Bruke databasert bildeanalyse for å forbedre kvantifiseringen av lungemetastase i 4T1 brystkreftmodell

Summary

Vi beskriver en mer konsekvent og rask metode for å kvantifisere lungemetastase i 4T1 brystkreftmodellen ved hjelp av Fiji-ImageJ.

Abstract

Brystkreft er en ødeleggende malignitet, som står for 40.000 kvinnelige dødsfall og 30% av nye kvinnelige kreftdiagnoser i USA i 2019 alene. Den ledende årsaken til brystkreftrelaterte dødsfall er den metastatiske byrden. Derfor må prekliniske modeller for brystkreft analysere metastatisk byrde for å være klinisk relevant. 4T1 brystkreft modellen gir en spontant metastaserende, kvantifiserbar musemodell for stadium IV menneskelig brystkreft. Imidlertid kvantifiserer de fleste 4T1-protokoller den metastatiske byrden ved å telle fargede kolonier manuelt på vevskulturplater. Selv om dette er tilstrekkelig for vev med lavere metastatisk byrde, forårsaker menneskelig feil i manuell telling inkonsekvente og variable resultater når platene er samløpet og vanskelig å telle. Denne metoden tilbyr en datamaskinbasert løsning på menneskelig tellingsfeil. Her evaluerer vi protokollen ved hjelp av lungene, et svært metastatisk vev i 4T1-modellen. Bilder av metylen blåfargede plater er anskaffet og lastet opp for analyse i Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ bestemmer deretter prosentandelen av det valgte området av bildet som er blått, som representerer prosentandelen av platen med metastatisk byrde. Denne databaserte tilnærmingen gir mer konsistente og raske resultater enn manuell telling eller histopatologisk evaluering for svært metastatisk vev. Konsistensen av Fiji-ImageJ resultater avhenger av kvaliteten på bildet. Små variasjoner i resultatene mellom bildene kan oppstå, og dermed anbefales det at flere bilder tas og resultatene er i gjennomsnitt. Til tross for sine minimale begrensninger, er denne metoden en forbedring for å kvantifisere metastatisk byrde i lungene ved å tilby konsistente og raske resultater.

Introduction

En av åtte kvinner vil bli diagnostisert med brystkreft i hennes levetid, og likevel til tross for flere behandlingstilbud brystkreft er den nest ledende årsaken til kreftrelaterte dødsfall hos amerikanske^{kvinner 1}. Disse kvinnene dør ikke av den primære svulsten i brystet. I stedet er den metastatiske byrden ansvarlig for dødeligheten av denne sykdommen, da den vanligvis sprer seg til lunge, bein, hjerne, lever og lymfeknuter². På grunn av dette må brystkreftmodeller evaluere metastase for å bidra til å dempe dødeligheten av denne sykdommen. 4T1 murine brystkreft modellen er en ypperlig protokoll for å oppnå dette. Metoden beskrevet her gir en forbedring av 4T1-modellen ved hjelp av Fiji-ImageJ for å kvantifisere lungemetastase, noe som gir konsistente og raske resultater.

4T1-modellen er veletablert, med de fleste laboratorier ved hjelp av protokoller som de som er beskrevet av Pulaski og Ostrand-Rosenberg i 2001³. 4T1 cellelinjen er 6-Thioguanine (6TG) resistent og representativ for stadium IV, trippel negativ brystkreft^3,4,5. Det er klinisk relevant da det er en ortopisk modell og spontant metastaserer til de samme organene som i human brystkreft^3,4. 4T1-cellene metastaserer spontant med en forutsigbar hastighet basert på mengden celler injisert^3,4. Viktigere, genetiske forskjeller mellom mus som brukes her forårsaket forventet inter-individuell variasjon i metastatisk byrde. For å evaluere metastase høstes vev for å samle og kvantifisere kreftceller i fjerne steder ved hjelp av 6TG-valg og metylenblå farging. Resultatet er en samling av vevskulturplater med blå prikker som representerer metastatiske kolonier. Pulaski- og Ostrand-Rosenberg-protokollen kvantifiserer imidlertid metastatiske kolonier ved å telle dem manuelt, og derfor har dette vært standardmet for å evaluere metastase i denne modellen. Mens dette er lett for vev med lav metastatisk byrde, vev som lungene er ofte lastet med metastaser. Siden lungeplater kan være svært samløpet, nøyaktig og nøyaktig kvantifisere metastatiske kolonier ved manuell telling er vanskelig og utsatt for menneskelig feil. For bedre å kvantifisere metastatisk byrde beskriver vi bruk av Fiji-ImageJ for en databasert løsning på menneskelig tellefeil. Histopatologisk analyse med hematoksylin og eosin (H&E) farging er et annet middel for å kvantifisere lungemetastaser, og interessant har også blitt forbedret med Fiji-ImageJ programvare^6,7. Men fordi histopatologisk analyse observerer en enkelt bit av lungene, kan det være unøyaktig og urepresentativt. Dette skyldes at 4T1-modellen forårsaker flere metastatiske lesjoner i hele orgelet som ikke er jevnt fordelt. Mens generelle trender mellom histopatologisk analyse og manuell telling kan være^{lik 8,}kan individuelle verdier variere, og derfor bør histopatologisk analyse ikke brukes som eneste kvantifiseringsmidler. Vi viser fordelen i forhold til histopatologisk analyse og uoverensstemmelser i manuell telling mellom ulike tellere, samtidig som vi viser konsistensen av å bruke Fiji-ImageJ. I tillegg viser vi at denne metoden kan redusere inkubasjonstiden fra 10-14 dager til 5 dager, noe som betyr at forskere kan analysere data fra studien mye raskere enn når de er avhengige av manuell telling.

Denne metoden er en samling av enkle justeringer i Pulaski og Ostrand-Rosenberg protokoll³. Fordi 4T1-modellen er mye brukt, og fordi lungemetastase er en kritisk parameter for å måle i prekliniske modeller, tror vi denne metoden kan brukes mye og er svært verdifull for brystkreftforskere. De eneste ekstra forsyningene som trengs er et kamera og tilgang til en datamaskin med Fiji-ImageJ, en gratis programvare som brukes ofte i bildeanalyse⁹. Denne metoden fokuserer spesielt på lungemetastase, men den kan brukes til andre vev med betydelig metastatisk byrde.

Protocol

Alle metoder som er beskrevet her har blitt godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) av Virginia Tech og i samsvar med National Institutes of Health Guide for omsorg og bruk av laboratoriedyr. Å utføre denne protokollen krever tillatelse fra de aktuelle institusjonene og overholdelse av alle nødvendige retningslinjer. 1. Cellekultur Lag komplette kulturmedier (RPMI + 10% Fetal Bovine Serum +1% Pen Strep). Gjenopplive 4T1-celler i henhold til<sup class="xref"…

Representative Results

Denne metoden inneholder enkle justeringer fra Pulaski- og Ostrand-Rosenberg 4T1-protokollen3 og kan visualiseres i figur 1. Når 3 separate forskere manuelt telte metastatiske kolonier for 12 lungeplater (1:10 fortynning), var resultatene svært inkonsekvente mellom forskjellige tellere (figur 2A). Alle forskere ble rettet mot å “telle de metastatiske koloniene som vises som blå prikker”, men uoverensstemmelsene viser problemet med man…

Discussion

Som demonstrert, manuelt telle metastatiske kolonier på hver lungeplate kan være en unøyaktig og upresis metode for å kvantifisere lungemetastase, viser behovet for en bedre kvantifisering (Figur 2). Histopatologisk analyse skilte seg litt fra både manuell telling og Fiji-ImageJ analyse (Figur 2B og 4D), sannsynligvis fordi H & E lysbildene ikke er et representativt utvalg av hele orgelet. Protokollen høster en hel lunge, og er derfor mer …

Materials

Anesthesia chamber	See comments	See comments	Use approved materials in your institution's policies
Anesthetic agent	See comments	See comments	Use approved materials in your institution's policies
BALB/c Female Mice	The Jackson Laboratory	651
Blunt scissors	Roboz	RS-6700
Calculator	Any	Any
Camera	Any	Any	Minimum of 8 megapixels
Centrifuge	Any	Any	Needs to be capable of 125 x g and 300 x g
CO2 euthanasia setup	See comments	See comments	Use approved materials in your institution's policies
Cold room, refrigerator, cold storage	Any	Any
Computer with Fiji-ImageJ	Any	Any	Needs to be capable of running Fiji-ImageJ
Counting Chamber	Fisher Scientific	02-671-10
Curved scissors	Roboz	RS-5859
Distilled water	Any	Any
Elastase	MP Biomedicals	100617
Electronic scale	Any	Any
Fetal Bovine Serum (FBS)	R&D Systems	S11150
Forceps	Roboz	RS-8100
Ice	N/A	N/A
Incubator	See comments	See comments	Needs to be capable of 5% CO2 and 37 °C
Methanol	Fisher Scientific	A412SK-4
Methylene blue	Sigma-Aldrich	03978-250ML
Penicillin Streptomycin	ATCC	30-2300
Pins or needles	Any	Any	For pinning down mice during necropsy
Plastic calipers	VWR	25729-670
RMPI-1640 Medium	ATCC	30-2001
Rocker or rotating wheel	Any	Any
Sharp scissors	Roboz	RS-6702
Sterile disposable filter with PES membrane	ThermoFisher Scientific	568-0010
T-150 Flasks	Fisher Scientific	08-772-48
T-25 Flasks	Fisher Scientific	10-126-10
T-75 Flasks	Fisher Scientific	13-680-65
Tri-cornered plastic beaker	Fisher Scientific	14-955-111F	Used to weigh mice
Trypan blue	VWR	97063-702
Trypsin-EDTA	ATCC	30-2101
Type IV collagenase	Sigma-Aldrich	C5138
1 cm tissue culture plates	Nunclon	153066
1 mL syringe	BD	309659
1.7 mL microcentrifuge tubes	VWR	87003-294
10 cm tissue culture plates	Fisher Scientific	08-772-22
12 well plate	Corning	3512
15 mL centrifuge tube	Fisher Scientific	14-959-70C
1X Dulbecco's Phostphate Buffered Saline (DPBS)	Fisher Scientific	SH30028FS
1X Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS)	Thermo Scientific	SH3026802
27 g 1/2 in needles	Fisher Scientific	14-826-48
4T1 (ATCC® CRL­2539™)	ATCC	CRL-2539
50 mL centrifuge tube	Fisher Scientific	14-959-49A
6-Thioguanine	Sigma-Aldrich	A4882
70 μM cell strainer	Fisher Scientific	22-363-548
70% ethanol	Sigma Aldrich	E7023	Dilute to 70% with DI water