Summary
La proliferación es una parte crítica de la función celular, y una lectura común utilizada para evaluar la toxicidad potencial de nuevos fármacos. Por lo tanto, la medición de la proliferación es un ensayo frecuentemente utilizado en la biología celular. Aquí presentamos un método simple y versátil de medición de la proliferación que se puede utilizar en células adherentes y no adherentes.
Abstract
La capacidad de una célula para proliferar es integral a la función normal de la mayoría de las células, y la desregulación de la proliferación está en el corazón de muchos procesos de la enfermedad. Por estas razones, la medición de la proliferación es una herramienta común utilizada para evaluar la función celular. La proliferación celular se puede medir simplemente contando; sin embargo, se trata de un medio indirecto para medir la proliferación. Un medio común de detectar directamente las células que se preparan para dividir es mediante la incorporación de análogos de nucleósidos etiquetados. Estos incluyen el nucleósido radioactivo analógico 3H-timidina más análogos nucleósidos no radiactivos tales como 5-bromo-2' deoxiuridina (BrdU) y 5-etil-2o-desoxiuridina (EdU). La incorporación de EdU se detecta por química de clic, que tiene varias ventajas en comparación con BrdU. En este informe, proporcionamos un protocolo para medir la proliferación mediante la incorporación de EdU. Este protocolo incluye opciones para varias lecturas, junto con las ventajas y desventajas de cada una. También discutimos los lugares donde el protocolo se puede optimizar o modificar para satisfacer las necesidades específicas del experimento planeado. Por último, tocamos las formas en que este protocolo básico se puede modificar para medir otros metabolitos celulares.
Introduction
La proliferación es una parte crítica de la función celular1,2. El control de la proliferación influye en procesos normales como el desarrollo y en procesos patológicos como el cáncer y las enfermedades cardiovasculares. El crecimiento hiperplástico de las células musculares lisas vasculares, por ejemplo, se cree que es un precursor de la aterosclerosis3. Los cambios en la proliferación celular también se utilizan para evaluar la toxicidad potencial de nuevos fármacos. Dado su impacto generalizado, la medición de la proliferación es un pilar de muchos laboratorios basados en la biología celular.
La proliferación celular se puede medir simplemente contando las células si la población celular de interés se divide con bastante rapidez. Para las células de crecimiento más lento, el recuento de células puede ser menos sensible. La proliferación se mide a menudo mediante la incorporación de análogos de nucleósidos etiquetados. Aunque el estándar de oro es la incorporación de 3H-timidina, muchos laboratorios están alejándose de este método dada la disponibilidad de alternativas más nuevas y no radiactivas. Estos incluyen colorantes fluorescentes citoplasmáticos, detección de proteínas asociadas al ciclo celular, y la incorporación de análogos de nucleósidos no radiactivos tales como 5-bromo-2' desoxiuridina (BrdU) y 5-etil-2o-desoxiruridina (EdU)4.
Los tintes citoplásmicos, como el éster de succinimidil de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE), detectan la proliferación porque la intensidad del tinte se reduce a la mitad cada vez que la célula divide5. Esta técnica se utiliza comúnmente en la citometría de flujo para células no adherentes. No se ha utilizado mucho para células adherentes, pero con la nueva generación de lectores de placas de imágenes esto puede cambiar. La detección de proteínas asociadas al ciclo celular a través de técnicas basadas en anticuerpos (citometría de flujo, inmunohistoquímica, etc.) se utiliza a menudo para tejidos o células no adherentes. Estas células/tejidos deben ser fijados y permeabilizados antes de la tinción. Los análogos de nucleósidoBrdU y EdU son similares en enfoque a 3H-timidina, pero sin el inconveniente de la radiactividad. La incorporación de BrdU se detecta mediante anticuerpos anti-BrdU, y por lo tanto las células deben ser fijas y permeabilizadas antes de la tinción. Además, las células deben tratarse con DNase para exponer el epítopo de BrdU.
La incorporación de EdU se detecta mediante la química de clics, en la que los grupos de alquino y azida "hacen clic" juntos en presencia de cobre catalítico. Cualquiera de los grupos puede servir como molécula biosintéticamente incorporada o molécula de detección4. Los análogos de nucleósidos disponibles comercialmente tienen el grupo alquino unido. Para los ensayos de proliferación, por lo tanto, el análogo de nucleósido salyne funcionalizado es detectado por un azida conjugada con un tinte fluorescente u otro marcador. La incorporación de EdU tiene varias ventajas sobre BrdU. En primer lugar, debido a que los grupos de alquino y azida no se encuentran en las células de mamíferos, esta interacción es muy específica con un fondo bajo6. Debido a que ambos grupos son pequeños, las células no necesitan someterse a la desnaturalización del ADN para exponer el análogo de nucleósido como se requiere para BrdU7. Por último, la química del clic es muy versátil, y se puede utilizar para el etiquetado metabólico de ADN, ARN, proteínas, ácidos grasos, y carbohidratos8,9,10,11. Si el objetivo metabólicamente etiquetado de interés está en la superficie celular, las células vivas se pueden etiquetar12. Además, las células se pueden procesar para la tinción inmunofluorescente con anticuerpos.
El siguiente protocolo describe el uso de la incorporación de EdU y la química de clic para medir la proliferación en células musculares lisas vasculares humanas(Figura 1). Mostramos tres formas diferentes de medir la incorporación de EdU, resultados representativos de cada uno, y sus ventajas y desventajas. La medición de la proliferación a través de la química de clics es particularmente útil para las células de crecimiento adherente y más lentas. Además, la morfología de la célula está bien mantenida y también se puede realizar la tinción basada en anticuerpos.
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Protocol
1. Detección de EdU usando etiqueta fluorescente
- Soluciones de stock
- Prepare una solución de stock EdU de 5 mM añadiendo 12,5 mg de EdU a 10 ml de DobleE2O destilado.
- Preparar los componentes de la solución de etiquetado: 200 mM tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) (100 mg en 1,15 mL H2O), 100 mM CuSO4 (15,95 mg en 1 mL H2O; hacer fresco), 10 mM Cy3 picolyl-azida (1 mg en 95,3 mL H 2 O 2 O 2 O2O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 , se almacena en alícuotas de 5 l a -20 oC) y ascorbato sódico de 1 M (200 mg en 1 ml de H2O; en fresco).
- Preparar la solución de stock de resazurina a una concentración de 0,15 mg/ml. Filtrar esterilizar y almacenar 1 mL alícuotas a 4oC.
NOTA: Picolyl azida está disponible conjugada con varios fluores diferentes, biotina y peroxidasa de rábano picante (HRP).
- Etiquetar las células musculares lisas vasculares (VSMC) con EdU.
NOTA: Los VSCM humanos fueron aislados de las arterias ilíacas a través del crecimiento de trozos de tejido explantados. Cuando se cultivan en medios libres de suero con insulina, transferrina, selenio estas células expresan marcadores VSMC de altilina, cadena pesada de miosina muscular lisa (SM-MHC) y SMC áactina13.- Placa vascular células musculares lisas a 2 x 104/ml en el medio de eagle modificado de Dulbecco (DMEM) en una placa de 96 pozos.
NOTA: Las células se cultivan a 37 oC en medios de células musculares lisas con un 2% de suero bovino fetal. - (Opcional) Espere varias horas para pasar la noche para la adherencia. Añadir 20 l de stock de resazurina a cada poca. Incubar a 37oC durante 3 h. Leer la señal de fluorescencia en un lector de placas (560ex, 594em). Sustituya los medios por DMEM frescos.
NOTA: Este paso es opcional. Resazurin se utiliza para normalizar los números de celda y tener en cuenta la variabilidad bien a pozo en el chapado14. - Añadir solución salina tamponada de fosfato (PBS) o factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) 30 ng/mL a 3 x 6 pozos por tratamiento al comienzo del período de cultivo e incubar durante 72 h.
- Diluir 5 mM EdU stock a 1 mM. Añadir 2 l a cada pocal (concentración final 20 m) durante las últimas 24 h del período de cultivo de 72 h. No agregue EdU a un conjunto de réplicas. Estos pozos se utilizarán para determinar la fluorescencia/luminiscencia de fondo.
NOTA: La duración del cultivo y etiquetado con EdU está optimizada para células musculares lisas, pero puede necesitar ser modificada por tipo de célula.
- Placa vascular células musculares lisas a 2 x 104/ml en el medio de eagle modificado de Dulbecco (DMEM) en una placa de 96 pozos.
- Fijar celdas en paraformaldehído (PFA).
- Retire los medios y agregue 150 sl de 4% PFA (en PBS) por pozo durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Retire el PFA y agregue 150 l de 1% de éter de polietilenglicol tert-octilfenilo (TX-100) (en agua) por pocil durante 30 minutos a temperatura ambiente.
- Retire TX-100 lavándolo tres veces con PBS.
ADVERTENCIA: La PFA es tóxica, maneja con cuidado.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Las celdas fijas se pueden almacenar en PBS a 4 oC.
- Detectar EdU incorporado.
- Hacer solución de etiquetado (10 ml por 96 pocillos, utilizando 60 pocillos interiores) justo antes de su uso mediante la adición de reactivos de soluciones de stock en el siguiente orden: THPTA 20 l, CuSO4 20 l, ciádula picolida de 5 ol, ascorbato de Na 100 l a PBS para un volumen total de 10 ml.
- Retire el PBS de los pozos y agregue 150 l de solución de etiquetado a cada poca. Incubar 30 min a 37oC. Para detectar todos los núcleos, agregue 4o,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) a cada pocal. Leer en un lector de placas de fluorescencia (Cy3 550ex, 570em; DAPI 350ex, 470em) o imagen en un microscopio.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Las celdas fijas y teñidas se pueden almacenar en PBS a 4 oC e imágenes más adelante.
2. Detección de EdU utilizando luminiscencia
- Complete las secciones 1.1–1.3.
- Prepare la solución salina con Tris-buffered con 0.1% polisorbato 20 (TBST).
- Pozos de bloques.
- Añadir 150 l de tampón de bloqueo(Tabla de materiales)a cada pocto e incubar durante 90 minutos a temperatura ambiente.
- Retire el tampón de bloqueo y lávelo tres veces con 200 ml de PBS.
- Detectar EdU incorporado.
- Hacer la solución de etiquetado como se indica en el paso 1.4.1, sustituyendo la biotina picolyl azida por Ci3 picolyl azida.
- Lavar los pozos cinco veces con 200 ml de TBST, con agitación, 3 minutos por lavado.
- Peroxidasis endógenas de quench con 150 ml de 0,3% H2O2 para 20 min a temperatura ambiente.
- Retire H2O2 y lave cinco veces con 200 ml de TBST, agitando 3 minutos por lavado.
- Diluir la peroxidasa de estreptavidina-caballo de rábano (SA-HRP; 1:200) en TBST y añadir 50 l a cada pocto. Incubar 1 h a temperatura ambiente.
- Lavar cinco veces con 200 ml de TBST, con agitación, 3 min por lavado.
- Añadir 50 ml de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas quimioluminiscentes (ELISA) sustrato(Tabla de materiales)a cada pocil.
- Leer inmediatamente en el lector de placas capaz de detectar luminiscencia.
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Representative Results
En la Figura 2,demostramos los resultados de tres experimentos diferentes que miden la proliferación de VSMC en respuesta al PDGF. Después de cultivar las células en medios formulados para smCs, llevamos a cabo el experimento en DMEM libre de suero, para eliminar cualquier efecto potencial de los factores séricos o de crecimiento en la proliferación. En la Figura 2A comparamos los resultados, del mismo experimento, utilizando una lectura fluorescente vs luminiscente. Para leer estas placas, utilizamos un lector de microplacas multimodo que puede leer la absorbancia, la fluorescencia y la luminiscencia (ver Tabla de Materiales).
Usando el lector de placas en modo de escaneo bien, las lecturas fluorescentes se promedian en todo el pozo. Este modo alivia las posibles imprecisiones debido a las diferencias entre el centro y los bordes del pozo. Sin embargo, si muy pocos núcleos son positivos, los resultados de lectura de esta manera probablemente subestima el "número" de células positivas cuando sólo unos pocos son positivos. Número, con esta lectura, significa fluorescencia en relación con la de otro pozo, y no los números celulares exactos. Además, si hay una fibra o un grupo de células muertas que recoge la fluorescencia, esto se incluirá en la exploración de área. Sin embargo, la ventaja de usar el lector de placas es el tiempo. Mientras que la lectura en modo de escaneo toma de 15 a 20 segundos por pozo, se automatiza en lugar del método personal que consume mucho tiempo para tomar fotografías y analizarlas utilizando software de imágenes.
Para corregir las posibles subestimaciones del método anterior, convertimos la exploración fluorescente en una lectura homogénea y líquida en la que se detectan células que toman EdU con una mitad de azide biotina, que a su vez se detecta con peroxidasa estreptavidina-barábicos (véase la Figura 1). La cantidad de peroxidasa de rábano picante se cuantifica entonces utilizando un sustrato estándar formateado para ELISA. La ventaja de esta técnica es una lectura más homogénea, y la Figura 2A,B muestra ejemplos de experimentos en los que se empleó este método. Además, la placa se puede leer en segundos. Sin embargo, hay desventajas en este método. En primer lugar, el fondo con este método es mayor que con la fluorescencia. Para disminuir el fondo, incorporamos un paso de bloqueo y varios lavados. Como reflejo de este trasfondo, los controles negativos (células no tratadas) tienden a ser más altos, y el aumento del pliegue en la proliferación es menor. En segundo lugar, al igual que con la lectura de fluorescencia, las fibras o células muertas que recogen los reactivos de detección se sumarán a la luminiscencia total.
En un intento de disminuir la variabilidad en los experimentos anteriores, normalizamos nuestros resultados a los recuentos iniciales de células. Para los ensayos de proliferación, la normalización debe hacerse en células vivas al principio del ensayo antes de que las células se dividan. Además, el ensayo no puede afectar a la función celular o la incorporación de EdU. Dadas estas limitaciones, elegimos utilizar el metabolismo como reflejo del número celular a través de resazurina14. Los resultados con y sin normalización se muestran en la Figura 2B. Sin embargo, en un conjunto separado de experimentos encontramos que este método no es lo suficientemente sensible como para detectar pequeñas diferencias en los números de celda. Además, cualquier error en esta lectura introduce más error en todo el experimento. Por estas razones, hemos optado por tener un cuidado extraordinario a las células de placas de la manera más uniforme posible, y no realizar un paso de normalización.
Para estar seguros de que estábamos obteniendo los resultados más precisos posibles, volvimos a la tinción fluorescente (sección 1) y al conteo de células usando un microscopio de fluorescencia invertida. La ventaja de este método es que se puede ver físicamente y contar las células positivas, asegurando la mayor precisión(Figura 3). Cualquier residuo fluorescente puede ser excluido del conteo. Los recuentos de fondo sin EdU son 0 ya que no hay fluorescencia visible y, por lo tanto, no hay fondo que restar. La principal desventaja de este método es el tiempo. Para contar núcleos en células chapadas en una placa de 96 pozos, tomamos 3 imágenes por pozo de células positivas edU y células totales (DAPI), que requieren 6 imágenes por pozo. Tomamos fotos verticalmente desde la sección media de la parte superior hasta la parte inferior del pozo, teniendo cuidado de no superponerse y contar las células dos veces. Contar el total de células nos da una segunda pieza de datos que confirma nuestros resultados de proliferación. Sin embargo, a la luz del tiempo de duplicación relativamente lento de VSMC (36-48 h), el aumento del pliegue en las células totales estimuladas con controles PDGF vs es mucho menor que el aumento del pliegue de las células positivas de La EdU, por lo que medimos la incorporación de EdU(Figura 2C).
La forma más eficiente y precisa de contar las células positivas y totales de EdU es mediante el uso de un lector de placas de imagen. Este método combina la precisión del recuento con la velocidad de automatización. El principal inconveniente es que este equipo no está disponible en todas las instituciones. Al comparar los recuentos automatizados frente a los manuales, el recuento manual positivo de EdU era esencialmente idéntico al recuento automatizado(Figura 2C,izquierda), al igual que los recuentos totales no estimulados(Figura 2C,derecha). Sin embargo, el recuento manual fue menor que el recuento automatizado en el total de células estimuladas por PDGF. Esta diferencia probablemente se relaciona con los patrones de crecimiento celular. Debido a que las células tienden a crecer en el centro del pozo, con números más pequeños los recuentos automatizados y manuales eran casi idénticos. Sin embargo, con números más altos probablemente había más celdas en los bordes y los recuentos manuales, que no capturaban las células en la periferia del pozo, eran menos precisos.
Figura 1: Descripción general de la detección de EdU por fluorescencia o luminiscencia.
VSMC u otras células adherentes se tratan bajo condiciones de interés. EdU se añade durante las últimas 24 h del período de cultivo e incorpora al ADN de las células divisorias. La EdU incorporada se detecta mediante fluorescencia (sección 1 del protocolo) o luminiscencia (sección 2 del protocolo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Medición de la proliferación con diferentes lecturas mediante la incorporación de EdU y la química de clic.
(A) los VSMC se cultivaron en presencia o ausencia de PDGF. A EdU se le añadieron las últimas 24 horas de cultivo, y la incorporación se detectó por fluorescencia (sección 1 del protocolo) o por luminiscencia (sección 2 del protocolo). (B) los VSMC fueron tratados como se describe en el panel A, y la incorporación de EdU se midió por luminiscencia. Los resultados se normalizaron a los recuentos iniciales de células mediante el ensayo de viabilidad de resazurina. (C) los VSMC fueron tratados como en el panel A, y la incorporación de EdU se midió por fluorescencia. Las células positivas de EdU se contaban automáticamente, utilizando un lector de placas de imágenes, o manualmente mediante imágenes y luego contando usando software de imágenes. Los resultados que se muestran son la desviación media de la desviación estándar de 3-6 repeticiones por tratamiento.
Figura 3: Visualización de células positivas EdU después del protocolo de fluorescencia de clic.
VSMC se trató como se describe en la Figura 2,y se detectó EdU incorporado mediante fluorescencia (sección 1 del protocolo). Cada imagen es un solo pozo de una placa de 96 pozos. Los núcleos totales se muestran en azul (DAPI) y los núcleos positivos EdU son verdes. Barra de escala de 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La incorporación de EdU es una forma sencilla y directa de medir la proliferación celular; es particularmente útil para las células adherentes13. Nuestro protocolo utiliza células musculares lisas, pero es aplicable a cualquier célula adherente (epitelial, endotelial, etc.). Aunque el protocolo no es complicado, el único paso crítico es hacer que la solución de etiquetado sea: los ingredientes deben agregarse en el orden indicado. Además, al igual que las manchas occidentales quimioluminiscentes, si se utiliza la lectura de luminiscencia, la placa debe leerse inmediatamente.
Varias partes del protocolo se pueden modificar u optimizar según sea necesario. Una parte es la duración de la incubación con EdU. Debido a que nuestro objetivo era detectar tantas células que proliferan como fuera posible, añadimos EdU para un total de 24 horas antes de la fijación y la tinción. Sin embargo, este tiempo probablemente mide las células en las fases S y G2/M. Para etiquetar sólo las células en la fase S, Cecchini et al. aconsejan que incluso las células que dividen lentamente se incuban con EdU durante no más de 6 horas7. Otra parte del protocolo que se puede optimizar es la cantidad de quelante. Las reacciones de Alkyne-azida requieren un catalizador de cobre (CuSO4). THPTA es un quelante de cobre que mantiene el cobre en el estado de oxidación necesario. La relación entre quelador y cobre puede variar, para aumentar la unión alquino-azida. Observamos la tinción brillante con una relación quelante:cobre de 2:1, en el contexto de usar también picolyl azide. La mitad del picol añade actividad quelante que disminuye la concentración de cobre necesaria y aumenta la eficiencia de la reacción15. Chelator:las relaciones de cobre se pueden aumentar, por lo general hasta 5:1, para optimizar las necesidades de los investigadores. Un mejor quelante, 2-[4-(bis[(1-tert-butyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amino-methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl]acetic acid (BTTAA), ahora está disponible comercialmente16. Este quelante no estaba disponible comercialmente cuando derivamos este protocolo por primera vez. Por último, aunque usamos paraformaldehído como fijador en este protocolo, las células se pueden fijar con metanol, que también obvia el paso de permeabilización. La fijación con metanol puede ser útil si se quiere combinar la tinción inmunofluorescente de proteínas celulares específicas con la incorporación de EdU.
Un inconveniente de este método es la citotoxicidad potencial de edU, particularmente cuando se etiqueta continuamente con EdU durante días en lugar de una etiqueta de pulso de horas. Dependiendo de las células utilizadas, EdU se ha encontrado para causar detención del ciclo celular o incluso apoptosis17. Se cree que esta toxicidad se debe a la replicación defectuosa del ADN de la adición de nucleósidos artificiales18. Los estudios han demostrado que esta toxicidad depende de la línea celular y depende de la concentración17. No observamos ningún problema con la toxicidad en nuestros estudios.
En resumen, la medición de la proliferación a través de la EdU y la química de clics tiene varias ventajas sobre otros métodos de uso común como la incorporación de BrdU o 3H-timidina. Estos incluyen evitar la radiactividad, alta especificidad con fondo bajo, y no hay necesidad de pasos de desnaturalización severas. Una vez establecida, la química del clic es altamente versátil, y se puede modificar fácilmente para el etiquetado metabólico de ARN, proteínas, ácidos grasos y carbohidratos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Katie Carroll por la asistencia técnica. También damos las gracias al Dr. David Cool y al Laboratorio de Análisis de Proteómica por la instrucción y el suministro del lector de placas de imágenes Cytation. Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación Estatal Wright (a L.E.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Carbosynth | NE08701 | |
| biotin picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1167-5 | |
| CuSO4 | Fisher Scientific | C1297-100G | |
| Cy3 picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1178-1 | |
| Cytation Plate Reader | Biotek | ||
| EVOS Microscope | Thermo Fisher Scientific | ||
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| Na ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-250G | |
| NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes | Invitrogen | R37606 | DAPI nuclear stain |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | blocking buffer |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15710 | |
| PBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Sodium Chloride | Sigma Life Science | S3014-5kg | |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate | Life Technologies | S911 | |
| Super Signal ELISA Femto | Thermo Scientific | PI137075 | ELISA substrate |
| Synergy Plate Reader | Biotek | ||
| THPTA | Click Chemistry Tools | 1010-100 | |
| Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl) | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Triton X 100 | Bio-Rad | 1610407 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
References
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