Vi beskriver en mer konsekvent og rask metode for å kvantifisere lungemetastase i 4T1 brystkreftmodellen ved hjelp av Fiji-ImageJ.
Brystkreft er en ødeleggende malignitet, som står for 40.000 kvinnelige dødsfall og 30% av nye kvinnelige kreftdiagnoser i USA i 2019 alene. Den ledende årsaken til brystkreftrelaterte dødsfall er den metastatiske byrden. Derfor må prekliniske modeller for brystkreft analysere metastatisk byrde for å være klinisk relevant. 4T1 brystkreft modellen gir en spontant metastaserende, kvantifiserbar musemodell for stadium IV menneskelig brystkreft. Imidlertid kvantifiserer de fleste 4T1-protokoller den metastatiske byrden ved å telle fargede kolonier manuelt på vevskulturplater. Selv om dette er tilstrekkelig for vev med lavere metastatisk byrde, forårsaker menneskelig feil i manuell telling inkonsekvente og variable resultater når platene er samløpet og vanskelig å telle. Denne metoden tilbyr en datamaskinbasert løsning på menneskelig tellingsfeil. Her evaluerer vi protokollen ved hjelp av lungene, et svært metastatisk vev i 4T1-modellen. Bilder av metylen blåfargede plater er anskaffet og lastet opp for analyse i Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ bestemmer deretter prosentandelen av det valgte området av bildet som er blått, som representerer prosentandelen av platen med metastatisk byrde. Denne databaserte tilnærmingen gir mer konsistente og raske resultater enn manuell telling eller histopatologisk evaluering for svært metastatisk vev. Konsistensen av Fiji-ImageJ resultater avhenger av kvaliteten på bildet. Små variasjoner i resultatene mellom bildene kan oppstå, og dermed anbefales det at flere bilder tas og resultatene er i gjennomsnitt. Til tross for sine minimale begrensninger, er denne metoden en forbedring for å kvantifisere metastatisk byrde i lungene ved å tilby konsistente og raske resultater.
En av åtte kvinner vil bli diagnostisert med brystkreft i hennes levetid, og likevel til tross for flere behandlingstilbud brystkreft er den nest ledende årsaken til kreftrelaterte dødsfall hos amerikanskekvinner 1. Disse kvinnene dør ikke av den primære svulsten i brystet. I stedet er den metastatiske byrden ansvarlig for dødeligheten av denne sykdommen, da den vanligvis sprer seg til lunge, bein, hjerne, lever og lymfeknuter2. På grunn av dette må brystkreftmodeller evaluere metastase for å bidra til å dempe dødeligheten av denne sykdommen. 4T1 murine brystkreft modellen er en ypperlig protokoll for å oppnå dette. Metoden beskrevet her gir en forbedring av 4T1-modellen ved hjelp av Fiji-ImageJ for å kvantifisere lungemetastase, noe som gir konsistente og raske resultater.
4T1-modellen er veletablert, med de fleste laboratorier ved hjelp av protokoller som de som er beskrevet av Pulaski og Ostrand-Rosenberg i 20013. 4T1 cellelinjen er 6-Thioguanine (6TG) resistent og representativ for stadium IV, trippel negativ brystkreft3,4,5. Det er klinisk relevant da det er en ortopisk modell og spontant metastaserer til de samme organene som i human brystkreft3,4. 4T1-cellene metastaserer spontant med en forutsigbar hastighet basert på mengden celler injisert3,4. Viktigere, genetiske forskjeller mellom mus som brukes her forårsaket forventet inter-individuell variasjon i metastatisk byrde. For å evaluere metastase høstes vev for å samle og kvantifisere kreftceller i fjerne steder ved hjelp av 6TG-valg og metylenblå farging. Resultatet er en samling av vevskulturplater med blå prikker som representerer metastatiske kolonier. Pulaski- og Ostrand-Rosenberg-protokollen kvantifiserer imidlertid metastatiske kolonier ved å telle dem manuelt, og derfor har dette vært standardmet for å evaluere metastase i denne modellen. Mens dette er lett for vev med lav metastatisk byrde, vev som lungene er ofte lastet med metastaser. Siden lungeplater kan være svært samløpet, nøyaktig og nøyaktig kvantifisere metastatiske kolonier ved manuell telling er vanskelig og utsatt for menneskelig feil. For bedre å kvantifisere metastatisk byrde beskriver vi bruk av Fiji-ImageJ for en databasert løsning på menneskelig tellefeil. Histopatologisk analyse med hematoksylin og eosin (H&E) farging er et annet middel for å kvantifisere lungemetastaser, og interessant har også blitt forbedret med Fiji-ImageJ programvare6,7. Men fordi histopatologisk analyse observerer en enkelt bit av lungene, kan det være unøyaktig og urepresentativt. Dette skyldes at 4T1-modellen forårsaker flere metastatiske lesjoner i hele orgelet som ikke er jevnt fordelt. Mens generelle trender mellom histopatologisk analyse og manuell telling kan værelik 8,kan individuelle verdier variere, og derfor bør histopatologisk analyse ikke brukes som eneste kvantifiseringsmidler. Vi viser fordelen i forhold til histopatologisk analyse og uoverensstemmelser i manuell telling mellom ulike tellere, samtidig som vi viser konsistensen av å bruke Fiji-ImageJ. I tillegg viser vi at denne metoden kan redusere inkubasjonstiden fra 10-14 dager til 5 dager, noe som betyr at forskere kan analysere data fra studien mye raskere enn når de er avhengige av manuell telling.
Denne metoden er en samling av enkle justeringer i Pulaski og Ostrand-Rosenberg protokoll3. Fordi 4T1-modellen er mye brukt, og fordi lungemetastase er en kritisk parameter for å måle i prekliniske modeller, tror vi denne metoden kan brukes mye og er svært verdifull for brystkreftforskere. De eneste ekstra forsyningene som trengs er et kamera og tilgang til en datamaskin med Fiji-ImageJ, en gratis programvare som brukes ofte i bildeanalyse9. Denne metoden fokuserer spesielt på lungemetastase, men den kan brukes til andre vev med betydelig metastatisk byrde.
Som demonstrert, manuelt telle metastatiske kolonier på hver lungeplate kan være en unøyaktig og upresis metode for å kvantifisere lungemetastase, viser behovet for en bedre kvantifisering (Figur 2). Histopatologisk analyse skilte seg litt fra både manuell telling og Fiji-ImageJ analyse (Figur 2B og 4D), sannsynligvis fordi H & E lysbildene ikke er et representativt utvalg av hele orgelet. Protokollen høster en hel lunge, og er derfor mer …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine (IA), Virginia Tech Institute for Critical Technology and Applied Science Center for Engineered Health (IA) og National Institutes of Health R21EB028429 (IA).
Anesthesia chamber | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
Anesthetic agent | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
BALB/c Female Mice | The Jackson Laboratory | 651 | |
Blunt scissors | Roboz | RS-6700 | |
Calculator | Any | Any | |
Camera | Any | Any | Minimum of 8 megapixels |
Centrifuge | Any | Any | Needs to be capable of 125 x g and 300 x g |
CO2 euthanasia setup | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
Cold room, refrigerator, cold storage | Any | Any | |
Computer with Fiji-ImageJ | Any | Any | Needs to be capable of running Fiji-ImageJ |
Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
Curved scissors | Roboz | RS-5859 | |
Distilled water | Any | Any | |
Elastase | MP Biomedicals | 100617 | |
Electronic scale | Any | Any | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11150 | |
Forceps | Roboz | RS-8100 | |
Ice | N/A | N/A | |
Incubator | See comments | See comments | Needs to be capable of 5% CO2 and 37 °C |
Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
Methylene blue | Sigma-Aldrich | 03978-250ML | |
Penicillin Streptomycin | ATCC | 30-2300 | |
Pins or needles | Any | Any | For pinning down mice during necropsy |
Plastic calipers | VWR | 25729-670 | |
RMPI-1640 Medium | ATCC | 30-2001 | |
Rocker or rotating wheel | Any | Any | |
Sharp scissors | Roboz | RS-6702 | |
Sterile disposable filter with PES membrane | ThermoFisher Scientific | 568-0010 | |
T-150 Flasks | Fisher Scientific | 08-772-48 | |
T-25 Flasks | Fisher Scientific | 10-126-10 | |
T-75 Flasks | Fisher Scientific | 13-680-65 | |
Tri-cornered plastic beaker | Fisher Scientific | 14-955-111F | Used to weigh mice |
Trypan blue | VWR | 97063-702 | |
Trypsin-EDTA | ATCC | 30-2101 | |
Type IV collagenase | Sigma-Aldrich | C5138 | |
1 cm tissue culture plates | Nunclon | 153066 | |
1 mL syringe | BD | 309659 | |
1.7 mL microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
10 cm tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
12 well plate | Corning | 3512 | |
15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
1X Dulbecco's Phostphate Buffered Saline (DPBS) | Fisher Scientific | SH30028FS | |
1X Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS) | Thermo Scientific | SH3026802 | |
27 g 1/2 in needles | Fisher Scientific | 14-826-48 | |
4T1 (ATCC® CRL2539™) | ATCC | CRL-2539 | |
50 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
6-Thioguanine | Sigma-Aldrich | A4882 | |
70 μM cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
70% ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | Dilute to 70% with DI water |