Summary
Proliferation är en kritisk del av cellulär funktion, och en gemensam avläsning som används för att bedöma potentiell toxicitet av nya läkemedel. Att mäta proliferation är därför en ofta använd analys i cellbiologi. Här presenterar vi en enkel, mångsidig metod för att mäta proliferation som kan användas i anhängare och icke-anhängare celler.
Abstract
Förmågan hos en cell att förgöra är integrerad med den normala funktionen hos de flesta celler, och dysreglering av proliferation är kärnan i många sjukdomsprocesser. Av dessa skäl är mätning av proliferation ett vanligt verktyg som används för att bedöma cellernas funktion. Cellproliferation kan mätas helt enkelt genom att räkna; Detta är dock ett indirekt sätt att mäta spridningen. Ett vanligt sätt att direkt upptäcka celler förbereder sig för att dela är genom inkorporering av märkta nukleosid analoger. Dessa inkluderar den radioaktiva nukleosid analog 3H-tymidin plus icke-radioaktiva nukleosidanaloger såsom 5-Bromo-2 ' deoxiuridin (BrdU) och 5-ethynyl-2′-deoxiuridin (EdU). Inkorporering av EdU upptäcks genom klick kemi, vilket har flera fördelar jämfört med BrdU. I denna rapport tillhandahåller vi ett protokoll för att mäta spridningen genom införlivandet av EdU. Detta protokoll innehåller alternativ för olika avläsning, tillsammans med fördelar och nackdelar med varje. Vi diskuterar också platser där protokollet kan optimeras eller ändras för att tillgodose de specifika behoven hos det planerade experimentet. Slutligen, vi berör de sätt som detta grundläggande protokoll kan ändras för att mäta andra cellmetaboliter.
Introduction
Spridning är en kritisk del av cellulär funktion1,2. Kontroll av spridning påverkar normala processer såsom utveckling, och patologiska processer såsom cancer och hjärt-kärlsjukdom. Hyperplastisk tillväxt av vaskulära glatta muskelceller, till exempel, tros vara en föregångare till åderförkalkning3. Förändringar i cellproliferation används också för att bedöma potentiell toxicitet av nya läkemedel. Med tanke på dess utbredda inverkan är mätning av proliferation en stöttepelare för många cell biologiskt baserade laboratorier.
Cellproliferation kan mätas genom att helt enkelt räkna celler om cellpopulationen av intresse delar sig ganska snabbt. För långsammare växande celler, cellantal kan vara mindre känsliga. Proliferation mäts ofta genom inkorporering av märkta nukleosidanaloger. Även om Guldstandarden är 3H-tymidin inkorporering, många laboratorier får bort från denna metod med tanke på tillgängligheten av nyare, icke-radioaktiva alternativ. Dessa inkluderar cytoplasmiska fluorescerande färgämnen, detektering av cellcykelns associerade proteiner, och inkorporering av icke-radioaktiva nukleosidanaloger såsom 5-Bromo-2 ' deoxiuridin (BrdU) och 5-ethynyl-2′-deoxiuridin (EdU)4.
Cytoplasmiska färgämnen, såsom karboxyfluorescein diacetat succinimidyl Ester (CFSE), upptäcka proliferation eftersom intensiteten av färgämnet halvorna varje gång cellen delar5. Denna teknik används ofta i flödescytometri för icke-adherenta celler. Det har inte använts mycket för anhängare celler, men med den nya generationen av avbildning plattan läsare detta kan förändras. Detektion av cellcykelns associerade proteiner genom antikroppsbaserad teknik (flödescytometri, immunohistokemi, etc.) används ofta för vävnader eller icke-adherenta celler. Dessa celler/vävnader måste vara fast och permeabilized före färgning. Nukleosidanaloger BrdU och EdU är liknande i inställning till 3H-tymidin, men utan besvär av radioaktivitet. Inkorporering av BrdU detekteras av anti-BrdU-antikroppar, och därför måste celler fixeras och permeabiliseras före färgning. Dessutom måste celler behandlas med DNase för att exponera BrdU Epitope.
Inkorporering av EdU upptäcks genom klick kemi, där Alkynalkoholer-och azid-grupper "klickar" tillsammans i närvaro av katalytisk koppar. Endera gruppen kan fungera som den biosynthetically inkorporerade molekylen eller Avkännings molekylen4. Kommersiellt tillgängliga nukleosidanaloger har Alkynalkoholer gruppen bifogas. För proliferation analyser, därför, Alkynalkoholer funktionaliserade nukleosid analog detekteras av en azid konjugerat till ett fluorescerande färgämne eller annan markör. Inkorporering av EdU har flera fördelar jämfört med BrdU. För det första, eftersom Alkynalkoholer-och azid-grupper inte finns i däggdjursceller, är denna interaktion mycket specifik med en låg bakgrund6. Eftersom båda grupperna är små, celler behöver inte genomgå DNA-denaturering att exponera nukleosid analog som krävs för BrdU7. Slutligen, klicka kemi är mycket mångsidig, och kan användas för metabolisk märkning av DNA, RNA, protein, fettsyror, och kolhydrater8,9,10,11. Om det metaboliskt märkta målet av intresse ligger på cellytan kan levande celler märkas med12. Dessutom kan celler bearbetas ytterligare för immunofluorescenfärgning med antikroppar.
Följande protokoll beskriver användningen av EdU inkorporering och klicka på kemi för att mäta spridningen i humana vaskulära glatta muskelceller (figur 1). Vi visar tre olika sätt inkorporering av EdU kan mätas, representativa resultat från varje, och deras fördelar och nackdelar. Mäta proliferation via klick kemi är särskilt användbart för anhängare, långsammare växande celler. Dessutom är morfologin av cellen väl underhållna och antikroppsbaserad färgning kan också utföras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. detektion av EdU med fluorescerande etikett
- Lagerlösningar
- Bered en 5 mM EdU Stock lösning genom att tillsätta 12,5 mg EdU till 10 mL dubbeldestillerat H2O.
- Förbered etiketteringslösningens komponenter: 200 mM tris (3-hydroxipropyltriazolylmetyl) Amin (THPTA) (100 mg i 1,15 mL H2o), 100 mm CuSO4 (15,95 mg i 1 ml h2o; gör färsk), 10 mm Cy3 pikolylazid (1 mg i 95,3 ml h2o , lagrad i 5 μL alikvoter vid-20 ° c) och 1 M natriumaskorbat (200 mg i 1 mL H2O; gör färskt).
- Förbered resazurin stamlösning vid en koncentration av 0,15 mg/mL. Filtrera sterilisera och förvara 1 mL-portioner vid 4 ° c.
Anmärkning: Pikolinazid finns konjugerat till flera olika Fluors, biotin och pepparrotperoxidas (HRP).
- Märk vaskulära glatta muskelceller (VSMC) med EdU.
Anmärkning: mänskliga VSMCs isolerades från iliaca artärer via utväxt från explanterad bitar av vävnad. När odlas i serum fria medier med insulin, transferrin, selen dessa celler uttrycker VSMC markörer smoothelin, smidig muskel myosin tung kedja (SM-MHC) och SMC αactin13.- Tallrik vaskulära glatta muskelceller vid 2 x 104/ml i Dulbecco modifierade Eagle ' s medium (DMEM) i en 96 väl tallrik.
Notera: celler odlas vid 37 ° c i glatt muskel cell media med 2% foster bovint serum. - Valfritt Låt flera timmar över natten för följsamhet. Tillsätt 20 μL resazurin-lager till varje brunn. Inkubera vid 37 ° c i 3 h. Läs fluorescenssignalen i en Plattläsare (560ex, 594EM). Ersätt media med Fresh DMEM.
Anmärkning: det här steget är valfritt. Resazurin används för att normalisera cell nummer och redogöra för väl till väl variation i plätering14. - Tillsätt fosfatbuffrad saltlösning (PBS) eller trombocyt härledd tillväxtfaktor (PDGF) 30 ng/mL till 3 − 6 brunnar per behandling i början av odlingsperioden och inkubera för 72 h.
- Späd 5 mM EdU stock till 1 mM. Tillsätt 2 μL till varje brunn (slutlig koncentration 20 μM) under den sista 24 h av 72 h odlingsperioden. Lägg inte till EdU i en uppsättning replikat. Dessa brunnar kommer att användas för att bestämma bakgrundfluorescens/luminescence.
Varaktigheten av kultur och märkning med EdU är optimerad för glatta muskelceller men kan behöva ändras per celltyp.
- Tallrik vaskulära glatta muskelceller vid 2 x 104/ml i Dulbecco modifierade Eagle ' s medium (DMEM) i en 96 väl tallrik.
- Fixera celler i PARAFORMALDEHYD (PFA).
- Ta bort media och tillsätt 150 μL 4% PFA (i PBS) per brunn i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Ta bort PFA och tillsätt 150 μL av 1% polyetylenglykol tert-oktylfenyleter (TX-100) (i vatten) per brunn för 30 min vid rumstemperatur.
- Ta bort TX-100 genom att tvätta tre gånger med PBS.
FÖRSIKTIGHET: PFA är giftigt, hantera med försiktighet.
Obs: protokollet kan pausas här. Fasta celler kan förvaras i PBS vid 4 ° c.
- Identifiera inkorporerat EdU.
- Gör etikettering lösning (10 mL per 96 brunn plattan, med hjälp av inre 60 brunnar) strax före användning genom att tillsätta reagens från lagerlösningar i följande ordning: THPTA 20 μL, CuSO4 20 μl, Cy3 pikolinazid 5 μl, na askorbat 100 μl till PBS för en total volym av 10 ml.
- Ta bort PBS från brunnar och tillsätt 150 μL etiketteringslösning till varje brunn. Inkubera 30 min vid 37 ° c. För att upptäcka alla kärnor, tillsätt 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) till varje brunn. Läs på en fluorescens-Plattläsare (Cy3 550ex, 570EM; DAPI 350ex, 470EM) eller bild på ett mikroskop.
Obs: protokollet kan pausas här. Fasta och färgade celler kan lagras i PBS vid 4 ° c och avbildas vid ett senare tillfälle.
2. detektion av EdU med luminiscens
- Fyll i avsnitten 1.1 – 1.3.
- Bered Tris-buffrad saltlösning med 0,1% polysorbat 20 (TBST).
- Blockera brunnar.
- Tillsätt 150 μL blockeringsbuffert (tabell över material) till varje brunn och inkubera i 90 min vid rumstemperatur.
- Ta bort blockeringsbuffert och tvätta tre gånger med 200 μL PBS.
- Identifiera inkorporerat EdU.
- Gör etikettering lösning enligt anvisningarna i steg 1.4.1, ersätta biotin pikolinazid för Cy3 pikolinazid.
- Tvätta brunnarna fem gånger med 200 μL TBST, med skakning, 3 min per tvätt.
- Quench endogena peroxiaser med 150 μL av 0,3% H2O2 för 20 min vid rumstemperatur.
- Ta bort H2O2 och tvätta fem gånger med 200 μl tbst, med skakning 3 min per tvätt.
- Späd streptavidin-pepparrots peroxidas (SA-HRP; 1:200) i TBST och tillsätt 50 μL till varje brunn. Inkubera 1 h vid rumstemperatur.
- Tvätta fem gånger med 200 μL TBST, med skakning, 3 min per tvätt.
- Tillsätt 50 μL kemiluminescerande enzymlänkat immunosorbent assay (ELISA) substrat (tabell över material) till varje brunn.
- Läs direkt i Plattläsare som kan detektera Luminescens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I figur 2visar vi resultaten av tre olika experiment som mäter spridningen av vsmc som svar på PDGF. Efter odling av celler i media formulerade för SMCs genomförde vi experimentet i serum fri DMEM, för att eliminera eventuella effekter av serum eller tillväxtfaktorer på proliferation. I figur 2A jämför vi resultat, från samma experiment, med hjälp av en fluorescerande vs självlysande avläsning. För att läsa dessa plåtar använde vi en multimode-mikroplattläsare som kan läsa absorbans, fluorescens och luminiscens (se tabell över material).
Med hjälp av plattläsaren i skanningsläget är fluorescerande avläsningar i genomsnitt under hela brunnen. Detta läge lindrar potentiella felaktigheter på grund av skillnader mellan mitten och kanterna på brunnen. Men om mycket få kärnor är positiva, läsa resultat på detta sätt sannolikt underskattar "antal" positiva celler när endast ett fåtal är positiva. Tal, med denna avläsning, betyder fluorescens i förhållande till en annan brunn, och inte exakta cell nummer. Dessutom, om det finns en fiber eller en klump av döda celler som plockar upp fluorescens, detta kommer att ingå i området Skanna. Fördelen med att använda plattläsaren är dock tid. Medan läsning i skanningsläge tar 15 − 20 sekunder per brunn, det är automatiserat i motsats till den personliga tidskrävande metod för att ta bilder och analysera dem med hjälp av bildprogram.
För att korrigera potentiella underskattningar från ovanstående metod konverterade vi den fluorescerande skanningen till en homogen, flytande avläsning där celler som tar upp EdU upptäcks med en azid-biotin-fraktion, vilket i sin tur upptäcks med streptavidin-pepparrotperoxidas (se figur 1). Mängden pepparrotperoxidas kvantifieras sedan med hjälp av ett standard substrat som är formaterat för ELISA. Fördelen med denna teknik är en mer homogen avläsning, och figur 2a, B visar exempel på experiment där denna metod var anställd. Dessutom kan plattan läsas på några sekunder. Det finns dock nackdelar med denna metod. För det första är bakgrunden med denna metod högre än med fluorescens. För att minska bakgrunden, vi införlivat ett blockerande steg och flera tvättar. Som en återspegling av denna bakgrund, negativa kontroller (obehandlade celler) tenderar att vara högre, och luckan ökningen av spridningen är lägre. För det andra, som med fluorescens avläsning, alla fibrer eller döda celler som plockar upp detekterings reagenser kommer att lägga till den totala luminescence.
I ett försök att minska variationen i ovanstående experiment, normaliserade vi våra resultat till inledande cell räkningar. För proliferation analyser, normalisering måste göras på levande celler i början av analysen innan cellerna delar. Dessutom kan analysen inte påverka cellens funktion eller inkorporering av EdU. Med tanke på dessa begränsningar valde vi att använda metabolism som en återspegling av cell nummer via resazurin14. Resultat med och utan normalisering visas i figur 2b. Men i en separat uppsättning experiment fann vi att denna metod inte är tillräckligt känslig för att upptäcka små skillnader i cell nummer. Dessutom introducerar eventuella fel i denna avläsning mer fel i hela experimentet. Av dessa skäl har vi valt att ta extra omsorg till plåt celler så jämnt som möjligt, och inte utföra ett normaliserings steg.
För att vara säker på att vi fick de mest exakta resultaten möjligt, vi återgår till fluorescerande färgning (avsnitt 1) och räkna celler med en inverterad fluorescens Mikroskop. Fördelen med denna metod är att man fysiskt kan se och räkna de positiva cellerna, vilket säkerställer den mest noggrannhet (figur 3). Alla fluorescerande skräp kan uteslutas från räkningen. Bakgrunds antal utan EdU är 0 eftersom det inte finns någon synlig fluorescens, och därför ingen bakgrund att subtrahera. Den största nackdelen med denna metod är tid. Att räkna kärnor i celler pläterade i en 96 väl tallrik, vi tar 3 bilder per brunn av både EdU positiva celler och totala celler (DAPI), som kräver 6 bilder per brunn. Vi tar bilder vertikalt från midsection av toppen till botten av brunnen, noga med att inte överlappa och räkna celler två gånger. Räkna totala celler ger oss en andra del av data som bekräftar vår spridning resultat. Men mot bakgrund av den relativt långsamma fördubblings tiden för VSMC (36 − 48 h), är den ökade ökningen av totala celler stimuleras med PDGF vs kontroller mycket lägre än den Fold ökning av EdU positiva celler, vilket är anledningen till att vi mäter införlivandet av EdU (figur 2C).
Det mest effektiva och exakta sättet att räkna EdU positiva och totala celler är genom att använda en avbildning plattan läsare. Den här metoden kombinerar noggrannheten för att räkna med automatiserings hastigheten. Den största nackdelen är att denna utrustning inte är tillgänglig vid varje institution. Vid jämförelse av automatiserade vs manuella räkningar var EdU Positive manuell räkning i stort sett identisk med det automatiserade antalet (figur 2C, vänster), liksom de totala ostimulerade räkningarna (figur 2C, höger). Emellertid, den manuella räkningen var lägre än den automatiserade räkningen i totala PDGF-stimulerade celler. Denna skillnad gäller sannolikt celltillväxt mönster. Eftersom cellerna tenderar att växa i mitten av brunnen, med mindre siffror de automatiserade och manuella räkningar var nästan identiska. Men med högre siffror fanns det sannolikt fler celler i kanterna och de manuella räkningar, som inte fånga celler i utkanten av brunnen, var mindre exakt.
Bild 1: översikt av EdU-detektion genom fluorescens eller Luminescens.
VSMC eller andra adherenta celler behandlas under villkor av intresse. EdU läggs till under de sista 24 h av kultur perioden och införlivas i DNA för att dividera celler. Incorporated EdU identifieras sedan med fluorescens (protokoll avsnitt 1) eller luminiscens (protokoll avsnitt 2). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: mäta spridningen med olika avläsningar med hjälp av inkorporering av EdU och klicka på kemi.
A) vsmcs var odlade i närvaro eller frånvaro av PDGF. EdU lades till den sista 24 h kultur, och införlivande upptäcktes av antingen fluorescens (protokoll avsnitt 1) eller luminiscens (protokoll avsnitt 2). Bvsmcs behandlades enligt beskrivningen i panel A, och inkorporering av EdU mättes genom Luminescens. Resultaten normaliserades till initiala cellantal med hjälp av resazurin genomförbarhet analys. C) vsmcs behandlades som i panel A, och inkorporering av EdU mättes med fluorescens. EdU positiva celler räknades automatiskt, med hjälp av en bildplatta läsare, eller manuellt genom avbildning och sedan räkna med hjälp av bildprogram. Resultat som visas är den genomsnittliga ± standardavvikelsen på 3 – 6 replikat per behandling.
Figur 3: visualisering av EdU positiva celler efter Klicka fluorescensprotokoll.
Vsmc behandlades som beskrivs i figur 2, och Incorporated EdU upptäcktes med fluorescens (protokoll avsnitt 1). Varje bild är en enkel brunn av en 96 brunn plattan. Totala kärnor visas i blått (DAPI) och EdU positiva kärnor är gröna. Scale bar = 50 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inkorporering av EdU är ett enkelt och okomplicerat sätt att mäta cellproliferation; Det är särskilt användbart för anhängare celler13. Vårt protokoll använder glattmuskelceller, men det är tillämpligt på alla anhängare cell (epitelial, endoteliala, etc.). Även om protokollet inte är komplicerat, är det enda kritiska steget att göra etiketteringslösningen – ingredienserna måste läggas till i den ordning som anges. Dessutom, liksom kemiluminiscenta västerländska blots, om du använder Luminescens avläsning plattan måste läsas omedelbart.
Flera delar av protokollet kan ändras eller optimeras efter behov. En del är varaktigheten av inkubering med EdU. Eftersom vårt mål var att upptäcka så många prolifererande celler som möjligt, lade vi till EdU för en fullständig 24 h före fixering och färgning. Men denna timing sannolikt åtgärder celler i både S och G2/M faser. För att endast märka celler i S-fasen, rekommenderar Cecchini et al. att även långsamt dela celler inkuberas med EdU längre än 6 timmar7. En annan del av protokollet som kan optimeras är mängden chelator. Alkyne-azid-reaktioner kräver en koppar katalysator (CuSO4). THPTA är en kopparkelator som upprätthåller koppar i den nödvändiga Oxidationstillstånd. Förhållandet mellan kelator till koppar kan varieras, att öka alkyne-azid bindning. Vi observerar ljusa färgning med en kelator: koppar förhållande på 2:1, i samband med också med hjälp av picolyl azid. Den picolyl delen tillför kelering aktivitet som minskar koncentrationen av koppar behövs och ökar effektiviteten av reaktionen15. Chelator: koppar förhållanden kan ökas, vanligtvis upp till 5:1, för att optimera per prövarens behov. En bättre kelator, 2-[4-({BIS [(1-tert-butyl-1H-1, 2, 3-triazol-4-yl) metyl] amino} metyl)-1H-1, 2, 3-triazol-1-yl] ättiksyra (BTTAA), är nu kommersiellt tillgänglig16. Detta kelator var inte kommersiellt tillgänglig när vi först härrörde detta protokoll. Slutligen, även om vi använder PARAFORMALDEHYD som fixativ i detta protokoll, kan celler fixeras med metanol, vilket också undanrömer permeabiliseringssteget. Fixering med metanol kan vara till hjälp om man vill kombinera Immunofluorescerande färgning av specifika cellulära proteiner med inkorporering av EdU.
En nackdel med denna metod är den potentiella cytotoxiciteten hos EdU, särskilt vid kontinuerlig märkning med EdU i dagar i motsats till en puls etikett på timmar. Beroende på vilka celler som används har EdU visat sig orsaka cellcykelarrest eller till och med apoptos17. Denna toxicitet tros bero på defekt DNA-replikation från tillsats av konstgjorda nukleosider18. Studier har visat denna toxicitet vara cell linje beroende och koncentrationsberoende17. Vi har inte observerat några problem med toxicitet i våra studier.
Sammanfattningsvis, mäta proliferation via EdU och klicka kemi har flera fördelar jämfört med andra vanliga metoder såsom BrdU eller 3H-thymidine inkorporering. Dessa inkluderar att undvika radioaktivitet, hög specificitet med låg bakgrund, och inget behov av hårda denaturering steg. När etablerad, klicka kemi är mycket mångsidig, och kan lätt modifieras för metabolisk märkning av RNA, protein, fettsyror, och kolhydrater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Katie Carroll för teknisk assistans. Vi tackar också Dr David cool och proteomik analyslaboratorium för instruktion på och tillhandahållande av Cytation Imaging Plate Reader. Detta arbete stöddes av en Wright State Foundation Grant (till L.E.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Carbosynth | NE08701 | |
| biotin picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1167-5 | |
| CuSO4 | Fisher Scientific | C1297-100G | |
| Cy3 picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1178-1 | |
| Cytation Plate Reader | Biotek | ||
| EVOS Microscope | Thermo Fisher Scientific | ||
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| Na ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-250G | |
| NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes | Invitrogen | R37606 | DAPI nuclear stain |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | blocking buffer |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15710 | |
| PBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Sodium Chloride | Sigma Life Science | S3014-5kg | |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate | Life Technologies | S911 | |
| Super Signal ELISA Femto | Thermo Scientific | PI137075 | ELISA substrate |
| Synergy Plate Reader | Biotek | ||
| THPTA | Click Chemistry Tools | 1010-100 | |
| Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl) | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Triton X 100 | Bio-Rad | 1610407 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
References
- Fuster, J. J., et al. Control of cell proliferation in atherosclerosis: Insights from animal models and human studies. Cardiovascular Research. 86 (2), 254-264 (2010).
- Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).
- Cizek, S. M., et al. Risk factors for atherosclerosis and the development of preatherosclerotic intimal hyperplasia. Cardiovascular pathology the Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 16 (6), 344-350 (2007).
- Romar, G. A., Kupper, T. S., Divito, S. J. Research techniques made simple: Techniques to assess cell proliferation. Journal of Investigative Dermatology. 136, e1-e7 (2016).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. 44, 4-7 (2010).
- Sletten, E., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal Chemistry: Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality. Angewandte Chemie International Edition. 48 (38), 6974-6998 (2009).
- Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (59), 1-7 (2012).
- Clarke, S. T., Calderon, V., Bradford, J. A. Click Chemistry for Analysis of Cell Proliferation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 82 (1), (2017).
- Jiang, H., et al. Monitoring dynamic glycosylation in vivo using supersensitive click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 698-706 (2014).
- Izquierdo, E., Delgado, A.
- Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).
- Hong, V., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Finn, M. G. Labeling Live Cells by Copper-Catalyzed Alkyne-Azide Click Chemistry. Bioconjugate Chemistry. 21 (10), 1912-1916 (2011).
- Arumugam, P., Carroll, K. L., Berceli, S. A., Barnhill, S., Wrenshall, L. E. Expression of a Functional IL-2 Receptor in Vascular Smooth Muscle Cells. The Journal of Immunology. 202 (3), 694-703 (2019).
- Stoddart, M. J. Mammalian cell viability: methods and protocols. , Humana Press. New York, NY. (2011).
- Uttamapinant, C., Tangpeerachaikul, A., Grecian, S., Clarke, S., Singh, U. Fast, Cell-compatible Click Chemistry with Copper-chelating Azides for Biomolecular Labeling. Angewandte Chemie International Edition. 154 (11), 2262-2265 (2012).
- Bescancy-Webler, C., et al. Raising the Efficacy of Bioorthogonal Click Reactions for Bioconjugation: A Comparative Study. Angewandte. Chemie International Edition. 50 (35), 8051-8056 (2011).
- Diermeier-Daucher, S., et al. Cell type specific applicability of 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EDU) for dynamic proliferation assessment in flow cytometry. Cytometry Part A. 75 (6), 535-546 (2009).
- Cieślar-Pobuda, A., Los, M. J. Prospects and limitations of “Click-Chemistry”-based DNA labeling technique employing 5-ethynyl-2′deoxyuridine (EdU). Cytometry Part A. 83 (11), 977-978 (2013).
