Summary
Nous présentons une approche pour purifier l'ARNm ribosome-lié des cellules endothéliales vasculaires (ECs) directement dans le cerveau de souris, poumon et tissus cardiaques par l'intermédiaire de l'étiquette génétique EC-spécifique de la protéine verte améliorée de fluorescence (EGFP) dans des ribosomes en combination avec la purification d'ARN .
Abstract
De nombreuses études ont été limitées à l'utilisation d'essais cellulaires in vitro et de tissus entiers ou l'isolating de types cellulaires spécifiques d'animaux pour l'analyse in vitro du transcriptome et l'expression des gènes par qPCR et le séquençage de l'ARN. L'analyse complète de transcriptome et d'expression génique de types cellulaires spécifiques dans des tissus et organes complexes sera essentielle pour comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels les gènes sont réglementés et leur association avec l'homéostasie tissulaire et l'organe Fonctions. Dans cet article, nous démontrons la méthodologie pour l'isolement de l'ARN ribosome-lié directement in vivo dans l'endothélia vasculaire des poumons animaux comme exemple. Les matériaux et procédures spécifiques pour le traitement des tissus et la purification de l'ARN seront décrits, y compris l'évaluation de la qualité et du rendement de l'ARN ainsi que qPCR en temps réel pour les essais de gènes artériogènes. Cette approche, connue sous le nom de technique de purification d'affinité de ribosome de traduction (TRAP), peut être employée pour la caractérisation de l'expression de gène et de l'analyse de transcriptome de certains types de cellules directement in vivo dans n'importe quel type spécifique dans les tissus complexes.
Introduction
Dans les tissus complexes tels que le cerveau, le cœur et le poumon des mammifères, les niveaux élevés d'hétérogénéité cellulaire compliquent l'analyse des données d'expression génique dérivées d'échantillons de tissus entiers. Pour observer les profils d'expression génique dans un type de cellule particulier in vivo, une nouvelle méthodologie a été développée récemment, qui permet l'interrogation de l'ensemble de l'ARNm traduit de tout type de cellule génétiquement défini. Cette méthodologie est connue sous le nom de traduction ribosome affinity purification (TRAP) technique1,2. C'est un outil utile pour étudier la biologie cellulaire endothéliale et l'angiogenèse lorsqu'il est combiné avec la manipulation génétique d'autres gènes associés à l'angiogenèse chez les animaux.
Nous avons montré que la signalisation angiogénique PKD-1 et la transcription du gène angiogénique CD36 sont critiques pour la différenciation des cellules endothéliales (EC) et l'angiogenèse fonctionnelle3,4,5,6. Pour déterminer les mécanismes moléculaires de la signalisation angiogénique et métabolique dans la transcription génique et la transdifférenciation EC, nous avons créé des souris TRAP génétiquement modifiées avec des gènes angiogéniques spécifiquement supprimés sur la base de la technique TRAP1 , 2. En outre, chez nos animaux TRAP, non seulement ils ont une déficience génétique pkd-1 ou cd36 dans l'endothélia vasculaire ou la suppression globale du gène cd36, mais une protéine de fluorescence verte améliorée (EGFP) est également génétiquement étiquetée sur EC traduise des ribosomes. TRAP permet la purification d'affinité de l'ARNm lié au ribosome directement à partir de l'endothelia vasculaire des tissus ciblés, permettant l'analyse de l'expression génique et l'identification de nouveaux transcriptomes qui sont associés à la différenciation des CE et angiogenèse directement dans des conditions in vivo. Nous avons réussi à isoler l'ARN lié au ribosome de l'endothélie chez ces animaux génétiquement modifiés. L'ARN purifié peut être utilisé pour la caractérisation des gènes angiogéniques ou artériogéniques dans la régulation de la différenciation et des fonctions eC. Ce protocole fournit un guide étape par étape pour mettre en œuvre l'approche TRAP pour l'isolement de l'ARNm dans les EC directement in vivo.
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Protocol
Pour les expériences animales, toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux du Medical College of Wisconsin.
1. Préparer des réactifs
- Préparer un tampon de lyse à des concentrations de 10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 100 mg/mL cycloheximide, inhibiteurs de la protéase, et inhibiteurs recombinants RNase aux concentrations telles que décrites ci-dessous.
- Ajouter les réactifs suivants à 500 ml d'eau déionisée sans RNase : 1,19 g de HEPES, 5,59 g de KCl, 0,24 g de MgCl2, 35 mg de TNT, 0,5 mL de cycloheximide, et NaOH au besoin jusqu'à pH 7,4, inhibiteurs de la protéase sans EDTA (un mini comprimé par 10 ml) et inhibiteur de la RNase (1 0 l/mL).
- Conserver dans un réfrigérateur à 4 oC jusqu'à 1 mois.
- Préparer un tampon de lavage polysome à haute teneur en sel à des concentrations de 10 mM HEPES, pH 7,4, 350 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1% vol/vol CA-630, 0,5 mM DTT, et 100 mg/mL cycloheximide.
- Ajouter les réactifs suivants à 500 ml d'eau déionisée sans RNase : 1,19 g de HEPES, 13,05 g de KCl, 0,24 g de MgCl2, 5 ml de détergent nonionique et non dénaturant, 5 tubes de 7,7 mg de TNT, et 0,5 mL de cycloheximide, et NaOH au besoin jusqu'à pH 7,4.
- Conserver dans un réfrigérateur de 4 oC jusqu'à 1 mois.
- Lier l'anticorps anti-GFP aux perles magnétiques de protéine G avant de commencer l'expérience.
- Ajouter 10 mg d'anticorps anti-GFP dilués dans 200 ml de PBS aux perles de protéines G.
- Incuber avec une rotation de bout sur extrémité pendant 10 minutes à température ambiante.
- Placer les perles sur un support magnétique et retirer le supernatant.
- Suspendre les perles dans 200 ml de PBS et les conserver dans un réfrigérateur de 4 oC jusqu'à 1 semaine.
- Préparer le PBS glacé avec 100 mg/mL de cycloheximide.
- Ajouter 1 volume de solution cycloheximide (100 mg/mL) à 99 volumes de PBS glacé.
2. Isoler et lyser les tissus désirés
- Euthanasier les souris par injection IP de kétamine (500 mg/kg/poids corporel) et de xylazine (10 mg/kg/poids corporel) et isoler les tissus désirés (c.-à-d. le cœur, les poumons). Passez immédiatement à l'étape suivante.
- Placer les tissus désirés dans 500 ml de PBS glacé avec 100 mg/mL de cycloheximide.
- Émincer le tissu dans une suspension cellulaire avec un homogénéisateur motorisé ou un homogénéisateur en verre à petit dégagement. Si vous utilisez un homogénéisateur à moteur, limitez l'homogénéisation à moins d'une minute à basse fréquence (15 000 Hz) pour éviter la dénaturation de l'ARN.
- Suspendre les granulés de cellules dans 200 ml de tampon de lyse en pipetting et redessinant le tampon plusieurs fois. Homogénéiser davantage la suspension cellulaire avec 10 coups dans un homogénéisateur en verre à petit dégagement ou pendant 15 secondes à basse fréquence (15 000 Hz) dans un homogénéisateur motorisé.
- Centrifugeuse homogénéise pendant 10 min à 2 000 x g à 4 oC pour granuler les noyaux et les gros débris cellulaires, et garder le supernatant.
- Ajouter le détergent nonionic et non dénaturant à 1% vol/vol et DHPC à 30 mM au supernatant. Incuber sur glace pendant 5 min.
- Centrifugeuse lysate pendant 10 min à 16 000 x g pour granuler les matières insolubles. Transférer et garder 15% de lysate clair comme entrée pour les étapes futures.
3. Isoler les complexes ribosome/ARNm
- Ajouter 50 ml de perles liées aux anticorps pour le mélange de supernatant sysate cellulaire et incuber le mélange à 4 oC avec rotation de bout en bout pendant 30 min. C'est là que les anticorps anti-GFP lieront les ribosomes marqués GFP, nous permettant d'isoler davantage l'ARN de ces ribosomes.
- Recueillir les perles sur un support magnétique et laver 5 fois avec un tampon de lavage polysome à haute teneur en sel.
- Dessiner et jeter le liquide une fois que les perles se sont accumulées sur le côté du tube. Ensuite, pipette et redessiner jusqu'à 200 ml de tampon de lavage polysome à haute teneur en sel à plusieurs reprises. Répétez cette étape 5 fois et jetez tout le tampon après la répétition finale. Passez immédiatement à l'étape suivante.
4. Isoler l'ARNm
- Placer les perles dans le tampon RLT. Les étapes suivantes sont prises directement à partir du protocole de mini kit RNeasy et n'ont pas été élargis en aucune façon.
CAUTION: RLT tampon contient des sels de guanidine; ne PAS mélanger avec de l'eau de Javel. - Centrifugeuse lysate pendant 3 min à pleine vitesse 13 000 tr/min ou 16 000 g à 4 oC. Retirez soigneusement le supernatant de 350 ml par pipetting et transférez-le dans un nouveau tube de microfuge. Utilisez uniquement ce supernatant (lysate) dansles étapes suivantes.
- Ajouter un volume égal de 70 % d'éthanol dans le tube de microfuge.
- Transférer jusqu'à 700 ml de l'échantillon, y compris tout précipité qui aurait pu se former, sur une colonne de spin placée dans un tube de collecte de 2 ml. Fermer le couvercle doucement et la centrifugeuse pendant 15 s à 8 000 x g pour laver la membrane de la colonne de spin. Jetez le flux à travers.
- Ajouter 350 ml de tampon RW1 à la colonne de spin. Fermer le couvercle doucement et la centrifugeuse pendant 15 s à 8 000 x g pour laver la membrane de la colonne de spin. Jetez le flux à travers et réutiliser le tube de collecte à l'étape suivante.
CAUTION: Buffer RW1 contient des sels de guanidine; ne PAS mélanger avec de l'eau de Javel. - Ajouter 350 ml de tampon RW1 à la colonne de spin. Fermer le couvercle doucement et la centrifugeuse pendant 15 s à 8 000 x g. Jetez le flux à travers.
- Ajouter 500 ml de RPE tampon à la colonne de spin. Fermer le couvercle doucement et la centrifugeuse pendant 15 s à 8 000 x g pour laver la membrane de la colonne de spin. Jetez le flux à travers.
- Ajouter 500 ml de RPE tampon à la colonne de spin. Fermer le couvercle doucement et la centrifugeuse pendant 2 min à 8 000 x g pour laver la membrane de la colonne de spin. Ensuite, retirez soigneusement la colonne de spin du tube de collecte, en veillant à ce que la colonne ne touche pas le flux à travers.
- Placez la colonne de spin dans un nouveau tube de collecte de 2 ml et jetez l'ancien tube avec le flux à travers. Fermer le couvercle doucement et la centrifugeuse à pleine vitesse pendant 1 min pour enlever le tampon résiduel.
- Placez la colonne de spin dans un nouveau tube de collecte de 1,5 ml. Ajouter 30-50 ml d'eau sans RNase directement à la membrane de la colonne de spin. Fermer le couvercle doucement et la centrifugeuse pendant 1 min à 8 000 x g pour élifier l'ARN.
- Si le rendement prévu de l'ARN est de 30 mg, répétez l'étape 4.10 avec un autre 30-50 ml d'eau sans NNase, ou en utilisant l'elute de l'étape 4.10 (si haut [ARN] est nécessaire). Réutiliser le tube de collecte de l'étape 4.10.
- Utilisez l'ARN purifié pour l'analyse en aval, y compris le séquençage de l'ARN ou le PCR quantitatif en temps réel ou stockez l'ARN dissous dans H2O sans RNase à -80 oC pendant un an.
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Representative Results
Nos études précédentes4,7 suggèrent que CD36 peut fonctionner comme un commutateur pour la différenciation artériolaire et l'artérielisation capillaire par l'intermédiaire de la voie de signalisation De LPA/PKD-1. Pour étudier si l'axe de signalisation LPA/PKD-1-CD36 est essentiel pour l'artériogenèse in vivo, nous avons établi les nouvelles lignes TRAP qui non seulement ont une carence mondiale en cd36 ou endothélial-spécifique-cd36- ou pkd-1-déficience, mais permettent également l'isolement sélectif de l'ARN ribosome-lié des lignées cellulaires cre-marquées par GFP, et sont utiles en tant que journaliste fluorescent cre-activé2.
En effectuant le génotypage, nous avons observé que le gène cd36 a été supprimé globalement ou dans l'endothélie vasculaire pour les souris nulles cd36 endothéliales spécifiques (données non montrées), et le gène pkd-1 a également été supprimé dans l'endothélie vasculaire. La figure 1 est un résultat représentatif montrant la ligne de souris pkd-1 TRAP cd36 créée par le monde ou la ligne de souris pkd-1 TRAP spécifique à l'endothélial. À l'aide de la microscopie d'immunofluorescence, nous avons démontré qu'un GFP amélioré est génétiquement étiqueté sur les ribosomes des cellules endothéliales in vivo (figure 2). Nous avons ensuite isolé l'ARNm lié de ribosome directement in vivo et avons obtenu avec succès l'ARN de qualité comme montré par la mesure du rapport de 260 nm et 230 nm (figure 3). Une analyse plus approfondie à l'aide de qPCR en temps réel a démontré que l'expression de certains gènes artériogènes était régulée dans l'endothélie pulmonaire des souris cd36 null (figure 4), ce qui indique que l'ARN isolé directement in vivo dans l'endothélie vasculaire à l'aide du TRAP technologie sont qualifiées pour les études en aval. Ces études comprennent l'analyse de l'expression génique au niveau de l'ARNm et l'identification de nouveaux transcriptomes dans des conditions physiologiques et pathologiques, qui sont essentielles pour comprendre la régulation de la différenciation des cellules endothéliales vasculaires et l'angiogenèse fonctionnelle.
Figure 1 : Exemple de génotypage pour les souris TRAP génétiquement modifiées. Résultats représentatifs pour le génotypage des souris TRAP nulles cd36 ou des souris TRAP nulles pkd-1 spécifiques aux tissus conditionnels. Les souris transgéniques VEC-cre expriment Cre recombinase sous le contrôle d'un promoteur de Cdh5 B6 ; 129-Tg (Cdh5-cre)1Spe/J souris étaient du pain avec B6.129S4-Gt(ROSA)26Sor tm1(CAG-EGFP/Rpl10a,-birA)Wtp/J, et plus loin avec B6.129S1tm1Mfe-cd36 /J ou pkd-1loxP/lP. Les souris double mutantes cd36 TRAP (A) et pkd-1 TRAP (B) ont été obtenues, dans lesquelles un GFP amélioré est étiqueté sur L10a du ribosome dans les cellules endothéliales vasculaires, et le gène cd36 est supprimé globalement et gène pkd-1 spécifiquement dans l'endothélia vasculaire. Des queues de souris ont été rassemblées pour l'extraction d'ADN utilisant un kit et basées sur l'instruction du fabricant, et l'ADN dans tous les échantillons a été amplifié par la réaction en chaîne de polymérase (PCR), et puis évalué par l'électrophorèse d'agarose-gel de 1-2%. Les photographies sont l'image de gel d'agarose montrant les résultats de l'amplification des mutants cd36 ou pkd-1 avec/sans TRAP ou souris sauvages de type (WT). Panneau de génotype de souris A: voie 1, cd36-/-; TRAP- / -; voie 2, TRAPet voie 3, cd36-/-; TRAP-ETC; Cdh5-/-; voie 4, TRAPet Cdh5-/-; voie 5, cd36-/-; TRAP-ETC; Cdh5-/-; voie 6, cd36-/-; TRAP- / -; Cdh5-/-; voie 7, TRAPet Cdh5-/-; voie 8, TRAP-/-; voie 9, échelle d'ADN. Panneau de génotype de souris B: voie 1, pkd-1fl/-; TRAP- / -; Cdh5-/-; voie 2, pkd-1fl/fl; TRAP-ETC; Cdh5-/-; voie 3, pkd-1fl/-; TRAPMD/ voie 4, pkd-1fl/fl; TRAPMD/ Cdh5-/-; voie 5, pkd-1fl/fl; TRAP-ETC; Cdh5-/-; voie 6, pkd-1fl/-; voie 7, échelle d'ADN. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Exemple d'expression gFP améliorée spécifique à l'endothélial sous le microscope à fluorescence. Endothelia vasculaire de sang dans les tissus de poumon des souris cd36 KNOCKOUT TRAP étaient EGFP positif (couleur verte, panneau supérieur) sous le microscope d'immunofluorescence. L'absence de l'anticorps GFP primaire a été utilisée comme un contrôle négatif (panneau inférieur). Les tissus de souris ont été co-tachés en utilisant des anticorps GFP et CD31 avec des anticorps de fluorescence secondaires appropriés (couleur rouge). Images représentatives acquises à l'aide d'un système d'imagerie par microscopie à fluorescence. Barre de 200 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : La qualité et la quantité de l'ARNm ribosomal-lié des cellules endothéliales purifiées et directement extraites des tissus des souris trap. Un exemple pour la qualité et la concentration de l'ARN purifié des tissus pulmonaires dans une souris trap cd36. Un spectrophotomètre a été utilisé pour évaluer la quantité et la pureté de l'ARN extrait. Comme le montre ce chiffre, la concentration d'ARN est de 51,2 ng/L. Le rapport d'absorption à 260 nm et 280 nm est de 1,87 alors que le rapport de 260 nm et 230 nm est de 2,40, ce qui indique la pureté des échantillons d'ARN extraits. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Exemple d'expression des gènes angiogéniques et des ligands notch dans l'ARN lié par ribosome des cellules endothéliales par des essais qPCR en temps réel. L'ARNm isolé du ribosome endothélial du poumon dans le contrôle de TRAP et les souris cd36 déficientes de TRAP d'EC-spécifiques a été soumis aux essais qPCR en temps réel, utilisant des amorces achetées d'une compagnie de biotechnologie comprenant Hey2, ephrin B2, et delta comme ligand 4 (DLL4). Les gènes de conservation de la maison PPIA a été utilisé pour la normalisation. L'étudiant t-test a été utilisé pour l'analyse statistique. P et lt; 0,05; Pet lt;0,01.
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Discussion
L'angiogenèse est un processus complexe en plusieurs étapes, dans lequel la transcription et l'expression de gènes angiogéniques spécifiques aux CE jouent un rôle essentiel dans la différenciation et la reprogrammation angiogénique3,4. Pour surmonter les barrières de la diversité cellulaire et de la complexité architecturale pour mieux comprendre la fonction du système vasculaire des mammifères au niveau moléculaire in vivo, nous avons créé des souris TRAP spécifiques à eC, accompagnées de cd36 spécifiques à eC , déficit pkd-1 spécifique à eC ou carence globale en cd36 à l'aide d'un modèle de souris TRAP à floxed polyvalent ou d'UN EGFP-TRAP généré dans le laboratoire Pu2 en combinaison avec d'autres lignées de souris génétiquement modifiées. Cela permettra l'examen de l'ensemble de l'ARNm traduit de cequis vasculaires eCs de tissus intacts in vivo sous EC-spécifique dans pkd-1 ou une carence globale dans l'expression du gène cd36 8, ce qui est essentiel pour l'enquête sur transcription génique associée à l'angiogenèse physiologique et pathologique4,7,9,10. Conformément à d'autres études1,2, notre approche de l'isolement de l'ARNm spécifique à eC n'a pas besoin de fixation tissulaire, de dissociation des tissus ou d'isolement des cellules individuelles des tissus et évite ainsi les artefacts potentiels qui résultat de ces traitements. Nous avons également été en mesure d'effectuer des purifications TRAP et d'extraire l'ARNm lié au ribosome de qualité des tissus congelés. En outre, ce qui a été purifié est la teneur traduite en ARNm des EC directement in vivo, ce qui représentera mieux la teneur en protéines par rapport à l'utilisation de l'ARN total pour le profil d'expression génique. En outre, le transgène TRAP étiquette génétiquement les CE avec EGFP, permettant également non seulement pour l'extraction de l'ARNm lié au ribosome, mais aussi pour la visualisation dans les études immunohistochimiques ou électrophysiologiques.
Cependant, l'approche a montré de faibles rendements d'ARN, en particulier avec l'ARNm purifié des tissus cardiaques ou des tissus précédemment congelés. Nous avons donc besoin d'optimiser les conditions pour augmenter les rendements. Cependant, nous avons observé chez les souris déficientes cd36 spécifiques à EC, les niveaux d'éphin B2 et de DLL4 ont été significativement augmentés dans les deux endothelia pulmonaires (figure 4) et cardiaques (données non montrées) par rapport au contrôle. Ces résultats étaient compatibles avec nos études in vitro précédentes3,4, ce qui suggère que la qualité de l'ARN est suffisante pour l'analyse en aval. Le rendement était faible, peut-être en raison des conditions strictes. Pour surmonter cette limitation et améliorer le rendement, il est essentiel de mettre en place une zone de travail exempte de RNase et de décontaminer les surfaces de travail et l'équipement qui peuvent être contaminés par la RNase et changer fréquemment de gants afin d'extraire de l'ARN de qualité. Il est également essentiel de trouver des concentrations appropriées d'anticorps GFP dans la matrice d'affinité et d'utiliser des concentrations appropriées d'inhibiteur de la NAse dans le tampon de lyse tissulaire. L'utilisation de produits en plastique sans RNase et de réactifs est bénéfique pour l'extraction de l'ARN à partir de ribosomes endothéliales des tissus ciblés.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas de conflit d'intérêts.
Acknowledgments
Le travail du Dr Ren est soutenu par l'American Heart Association (13SDG14800019; BR), la Fondation Ann's Hope (FP00011709; BR), l'American Cancer Society (86-004-26; MCW Cancer Center to BR), et le National Institute of Health (HL136423; BR); Jordan Palmer est soutenu par le programme de stages MCW CTSI 500 Stars 2018; P. Moran bénéficie d'une subvention de formation en recherche institutionnelle de NHLBI (5T35 HL072483-34).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer with Nanochips and Picochips | Agilent | G2939AA, 5067-1511 & 5067-1513 | |
| Cell scrapers | Sarstedt | 83.1832 | |
| Homogenizers | Fisher Scientific | K8855100020 | |
| Magnet (Dynamag-2) | Invitrogen | 123-21D | Will depend on purification scale; samples in 1.5-mL tubes can be concentrated on a DynaMag-2 |
| Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| NanoDrop 2000C spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000C | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5430R | with rotor for 1.5-mL microcentrifuge tubes |
| RNase-free 1.5mL microcentrifuge tubes | Applied Biosystems | AM12450 | |
| Rnase-free 50-mL conical tubes | Applied Biosystems | AM12501 | |
| RNase-free 1000-μl filter tips | Rainin | RT-1000F | |
| RNase-free 200-μl filter tips | Rainin | RT-200F | |
| RNase-free 20-μl filter tips | Rainin | RT-20F | |
| Rotor for homogenizers | Yamato | LT-400D | |
| Tube rotator, Labquake brand | Thermo Fisher | 13-687-12Q |
References
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