Summary
Proliferasyon hücresel fonksiyonun kritik bir parçasıdır ve yeni ilaçların potansiyel toksisitesini değerlendirmek için kullanılan yaygın bir okumadır. Bu nedenle, proliferasyonun ölçülmesi hücre biyolojisinde sıkça kullanılan bir ispondur. Burada, yapışık ve yapışık olmayan hücrelerde kullanılabilecek basit ve çok yönlü bir proliferasyon ölçme yöntemi salıyoruz.
Abstract
Bir hücrenin çoğalma yeteneği çoğu hücrenin normal fonksiyonunun ayrılmaz bir parçasıdır ve proliferasyon un disregülasyonu birçok hastalık süreçlerinin merkezinde yer alır. Bu nedenlerden dolayı, proliferasyonölçümü hücre fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılan yaygın bir araçtır. Hücre çoğalması basitçe sayılarak ölçülebilir; ancak bu, çoğalma ölçmek için dolaylı bir araçtır. Bölmeye hazırlanan hücreleri doğrudan algılamanın ortak yollarından biri, etiketli nükleozit analoglarının birleştirilmesidir. Bunlar arasında radyoaktif nükleozit analog 3H-timinin artı 5-bromo-2' deoksiürin (BrdU) ve 5-etirnil-2′-deoksitürin (EdU) gibi radyoaktif olmayan nükleozit analogları bulunmaktadır. EdU'nun dahil edilmesi, BrdU ile karşılaştırıldığında çeşitli avantajları olan tıklama kimyası ile algılanır. Bu raporda, EdU'nun dahil edilmesiyle çoğalma ölçmek için bir protokol salıyoruz. Bu protokol, her birinin avantajları ve dezavantajları ile birlikte çeşitli okumalar için seçenekler içerir. Ayrıca, protokolün planlanan deneyin özel gereksinimlerini karşılamak üzere optimize edilebildiği veya değiştirilebileceği yerleri de tartışırız. Son olarak, bu temel protokolün diğer hücre metabolitlerini ölçmek için değiştirilme yollarına değiniyoruz.
Introduction
Proliferasyon hücresel fonksiyonun kritik bir parçasıdır1,2. Proliferasyonun kontrolü, kanser ve kardiyovasküler hastalık gibi gelişim ve patolojik süreçler gibi normal süreçleri etkiler. Vasküler düz kas hücrelerinin hiperplastik büyüme, örneğin, ateroskleroz bir habercisi olduğu düşünülmektedir3. Hücre çoğalmasındaki değişiklikler, yeni ilaçların potansiyel toksisitesini değerlendirmek için de kullanılmaktadır. Yaygın etkisi göz önüne alındığında, proliferasyon ölçümü birçok hücre biyolojisi tabanlı laboratuvarların dayanak noktasıdır.
Hücre çoğalması, hücre popülasyonu oldukça hızlı bölünürse, sadece hücreleri sayarak ölçülebilir. Yavaş büyüyen hücreler için hücre sayıları daha az hassas olabilir. Proliferasyon genellikle etiketli nükleozit analoglarının birleştirilmesi ile ölçülür. Altın standart 3H-timidin dahil olmasına rağmen, birçok laboratuvarlar yeni, radyoaktif olmayan alternatifler durumu göz önüne alındığında bu yöntemden uzak laşıyorlar. Bunlar arasında sitoplazmik floresan boyalar, hücre döngüsü ile ilişkili proteinlerin saptanması ve 5-bromo-2' deoksiürin (BrdU) ve 5-ethynyl-2′-deoksitürin(EdU) 4 gibi radyoaktif olmayan nükleozit analoglarının birleşmesi sayılabilir.
Karboksifluorescein diasetat succinimidyl ester (CFSE) gibi sitoplazmik boyalar, hücre5'iher bölünde de boyanın yoğunluğu yarıya indiği için çoğalma tespit eder. Bu teknik genellikle non-yapışık hücreler için akış sitometri kullanılır. Bu yapışık hücreler için çok kullanılmamıştır, ancak görüntüleme plaka okuyucuların yeni nesil ile bu değişebilir. Antikor temelli tekniklerle (akış sitometrisi, immünohistokimya, vb.) hücre döngüsü ile ilişkili proteinlerin saptanması genellikle dokular veya non-yapışık hücreler için kullanılır. Bu hücreler/dokular boyama dan önce sabit ve permeabilize edilmelidir. Nükleozit analogları BrdU ve EdU 3H-timidin yaklaşım benzer, ancak radyoaktivite rahatsızlık olmadan. BrdU'nun dahil edilmesi anti-BrdU antikorları tarafından saptanmıştır ve bu nedenle hücreler boyamadan önce sabit ve permeabilize edilmelidir. Buna ek olarak, brdU epitop maruz kalmak için hücreler DNase ile tedavi edilmelidir.
EdU'nun birleştirilmesi, alkin ve azid gruplarının katalitik bakır varlığında bir araya gelip "tıkladığı" tıklama kimyası ile saptanır. Her iki grup biyosentetik olarak dahil molekül veya algılamamolekülü 4olarak hizmet verebilir. Ticari olarak mevcut nükleozit analogları alkyne grubu bağlı. Bu nedenle, alkine fonksiyonel nükleozit analogunun floresan boya veya diğer belirteçlere konjuge bir azid ile saptanır. EdU'nun bã1/4tçeye karŠı çok sayıda avantajı bulunuyor. Birincisi, alkine ve azit grupları memeli hücrelerinde bulunmadığından, bu etkileşim düşük arka plan6ile son derece spesifiktir. Her iki grup da küçük olduğundan, brdU7için gerekli olan nükleozit analogunu ortaya çıkarmak için hücrelerin DNA denatürasyonuna geçmesi gerekmez. Son olarak, tıklama kimyası çok yönlü, ve DNA, RNA, protein, yağ asitleri vekarbonhidratlar8,9,10,11metabolik etiketleme için kullanılabilir. Metabolik olarak etiketlenmiş ilgi hedefi hücre yüzeyinde ise, canlı hücreler12olarak etiketlenebilir. Buna ek olarak, hücreler daha fazla antikorlar ile immünofloresan boyama için işlenebilir.
Aşağıdaki protokol, insan vasküler düz kas hücrelerinde çoğalmayı ölçmek için EdU kuruluş ve tıklama kimyası kullanımını açıklar(Şekil 1). EdU'nun üç farklı şekilde ölçülebileceğini, her birinden temsili sonuçlar ve bunların avantaj ve dezavantajlarının ölçülebileceğini gösteriyoruz. Tıklama kimyası ile çoğalma ölçme özellikle yapışık, yavaş büyüyen hücreler için yararlıdır. Buna ek olarak, hücrenin morfolojisi iyi korunur ve antikor bazlı boyama da yapılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Floresan etiket kullanılarak EdU'nun algılanması
- Stok çözümleri
- 10 mL çift distile H2O'ya 12,5 mg EdU ekleyerek 5 mM EdU stok çözeltisi hazırlayın.
- Etiketleme çözeltisi bileşenlerini hazırlayın: 200 mM tris (3-hidroksipropiltririlolylmethyl)amin (THPTA) (100 mg in 1.15 mL H2O), 100 mM CuSO4 (1m CuSO 1 mL H2O; taze olun), 10 mM Cy3 pikolyl-azide (1 mg in 95.3 m HL2L2L - 20 °C'de 5°L aliquots ve 1 M sodyum askorbat (1 mL H2O 200 mg; taze olun) saklanır.
- Resazurin stok çözeltisini 0.15 mg/mL konsantrasyonda hazırlayın. Filtre sterilize ve 4 ° C'de 1 mL aliquots saklayın.
NOT: Picolyl azide birkaç farklı flor, biotin ve horseradish peroksidaz (HRP) konjuge mevcuttur.
- Etiket vasküler düz kas hücreleri (VSMC) EdU ile.
NOT: İnsan VSMC'leri iliyak arterlerden dışa dönük doku parçalarından büyüme yoluyla izole edildi. İnsülin, transferrin, selenyum ile serumsuz ortamda büyüdüklerinde bu hücreler VSMC belirteçlerini smoothelin, düz kas miyozin ağır zinciri (SM-MHC) ve SMC αactin13'üifade eder.- Plaka vasküler düz kas hücreleri 2 x 104/ mL Dulbecco modifiye Eagle's orta (DMEM) bir 96 iyi plaka.
NOT: Hücreler %2 fetal sığır serumu ile düz kas hücreli ortamda 37 °C'de yetiştirilir. - (İsteğe bağlı) Bağlılık için bir gecede birkaç saat bekleyin. Her kuyuya 20 μL resazurin stoğu ekleyin. 37 °C'de 3 7 °C'de kuluçkaya yatırın. Ortamı taze DMEM ile değiştirin.
NOT: Bu adım isteğe bağlıdır. Resazurin hücre numaralarını normalleştirmek ve kaplama iyi-to-well değişkenlik hesap için kullanılır14. - Kültür döneminin başlangıcında tedavi başına 3−6 kuyuya fosfat tamponlu salin (PBS) veya trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF) ekleyin ve 72 saat kuluçka yada kuluçka.
- 5 mM EdU stoku 1 mM'ye seyreltin. 72 saat kültür periyodunun son 24 h'si için her kuyuya 2°L (son konsantrasyon 20°L) ekleyin. EdU'yi bir çoğaltma kümesine eklemeyin. Bu kuyular arka plan floresan / lüminesans belirlemek için kullanılacaktır.
NOT: EdU ile kültür ve etiketleme süresi düz kas hücreleri için optimize edilmiştir, ancak hücre tipine göre değiştirilmesi gerekebilir.
- Plaka vasküler düz kas hücreleri 2 x 104/ mL Dulbecco modifiye Eagle's orta (DMEM) bir 96 iyi plaka.
- Paraformaldehit (PFA) hücreleri düzeltmek.
- Ortamı çıkarın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca her kuyuda %4 PFA (PBS'de) 150 μL ekleyin.
- PFA'yı çıkarın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kuyu başına %1 polietilen glikol tert-oktilfenil eter (TX-100) (suda) ekleyin.
- TX-100'ü PBS ile üç kez yıkayarak çıkarın.
DİkKAT: PFA toksiktir, dikkatli bir şekilde ele alın.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Sabit hücreler 4 °C'de PBS'de saklanabilir.
- Dahil edu algıla.
- Aşağıdaki sırayla stok çözeltilerinden reaktifler ekleyerek kullanılmadan hemen önce etiketleme çözeltisi (96 kuyu başına 10 mL) yapın: THPTA 20 μL, CuSO4 20 μL, Cy3 picolyl azide 5 μL, Na askorbate 100 μL pbs toplam hacmi için 10 mL.
- PBS'yi kuyulardan çıkarın ve her kuyuya 150 μL etiketleme çözümü ekleyin. 37 °C'de kuluçka 30 dk. Tüm çekirdekleri algılamak için, her iyi 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) ekleyin. Bir floresan plaka okuyucu (Cy3 550ex, 570emokuyun ; DAPI 350ex, 470em) veya bir mikroskop üzerinde görüntü.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Sabit ve lekeli hücreler PBS'de 4 °C'de saklanabilir ve daha sonra görüntülenebilir.
2. Lüminesans kullanarak EdU'nun saptanması
- Bölüm 1.1-1.3'ün tamamını tamamlayın.
- %0,1 polisorbat 20 (TBST) ile Tris-tamponlu tuzlu hazırlayın.
- Kuyuları engelleyin.
- Her kuyuya 150 μL bloke tamponu(Malzeme Tablosu)ekleyin ve oda sıcaklığında 90 dakika kuluçkaya yatırın.
- Engelleme tamponu çıkarın ve 200 μL PBS ile üç kez yıkayın.
- Dahil edu algıla.
- Adım 1.4.1 yönettiği gibi etiketleme çözümü olun, Cy3 pikolyl azide için biotin picolyl azide yerine.
- 200 μL TBST ile kuyuları beş kez yıkayın, sallayarak, yıkama başına 3 dk.
- Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca %0,3 H2O2 ile 150 μL'lik endojen peroksidazları söndürün.
- H2O2'yi çıkarın ve 200 μL TBST ile beş kez yıkayın ve yıkama başına 3 dk sallayın.
- Seyreltik streptavidin-horseradish peroksidaz (SA-HRP; 1:200) TBST ve her kuyuya 50 μL ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat kuluçka.
- 200 μL TBST ile beş kez yıkayın, sallayarak, yıkama başına 3 dk.
- Her kuyuya 50 μL kemilüminesan enzimbağlantılı immünosorbent tsay (ELISA) substratı(Malzeme Tablosu)ekleyin.
- Lüminesans algılama yeteneğine sahip plaka okuyucu hemen okuyun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil2'de, PDGF'ye yanıt olarak VSMC'nin çoğalmasını ölçen üç farklı deneyin sonuçlarını gösteriyoruz. Kobİ'ler için formüle edilmiş ortamdaki hücreleri büyüttükten sonra, serum veya büyüme faktörlerinin çoğalma üzerindeki olası etkilerini ortadan kaldırmak için serumsuz DMEM'de deney yaptık. Şekil 2A'da, aynı deneyden elde edilen sonuçları floresan vs Parlak okuma kullanarak karşılaştırıyoruz. Bu plakaları okumak için, emicilik, floresan ve Parlaklığı okuyabilen çok modlu bir mikroplaka okuyucu kullandık (Bkz. Malzemeler Tablosu).
Plaka okuyucuyu iyi tarama modunda kullanarak, floresan okumalar tüm kuyuüzerinde ortalamaolarak alınır. Bu mod, kuyunun merkezi ve kenarları arasındaki farklar nedeniyle olası yanlışlıkların hafifletimi. However, if very few nuclei are positive, reading results in this way likely underestimates the "number" of positive cells when only a few are positive. Sayı, bu okuma ile, floresan başka bir kuyunun göreli anlamına gelir, ve tam hücre numaraları. Buna ek olarak, floresan alır ölü hücrelerin bir yığın veya bir lif varsa, bu alan tarama dahil edilecektir. Ancak, plaka okuyucu kullanmanın avantajı zaman. Tarama modunda okuma iyi başına 15−20 saniye süreriken, fotoğraf çekmek ve görüntüleme yazılımı kullanarak analiz kişisel zaman yoğun yöntem aksine otomatiktir.
Yukarıdaki yöntemden potansiyel hafife almaları düzeltmek için floresan tonu, EdU'yu alan hücrelerin azide-biotin moiety ile tespit edildiği homojen, sıvı bir okumaya dönüştürdük, bu da streptavidin-horseradish peroksidaz ile saptandı. (bkz. Şekil 1). Horseradish peroksidaz miktarı daha sonra ELISA için biçimlendirilmiş standart bir substrat kullanılarak ölçülür. Bu tekniğin avantajı daha homojen bir okumadır ve Şekil 2A,B bu yöntemin kullanıldıkları deney örneklerini gösterir. Buna ek olarak, plaka saniye içinde okunabilir. Ancak bu yöntemin dezavantajları vardır. İlk olarak, bu yöntem ile arka plan floresan ile daha yüksektir. Arka planı azaltmak için bir engelleme adımı ve birden fazla yıkama dahil ettik. Bu arka planın bir yansıması olarak, negatif kontroller (işlenmemiş hücreler) daha yüksek olma eğilimindedir ve çoğalma kat artışı daha düşüktür. İkinci olarak, floresan okuma olduğu gibi, algılama reaktifleri almak herhangi bir lif veya ölü hücreler toplam Parlaklık katacak.
Yukarıdaki deneylerdeki değişkenliği azaltmak amacıyla, sonuçlarımızı ilk hücre sayılarına göre normalleştirdik. Proliferasyon tahlilleri için, normalleştirme hücrelerin bölünmesi önce tahlil başında canlı hücreler üzerinde yapılmalıdır. Buna ek olarak, tetkik hücre işlevini veya EdU dahil etkileyemez. Bu kısıtlamalar göz önüne alındığında, biz resazurin14ile hücre sayısının bir yansıması olarak metabolizma kullanmayı seçti. Normalleştirme li ve normalolmayan sonuçlar Şekil 2B'degösterilmiştir. Ancak, ayrı bir deney kümesinde bu yöntemin hücre sayılarında küçük farklılıkları algılayacak kadar hassas olmadığını bulduk. Buna ek olarak, bu okumadaki herhangi bir hata tüm denemede daha fazla hata yalar. Bu nedenlerden dolayı, hücrelere mümkün olduğunca eşit bir şekilde olağanüstü özen göstermeyi ve normalleştirme adımı atmamayı seçtik.
Mümkün olan en doğru sonuçları aldığımızdan emin olmak için, ters floresan mikroskobu kullanarak floresan boyama (bölüm 1) ve sayma hücrelerine geri döndürüldük. Bu yöntemin avantajı, pozitif hücreleri fiziksel olarak görüp saymak ve en doğru olanı sağlamaktır (Şekil 3). Herhangi bir floresan enkaz sayımı dışında tutulabilir. Görünür floresan olmadığı için EdU'suz arka plan sayıları 0'dır ve bu nedenle çıkarı için arka plan yoktur. Bu yöntemin en büyük dezavantajı zaman. 96 kuyu plakalı hücrelerdeki çekirdekleri saymak için, hem EdU pozitif hücrelerinin hem de toplam hücrelerin (DAPI) her yerinde 3 fotoğraf çekeriz ve her biri 6 görüntü gerektirir. Üst ten dibine dikey olarak fotoğraf çekiyoruz, üst üste binmemeye ve hücreleri iki kez saymamaya özen lıyoruz. Toplam hücreleri saymak bize çoğalma sonuçlarımızı doğrulayan ikinci bir veri verir. Ancak, VSMC'nin nispeten yavaş iki katına çıkarma süresi (36−48 h) ışığında, PDGF vs kontrolleri ile uyarılan toplam hücrelerdeki kat artışı EdU pozitif hücrelerin kat artışından çok daha düşüktür, bu nedenle EdU'nun birleşmesini ölçeriz (Şekil 2C).
EdU pozitif ve toplam hücreleri saymak için en verimli ve doğru yolu bir görüntüleme plaka okuyucu kullanarak. Bu yöntem, sayma doğruluğunu otomasyon hızıyla birleştirir. Ana dezavantajı ekipman bu parça her kurumda mevcut olmamasıdır. Otomatik vs manuel sayıları karşılaştırırken, EdU pozitif manuel sayım aslında otomatik sayım(Şekil 2C, sol) ile aynıydı, toplam uyarılmamış sayımlar(Şekil 2C, sağ). Ancak, manuel sayım toplam PDGF uyarılmış hücrelerde otomatik sayım daha düşüktü. Bu fark büyük olasılıkla hücre büyüme kalıpları ile ilgilidir. Hücreler kuyunun merkezinde büyüme eğiliminde olduğundan, daha küçük sayılarla otomatik ve manuel sayımlar neredeyse aynıydı. Ancak, daha yüksek sayılar ile kenarlarında büyük olasılıkla daha fazla hücre vardı ve kuyunun çevresinde hücreleri yakalamak değildi manuel sayıları, daha az doğru idi.
Şekil 1: Floresan veya lüminesans ile EdU tespitine genel bakış.
VSMC veya diğer yapışık hücreler ilgi koşulları altında tedavi edilir. EdU kültür döneminin son 24 saat için eklenir ve bölen hücrelerin DNA içine dahil. Incorporated EdU daha sonra floresan (protokol bölüm 1) veya lüminesans (protokol bölüm 2) kullanılarak algılanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: EdU ve click kimya'yı kullanarak farklı okumalarla çoğalma ölçümü.
(A) VSMC'ler PDGF varlığında veya yokluğunda kültürlendi. EdU kültürün son 24 saat eklendi ve birleşme floresan (protokol bölüm 1) veya lüminesans (protokol bölüm 2) tarafından tespit edildi. (B) VSMC'ler A panelinde tanımlandığı gibi ele alındı ve EdU'nun dahil edilmesi lüminesans ile ölçüldü. Sonuçlar resazurin canlılık tahsini kullanılarak ilk hücre sayılarına göre normalleştirildi. (C) VSMC'ler A panelinde olduğu gibi ele alındı ve EdU'nun dahil edilmesi floresan ile ölçüldü. EdU pozitif hücreler otomatik olarak, bir görüntüleme plakası okuyucu kullanılarak, ya da elle görüntüleme ve daha sonra görüntüleme yazılımı kullanılarak sayma tarafından sayılır. Gösterilen sonuçlar tedavi başına 3-6 kopyanın ortalama ± standart sapmasıdır.
Şekil 3: EdU pozitif hücrelerinin flüoresans protokolüne tıkladıktan sonra görüntülenmesi.
VSMC Şekil 2'deaçıklandığı şekilde ele alındı ve floresan kullanılarak edu saptandı (protokol bölüm 1). Her görüntü 96 kuyu plakatek bir kuyudur. Toplam çekirdekmavi (DAPI) ve EdU pozitif çekirdekleri yeşil olarak gösterilir. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EdU'nun birleştirilmesi hücre çoğalmasını ölçmenin basit ve basit bir yoludur; özellikle yapışık hücreler için yararlıdır13. Protokolümüz düz kas hücreleri kullanır, ancak herhangi bir yapışık hücre için geçerlidir (epitel, endotel, vb). Protokol karmaşık olmasa da, tek kritik adım etiketleme çözümünü yapmaktır — maddeler listelenen sıraya eklenmelidir. Buna ek olarak, kemilüminesans Batı lekeleri gibi, lüminesans okuma kullanıyorsanız plaka hemen okunmalıdır.
Protokolün çeşitli bölümleri gerektiğinde değiştirilebilir veya optimize edilebilir. Bir kısmı EdU ile kuluçka süresidir. Amacımız mümkün olduğunca çok çoğalan hücretespit etmek olduğu için, sabitleme ve boyama önce tam 24 saat için EdU ekledi. Ancak, bu zamanlama büyük olasılıkla hem S hem de G2/M fazlarında hücreleri ölçer. S fazında sadece hücreleri etiketlemek için, Cecchini ve ark. hatta yavaş yavaş bölünen hücrelerin edu ile en fazla 6 saat7kuluçka ya da Protokolün optimize edilebilen bir diğer parçası da şelatör miktarıdır. Alkyne-azit reaksiyonları bakır katalizör gerektirir (CuSO4). THPTA gerekli oksidasyon durumunda bakır tutan bir bakır şelatördür. Alkilen-azide bağlanmasını artırmak için şelatörün bakıra oranı çeşitli olabilir. Biz bir şelatör ile parlak boyama gözlemlemek: bakır oranı 2:1, ayrıca picolyl azide kullanarak bağlamında. Picolyl moiety gerekli bakır konsantrasyonu azalır ve reaksiyon un verimliliğini artırır şelat aktivitesi ekler15. Chelator: bakır oranları, genellikle 5:1 kadar, araştırmacı ihtiyaçlarını optimize etmek için artırılabilir. Daha iyi bir şelatör, 2-[4-({bis[(1-tert-butyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)metil]amino}metil)-1H-1,2,3-triazol-1-yl]asetik asit (BTTAA), artık ticari olarak mevcuttur16. Bu protokolü ilk elde ettiğimizde bu şelatör ticari olarak mevcut değildi. Son olarak, bu protokolde bir fiksatif olarak paraformaldehit kullanmak rağmen, hücreler metanol ile sabit olabilir, hangi da permeabilizasyon adımı obviates. Metanol ile sabitleme bir EdU dahil ile belirli hücresel proteinlerin immünfloresan boyama birleştirmek istiyorsa yararlı olabilir.
Bu yöntemin bir dezavantajı EdU potansiyel sitotoksisite, özellikle sürekli saat bir darbe etiketi aksine gün boyunca EdU ile etiketleme. Kullanılan hücrelere bağlı olarak, EdU hücre döngüsü tutuklama ve hatta apoptosis neden olduğu bulunmuştur17. Bu toksisitenin yapay nükleozitlerin eklenmesinden kaynaklanan kusurlu DNA replikasyonundan kaynaklandığı düşünülmektedir18. Çalışmalar bu toksisitehücre hattı bağımlı ve konsantrasyon bağımlı olduğunu göstermiştir17. Çalışmalarımızda toksisite ile ilgili herhangi bir sorun gözlemlemedik.
Özetle, EdU ve click kimyası ile çoğalma ölçme BrdU veya 3H-timidin birleşme gibi diğer yaygın olarak kullanılan yöntemlere göre çeşitli avantajları vardır. Bunlar arasında radyoaktiviteden kaçınma, düşük arka planlı yüksek özgüllük ve sert denatürasyon adımlarını önlemeye gerek yoktur. Kurulduktan sonra, tıklama kimyası son derece çok yönlüdür ve RNA, protein, yağ asitleri ve karbonhidratların metabolik etiketlemesi için kolayca değiştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Katie Carroll'a teknik yardım için teşekkür ederiz. Ayrıca Dr David Cool ve Proteomics Analiz Laboratuvarı öğretim ve Cytation görüntüleme plaka okuyucu sağlanması için teşekkür ederiz. Bu çalışma Wright Devlet Vakfı hibe (L.E.W.) tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Carbosynth | NE08701 | |
| biotin picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1167-5 | |
| CuSO4 | Fisher Scientific | C1297-100G | |
| Cy3 picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1178-1 | |
| Cytation Plate Reader | Biotek | ||
| EVOS Microscope | Thermo Fisher Scientific | ||
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| Na ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-250G | |
| NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes | Invitrogen | R37606 | DAPI nuclear stain |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | blocking buffer |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15710 | |
| PBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Sodium Chloride | Sigma Life Science | S3014-5kg | |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate | Life Technologies | S911 | |
| Super Signal ELISA Femto | Thermo Scientific | PI137075 | ELISA substrate |
| Synergy Plate Reader | Biotek | ||
| THPTA | Click Chemistry Tools | 1010-100 | |
| Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl) | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Triton X 100 | Bio-Rad | 1610407 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
References
- Fuster, J. J., et al. Control of cell proliferation in atherosclerosis: Insights from animal models and human studies. Cardiovascular Research. 86 (2), 254-264 (2010).
- Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).
- Cizek, S. M., et al. Risk factors for atherosclerosis and the development of preatherosclerotic intimal hyperplasia. Cardiovascular pathology the Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 16 (6), 344-350 (2007).
- Romar, G. A., Kupper, T. S., Divito, S. J. Research techniques made simple: Techniques to assess cell proliferation. Journal of Investigative Dermatology. 136, e1-e7 (2016).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. 44, 4-7 (2010).
- Sletten, E., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal Chemistry: Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality. Angewandte Chemie International Edition. 48 (38), 6974-6998 (2009).
- Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (59), 1-7 (2012).
- Clarke, S. T., Calderon, V., Bradford, J. A. Click Chemistry for Analysis of Cell Proliferation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 82 (1), (2017).
- Jiang, H., et al. Monitoring dynamic glycosylation in vivo using supersensitive click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 698-706 (2014).
- Izquierdo, E., Delgado, A.
- Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).
- Hong, V., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Finn, M. G. Labeling Live Cells by Copper-Catalyzed Alkyne-Azide Click Chemistry. Bioconjugate Chemistry. 21 (10), 1912-1916 (2011).
- Arumugam, P., Carroll, K. L., Berceli, S. A., Barnhill, S., Wrenshall, L. E. Expression of a Functional IL-2 Receptor in Vascular Smooth Muscle Cells. The Journal of Immunology. 202 (3), 694-703 (2019).
- Stoddart, M. J. Mammalian cell viability: methods and protocols. , Humana Press. New York, NY. (2011).
- Uttamapinant, C., Tangpeerachaikul, A., Grecian, S., Clarke, S., Singh, U. Fast, Cell-compatible Click Chemistry with Copper-chelating Azides for Biomolecular Labeling. Angewandte Chemie International Edition. 154 (11), 2262-2265 (2012).
- Bescancy-Webler, C., et al. Raising the Efficacy of Bioorthogonal Click Reactions for Bioconjugation: A Comparative Study. Angewandte. Chemie International Edition. 50 (35), 8051-8056 (2011).
- Diermeier-Daucher, S., et al. Cell type specific applicability of 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EDU) for dynamic proliferation assessment in flow cytometry. Cytometry Part A. 75 (6), 535-546 (2009).
- Cieślar-Pobuda, A., Los, M. J. Prospects and limitations of “Click-Chemistry”-based DNA labeling technique employing 5-ethynyl-2′deoxyuridine (EdU). Cytometry Part A. 83 (11), 977-978 (2013).
