 *P < 0.05;**P <0.01.
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Discussion
血管新生は、EC特異的血管新生遺伝子転写および発現がEC分化および血管新生リプログラミング3、4において重要な役割を果たす複雑な多段階プロセスである。細胞の多様性と建築の複雑さから、生体内の分子レベルで哺乳類血管系の機能をよりよく理解するために、EC特異的なCD36を伴うEC特異的TRAPマウスを作成しました。 、EC特異的pkd-1欠乏またはグローバルcd36欠乏は、他の遺伝子操作マウスラインと組み合わせてPu実験室2で生成された汎用性の高いフロキセドTRAPマウスモデルまたはEGFP-TRAPを用いて用いる。これにより、pkd-1またはcd36遺伝子発現8におけるEC特異的な生体内の無傷組織からの血管ECの翻訳されたmRNA補体全体の検査が可能となり、これは、調査に不可欠である。生理学的および病理学的血管新生に関連する遺伝子転写 4,7,9,10.他の研究1、2と一致し、EC特異的mRNAの単離に対する我々のアプローチは、組織の固定、組織の解離、または組織からの単一細胞の単一細胞の単一細胞の単一細胞の単一を必要とせず、したがって潜在的なアーティファクトを回避するこれらの治療の結果。また、TRAP精製を行い、凍結組織から高品質のリボソーム結合mRNAを抽出することができました。さらに、精製されたのは、生体内で直接ICの翻訳されたmRNA含有量であり、これは遺伝子発現プロファイルに全RNAを使用する場合と比較してタンパク質含有量をより良く表す。さらに、TRAPトランスジーンはEGFPを用いてICを遺伝子的に標識し、リボソーム結合mRNAの抽出だけでなく、免疫組織化学的または電気生理学的研究における可視化にも利用できる。
しかし、このアプローチは、特に心臓組織または以前に凍結された組織からの精製されたmRNAを用いて、低RNA収率を示した。したがって、収量を増やすために条件を最適化する必要があります。しかしながら、EC特異的cd36欠損マウスでは、コントロールと比較した場合、肺(図4)と心臓(図4)と心臓(図4)の両方でエフリンB2およびDLL4のレベルが有意に増加した。これらの結果は、以前のインビトロ研究3,4と一致しており、これはRNA品質が下流分析に十分であることを示唆している。厳しい条件のため、収率は低かった。この制限を克服し、収量を改善するためには、RNaseフリーの作業ゾーンを設置し、RNaseで汚染される可能性のある作業面や機器を除染し、品質のRNAを抽出するために手袋を頻繁に交換することが重要です。また、親和性マトリックス中に適切な濃度のGFP抗体を見つけ、組織リシスバッファーに適切な濃度のRNase阻害剤を使用することも重要です。RNaseフリープラスチックウェアおよび試薬の使用は、標的組織の内皮リボソームからのRNA抽出に有益である。
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Disclosures
著者らは、利益相反がないと宣言している。
Acknowledgments
レン博士の研究は、アメリカ心臓協会(13SDG14800019;)BR)、アンの希望財団(FP00011709;BR)、米国癌学会(86-004-26;BRへのMCW癌センター)、および国立衛生研究所(HL136423);BR);ジョーダン・パーマーは、2018年MCW CTSI 500スターインターンシッププログラムによってサポートされています。P.モランは、NHLBI(5T35 HL072483-34)からの機関研究訓練助成金によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer with Nanochips and Picochips | Agilent | G2939AA, 5067-1511 & 5067-1513 | |
| Cell scrapers | Sarstedt | 83.1832 | |
| Homogenizers | Fisher Scientific | K8855100020 | |
| Magnet (Dynamag-2) | Invitrogen | 123-21D | Will depend on purification scale; samples in 1.5-mL tubes can be concentrated on a DynaMag-2 |
| Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| NanoDrop 2000C spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000C | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5430R | with rotor for 1.5-mL microcentrifuge tubes |
| RNase-free 1.5mL microcentrifuge tubes | Applied Biosystems | AM12450 | |
| Rnase-free 50-mL conical tubes | Applied Biosystems | AM12501 | |
| RNase-free 1000-μl filter tips | Rainin | RT-1000F | |
| RNase-free 200-μl filter tips | Rainin | RT-200F | |
| RNase-free 20-μl filter tips | Rainin | RT-20F | |
| Rotor for homogenizers | Yamato | LT-400D | |
| Tube rotator, Labquake brand | Thermo Fisher | 13-687-12Q |
References
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