Summary
ويشكل الانتشار جزءا هاما من الوظيفة الخلوية ، وقراءه مشتركه تستخدم لتقييم السمية المحتملة للعقاقير الجديدة. ولذلك ، فان قياس الانتشار هو فحص يستخدم بكثرة في بيولوجيا الخلايا. نقدم هنا طريقه بسيطه ومتنوعة لقياس الانتشار يمكن استخدامها في الخلايا الملتصقة وغير الملتصقة.
Abstract
قدره الخلية علي التكاثر جزء لا يتجزا من الوظيفة العادية لمعظم الخلايا ، وخلل الانتشار هو في قلب العديد من عمليات المرض. ولهذه الأسباب ، فان قياس الانتشار أداه مشتركه تستخدم لتقييم وظيفة الخلية. ويمكن قياس تكاثر الخلايا ببساطه عن طريق العد ؛ ومع ذلك ، فان هذه وسيله غير مباشره لقياس الانتشار. أحدي الوسائل الشائعة للكشف المباشر عن الخلايا التي تستعد للتقسيم هي عن طريق دمج النظير النيونوسايد المسمي. وتشمل هذه التناظرية النيونوسايد المشعة 3ح-thymidine بالاضافه إلى النظير النيونوسايد غير المشعة مثل 5-برومو-2 ' ديوكسيريدين (brdu) و 5-ethynyl-2′-ديوكسيرادين (ايدو). يتم الكشف عن تاسيس EdU بالنقر علي الكيمياء ، والتي لديها العديد من المزايا بالمقارنة مع BrdU. وفي هذا التقرير ، نقدم بروتوكولا لقياس الانتشار بدمج النظام التعليمي. ويتضمن هذا البروتوكول خيارات لمختلف القراءات ، إلى جانب مزايا ومساوئ كل منها. ونناقش أيضا الأماكن التي يمكن فيها تحسين البروتوكول أو تغييره لتلبيه الاحتياجات المحددة للتجربة المخطط لها. وأخيرا ، فاننا نلمس الطرق التي يمكن بها تعديل هذا البروتوكول الأساسي لقياس نواتج أيض الخلايا الأخرى.
Introduction
الانتشار هو جزء هام من الوظيفة الخلوية1،2. السيطرة علي الانتشار يؤثر علي العمليات العادية مثل التنمية ، والعمليات المرضية مثل السرطان وامراض القلب والاوعيه الدموية. فرط النمو من خلايا العضلات الملساء الاوعيه الدموية, علي سبيل المثال, ويعتقد ان تكون مقدمه لتصلب الشرايين3. وتستخدم أيضا التغيرات في انتشار الخلايا لتقييم السمية المحتملة للعقاقير الجديدة. ونظرا لتاثيرها الواسع النطاق ، فان قياس الانتشار هو عماد العديد من المختبرات القائمة علي بيولوجيا الخلايا.
ويمكن قياس تكاثر الخلايا بمجرد عد الزنزانات إذا كان عدد سكان الخلية من الفائدة يقسم بسرعة إلى حد ما. بالنسبة للخلايا البطيءه النمو ، قد تكون عمليات عد الخلايا اقل حساسية. وغالبا ما يقاس الانتشار بإدماج النظير المسمي النيونوسايد. علي الرغم من ان معيار الذهب هو 3H-التاسيس thymidine, العديد من المختبرات الابتعاد عن هذه الطريقة نظرا لتوافر البدائل الأحدث, غير المشعة. وتشمل هذه الاصباغ الفلورية الخلوية ، والكشف عن دوره الخلايا البروتينات المرتبطة بها ، ودمج النظير النيونوسايد غير المشعة مثل 5-برومو-2 ' ديوكسيريدين (BrdU) و 5-ethynyl-2′-ديوكسيرادين (ايدو)4.
الاصباغ الخلوية ، مثل كاربوكسيفلوريسسين دياسيتات النجاح استر (cfse) ، والكشف عن انتشار لان كثافة نصفين الصبغة في كل مره يقسم الخلية5. ويشيع استخدام هذه التقنية في التدفق الخلوي للخلايا غير الملتصقة. لم يتم استخدامه كثيرا للخلايا الملتصقة ، ولكن مع الجيل الجديد من قراء لوحه التصوير قد يتغير هذا. وغالبا ما يستخدم الكشف عن البروتينات المرتبطة بدوره الخلية من خلال التقنيات القائمة علي الأجسام المضادة (قياس التدفق الخلوي ، مناعي ، الخ) للانسجه أو الخلايا غير الملتصقة. يجب ان تكون هذه الخلايا/الانسجه ثابته وتتخللها قبل تلطيخ. النظائر النيونوسيد BrdU و EdU متشابهة في النهج إلى 3H-الثيميدين ، ولكن من دون إزعاج من النشاط الإشعاعي. يتم الكشف عن دمج BrdU من قبل الأجسام المضادة BrdU ، التالي يجب ان تكون ثابته الخلايا وتتخللها قبل تلطيخ. الاضافه إلى ذلك ، يجب ان تعامل الخلايا مع DNase لفضح مرضبه BrdU.
يتم الكشف عن تاسيس EdU عن طريق النقر الكيمياء ، والتي المجموعات الالكيد وأزيد "انقر" معا في وجود النحاس الحفاز. يمكن لأي من المجموعتين ان تكون بمثابه الجزيء الحيوي المدمج أو جزيء الكشف4. النظائر النيونوسيد المتاحة تجاريا لديها مجموعه الالكاين المرفقة. بالنسبة لاختبارات الانتشار ، لذلك ، يتم الكشف عن التناظرية الوظيفية الالكالي الجانبية من قبل أزيد مترافق إلى صبغه فلورية أو علامة أخرى. دمج التعليمية له العديد من المزايا علي BrdU. أولا ، لأنه لم يتم العثور علي المجموعات الكيميه والأزيد في خلايا الثدييات ، وهذا التفاعل هو محدده للغاية مع خلفيه منخفضه6. لان كلا المجموعتين صغيره ، الخلايا لا تحتاج إلى الخضوع لمسخ الحمض النووي لفضح التناظرية النونوزيد كما هو مطلوب ل BrdU7. وأخيرا ، انقر فوق الكيمياء هو تنوعا للغاية ، ويمكن استخدامها لوضع العلامات الايضيه من الحمض النووي ، RNA ، البروتين ، الأحماض الدهنية ، والكربوهيدرات8،9،10،11. إذا كان الهدف الأيضي المسمي الفائدة علي سطح الخلية ، يمكن تسميه الخلايا الحية12. الاضافه إلى ذلك ، يمكن معالجه الخلايا لتلطيخ النيون المناعي مع الأجسام المضادة.
يصف البروتوكول التالي استخدام التاسيس EdU وانقر فوق الكيمياء لقياس الانتشار في خلايا العضلات الملساء الوعائية البشرية (الشكل 1). نعرض ثلاث طرق مختلفه لدمج ايدو يمكن قياسها ، والنتائج التمثيلية من كل منها ، ومزاياها وعيوبها. قياس الانتشار عن طريق النقر بالكيمياء مفيد بشكل خاص للخلايا الملتصقة والبطيءه النمو. الاضافه إلى ذلك ، يتم الحفاظ علي مورفولوجية الخلية بشكل جيد ويمكن أيضا تلطيخ المضادة للأجسام التي تقوم بها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الكشف عن ايدو باستخدام تسميه الفلورسنت
- حلول الأسهم
- اعداد الحل 5 مم ايدو الأسهم عن طريق أضافه 12.5 ملغ من ايدو إلى 10 مل من المقطر مزدوج ه2س.
- اعداد مكونات حل الملصقات: 200 مم تريس (3-هيدروكسي بروبيل تريازيلميثيل) أمين (THPTA) (100 ملغ في 1.15 mL ح2) ، 100 مم cuso4 (15.95 mg في 1 مل h2؛ جعل الطازجة) ، 10 ملم Cy3 picolyl-أزيد (1 ملغ في 95.3 ml h2o ، المخزنة في 5 μl قسامات في-20 درجه مئوية) ، و 1 م اسكوربات الصوديوم (200 ملغ في 1 مل H2؛ جعل الطازجة).
- اعداد محلول الأسهم resلازوردي في تركيز 0.15 ملغ/مل. تصفيه تعقيم وتخزين 1 مل قسامات في 4 ° c.
ملاحظه: يتم الحصول علي العديد من المزامير المختلفة ، البيوتين ، والبيروكسيديز الفجل (الرسالة التالية).
- تسميه خلايا العضلات الملساء الاوعيه الدموية (VSMC) مع ايدو.
ملاحظه: تم عزل VSMCs البشرية من الشرايين الحرقفيه عبر النمو من القطع المفسرة من الانسجه. عندما تزرع في المصل وسائل الاعلام الحرة مع الانسولين ، transferrin ، السيلينيوم هذه الخلايا التعبير عن علامات VSMC سموثيلين ، سلس العضلات ميوسين سلسله الثقيلة (SM-MHC) و SMC αactin13.- لوحه خلايا العضلات الملساء الاوعيه الدموية في 2 × 104/مل في المتوسطة دولبيكو النسر المعدلة (dmem) في لوحه 96 جيدا.
ملاحظه: تزرع الخلايا في 37 درجه مئوية في وسائط الخلايا العضلية الملساء مع 2 ٪ مصل الأبقار الجنينية. - اختياري السماح لعده ساعات ليلا للانضمام. أضافه 20 μL resلازوردي الأسهم لكل بئر. احتضان في 37 درجه مئوية ل 3 ح. قراءه اشاره مضان في قارئ لوحه (560ex، 594em). استبدل الوسائط ب DMEM الجديد.
ملاحظه: هذه الخطوة اختياريه. يتم استخدام resلازوردي لتطبيع أرقام الخلايا وحساب للتغير جيدا إلى حسنا في الطلاء14. - أضافه الفوسفات المالحة مخزنه (تلفزيوني) أو الصفائح الدموية المشتقة عامل النمو (PDGF) 30 نانوغرام/مل إلى 3 − 6 ابار لكل علاج في بداية فتره الثقافة واحتضان ل 72 h.
- تمييع 5 ملم ايدو الأسهم إلى 1 ملم. أضافه 2 μL لكل بئر (التركيز النهائي 20 μM) لأخر 24 ح من فتره الثقافة 72 h. لا تقم باضافه EdU إلى مجموعه واحده من النسخ المتماثلة. ستستخدم هذه الآبار لتحديد الخلفية الفلورية/التلالؤ.
ملاحظه: يتم تحسين مده الثقافة ووضع العلامات مع EdU لخلايا العضلات الملساء ولكن قد تحتاج إلى تعديل لكل نوع الخلية.
- لوحه خلايا العضلات الملساء الاوعيه الدموية في 2 × 104/مل في المتوسطة دولبيكو النسر المعدلة (dmem) في لوحه 96 جيدا.
- إصلاح الخلايا في بارافورمالدهيد (PFA).
- أزاله وسائل الاعلام وأضافه 150 μL من 4 ٪ PFA (في الخدمات التلفزيونية) لكل بئر لمده 10 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
- أزاله PFA وأضافه 150 μL من 1 ٪ البولي إيثيلين جلايكول تيرتي-اوكتيلف# ينيل الأثير (TX-100) (في الماء) لكل بئر لمده 30 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
- أزاله TX-100 عن طريق غسل ثلاث مرات مع تلفزيوني.
تحذير: PFA السامة ، والتعامل مع الرعاية.
ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. ويمكن تخزين الخلايا الثابتة في الاذاعه التلفزيونية في 4 ° c.
- كشف المدمجة ايدو.
- جعل الحل وضع العلامات (10 مل لكل 96 لوحه جيدا ، وذلك باستخدام الآبار 60 الداخلية) فقط قبل استخدامها عن طريق أضافه الكواشف من حلول الأوراق المالية في الترتيب التالي: THPTA 20 μL ، CuSO4 20 Μl ، Cy3 picolyl أزيد 5 Μl ، Na اسكوربات 100 μl إلى النظام
- أزاله تلفزيوني من الآبار وأضافه 150 μL من حل وضع العلامات لكل بئر. احتضان 30 دقيقه في 37 درجه مئوية. للكشف عن جميع النوى ، أضافه 4 ′ ، 6-diamidino-2-فينيلانديول (DAPI) لكل بئر. قراءه علي قارئ لوحه مضان (Cy3 550ex, 570em; DAPI 350ex، 470em) أو صوره علي المجهر.
ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. ويمكن تخزين الخلايا الثابتة والملونة في الاذاعه التلفزيونية في 4 درجه مئوية والذين تتراوح أعمارهم في وقت لاحق.
2. الكشف عن ايدو باستخدام التلالؤ
- الأقسام الكاملة 1.1 – 1.3.
- اعداد تريس-المالحة مخزنه مع 0.1 ٪ السكاريد 20 (TBST).
- كتله الآبار.
- أضافه 150 μL من حظر المخزن المؤقت (جدول المواد) لكل بئر واحتضان لمده 90 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
- أزاله حظر المخزن المؤقت ويغسل ثلاث مرات مع 200 μL من تلفزيوني.
- كشف المدمجة ايدو.
- جعل الحل وضع العلامات وفقا لتوجيهات في الخطوة 1-4-1 ، واستبدال البيوتين picolyl أزيد ل Cy3 picolyl أزيد.
- يغسل الآبار خمس مرات مع 200 μL من TBST ، مع الاهتزاز ، 3 دقيقه لكل غسل.
- إرواء البيروكسياسات الذاتية مع 150 μL من 0.3% H2O2 لمده 20 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
- أزاله H2O2 ويغسل خمس مرات مع 200 ΜL من tbst ، مع اهتزاز 3 دقيقه لكل غسل.
- تمييع العقديات-الفجل البيروكسيديز (SA-الصورة ؛ 1:200) في TBST وأضافه 50 μL لكل بئر. احتضان 1 ساعة في درجه حرارة الغرفة.
- يغسل خمس مرات مع 200 μL من TBST ، مع الاهتزاز ، 3 دقيقه لكل غسل.
- أضافه 50 μL من انزيم الكيميائية المرتبطة المقايسة المناعية (اليسا) الركيزة (جدول المواد) لكل بئر.
- قراءه فورا في لوحه القارئ قادره علي الكشف عن التلالؤ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في الشكل 2، ونحن نظهر نتائج ثلاث تجارب مختلفه قياس انتشار vsmc استجابه ل PDGF. بعد زراعه الخلايا في وسائل الاعلام وضعت ل SMCs ، نفذنا التجربة في المصل DMEM مجانا ، للقضاء علي اي اثار محتمله من المصل أو عوامل النمو علي الانتشار. في الشكل 2A نقارن النتائج ، من نفس التجربة ، وذلك باستخدام قراءات الفلورسنت مقابل الاناره. لقراءه هذه اللوحات ، استخدمنا قارئ اللوحة المجهرية متعدد الاستخدامات التي يمكن ان تقرا الامتصاص ، فلوري ، والتلالؤ (انظر جدول المواد).
باستخدام قارئ لوحه في المسح الضوئي وضع جيدا ، يتم متوسط قراءات الفلورسنت علي مدي البئر بأكمله. هذا الوضع يخفف من عدم الدقة المحتملة بسبب الاختلافات بين وسط وحواف البئر. ومع ذلك ، إذا كانت النوى القليلة جدا ايجابيه ، فان قراءه النتائج بهذه الطريقة يرجح انها تقلل من "عدد" الخلايا الايجابيه عندما تكون بعضها ايجابيه فقط. رقم ، مع هذه القراءة ، يعني مضان بالنسبة لذلك من بئر آخر ، وليس أرقام الخلايا الدقيقة. الاضافه إلى ذلك ، إذا كان هناك ألياف أو اجمه من الخلايا الميتة التي تلتقط فلوري ، سيتم تضمين هذا في مسح المنطقة. ومع ذلك ، فان ميزه استخدام قارئ لوحه هو الوقت. بينما القراءة في وضع المسح الضوئي ياخذ 15 − 20 ثانيه لكل بئر ، فانه يتم تلقائيا بدلا من الطريقة الشخصية التي تتطلب وقتا طويلا من التقاط الصور وتحليلها باستخدام برامج التصوير.
لتصحيح النقص المحتمل في التقديرات من الطريقة المذكورة أعلاه ، قمنا بتحويل المسح الفلوري إلى قراءات متجانسة وسائله يتم فيها الكشف عن الخلايا التي تتناول EdU مع moiety الذي يزيد من البيوتين ، والذي يتم الكشف عنه بدوره مع العقديات-الفجل البيروداز (انظر الشكل 1). يتم بعد ذلك تحديد كميه البيروكسيديز الفجل باستخدام ركيزة قياسيه مهياه ل ELISA. وميزه هذه التقنية هي قراءه أكثر تجانسا ، ويبين الشكل 2الف وباء أمثله للتجارب التي استخدمت فيها هذه الطريقة. الاضافه إلى ذلك ، يمكن قراءه لوحه في ثوان. ومع ذلك ، هناك مساوئ لهذه الطريقة. أولا ، الخلفية مع هذا الأسلوب هو اعلي من مع مضان. لتقليل الخلفية ، قمنا بدمج خطوه الحجب والغسيل المتعدد. وكانعكاس لهذه الخلفية ، تميل الضوابط السلبية (الخلايا غير المعالجة) إلى ان تكون اعلي ، وتكون الزيادة في الانتشار في الاضعاف اقل. ثانيا ، كما هو الأمر مع قراءات مضان ، اي ألياف أو خلايا ميتة تلتقط الكواشف الكشف ستضيف إلى التلالؤ الكلي.
في محاولة لتقليل التباين في التجارب المذكورة أعلاه ، قمنا بتطبيع نتائجنا لتعداد الخلايا الاوليه. لاختبارات الانتشار ، يجب ان يتم التطبيع علي الخلايا الحية في بداية الفحص قبل ان تقسم الخلايا. الاضافه إلى ذلك ، فان الفحص لا يمكن ان يؤثر علي وظيفة الخلية أو تاسيس EdU. ونظرا لهذه القيود ، اخترنا استخدام الأيض كانعكاس لرقم الخلية عبر resلازوردي14. تظهر النتائج مع وبدون التطبيع في الشكل 2B. ومع ذلك ، في مجموعه منفصلة من التجارب وجدنا ان هذه الطريقة ليست حساسة بما فيه الكفاية للكشف عن الاختلافات الصغيرة في أرقام الخلايا. بالاضافه إلى ذلك ، اي خطا في هذه القراءة يقدم المزيد من الخطا في التجربة بأكملها. لهذه الأسباب ، لقد انتخبنا لاتخاذ الرعاية الاستثنائية لخلايا لوحه بالتساوي قدر الإمكان ، وعدم تنفيذ خطوه التطبيع.
للتاكد من اننا حصلنا علي النتائج الأكثر دقه ممكنة ، ونحن عاد إلى تلطيخ الفلورسنت (القسم 1) وعد الخلايا باستخدام المجهر مضان المقلوب. ميزه هذا الأسلوب هو انه يمكن للمرء ان يري جسديا وحساب الخلايا الايجابيه ، وضمان أكثر دقه (الشكل 3). ويمكن استبعاد اي حطام فلوري من العد. العد الخلفي بدون EdU هي 0 حيث لا يوجد اي مضان مرئي ، التالي لا توجد خلفيه لطرحها. العيب الرئيسي لهذا الأسلوب هو الوقت. لحساب نوى في الخلايا مطلي في لوحه جيدا 96 ، ونحن ناخذ 3 صور في بئر من كل من الخلايا الايجابيه ايدو والخلايا الكلية (DAPI) ، والتي تتطلب 6 صور لكل بئر. نحن التقاط الصور عموديا من القسم الأوسط من اعلي إلى أسفل البئر ، مع الحرص علي عدم التداخل وعد الخلايا مرتين. عد مجموع الخلايا يعطينا قطعه ثانيه من البيانات التي تؤكد نتائج الانتشار لدينا. ومع ذلك ، في ضوء الوقت مضاعفه بطيئه نسبيا من VSMC (36 − 48 ح) ، وزيادة اضعاف في مجموع الخلايا حفز مع PDGF مقابل الضوابط هو اقل بكثير من زيادة اضعاف الخلايا الايجابيه ايدو ، وهذا هو السبب في اننا قياس دمج ايدو (الشكل 2C).
الطريقة الأكثر كفاءه ودقه لحساب الخلايا الايجابيه والاجماليه ل EdU هي باستخدام قارئ لوحه التصوير. هذا الأسلوب يجمع بين دقه العد مع سرعه الاتمته. والعيب الرئيسي هو ان هذه القطعة من المعدات غير متوفرة في كل مؤسسه. في مقارنه العد الألى مقابل اليدوية ، كان العد اليدوي الإيجابي ايدو مطابقا أساسا للعد الألى (الشكل 2C، يسار) ، كما كانت التهم الاجماليه غير المحفزة (الشكل 2c، يمين). ومع ذلك ، كان العدد اليدوي اقل من العدد التلقائي في الخلايا المحفزة PDGF الإجمالي. ويرتبط هذا الاختلاف علي الأرجح بأنماط نمو الخلايا. لان الخلايا تميل إلى النمو في وسط البئر ، مع أرقام أصغر الألى والعد اليدوي كانت متطابقة تقريبا. مهما, مع أرقام [هيغر] كان هناك علي الأرجح كثير خلايا في الحافات والحساب يدوية, اي لم يلتقط خلايا في المحيط من البئر, كانوا اقل دقيقه.
الشكل 1: نظره عامه علي الكشف عن EdU بواسطة الفلورية أو التلالؤ.
يتم التعامل مع VSMC أو غيرها من الخلايا الملتصقة في ظل ظروف الفائدة. تتم أضافه EdU لأخر 24 ساعة من فتره الثقافة ودمجها في الحمض النووي للخلايا الفاصلة. ثم يتم الكشف عن المدمجة ايدو باستخدام مضان (بروتوكول القسم 1) أو التلالؤ (بروتوكول القسم 2). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: قياس الانتشار مع القراءات المختلفة باستخدام دمج EdU والنقر علي الكيمياء.
(ا) كانتالمجموعاتالتي تم استزراعها في حضور أو غياب المؤسسة العامة للهجرة. تمت أضافه EdU ال 24 ساعة الاخيره من الثقافة ، وتم الكشف عن التاسيس من قبل اما مضان (البروتوكول القسم 1) أو التلالؤ (بروتوكول القسم 2). (ب) عوملت الشركة علي النحو الموصوف في اللوحة (ا) ، وتم قياس دمج المعيار التعليمي من خلال التلالؤ. وتم تطبيع النتائج لحساب الخلايا الاوليه باستخدام فحص قابليه البقاء. (ج) عوملت الشركة علي انها في الفريق الف ، وتم قياس ادراج المعيار التعليمي التربوي بالفلورية. تم حساب الخلايا الايجابيه EdU تلقائيا ، باستخدام قارئ لوحه التصوير ، أو يدويا عن طريق التصوير ومن ثم العد باستخدام برامج التصوير. النتائج المبينة هي الانحراف المعياري المتوسط ± 3-6 نسخ متماثلة لكل علاج.
الشكل 3: التصور من الخلايا الايجابيه ايدو التالية انقر فوق بروتوكول الفلورية.
وتم التعامل مع VSMC علي النحو الموصوف في الشكل 2، وتم الكشف عن الشركة التعليمية المدمجة باستخدام الفلوري (القسم 1 من البروتوكول). كل صوره هي بئر واحده من لوحه 96 جيدا. وتظهر النوى الاجماليه باللون الأزرق (DAPI) والنوى الايجابيه EdU خضراء. شريط مقياس = 50 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
دمج التعليمية هو وسيله بسيطه ومباشره لقياس انتشار الخلايا. ومن المفيد بشكل خاص للخلايا الملتصقة13. بروتوكولنا يستخدم خلايا العضلات الملساء ، ولكنه ينطبق علي اي خليه ملتصقة (الظهاريه ، بطانية ، الخ). علي الرغم من ان البروتوكول ليس معقدا ، فان الخطوة الحاسمة الواحدة هي صنع حل وضع العلامات-يجب أضافه المكونات بالترتيب المذكور. الاضافه إلى ذلك ، مثل البقع الغربية الكيميائية ، إذا كان استخدام قراءات التلالؤ اللوحة يجب ان تقرا علي الفور.
يمكن تعديل عده أجزاء من البروتوكول أو تحسينها حسب الحاجة. جزء واحد هو مده الاحتضان مع ايدو. لان هدفنا كان للكشف عن العديد من تكاثر الخلايا قدر الإمكان ، وأضاف نحن EdU لكامل 24 ساعة قبل تحديد وتلطيخ. ومع ذلك ، هذا التوقيت المرجح يقيس الخلايا في كل من المراحل S و G2/M. لتسميه الخلايا فقط في المرحلة S, Cecchini وآخرون المشورة بأنه حتى ببطء تقسيم الخلايا تكون حضنت مع EdU لمده لا تزيد عن 6 ساعات7. جزء آخر من البروتوكول الذي يمكن ان يكون الأمثل هو كميه من chelator. وتتطلب ردود الفعل الكيدية-ازيديه محفزا نحاسيا (CuSO4). Thpta هو خالب النحاس الذي يحافظ علي النحاس في حاله الاكسده اللازمة. ويمكن ان تكون نسبه المعدن الثقيل إلى النحاس متنوعة ، لزيادة ملزمه الالكاين-أزيد. نلاحظ تلطيخ مشرق مع chelator: نسبه النحاس من 2:1 ، في سياق أيضا باستخدام أزيد picolyl. و picolyl شارده يضيف النشاط مخلبي الذي يقلل من تركيز النحاس اللازمة ويزيد من كفاءه رد فعل15. [شلتور]: نحاسه معدلات يستطيع كنت زدت, عاده [أوب-5:1], ان يحسن لكل محقق حاجات. أفضل مخلبيه ، 2-[4-({bis [(1-tert-بوتيل-1H-1 ، 2 ، 3-triazol-4-yl) الميثيل] الامينيه} الميثيل)-1H-1 ، 2 ، 3-triazol-1-yl] حمض الخليك (بتا) ، والآن متاح تجاريا16. ولم يكن هذا المعدن متاحا تجاريا عندما استنتجنا هذا البروتوكول لأول مره. وأخيرا ، علي الرغم من اننا نستخدم بارافورمالدهيد كمثبت في هذا البروتوكول ، يمكن ان تكون ثابته الخلايا مع الميثانول ، والتي أيضا تجنب الخطوة تتخلل. تحديد مع الميثانول يمكن ان يكون مفيدا إذا كان أحد يريد الجمع بين تلطيخ المناعية من البروتينات الخلوية المحددة مع تاسيس ايدو.
عيب واحد من هذا الأسلوب هو السمية الخلوية المحتملة من EdU ، وخاصه عندما وضع العلامات باستمرار مع ايدو لعده أيام بدلا من تسميه نبض من ساعات. اعتمادا علي الخلايا المستخدمة ، تم العثور علي EdU لتسبب القبض علي دوره الخلية أو حتى المبرمج17. ويعتقد ان هذه السمية بسبب النسخ المتماثل الحمض النووي المعيبة من أضافه النيونوسيدس الاصطناعية18. وقد أظهرت الدراسات ان هذه السمية تكون تابعه لخط الخلية وان التركيز يعتمد علي17. لم نلاحظ اي مشاكل مع السمية في دراساتنا.
وباختصار ، قياس الانتشار عن طريق EdU وانقر الكيمياء لديها العديد من المزايا علي غيرها من الطرق الشائعة الاستخدام مثل BrdU أو 3H-التاسيس thymidine. وتشمل هذه تجنب النشاط الإشعاعي ، وخصوصية عاليه مع خلفيه منخفضه ، وليس هناك حاجه لخطوات التشبع قاسيه. بمجرد تاسيسها ، انقر فوق الكيمياء هو تنوعا للغاية ، ويمكن تعديلها بسهوله لوضع العلامات الايضيه من RNA ، والبروتين ، والأحماض الدهنية ، والكربوهيدرات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
نشكر كاتي كارول علي المساعدة الفنية. كما نشكر الدكتور ديفيد كول ومختبر تحليل البروبروتيميكس لتعليم وتوفير قارئ لوحه التصوير الخلوي. وكان هذا العمل مدعوما بمنحه من مؤسسه رايت ستيت (إلى L.E.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Carbosynth | NE08701 | |
| biotin picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1167-5 | |
| CuSO4 | Fisher Scientific | C1297-100G | |
| Cy3 picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1178-1 | |
| Cytation Plate Reader | Biotek | ||
| EVOS Microscope | Thermo Fisher Scientific | ||
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| Na ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-250G | |
| NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes | Invitrogen | R37606 | DAPI nuclear stain |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | blocking buffer |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15710 | |
| PBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Sodium Chloride | Sigma Life Science | S3014-5kg | |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate | Life Technologies | S911 | |
| Super Signal ELISA Femto | Thermo Scientific | PI137075 | ELISA substrate |
| Synergy Plate Reader | Biotek | ||
| THPTA | Click Chemistry Tools | 1010-100 | |
| Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl) | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Triton X 100 | Bio-Rad | 1610407 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
References
- Fuster, J. J., et al. Control of cell proliferation in atherosclerosis: Insights from animal models and human studies. Cardiovascular Research. 86 (2), 254-264 (2010).
- Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).
- Cizek, S. M., et al. Risk factors for atherosclerosis and the development of preatherosclerotic intimal hyperplasia. Cardiovascular pathology the Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 16 (6), 344-350 (2007).
- Romar, G. A., Kupper, T. S., Divito, S. J. Research techniques made simple: Techniques to assess cell proliferation. Journal of Investigative Dermatology. 136, e1-e7 (2016).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. 44, 4-7 (2010).
- Sletten, E., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal Chemistry: Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality. Angewandte Chemie International Edition. 48 (38), 6974-6998 (2009).
- Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (59), 1-7 (2012).
- Clarke, S. T., Calderon, V., Bradford, J. A. Click Chemistry for Analysis of Cell Proliferation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 82 (1), (2017).
- Jiang, H., et al. Monitoring dynamic glycosylation in vivo using supersensitive click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 698-706 (2014).
- Izquierdo, E., Delgado, A.
- Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).
- Hong, V., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Finn, M. G. Labeling Live Cells by Copper-Catalyzed Alkyne-Azide Click Chemistry. Bioconjugate Chemistry. 21 (10), 1912-1916 (2011).
- Arumugam, P., Carroll, K. L., Berceli, S. A., Barnhill, S., Wrenshall, L. E. Expression of a Functional IL-2 Receptor in Vascular Smooth Muscle Cells. The Journal of Immunology. 202 (3), 694-703 (2019).
- Stoddart, M. J. Mammalian cell viability: methods and protocols. , Humana Press. New York, NY. (2011).
- Uttamapinant, C., Tangpeerachaikul, A., Grecian, S., Clarke, S., Singh, U. Fast, Cell-compatible Click Chemistry with Copper-chelating Azides for Biomolecular Labeling. Angewandte Chemie International Edition. 154 (11), 2262-2265 (2012).
- Bescancy-Webler, C., et al. Raising the Efficacy of Bioorthogonal Click Reactions for Bioconjugation: A Comparative Study. Angewandte. Chemie International Edition. 50 (35), 8051-8056 (2011).
- Diermeier-Daucher, S., et al. Cell type specific applicability of 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EDU) for dynamic proliferation assessment in flow cytometry. Cytometry Part A. 75 (6), 535-546 (2009).
- Cieślar-Pobuda, A., Los, M. J. Prospects and limitations of “Click-Chemistry”-based DNA labeling technique employing 5-ethynyl-2′deoxyuridine (EdU). Cytometry Part A. 83 (11), 977-978 (2013).
