Summary
我们提出了一个协议，用于识别和量化主要类别的水溶性代谢物在酵母 糖体中。所述方法通用、坚固且灵敏。它允许结构异构体和立体形式的水溶性代谢物彼此分离。
Abstract
代谢学是一种用于识别和量化细胞、组织、器官、生物流体或生物体内许多低分子量中间体和代谢产物的方法。代谢学传统上侧重于水溶性代谢物。水溶性代谢体是综合细胞网络的最终产物，它集成了各种基因组、表观基因组、转录学、蛋白质组学和环境因素。因此，代谢分析直接评估了在各种生物体中过多的生物过程中对所有这些因素的行动结果。其中一种生物是初露头角的酵母 糖核酸，一种具有完全测序基因组的单细胞真核生物。由于 S.Cerevisiae 是适应综合分子分析，它被用作解剖真核细胞内许多生物过程背后的机制的模型。一种多功能的分析方法，用于对水溶性代谢体进行可靠、敏感和准确的定量评估，将为剖析这些机制提供基本方法。在这里，我们提出了一个协议，为代谢活性的优化条件淬火和水溶性代谢物提取从 S.Cerevisiae 细胞。该协议还描述了使用液相色谱加上串联质谱法（LC-MS/MS）对提取的水溶性代谢物进行定量分析。此处描述的非目标代谢学的 LC-MS/MS 方法用途广泛且坚固。它能够识别和量化370多种具有不同结构、物理和化学特性的水溶性代谢物，包括这些代谢物的不同结构异构体和立体体形式。这些代谢物包括各种能量载体分子、核苷酸、氨基酸、单糖、糖解中间体和三碳循环中间体。非靶向代谢的LC-MS/MS方法非常敏感，允许在低至0.05pmol/μL的浓度下识别和量化某些水溶性代谢物。该方法已成功用于评估在不同条件下培养的野生型和突变酵母细胞的水溶性代谢体。
Introduction
水溶性代谢物是低分子量中间体和新陈代谢产物，有助于基本的细胞过程。这些进化保存的过程包括将营养转化为可用能量、大分子的合成、细胞生长和信号、细胞周期控制、基因表达的调节、应激反应、新陈代谢的转化后调节、线粒体功能的维持、车辆细胞贩运、自噬、细胞老化以及调节细胞死亡1、2、3。
水溶性代谢物的许多基本作用是通过研究在萌芽酵母S.Cerevisiae1，3，4，7，9，14，15，16，17，18，19，20，21，22发现。这种单细胞真核生物是一个有用的模型有机体，通过解剖机制，水溶性代谢物有助于细胞过程，因为它的适应先进的生化，遗传和分子生物分析23，24，25，26。虽然非靶向代谢的LC-MS/MS方法已用于研究水溶性代谢物在萌芽酵母3、18、22、27中的作用，但这种分析需要改进其多功能性、稳健性、灵敏度，以及区分这些代谢物的不同结构异构体和立体体形式的能力。
近年来，在将非靶向代谢物的LC-MS/MS方法应用于体内水溶性代谢物的分析方面取得了重大进展。然而，使用这种方法的许多挑战仍然是2，28，29，30，31，32，33，34，35，36。这些挑战包括以下挑战。首先，许多水溶性代谢物的细胞内浓度低于目前使用的方法的敏感阈值。二是代谢活性淬火效率过低，细胞内代谢物淬火相关细胞泄漏程度过高，不适合现行方法：因此，目前使用的方法低估了水溶性代谢物的细胞内浓度。第三，现有方法不能区分特定代谢物的结构异构体（即具有相同化学公式但原子连接性的分子）或立体体（即具有相同化学公式和原子连接性的分子，但具有空间中不同的原子排列）：这防止了某些代谢物的正确注释，目前使用的方法。第四，现有的母离子（MS1）和二次离子（MS2）质量光谱在线数据库不完整：这会影响使用当前方法产生的原始 LC-MS/MS 数据对特定代谢物的正确识别和量化。第五，现有方法不能使用单一类型的代谢物提取来回收所有或大多数类型的水溶性代谢物。第六，现有方法不能使用单一类型的LC柱来分离所有或大多数类型的水溶性代谢物。
在这里，我们优化了在 S.cerevisiae 细胞内淬火的条件，在提取之前保持这些细胞内的大部分水溶性代谢物，并从酵母细胞中提取大多数类型的水溶性代谢物。我们开发了一种多功能、坚固和敏感的方法，用于基于LC-MS/MS的识别和量化从 S.Cerevisiae 细胞中提取的370多种水溶性代谢物。这种非靶向代谢方法能够评估各种能量载体分子、核苷酸、氨基酸、单糖、糖解中间体和三碳基循环中间体的细胞内浓度。开发的LC-MS/MS方法允许识别和量化具有不同结构、物理和化学特性的不同结构异构体和立体形式的水溶性代谢物。
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Protocol
1. 制造和消毒一种生长酵母的媒介
- 用巴托普酮 （YP） 介质制作 180 mL 的完整酵母提取物。完整的 YP 介质包含 1% （w/v） 酵母提取物和 2% （w/v） 巴托普酮。
- 将 180 mL 的 YP 介质均匀地分配到四个 250 mL 的埃伦迈尔烧瓶中。每个烧瓶都含有 45 mL 的 YP 介质。
- 在 15 psi/121 °C 下自动包装 45 分钟，用 YP 介质对烧瓶进行消毒。
2. 野生型酵母菌株
- 使用 BY4742（MAT+他 3 =1 leu2=0 lys2 =0 ura3+0） 应变。
3. 在含有2%葡萄糖的YP介质中生长酵母
- 在 15 psi/121 °C 下自动夹紧 45 分钟，对 20% （w/v） 葡萄糖库存溶液进行消毒。
- 将 5 mL 的自体 20% （w/v） 葡萄糖库存溶液添加到两个 Erlenmeyer 烧瓶中，并加入 45 mL 的消毒 YP 介质。YP 介质中的最终浓度葡萄糖为 2% （w/v）。
- 使用微生物循环将酵母细胞接种到两个埃伦迈尔烧瓶中，YP介质含有2%葡萄糖。
- 在200 rpm的旋转摇床中，在30°C下在夜间生长酵母细胞。
- 以酵母文化为例。确定每 mL 培养物的酵母细胞总数。使用血细胞计计算细胞。
4. 细胞转移到YP介质中，细胞生长在2%的葡萄糖中
- 将经过消毒的 20% （w/v） 葡萄糖库存溶液的 5 mL 加入到其余两个 Erlenmeyer 烧瓶中，并加入自动夹杂的 YP 介质。葡萄糖的最终浓度为2%（w/v）。
- 将YP介质中含有5.0×107 细胞的2%葡萄糖的隔夜酵母培养物卷转移到两个Erlenmeyer烧瓶中，YP介质含有2%葡萄糖。使用无菌移液器进行细胞转移。
- 在 200 rpm 的旋转摇床中，在 30 °C 下将酵母细胞生长至少 24 小时（如果实验需要，或更多）。
5. 制作试剂、准备实验室用具和设置细胞淬火设备
- 准备以下： 1） 淬火溶液 （60% 高档 （>99.9%） 甲醇在 155 mM 碳酸氢铵 （ABC） 缓冲器， pH = 8.0）;2） 冰冷 ABC 溶液 （pH = 8.0）;3） 能够测量至 -20 °C 的数字温度计;4） 500 mL 大型离心机瓶：5） 预冷高速离心机，带有预冷却转子和预冷却的 500 mL 离心机瓶，均在 -5 °C;6） 代谢物提取管（15 mL高速玻璃离心机管，带聚四氟乙烯衬里盖）：和 7） 干冰。
6. 细胞淬火
- 使用血细胞计确定每 ML YP 中含有 2% 葡萄糖培养物的酵母细胞数量。
- 将含有 5.0 x 108 细胞的 2% 葡萄糖的 YP 介质培养体卷转移到预冷却的 500 mL 离心机瓶中。
- 快速将装有细胞的离心机瓶填充至 200 mL 的淬火溶液，该溶液存储在 -20 °C 下。
- 在 11，325 x g 的高速离心机中将瓶子离心，在 -5 °C 下 3 分钟离心。
- 快速而温柔地从离心机中回收瓶子;轻轻拧开盖子，取出超高分子，而不会干扰颗粒。
- 快速将细胞颗粒重新插入 10 毫升冰冷 ABC 缓冲器中，并将悬架转移到 15 mL 高速玻璃离心机管中，并配有聚四氟乙烯衬里盖，用于代谢物提取。
- 在临床离心机中通过离心机在 3，000 x g 下收集细胞，在 0 °C 下采集 3 分钟。
- 快速取出超高纳坦，将管子放在干冰上，开始代谢物提取或将管子储存在 -80 °C 下，直到提取。
7. 制备试剂、实验室用具和代谢物提取设备
- 准备如下： 1） LC-MS 级氯仿：2） LC-MS级甲醇;3） LC级纳米纯净水：4） LC-MS 等级 （ACN）;5） 玻璃珠（酸洗，425-600μm）;6） 带带固定器的泡沫管支架套件的漩涡：7） 15 mL 高速玻璃离心机管，带聚四氟乙烯衬里盖;8） 小瓶女士;9） 干冰：10） 1.5 mL 管用乙醇洗一次，一次用 ACN 洗一次，用纳米纯净水洗一次。
注：仅使用抗有机溶剂的聚丙烯制成的微管尖和管。
8. 代谢物提取
- 要将代谢物保存在干冰上或从第 6.7 步储存在 -80 °C 管中，添加以下：1） 2 mL 氯仿储存在 -20 °C;2） 1 mL 甲醇储存在 -20 °C;3） 1mL 冰冷纳米纯净水：和 4） 200 μL 的 425-600 μm 酸洗玻璃珠。
- 用铝箔盖住并关闭管子的口。将管子放在带固定器的泡沫管支架套件中，以中等速度（即设定为 6 的速度，其中 12 个是漩涡的最大速度）在 4 °C 下涡流 30 分钟，以方便代谢物提取。
- 在冰上孵育管子15分钟（不是干冰！），促进蛋白质沉淀和上水与下有机相分离。
- 在 3，000 x g 的临床离心机中离心管，在 4 °C 下 10 分钟。 此离心步骤允许将上水相（包含水溶性代谢物）与中间层（包含细胞碎片和蛋白质）和下部有机相（其中大部分含有脂质）分离。
- 使用微管将上水相 （400 μL） 转移到洗过并标记为 1.5 mL 的管中，其中含有 800 μL 的 ACN，存储在 -20 °C 下。
注：在将上水相添加到 ACN 后，将会有白云降水，保持在 -20 °C。 - 将样品在桌面离心机中离心，在 13，400 x g 下离心 10 分钟，在 4 °C 下。
注：离心后白云降水将消失。 - 将 800 μL 从管中液体的上部转移到标记的 MS 小瓶。将样品存储在 0 °C 下，直到 LC-MS/MS 分析。
9. 为LC准备试剂、实验室用具和设备
- 准备以下： 1） 漩涡：2） 超声波声波器：3） 玻璃瓶女士;4） 配备二进制泵、脱气器和自动采样器的 LC 系统;5） 材料 表中命名的 zwitterion 相色谱柱（5 μm 聚合物，150 x 2.1 毫米）：6） 柱加热器：和 7） 移动相，包括 A 相（5：95 ACN：水（v/v），含 20 mM 醋酸铵、pH = 8.0）和 B 相（100% ACN）。
10. LC提取代谢物分离
- 将 MS 小瓶的内容置于超声波声波下 15 分钟。
- 漩涡 MS 小瓶 3x 在室温下 10 秒 （RT） 。
- 将 MS 小瓶放入井板中。
- 在色谱仪期间，将柱保持在 45 °C，流量为 0.250 mL/min。将样品放在 0 °C 的井板中。 在色谱仪中需要使用的 LC 梯度请参阅表 1。
注：从野生型菌株 BY4742 的细胞中提取的水溶性代谢物的代表性总离子色谱图见 图 1。通过正电离 [ESI （+） 模式执行的质谱分析，通过 LC 分离的代谢物进行识别和量化，如第 11 步所述。
11. LC分离的代谢物的质谱分析
- 使用配备加热电喷雾电离 （HESI） 的质谱仪，对 LC 分离的水溶性代谢物进行识别和定量。使用质谱仪的分析仪用于MS1离子，将质谱仪的探测器用于MS2离子。分别使用 表 2 和表 3 中提供的设置进行依赖于数据的 MS1 离子和 MS2 离子的采集。
- 在 ESI （+） 和 ESI （-） 模式下，使用 10 μL 的样本量进行注射。
12. 通过处理LC-MS/MS的原始数据来识别和量化不同的代谢物
- 使用材料表中命名的软件，对原始LC-MS/MS文件中不同的水溶性代谢物进行识别和量化。本软件使用MS1进行代谢物定量，MS2用于代谢物鉴定。该软件利用最广泛策划的质量光谱碎片库，通过匹配MS光谱，使用LC-MS/MS原始数据对代谢物进行注释。该软件还使用MS1和同位素图案匹配的确切质量，使用在线数据库对代谢物进行注释。有关详细信息，请参阅图 2。
- 使用可在线免费获得的数据库和光谱库（https://www.mzcloud.org），搜索原始数据的 MS2 光谱。
13. 通过碘化物（PI）染色和荧光显微镜对膜完整性进行检测
- 按照第 6 步的描述进行细胞淬火后，用 15 mL 的 ABC 缓冲器彻底清洗淬火细胞，以去除淬火溶液。在 0 °C 下以 3，000 x g 的离心收集细胞 5 分钟。
- 将细胞颗粒重新悬浮在 1 mL 的 ABC 缓冲器中，并添加 0.5 mL 的 PI 溶液（0.5 毫克/毫升）。
- 漩涡管与样品3x为10s，并孵育它10分钟在黑暗和冰上。
- 将样品在桌面离心机中离心，在 13，400 x g 下离心 10 分钟，在 4 °C 下。
- 取出超高纳特，在 1 mL 的 ABC 缓冲器中重新使用颗粒。
- 在 13，400 x g 下离心管，在 4 °C 下 10 分钟离心，并取出超高线。再重复此步骤 2 次，以删除绑定到细胞表面的 PI。
- 将颗粒重新悬浮在 300 μL 的 ABC 缓冲器中。将悬浮的 10 μL 置于显微镜滑梯表面。
- 用荧光显微镜捕捉差分干扰对比度 （DIC） 和荧光显微镜图像。使用在 593 nm 和 636 nm（分别）的激发和排放波长设置的过滤器。
- 使用软件计算总细胞数（在 DIC 模式下）和荧光染色细胞的数量。此外，使用此软件确定单个细胞的染色强度。
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Representative Results
为了改进酵母细胞内水溶性代谢物的定量评估，我们优化了细胞淬火的条件，以便检测代谢物。为此目的的细胞淬火涉及快速逮捕细胞内的所有酶反应31，33，37，38。这种细胞代谢活性的抑制是任何方法在体内量化水溶性代谢物的重要步骤，因为它防止低估其细胞内浓度31，33，37，38。代谢物评估的细胞淬火总是会损害等离子体膜（PM）（和细胞壁（CW）的完整性（如果存在的话）：这会导致代谢物泄漏从细胞31，33，37，38。该方法采用细胞淬火条件，最大限度地减少此类损伤，从而显著减少细胞内代谢物的淬火相关细胞泄漏。事实上，目前大多数细胞淬火方法都涉及使用一定浓度的甲醇（即 40% （v/v）， 60% （v/v）， 80% （v/v）， 或 100% （v/v） 在特定温度 （即， -20 °C， -40 °C， 或 -60 °C）， 有或没有缓冲31，33，37，38.我们比较了目前使用的细胞淬火方法之一的 PM 和 CW 损伤的效率（即， 在没有缓冲器38的情况下，用 80% （v/v） 甲醇进行细胞治疗，用于改良细胞淬火方法（即在 pH = 8.0 的 ABC 同位素缓冲溶液存在的情况下，在 -20 °C 下使用 60% （v/v） 甲醇进行细胞治疗）。PI 是一种荧光染料，对完好无损的细胞不透水;它只能进入细胞，当PM的完整性（和CW，如果存在）受损39。此外，PI的荧光发射强度上升30倍时，它必然与DNA或RNA39。因此，PI染色检测可用于评估细胞内代谢物的淬火相关细胞泄漏的效率，因为只有酵母细胞的PM和CW受损39，这些代谢物才能泄漏到细胞外空间。我们发现，改性细胞淬火方法对PM和CW的损害明显低于细胞治疗的淬火方法，在-40°C（图3）下使用非缓冲80%（v/v）甲醇。事实上，几乎所有使用这种方法淬火的细胞都表现出红色荧光发射，这是PM和CW未受损的酵母细胞的特征（图3）。相比之下，几乎所有使用其他方法淬火的细胞都表现出酵母细胞的绿色荧光发射特征，酵母细胞的PM和CW受到显著损伤（图3）。最强烈的红色荧光通过软件转换为绿色荧光，以区分强烈的红色荧光和轻度红色荧光排放。
改性细胞淬火方法通过细胞处理，在-40°C下使用未缓冲的80%（v/v）甲醇，使酵母细胞的水溶性代谢物泄漏明显低于- 淬火方法。 我们使用这种方法（即在 -20 °C 下使用 60% （v/v） 甲醇进行细胞治疗，在 pH = 8.0 时使用 ABC 的同位素缓冲溶液进行等量的淬火;图4）或其他方法（即通过细胞治疗与非缓冲80%（v/v）甲醇在-40°C;图5）。在LC-MS/MS的帮助下，对特定水溶性代谢物的淬火相关细胞泄漏到细胞外溶液的程度进行了评估。细胞外溶液中不同氨基酸类（即大大小小酸性、基础性、中性非极性氨基酸和中性极性氨基酸）的浓度在细胞淬火前后进行测量。我们发现，细胞淬火方法导致所有这些氨基酸类泄漏到细胞外溶液（图4）明显低于其他方法（图5）。
酵母细胞内水溶性代谢物定量评估的LC-MS/MS方法使用单一类型的柱子进行所有水溶性代谢物类的色谱分离。本专栏是 材料表中命名的 zwitterion 相列。我们发现，本专栏提供了不同类别的水溶性代谢物比 材料表 （补充表1）中命名的反相列更有效的分离。事实上，水溶性代谢物标准（即 NAD+、AMP、GMP、精氨酸和谷氨酸）的保留时间 （RT） 变化值明显较低，与反向相列（补充表 1）相比，zwitterion 相列的峰值形状要清晰得多。 在补充表2中提供了用于所有代谢物（即水溶性和水溶性）的色谱分离的LC条件。
LC-MS/MS 方法的另一个优点是能够在上述 zwitterion 相柱上进行色谱分离，从而有效地将具有不同结构、物理和化学特性的不同水溶性代谢物分离。这些水溶性代谢物包括以下代谢物类：1）酸性、基础性、中性极性、非中性极性氨基酸，包括其不同的结构异构体（图6）：2） 稳定且不稳定的核苷酸及其衍生物在细胞内执行重要功能（图7）：和3）各种单糖，包括它们不同的立体体形式（图8）。
重要的是，用于对酵母细胞内的水溶性代谢物进行定量评估的LC-MS/MS方法是多功能和坚固的。它使我们能够识别和量化374个水溶性代谢物 ，这些代 谢物具有不同的结构、物理和化学性质，这些代谢物在完整的YP介质中培养，最初含有2%的葡萄糖（补充表3）。在正电离子化模式下检测到240个代谢物，在阴离子化模式下检测到134个代谢物。所有这些水溶性代谢物的身份通过将其数据依赖性采集 （DDA） MS2 片段与 MS2 mzCloud 光谱库在正离子化模式和负电离模式下获得的片段进行匹配来确认。此在线库包括其 MS1 和 DDA MS2 参数中不同的代谢物标准的光谱。为了最大限度地将样品的 MS2 光谱与在线光谱库匹配，我们使用了不同的 DDA MS2 参数。这些参数在 补充表4中提供。使用前 5 个 MS2 事件、35 个碰撞能量值和 10 ms 激活时间，借助高能诱导碰撞分离 （HCD） 或碰撞诱导分离 （CID） 碎片化方法，获得了同一样本的近 6，000 个特征（假定代谢物）。在筛选了> 95% MS2 匹配和> 90% MS1 同位素模式匹配标准后，仅识别了 HCD 碎片条件下的 162 个代谢物和 CID 碎片条件下的 142 个代谢物。162 种代谢物中有 81 种是 HCD 碎片化方法所独有的，而 142 种代谢物中有 42 种是 CID 碎片化方法所独有的（见 补充表 4中名为"T5_35E__10 ms_HCD与 CID"的表）。因此，我们的结论是，在LC-MS/MS方法的帮助下，水溶性代谢物的正确注释需要使用许多不同的DDA MS2参数。
LC-MS/MS 方法也非常敏感。它允许识别和量化一些水溶性代谢物的浓度低至0.05pmol/μL（见 表4中的苯丙氨酸数据）。这种量子定量限制在不同代谢物类（表4）的浓度范围内变化很大。
此处使用的 MS 系统具有广泛的（至少两个数量级）线性动态范围，用于测量各种代谢物的浓度（补充表 5）。
图1：从液体色谱/质谱（LC-MS）数据中提取的从野生型菌株 BY4742 细胞中提取的水溶性代谢物的总离子色谱 （TIC）。 代谢物由LC在 材料表中命名的zwitterion相色谱柱上分离。代谢物由使用正电喷电离子化模式创建的父离子（MS1）的MS检测到。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：在材料表中命名的软件的帮助下，用于分析水溶性代谢物的工作流程。 所有参数均由软件根据MS原始数据自动更正，但以下除外：1）"检测化合物"选项卡：设定最小值，峰值强度10，000：2） "搜索化学斯皮德"选项卡：选择了 4 个在线数据库来识别代谢物，包括 BioCyc、人类代谢学数据库、KEGG 和酵母代谢学数据库。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：微分干扰对比度（DIC;上排）和荧光（下排）酵母细胞的微观图像，要么用碳酸氢铵（ABC）缓冲器（pH = 8.0;控制），要么用不同的淬火溶液淬火。 细胞淬火后，用PI溶液在黑暗和冰上孵育了同样数量的细胞10分钟。最强烈的红色荧光通过软件转换为绿色荧光，以区分强烈的红色荧光和轻度红色荧光的排放。将 PM 和 CW 的损坏效率与细胞淬火方法进行比较（即， 通过细胞治疗与 60% （v/v） 甲醇在 -20 °C 的情况下存在同位素缓冲解决方案的 ABC 在 pH = 8.0） 和目前使用的方法之一 （即， 通过细胞治疗与 80% （v/v） 甲醇在 -40 °C 在没有缓冲） 。显示比例尺条。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：不同氨基酸类的细胞淬火方法的泄漏百分比。 5.0 x 10 8 酵母细胞在pH =8.0 的ABC同位素缓冲溶液出现的情况下，在-20°C下用60%（v/v）甲醇进行淬火。使用LC-MS/MS测量不同氨基酸类的泄漏百分比，以测量其在淬火前后细胞外溶液中的浓度。显示 SD 和单个数据点±平均值（n = 3）。* p < 0.05。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5：目前使用的细胞淬火方法之一不同氨基酸类的泄漏百分比。 5.0 x10 8 酵母细胞在没有缓冲的情况下，在-40°C下用80%（v/v）甲醇进行淬火治疗。使用LC-MS/MS测量不同氨基酸类的泄漏百分比，以测量其在淬火前后细胞外溶液中的浓度。显示 SD 和单个数据点±平均值（n = 3）。* p < 0.05。 请单击此处查看此图的较大版本。
图6：在材料表命名的zwitterion相列上，酸性、基础性、中性极性和非中性极性氨基酸类的有效色谱分离，包括两个结构异构体（即卵氨酸和异油氨酸）。所有这些氨基酸均由MS/MS在正电离子化 [ESI （+）] 模式下检测到。表1描述了zwitterion相色谱列上的LC条件。表格2及表3中均描述MS/MS的情况。所有氨基酸标准都是以商业价格购买的（例如西格玛）。3 个独立色谱运行之间的保留时间变化小于 10 秒±。请单击此处查看此图的较大版本。
图7：不同类别核苷酸的有效色谱分离，包括能量不稳定的核苷酸（核苷单磷酸盐、核苷二磷酸盐和核苷三磷酸盐）和电子载体分子（NADH和NAD+），在材料表命名的zwitterion相列上。所有这些核苷酸均由 MS/MS 在正电离 [ESI （+）] 模式下检测到。表1描述了zwitterion相色谱列上的LC条件。表格2及表3中均描述MS/MS的情况。所有核苷酸标准都是以商业价格购买的（例如西格玛）。3 个独立色谱运行之间的保留时间变化小于 10 秒±。请单击此处查看此图的较大版本。
图8：不同类别的单糖的有效色谱分离，包括结构异构体和立体体形式的阿尔多和酮合索（果糖、曼诺和甘蔗糖），以及材料表中命名的zwitterion相列上的阿尔多-和酮酶（核糖和阿拉比诺塞）。所有这些单糖均由 MS/MS 在正电电化 [ESI （+）] 模式下检测到。表1描述了zwitterion相色谱列上的LC条件。表格2及表3中均描述MS/MS的情况。所有单糖标准均以商业价格购买（例如西格玛）。3 个独立色谱运行之间的保留时间变化小于 10 秒±。请单击此处查看此图的较大版本。
| 列类型 | 塞昆特 ZIC-pHILIC 5μm 聚合物 150 x 2.1 毫米 | ||
| 溶剂 A | LC-MS 级 H2O： ACN （95：5， v/v） 20m 铵醋酸盐 | ||
| 溶剂 B | LC-MS 级丙酮三叶酸 （ACN） | ||
| 压力限制 | 最大 = 300 条 | 最小值 = 0 | |
| HPLC 梯度计划 | |||
| 时间（分钟） | 流量 （0.25 毫升/分钟） | 成分 | |
| A% | B% | ||
| 0.5 | 0.25 | 5 | 95 |
| 26 | 0.25 | 40 | 60 |
| 30 | 0.25 | 70 | 30 |
| 31 | 0.25 | 70 | 30 |
| 31.1 | 0.4 | 5 | 95 |
| 43.9 | 0.4 | 5 | 95 |
| 44 | 0.25 | 5 | 95 |
| 45 | 0.25 | 5 | 95 |
表1：利用材料表中命名的zwitterion相列分离水溶性代谢物的LC条件。这些条件用于此处描述的所有实验。
| 全扫描质量范围（道尔顿） | 70-900 |
| FTMS（轨道拉法分析仪）全扫描分辨率 | 6.0 x 104 |
| FTMS （轨道拉普分析仪） HCD 分辨率 | 7500 |
| FTMS 全扫描 AGC 目标 | 1.0 x 106 |
| Ftms Msn Agc 目标 | 5.0 x 104 |
| 离子陷阱 （LTQ） MSn AGC 目标 | 1.0 x 104 |
| 离子源类型 | 加热电喷雾电离子化 |
| 毛细电温度 （°C） | 275 |
| 源加热器温度 （°C） | 250 |
| 护套气体流 | 10 |
| 辅助气体流 | 5 |
表2：用于分析LC分离的代谢物的质谱仪设置。 这些条件用于分析这里描述的所有实验中的代谢物。缩写： FTMS = 富里尔转换 （FTMS）;HCD = 高能诱导碰撞分离;LTQ = 线性陷阱四极体;AGC = 自动增益控制，MS 和 MS/MS 的离子人口值。
| 仪器极性 | 正/负 |
| 激活类型 | CID/HCD |
| 所需的最小信号 | 5000 |
| 隔离宽度 | 2 |
| CID 的规范化碰撞能量 | 35, 60 |
| 丙肝正常碰撞能量 | 35, 45, 55 |
| 默认充电状态 | 1 |
| CID 的激活时间 （ms） | 10, 30 |
| HCD （ms） 的激活时间 | 10 |
| CID 中的 MS/MS 事件数量 | 前 3 名、前 5 名、前 10 名 |
| HCD 中的 MS/MS 事件数量 | 前 5 名 |
| 丙肝和 CID 中使用的微扫描次数 | 1 |
表3：用于检测二次离子（MS2）的质谱仪设置。 缩写：HCD = 高能诱导碰撞分离;CID = 碰撞诱发分离;毫秒。
| 圣代谢物 | M.W. （g/摩尔） | [M+H]+1 | [M-H]-1 | 检测模式 | 检测到的浓度最低（pmol/μL） |
| 甘氨酸 | 75.03203 | 76.03931 | 74.02475 | P | 7.43E+00 |
| 色氨酸 | 204.08988 | 205.09716 | 203.0826 | P | 5.56E-02 |
| 苯丙氨酸 | 165.07898 | 166.08626 | 164.0717 | P | 5.14E-02 |
| 精氨酸 | 174.11168 | 175.11896 | 173.1044 | P | 7.14E-02 |
| 三氨酸* | 119.05824 | 120.06552 | 118.05096 | P | |
| 丝氨酸 | 105.04259 | 106.04987 | 104.03531 | P | 4.66E+00 |
| 谷氨酸 | 147.05316 | 148.06044 | 146.04588 | P | 4.20E-01 |
| 蛋氨酸 | 149.05105 | 150.05833 | 148.04377 | P | 1.96E+00 |
| 阿斯巴泰 | 133.03751 | 134.04479 | 132.03023 | P | 3.75E+00 |
| 缬氨酸 | 117.07898 | 118.08626 | 116.0717 | P | 1.49E+00 |
| 异亮氨酸 | 131.09463 | 132.10191 | 130.08735 | P | 1.84E+00 |
| 亮氨酸 | 131.09463 | 132.10191 | 130.08735 | P | 2.26E+00 |
| 组氨酸 | 155.06948 | 156.07676 | 154.0622 | P | 2.53E+00 |
| 酪氨酸 | 181.07389 | 182.08117 | 180.06661 | P | 8.72E-02 |
| 赖氨酸 | 146.10553 | 147.11281 | 145.09825 | P | 1.43E-01 |
| 丙氨酸 | 89.04768 | 90.05496 | 88.0404 | P | 1.12E+00 |
| 脯氨酸 | 115.06333 | 116.07061 | 114.05605 | P | 1.05E+00 |
| 半胱氨酸 | 121.01975 | 122.02703 | 120.01247 | P | 8.22E-01 |
| 天冬酰胺 | 132.05349 | 133.06077 | 131.04621 | P | 1.08E+00 |
| 谷氨酰胺 | 146.06914 | 147.07642 | 145.06186 | P | 1.92E+00 |
| 鸟嘌呤 | 151.04941 | 152.05669 | 150.04213 | P | 5.47E+00 |
| 鸟苷 | 283.09167 | 284.09895 | 282.08439 | P | 3.67E-01 |
| GMP | 363.058 | 364.06528 | 362.05072 | P | 7.17E-01 |
| 国内生产总值 | 443.02434 | 444.03162 | 442.01706 | P | 2.57E+00 |
| GTP | 522.99067 | 523.99795 | 521.98339 | P | 2.27E+00 |
| 放大 器 | 347.06309 | 348.07037 | 346.05581 | P | 5.25E-01 |
| ADP | 427.02942 | 428.0367 | 426.02214 | P | 1.32E+00 |
| ATP | 506.99575 | 508.00303 | 505.98847 | P | 1.77E+00 |
| 纳德 | 665.12478 | 666.13206 | 664.1175 | P | 1.47E+00 |
| 纳德+ | 663.10912 | 664.1164 | 662.10184 | P | 3.03E+00 |
| 葡萄糖** | 180.06339 | 181.07067 | 179.05611 | ||
| 果糖*** | 180.06339 | 181.07067 | 179.05611 | N | 5.67E-01 |
| 曼诺斯*** | 180.06339 | 181.07067 | 179.05611 | N | 1.05E+00 |
| 银河*** | 180.06339 | 181.07067 | 179.05611 | N | 9.00E-01 |
| 里博斯*** | 150.05283 | 151.06011 | 149.04555 | N | 1.10E+00 |
| 阿拉比诺斯*** | 150.05283 | 151.06011 | 149.04555 | N | 1.23E+00 |
| 果糖-6-磷酸盐*** | 260.02972 | 261.037 | 259.02244 | N | 6.60E+00 |
| 葡萄糖-6-磷酸盐*** | 260.02972 | 261.037 | 259.02244 | N | 4.27E+00 |
| 柠檬酸 | 192.12 克 | 193.034279 | 191.019726 | N | 9.33E-01 |
| 苹果酸 | 134.09 | 135.0288 | 133.014247 | N | 1.23E+00 |
| 丙酮酸 | 88.06 | 89.02332 | 87.008768 | N | 2.77E+00 |
表4：LC-MS/MS 方法可以识别和量化的不同水溶性代谢物标准的最低浓度。 每个代谢物标准的 MS1 峰值区域用于估计该代谢物的最低可量化浓度。显示了两个独立实验的平均值。对两个独立实验各进行了三次技术复制。注：可以检测到Threonine*，但由于它与同位素（一种三聚氨酸的化学同源体）共同授精，因此无法量化。葡萄糖**无法识别，因为它创造了多个色谱峰值。代谢物标准***只能在单个样品中识别和量化，但不能在代谢物标准的混合物或代谢物的生物混合物中识别和量化。
补充表 1：保留时间 （RT） 在列平衡后，将同一组代谢物的值移位，用于 zwitterion 相和反向相列（参见材料表）。 该表比较了zwitterion相和反向相列在亲水性和疏水性方面彼此不同的不同代谢物的保留可重复性。这些代谢物是在LC-MS/MS的帮助下确定的。 请注意，与反向相列相比，亲水代谢物（即NAD+、AMP、GMP、精氨酸和谷氨酸）的RT移位值显著降低，Zwitterion相列的峰值形状要清晰得多。相比之下，疏水代谢物（即乳酸、月桂酸和十二酸）的RT移位值明显较低，与zwitterion相列相比，反相柱的峰值形状要清晰得多。 表1 和 补充表2分别详细介绍了借助zwitterion相和反向相列分离代谢物的色谱分离条件。此处报告的 RT 移位值基于对从不同小瓶中采集的 20 个不同样本的测量。样品在列平衡后进行分析。每个样本中的代谢物从5.0×108 酵母细胞中提取。RT 移位值是 20 个不同样本（n = 20）的工具。从未修用的 t 测试中得出的 p 值用于比较两列与两个示例类型之间的等差。 请单击此处下载此表。
补充表2：材料表中命名的反相8列的LC条件，用于分离本研究中的不同代谢物。 柱属性如下： 150 x 2.1 毫米， 5μm 聚合物. 请单击此处下载此表。
补充表3：使用LC-MS/MS方法回收和注释的所有374种水溶性代谢物清单。 所有代谢物都是从相同的LC梯度运行中回收的，受 制于补充表4中描述的数据依赖性采集（DDA）碎片化算法，并使用 材料表中命名的软件进行注释。211 个代谢物的 MS1 峰值形状（其在表中的状态表示为空白）适合用于量化，并且它们各自的 MS2 光谱与 mzCloud 光谱库完全匹配。38 种代谢物的 MS2 光谱（其在表中的地位表示为 d）与在线光谱库具有完全匹配。不过，它们的 MS1 峰值形状不适合用于量化。125 种代谢物的 MS2 光谱（其在表中的状态表示为 n）与在线光谱库没有完全匹配。这些代谢物注释如下：1） 使用"预测成分节点"（根据 MS1 值的精确匹配、匹配和错过同位素的数量以及与理论参考标准匹配的同位素% 强度对代谢物进行注释）：2） 使用"化学斯皮德节点"（根据 MS1 值的精确匹配和 MS2 光谱与在线光谱库的相似匹配分数对代谢物进行注释）：和 3） 使用代谢物的保留时间 （RT） 转移值（这些值取决于代谢物的物理结构和化学性质）。表中列出的代谢物在所有3个生物复制品中都被发现，RT移位值为<0.2分钟。 请点击这里下载此表。
补充表4：一种数据依赖性采集（DDA）碎片化算法，在材料表中命名的软件的帮助下，用于水溶性代谢物的注释。请点击这里下载此表。
补充表5：一个典型的线性动态范围，当我们测量不同氨基酸的浓度时，借助材料表中命名的MS系统。 此处使用的 MS 系统具有广泛的（至少两个数量级）线性动态范围，用于测量各种代谢物的浓度。 请单击此处下载此表。
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Discussion
要成功使用此处描述的协议，请遵循下面描述的预防措施。氯仿和甲醇从实验室塑料制品中提取各种物质。因此，请谨慎处理。避免使用塑料的步骤，涉及接触这两种有机溶剂中的任何一个。使用硅酸盐玻璃移液器进行这些步骤。使用前用氯仿和甲醇将这些移液器升起。仅使用抗有机溶剂的聚丙烯制成的微管尖和管。在 LC-MS/MS 的样品准备过程中，在将气泡插入井板之前，先消除玻璃瓶中的所有气泡。
此处使用的 zwitterion 相列需要在每次运行后进行广泛的重新调理，以最大限度地减少 RT 移位。对于列重新调理，我们建议使用大约 20 卷的列的重新调理解决方案的卷。该列需要在初始移动阶段重新调整 15 分钟，流量增加 0.4 mL/min。为了避免在重新调理过程中对柱子造成任何损坏，请将柱子压力保持在制造商建议的压力上限以下。
值得注意的是，一些在反向模式下运行的混合分离色谱柱允许电带电代谢物的分辨率为40，41。这些混合分离列基于此处使用的反向列（见材料表），包含极地嵌入组，可以根据电荷40、41将代谢物分离。
在这里，我们描述了一种基于LC-MS/MS的非靶向代谢方法，用于对从酵母细胞中提取的许多水溶性代谢物进行定量分析。该方法比目前用于此目的的非靶向代谢方法具有若干优点。这些优势包括以下优势。首先，该方法很灵敏，允许以低至 0.05 pmol/μL 的浓度识别和量化某些水溶性代谢物。现有LC-MS/MS方法的敏感性较低，为3、22、27、42。其次，该方法采用细胞淬火程序，导致细胞内代谢物的泄漏明显低于目前使用的程序31，33，38报告。因此，我们为细胞淬火而开发的程序降低了目前使用的程序低估了水溶性代谢物细胞内浓度的程度。第三，与现有的LC-MS/MS方法2，31，33不同，该方法区分了不同的结构异构体和许多代谢物的立体体形式。这些代谢物包括各种能量载体分子、核苷酸、氨基酸、单糖、糖解中间体和三碳循环中间体。第四，我们使用该方法创建了广泛的MS1和MS2质量光谱数据库，以便使用原始LC-MS/MS数据正确识别和量化各种特定代谢物。相比之下，现有的MS1和MS2质量光谱在线数据库是不完整的43，44，45。第五，该方法使用单一类型的代谢物萃取来回收具有不同结构、物理和化学特性的水溶性代谢物。这些代谢物的多样性大大超过从酵母细胞3、22、27、46中单步提取水溶性代谢物的替代方法。六、与现有的LC-MS/MS方法3、22、47、48不同，该方法使用单一类型的LC列将水溶性代谢物的各种结构和功能类分开。第七，该方法能够识别和量化从酵母细胞中提取的370多种水溶性代谢物。这一数量的可识别和可量化代谢物超过报告的其他方法的代谢物的数量，在酵母3，22，27，49，50。
该方法有几个局限性。这些限制如下。LC 用于代谢物分离的 zwitterion 相列每次运行后都需要进行广泛的重新调理。此外，该方法仅针对水溶性、亲水代谢物的非靶向代谢物有效。此外，不同的异位体形式的碳水化合物（包括果糖、葡萄糖和甘油糖的异位体）无法通过该方法进行量化。这是因为该方法中使用的zwitterion相列在与其他代谢物混合时不能将这些碳水化合物异位体彼此分离。此外，该方法不能用于识别葡萄糖，因为这种碳水化合物在方法中使用的 zwitterion 相列的色谱过程中会产生多个峰值。最后，由于这种氨基酸与异位素同位素在代谢物通过色谱分离过程中共同排解，因此无法通过该方法进行量化。
我们使用这种LC-MS/MS方法来研究发芽酵母 S.Cerevisiae的水溶性代谢体的老化相关变化。我们还使用这种方法来调查在酵母细胞按时间顺序排列的衰老过程中，有多少延缓衰老的遗传、饮食和药理干预措施会影响酵母细胞的水溶性代谢体。由于LC-MS/MS方法具有多功能性、坚固性和灵敏度，可成功用于对进化远方真核生物中的水溶性元细胞体进行定量评估。
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Disclosures
作者宣称他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
我们感谢蒂托连科实验室的现任和前任成员进行讨论。我们感谢质谱学生物应用中心、结构和功能基因组学中心以及显微镜和细胞成像中心（均在康科迪亚大学）提供出色的服务。这项研究得到了加拿大自然科学和工程研究理事会（NSERC）的资助（RGPIN 2014-04482和CRDPJ 515900-17）。K.M得到了康科迪亚大学阿曼德·阿坎巴尔特奖学金和康科迪亚大学艺术与科学系主任卓越奖的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| L-histidine | Sigma | H8125 | |
| L-leucine | Sigma | L8912 | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Propidium iodide | Thermo Scientific | R37108 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Hardware equipment | |||
| 500 ml centrifuge bottles | Beckman | 355664 | |
| Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
| Beckman Coulter Centrifuge | Beckman | 6254249 | |
| Beckman Coulter Centrifuge Rotor | Beckman | JA-10 | |
| Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
| Digital thermometer | Omega | HH509 | |
| Foam Tube Holder Kit with Retainer | Thermo Scientific | 02-215-388 | |
| SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm) | Sigma Milipore | 150460 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µm | Agilent Technologies | 883725-901 | |
| Laboratory materials | |||
| 2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| Glass beads (acid-washed, 425-600 μm) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| 15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
| Software | |||
| Compound Discoverer 3.1 | Fisher Scientific | V3.1 | |
| Yeast strain | |||
| Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 |
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