Summary
增殖是细胞功能的关键部分，也是用于评估新药潜在毒性的常见读物。因此，测量增殖是细胞生物学中常用的测定方法。在这里，我们提出了一种简单、通用的测量增殖方法，可用于附着细胞和非粘附细胞。
Abstract
细胞增殖能力是大多数细胞正常功能的组成部分，增殖障碍是许多疾病过程的核心。由于这些原因，测量增殖是评估细胞功能的常用工具。细胞增殖只需计数即可测量;然而，这是衡量扩散的间接手段。直接检测准备分裂的细胞的一种常见方法就是加入标记的核苷模拟物。其中包括放射性核苷模拟3H-硫酰胺加非放射性核苷模拟物，如5-溴-2'脱氧尿碱（BrdU）和5-乙酰-2+-脱氧尿碱（EdU）。EdU 的加入通过点击化学检测，与 BrdU 相比，它具有几个优点。在本报告中，我们提供了一个协议，用于通过纳入EdU来测量扩散。该协议包括各种读出选项，以及每种读出的优缺点。我们还讨论了可以优化或更改协议以满足计划实验的特定需求的地方。最后，我们来谈谈如何修改这个基本协议来测量其他细胞代谢物。
Introduction
增殖是细胞功能1，2的关键部分。控制扩散会影响正常过程，如发育和病理过程，如癌症和心血管疾病。例如，血管平滑肌细胞的超塑性生长被认为是动脉粥样硬化3的前兆。细胞增殖的变化也被用来评估新药的潜在毒性。鉴于其广泛影响，测量增殖是许多基于细胞生物学的实验室的支柱。
如果感兴趣的细胞群分裂得相当快，只需计算细胞，即可测量细胞增殖。对于生长较慢的细胞，细胞计数可能不太敏感。扩散通常通过加入标记的核苷模拟物来衡量。虽然金本标准是3个H-硫酰胺结合，许多实验室正在摆脱这种方法，因为有更新的，非放射性替代品。其中包括细胞质荧光染料，检测细胞周期相关蛋白质，并纳入非放射性核苷类物，如5-bromo-2'脱氧尿碱（BrdU）和5-乙酰-2+-脱氧尿碱（EdU）4。
细胞质染料，如卡博氟西林二乙酸二乙酰乙酯（CFSE），检测增殖，因为染料的强度减半，每次细胞分裂5。此技术通常用于非粘附细胞的流式细胞测定。它并没有被大量用于粘附细胞，但随着新一代成像板读取器，这种情况可能会改变。通过基于抗体的技术（流细胞测定、免疫组织化学等）检测细胞周期相关蛋白，通常用于组织或非粘附细胞。这些细胞/组织在染色前必须固定和渗透。核苷模拟BrdU和EdU在接近3个H-硫酰胺的方法上相似，但没有放射性的不便。BrdU的加入通过抗BrdU抗体检测，因此细胞在染色前必须固定和渗透。此外，细胞必须用DNase处理，以暴露BrdU表位。
EdU的加入通过点击化学检测，其中烷基和阿齐德组在催化铜的存在下"点击"在一起。任一组都可以作为生物合成结合的分子或检测分子4。商业上可用的核苷类物附加了烷基组。因此，对于增殖测定，烷基可功能化核苷模拟被与荧光染料或其他标记物结合的阿齐德检测。与 BrdU 公司多，EdU 的合并有几个优势。首先，由于烷基和阿齐德组在哺乳动物细胞中找不到，这种相互作用在低背景6下是高度特异性的。由于两组都很小，细胞不需要进行DNA变性，以暴露核苷模拟，如BrdU7要求。最后，点击化学是高度通用的，可用于DNA，RNA，蛋白质，脂肪酸和碳水化合物8，9，10，11的代谢标记。如果代谢标记感兴趣的目标在细胞表面，活细胞可以标记为12。此外，细胞可以进一步处理免疫荧光染色与抗体。
以下协议描述了使用EdU合并和点击化学测量人类血管平滑肌细胞的增殖（图1）。我们展示了三种不同的方法，可以衡量EdU的合并，每个方法具有代表性的结果，以及它们的优缺点。通过点击化学测量增殖对于粘附性、生长较慢的细胞特别有用。此外，细胞的形态得到了很好的维护，并且也可以进行基于抗体的染色。
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Protocol
1. 使用荧光标签检测 EDU
- 库存解决方案
- 通过将 12.5 mg EdU 添加到 10 mL 的双蒸馏 H2O 中，准备 5 mM EdU 库存溶液。
- 准备标签溶液组分：200 mM tris（3-羟基苯甲酸酯）胺（THPTA）（100毫克，1.15 mL H2O），100 mM CuSO 4（15.95毫克，1 mL H2O;制作新鲜），10mM Cy3 picolyl-azide（1毫克，在95.3 mL H2O中），储存在-20°C下5μL等分，和1M抗坏血酸钠（200毫克在1mL H2O;使新鲜）。
- 以0.15mg/mL的浓度制备resazurin库存溶液。过滤灭菌，并在4°C下储存1 mL等分。
注： Picolyl azide 可与几种不同的荧光、生物锡和马萝卜过氧化物酶 （HRP） 结合使用。
- 使用 EdU 标记血管平滑肌细胞 （VSMC）。
注：人类VSMC通过从外植的块组织中生长，从iliac动脉中分离出来。当生长在无血清介质与胰岛素，转移素，硒这些细胞表达VSMC标记平滑素，平滑肌黄素重链（SM-MHC）和SMCβactin13。- 在Dulbeco的改性鹰介质（DMEM）中的2 x 104/mL的板血管平滑肌细胞（DMEM）。
注：细胞在平滑肌细胞培养基中生长37°C，胎儿牛血清为2%。 - （可选）等待几个小时过夜，以便坚持。在每个井中加入 20 μL 雷沙祖林库存。在37°C孵育3小时。在板读器（560 ex，594em）中读取荧光信号。用新的 DMEM 替换介质。
注： 此步骤是可选的。Resazurin用于使细胞数量正常化，并解释电镀14中的可良好变异性。 - 在培养期开始时，每次处理加入磷酸盐缓冲盐水（PBS）或血小板衍生生长因子（PDGF）30纳克/mL至3⁄6孔，孵育72小时。
- 稀释 5 mM EdU 库存至 1 mM。在 72 h 培养期的最后 24 小时，向每口井添加 2 μL（最终浓度为 20 μM）。不要将 EdU 添加到一组复制。这些井将用于确定背景荧光/发光。
注： 培养和标记与 EdU 的持续时间针对平滑肌细胞进行了优化，但可能需要根据每个细胞类型进行修改。
- 在Dulbeco的改性鹰介质（DMEM）中的2 x 104/mL的板血管平滑肌细胞（DMEM）。
- 将细胞固定在甲醛（PFA）中。
- 取出介质，在室温下每口井内加入 150 μL 4% PFA（PBS 中）。
- 去除PFA，并在室温下每井加入150 μL的1%聚乙烯乙二醇三酯-八苯醚（TX-100）（水中）。
- 使用 PBS 清洗三次，取出 TX-100。
注意：PFA是有毒的，小心处理。
注： 可以在此处暂停该协议。固定细胞可储存在4°C的PBS中。
- 检测合并 EdU。
- 在使用前，通过按以下顺序从库存溶液中添加试剂，使贴标溶液（每 96 孔板 10 mL，使用内部 60 孔）：THPTA 20 μL，CuSO4 20 μL，Cy3 picolyl azide 5 μL，Na 抗坏剂 100 μL 到 PBS，总体积为 10 mL。
- 从井中取出PBS，并在每口井中加入150μL的标签溶液。在37°C下孵育30分钟。要检测所有核，在每个孔中加入4°，6-二酰胺-2-苯林多尔（DAPI）。在荧光板读取器上阅读（Cy3 550ex，570em;DAPI 350ex， 470em） 或显微镜上的图像。
注： 可以在此处暂停该协议。固定和染色细胞可储存在4°C的PBS中，并在以后进行成像。
2. 使用发光检测 EdU
- 完成第 1.1~1.3 节。
- 用0.1%多索巴20（TBST）制备三缓冲盐水。
- 堵住井。
- 在每个井中加入150 μL的阻塞缓冲液（材料表），并在室温下孵育90分钟。
- 去除阻塞缓冲液，用200 μL的PBS洗涤三次。
- 检测合并 EdU。
- 使标签溶液按照步骤 1.4.1 中的指示，用生物锡片片代替 Cy3 picolyl azide。
- 用200 μL的TBST洗井5次，摇动，每次洗涤3分钟。
- 在室温下，用150μL的0.3%H2O22淬火内源性过氧化物酶20分钟。
- 去除 H2O2，用 200 μL 的 TBST 洗涤 5 次，每次洗涤时摇动 3 分钟。
- 在TBST中稀释链球蛋白-马萝卜过氧化物酶（SA-HRP;1：200），并在每口井中加入50μL。在室温下孵育1小时。
- 用200 μL的TBST洗涤5次，摇动，每次洗涤3分钟。
- 在每个井中加入50μL的化学发光酶链接免疫吸附测定（ELISA）基板（材料表）。
- 立即在能够检测发光的板式读取器中读取。
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Representative Results
在图2中，我们演示了三个不同实验的结果，它们测量VSMC在PDGF下的激增。在培养为SMC配制的培养细胞后，我们进行了无血清DMEM实验，以消除血清或生长因子对增殖的任何潜在影响。在图2A中，我们使用荧光与发光读出比较了同一实验的结果。为了读取这些板，我们使用多模微板读取器，可以读取吸光度、荧光和发光（参见材料表）。
在扫描孔模式下使用板读取器，在整个孔中平均荧光读数。此模式可缓解由于井的中心和边缘之间的差异而导致的潜在误差。然而，如果很少有核是阳性的，那么以这种方式的阅读结果可能会低估阳性细胞的"数量"，而只有很少的细胞是阳性的。数字，用这个读出，表示荧光相对于另一个井，而不是精确的细胞数。此外，如果有一个纤维或一团死细胞，拿起荧光，这将包括在区域扫描。但是，使用板读取器的优点是时间。虽然扫描模式下的读取每口井需要 15-20 秒，但相对于使用成像软件拍照和分析的个人耗时方法而言，它是自动化的。
为了纠正上述方法的潜在低估，我们将荧光扫描转换为同质液体读出，其中使用阿齐德-生物蛋白莫伊蒂检测取EdU的细胞，而后者又通过链球菌-马萝卜过氧化物酶检测（参见图 1。然后，使用 ELISA 格式的标准基板对马萝卜过氧化物酶的量进行量化。该技术的优点是更均匀的读出，图 2A，B显示了使用此方法的实验示例。此外，板可以在几秒钟内读取。但是，此方法有缺点。首先，该方法的背景高于荧光。为了减少背景，我们加入了一个阻塞步骤和多个分时。作为这一背景的反映，阴性对照（未经处理的细胞）往往较高，增殖的倍增较低。其次，与荧光读出一样，任何拾取检测试剂的纤维或死细胞都会增加总发光。
为了减少上述实验中的可变性，我们将结果归一化为初始细胞计数。对于增殖测定，必须在细胞分裂前在测定开始时对活细胞进行标准化。此外，测定不会影响细胞功能或EdU的加入。鉴于这些限制，我们选择使用代谢作为细胞数的反映，通过resazurin14。具有和没有规范化的结果如图2B所示。然而，在一组单独的实验中，我们发现这种方法不够敏感，无法检测细胞数的微小差异。此外，此读出中的任何错误都会在整个实验中引入更多错误。出于这些原因，我们选择对尽可能均匀的板细胞采取特别小心，而不是执行规范化步骤。
为了确保我们得到最准确的结果，我们恢复荧光染色（第 1 节）和使用倒荧光显微镜计算细胞。此方法的优点是，可以物理地看到和计数正细胞，确保最的准确性 （图 3）。任何荧光碎片都可以从计数中排除。没有 EdU 的背景计数为 0，因为没有可见的荧光，因此没有要减去的背景。此方法的主要缺点是时间。为了计算在96孔板中镀的细胞中的细胞核，我们每孔拍摄3张EdU阳性细胞和总细胞（DAPI）的照片，每孔需要6张图像。我们从井的中段到井底垂直拍摄照片，注意不要重叠，并计算两次细胞。计算细胞总数为我们提供了第二个数据，证实了我们的增殖结果。然而，鉴于VSMC的倍增时间相对缓慢（36~48小时），PDGF刺激的总细胞与对照组增加的倍数比EDU阳性细胞的倍增低，这就是为什么我们测量EDU的加入（图2C）。
最有效和准确的方法来计数EdU阳性和总细胞是通过使用成像板读取器。该方法将计数的准确性与自动化速度相结合。主要缺点是，并非所有机构都提供这种设备。在比较自动计数与手动计数时，EdU 正手动计数与自动计数（图 2C，左图）基本相同，未刺激计数总数（图 2C，右图）也是如此。然而，手动计数低于PDGF刺激细胞总数的自动计数。这种差异可能与细胞生长模式有关。因为细胞往往生长在井的中心，与较小的数字，自动和手动计数几乎相同。然而，随着数字的升高，边缘上的细胞可能更多，而手动计数（没有捕获油井边缘的细胞）则不太准确。
图1：通过荧光或发光检测的EdU检测概述。
VSMC 或其他粘附细胞在感兴趣的条件下进行治疗。在培养期的最后24小时添加EdU，并纳入分裂的细胞的DNA中。然后使用荧光（协议第 1 节）或发光（协议第 2 节）检测合并 EdU。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2：使用 EdU 和单击化学的加入使用不同的读出量测量扩散。
（A） VSMC 是在存在或不存在 PDGF 的情况下培养的.EdU 被添加到最后 24 小时的培养，并且通过荧光（协议第 1 节）或发光（协议第 2 节）检测到合并。（B） VSMC按小组A所述处理，并结合EdU通过发光进行测量。结果被归化为初始细胞计数使用resazurin可行性测定。（C） VSMC在面板A中被视为，并结合EdU通过荧光进行测量。EdU 阳性细胞自动计数，使用成像板读取器，或使用成像软件手动进行成像，然后计数。结果显示，每次治疗的平均= 标准偏差为 3⁄6 次复制。
图3：点击荧光协议后EdU阳性细胞的可视化。
VSMC如图2所述，并采用荧光检测了EDU（协议第1节）。每个图像是 96 孔板的单个孔。总核以蓝色（DAPI）显示，EdU阳性核为绿色。比例尺 = 50 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
纳入EdU是测量细胞增殖的一种简单、直接的方法;它特别适用于附着细胞13。我们的协议使用平滑肌肉细胞，但它适用于任何粘附细胞（上皮，内皮等）。尽管协议并不复杂，但关键的一步是制作标签解决方案 - 成分必须按列出的顺序添加。此外，像化学发光的西方印迹，如果使用发光读出板必须立即读取。
可以根据需要修改或优化协议的几个部分。其中一部分是与EdU的孵育期。因为我们的目标是检测尽可能多的增殖细胞，我们在修复和染色之前添加了EdU整整24小时。但是，此时间可能测量 S 和 G2/M 阶段的单元。为了只给S相的细胞贴上标签，Cecchini等人建议，即使是缓慢分裂的细胞，也用EdU孵育不超过6小时7。可以优化的协议的另一部分是包合器的数量。烷基-阿齐德反应需要铜催化剂（CuSO4）。THPTA 是一种铜包合器，可在必要的氧化状态下保持铜。合苯与铜的比例可以变化，以增加烷基-阿齐德结合。我们观察到明亮的染色与包合器：铜比2：1，在上下文中也使用picolyl azide。picolyl moiety增加了合化活性，降低了所需的铜的浓度，提高了反应效率15。切拉托：铜比可以增加，通常高达5：1，以优化每个调查员的需求。更好的夹子，2-[4-（[bis]（1-tt-丁基-1H-1，2，3-triazol-4-yl）甲基[氨基）-1H-1，2，3-triazol-1-yl_a乙酸（BTTAA），现已上市16。当我们第一次派生此协议时，此包器在商业上不可用。最后，虽然我们使用甲醛作为固定剂，但细胞可以用甲醇固定，这也消除了渗透步骤。如果想要将特定细胞蛋白的免疫荧光染色与EdU的合并相结合，使用甲醇修复会很有帮助。
此方法的一个缺点是 EdU 的潜在细胞毒性，特别是当连续使用 EdU 标记数天而不是与小时脉冲标签相比。根据所使用的细胞，EdU已被发现导致细胞周期逮捕，甚至凋亡17。这种毒性被认为是由于有缺陷的DNA复制从添加人造核苷18。研究表明，这种毒性是细胞系依赖和浓度依赖17。在我们的研究中，我们没有发现任何毒性问题。
总之，通过EdU和点击化学测量增殖与其他常用方法（如BrdU或3个H-thymidine合并）具有若干优势。这些包括避免放射性，高特异性与低背景，和不需要苛刻的变性步骤。一旦建立，点击化学是高度通用的，并可以很容易地修改为RNA，蛋白质，脂肪酸和碳水化合物的代谢标签。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢凯蒂·卡罗尔的技术援助。我们还感谢 David Cool 博士和蛋白质组学分析实验室对 Cytation 成像板阅读器的指导并提供。这项工作得到了赖特州基金会（L.E.W.）赠款的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Carbosynth | NE08701 | |
| biotin picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1167-5 | |
| CuSO4 | Fisher Scientific | C1297-100G | |
| Cy3 picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1178-1 | |
| Cytation Plate Reader | Biotek | ||
| EVOS Microscope | Thermo Fisher Scientific | ||
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| Na ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-250G | |
| NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes | Invitrogen | R37606 | DAPI nuclear stain |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | blocking buffer |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15710 | |
| PBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Sodium Chloride | Sigma Life Science | S3014-5kg | |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate | Life Technologies | S911 | |
| Super Signal ELISA Femto | Thermo Scientific | PI137075 | ELISA substrate |
| Synergy Plate Reader | Biotek | ||
| THPTA | Click Chemistry Tools | 1010-100 | |
| Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl) | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Triton X 100 | Bio-Rad | 1610407 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
References
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