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Biochemistry

Metabolômica Quantitativa de Saccharomyces Cerevisiae Usando cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem

Published: January 5, 2021 doi: 10.3791/62061
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biology, Concordia University, 2Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry, Concordia University

Summary

Apresentamos um protocolo para identificação e quantitação das principais classes de metabólitos solúveis em água no levedura Saccharomyces cerevisiae. O método descrito é versátil, robusto e sensível. Permite a separação de isômeros estruturais e formas estereogômicas de metabólitos solúveis em água uns dos outros.

Abstract

Metabolômica é uma metodologia utilizada para a identificação e quantificação de muitos intermediários de baixo peso molecular e produtos do metabolismo dentro de uma célula, tecido, órgão, fluido biológico ou organismo. A metabolômica tradicionalmente se concentra em metabólitos solúveis em água. O metabolome solúvel em água é o produto final de uma complexa rede celular que integra vários fatores genômicos, epigenômicos, transcriômicos, proteômicos e ambientais. Assim, a análise metabolômica avalia diretamente o resultado da ação para todos esses fatores em uma infinidade de processos biológicos dentro de diversos organismos. Um desses organismos é o fermento saccharomyces cerevisiae, um eucariote unicelular com o genoma totalmente sequenciado. Como a S. cerevisiae é favorável a análises moleculares abrangentes, é usada como modelo para dissecar mecanismos subjacentes a muitos processos biológicos dentro da célula eucariótica. Um método analítico versátil para a avaliação quantitativa robusta, sensível e precisa do metabolome solúvel em água forneceria a metodologia essencial para dissecar esses mecanismos. Aqui apresentamos um protocolo para as condições otimizadas de atividade metabólica saciando e extração metabólito solúvel em água a partir de células de S. cerevisiae. O protocolo também descreve o uso de cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem (LC-MS/MS) para a análise quantitativa dos metabólitos solúveis em água extraídos. O método LC-MS/MS de metabolômica não-direcionada descrito aqui é versátil e robusto. Permite a identificação e quantificação de mais de 370 metabólitos solúveis em água com diversas propriedades estruturais, físicas e químicas, incluindo diferentes isômeros estruturais e formas estereogômicas desses metabólitos. Estes metabólitos incluem várias moléculas portadoras de energia, nucleotídeos, aminoácidos, monossacarídeos, intermediários de glicólise e intermediários do ciclo tricarboxílico. O método LC-MS/MS de metabolômica não-direcionada é sensível e permite a identificação e a quantitação de alguns metabólitos solúveis em água em concentrações tão baixas quanto 0,05 pmol/μL. O método tem sido usado com sucesso para avaliar metabóboles solúveis em água de células de levedura silvestre e mutantes cultivadas em diferentes condições.

Introduction

Metabólitos solúveis em água são intermediários de baixo peso molecular e produtos do metabolismo que contribuem para processos celulares essenciais. Esses processos evolutivamente conservados incluem a conversão de nutrientes em energia utilizável, síntese de macromoléculas, crescimento e sinalização celular, controle do ciclo celular, regulação da expressão genética, resposta ao estresse, regulação pós-translacional do metabolismo, manutenção da funcionalidade mitocondrial, tráfico celular vesicular, autofagia, envelhecimento celular e morte celular regulada1,2,3.

Muitos desses papéis essenciais de metabólitos solúveis em água foram descobertos por estudos na levedura S. cerevisiae1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Este eucariote unicelular é um organismo modelo útil para dissecar mecanismos através dos quais metabólitos solúveis em água contribuem para processos celulares devido à sua comodidade às análises biológicas bioquímicas avançadas, genéticas e moleculares23,24,25,26. Embora os métodos LC-MS/MS de metabolômica não-direcionada tenham sido utilizados para estudar os papéis de metabólitos solúveis em água emleveduras brotantes 3,18,22,27, este tipo de análise requer a melhoria de sua versatilidade, robustez, sensibilidade e capacidade de distinguir entre diferentes isômeros estruturais e formas estereotipadas desses metabólicos.

Os últimos anos são marcados por avanços significativos na aplicação dos métodos LC-MS/MS de metabolômica não direcionada ao perfil de metabólitos solúveis em água in vivo. No entanto, muitos desafios no uso dessa metodologia permanecem2,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Esses desafios incluem o seguinte. Em primeiro lugar, as concentrações intracelulares de muitos metabólitos solúveis em água estão abaixo de um limiar de sensibilidade para os métodos atualmente utilizados. Em segundo lugar, a eficiência da saciamento da atividade metabólica é muito baixa, e a extensão do vazamento celular associado à extinção de metabólitos intracelulares é muito alta para os métodos atuais; portanto, os métodos atualmente utilizados subestimam as concentrações intracelulares de metabólitos solúveis em água. Em terceiro lugar, os métodos existentes não podem diferenciar os isômeros estruturais (ou seja, moléculas com a mesma fórmula química, mas conectividade atômica diferente) ou estereomers (ou seja, moléculas com a mesma fórmula química e conectividade atômica, mas com o arranjo atômico diferente no espaço) de metabólitos específicos; isso impede a anotação correta de certos metabólitos pelos métodos atualmente utilizados. Em quarto lugar, as bases de dados on-line espectrais existentes de íons-pais (MS1) e íons secundários (MS2) estão incompletas; isso afeta a identificação e a quantitação corretas de metabólitos específicos utilizando os dados brutos LC-MS/MS produzidos com a ajuda dos métodos atuais. Em quinto lugar, os métodos existentes não podem usar um único tipo de extração metabólito para recuperar todas ou a maioria das classes de metabólitos solúveis em água. Em sexto lugar, os métodos existentes não podem usar um único tipo da coluna LC para separar-se entre si todas ou a maioria das classes de metabólitos solúveis em água.

Aqui, otimizamos as condições para a extinção da atividade metabólica dentro das células de S. cerevisiae, mantendo a maioria dos metabólitos solúveis em água dentro dessas células antes da extração, e extraindo a maioria das classes de metabólitos solúveis em água de células de levedura. Desenvolvemos um método versátil, robusto e sensível para a identificação e quantificação baseada em LC-MS/MS de mais de 370 metabólitos solúveis em água extraídos de células S. cerevisiae. Este método de metabolomia não-direcionada permite avaliar as concentrações intracelulares de várias moléculas portadoras de energia, nucleotídeos, aminoácidos, monossacarídeos, intermediários de glicólise e intermediários do ciclo tricarboxílico. O método desenvolvido LC-MS/MS permite a identificação e quantificação de diferentes isômeros estruturais e formas estereosméricas de metabólitos solúveis em água com diversas propriedades estruturais, físicas e químicas.

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Protocol

1. Fazer e esterilizar um meio para o cultivo de leveduras

  1. Faça 180 mL de um extrato completo de levedura com meio bactopepton (YP). O meio YP completo contém 1% (p/v) extrato de levedura e 2% (w/v) bactopeptone.
  2. Distribua 180 mL do meio YP igualmente em quatro frascos de 250 mL Erlenmeyer. Cada um desses frascos contém 45 mL do meio YP.
  3. Esterilize os frascos com meio YP autoclavando a 15 psi/121 °C por 45 min.

2. Cepa de levedura tipo selvagem

  1. Use a cepa BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0).

3. Fermento crescente no meio YP contendo 2% de glicose

  1. Esterilize uma solução de estoque de 20% (w/v) de glicose por autoclaving a 15 psi/121 °C por 45 min.
  2. Adicione 5 mL da solução de estoque autoclaved de 20% (w/v) de glicose a cada um dos dois frascos Erlenmeyer com 45 mL do meio YP esterilizado. A glicose de concentração final no meio YP é de 2% (c/v).
  3. Use um laço microbiológico para inocular células de levedura em cada um dos dois frascos erlenmeyer com o meio YP contendo 2% de glicose.
  4. Cresça as células de levedura durante a noite a 30 °C em um agitador rotacional a 200 rpm.
  5. Tome uma alíquota da cultura da levedura. Determine o número total de células de levedura por mL de cultura. Conte células usando um hemócito.

4. Transferência celular para e célula cresce no meio YP com 2% de glicose

  1. Adicione 5 mL da solução de glicose esterilizada de 20% (w/v) para cada um dos dois frascos erlenmeyer restantes com o meio YP autoclavado. A concentração final de glicose é de 2% (c/v).
  2. Transfira um volume da cultura da levedura durante a noite em YP médio com 2% de glicose que contém o número total de 5,0 x 107 células em cada um dos dois frascos Erlenmeyer com o meio YP contendo 2% de glicose. Use uma pipeta estéril para a transferência celular.
  3. Cresça as células de levedura por pelo menos 24 h (ou mais, se o experimento exigir) a 30 °C em um agitador rotacional definido a 200 rpm.

5. Fazer reagentes, preparar labware e configurar equipamentos para saciar células

  1. Preparar o seguinte: 1) uma solução de saciação (60% de alto grau (>99,9%) metanol em 155 mM de biocarbonato de amônio (ABC), pH = 8,0); 2) uma solução ABC gelada (pH = 8,0); 3) um termômetro digital capaz de medir até -20 °C; 4) garrafas de centrífugas grandes de 500 mL; 5) uma centrífuga pré-resfriada de alta velocidade com um rotor pré-resfriado e garrafas de centrífugas de centrífugas pré-resfriadas de 500 mL para este rotor, tudo a -5 °C; 6) tubos de extração metabólito (tubos de centrífugas de vidro de alta velocidade de 15 mL com tampas forradas de politetrafluoroetileno); e 7) gelo seco.

6. Saciamento de células

  1. Use um hemótmetro para determinar o número de células de levedura por mL de YP com cultura de glicose de 2%.
  2. Transfira um volume da cultura em meio YP com 2% de glicose que contém o número total de 5,0 x 108 células em garrafas de centrífugas pré-resfriadas de 500 mL.
  3. Encha rapidamente a garrafa centrífuga contendo as células até o volume de 200 mL com uma solução de saciamento armazenada a -20 °C.
  4. Centrifugar as garrafas em uma centrífuga de alta velocidade a 11.325 x g por 3 min a -5 °C.
  5. Recuperar rapidamente e ternamente a garrafa da centrífuga; gentilmente desaparafusar a tampa e remover o sobrenatante sem perturbar a pelota.
  6. Ressuspenque rapidamente a pelota celular em 10 mL de tampão ABC gelado e transfira a suspensão para um tubo de centrífuga de vidro de alta velocidade de 15 mL com uma tampa forrada de politefluoroetileno para extração metabólito.
  7. Coletar células por centrifugação em uma centrífuga clínica a 3.000 x g por 3 min a 0 °C.
  8. Remova rapidamente o supernasal e coloque o tubo em gelo seco para iniciar a extração metabólito ou armazene o tubo a -80 °C até a extração.

7. Preparação de reagentes, labware e equipamentos para extração metabólito

  1. Preparar o seguinte: 1) clorofórmio de grau LC-MS; 2) Metanol de grau LC-MS; 3) Água nano-pura de grau LC; 4) Grau LC-MS (ACN); 5) contas de vidro (lavadas com ácido, 425-600 μm); 6) um vórtice com um kit porta-tubos de espuma com retentor; 7) Tubos de centrífugas de vidro de alta velocidade de 15 mL com tampas forradas com politefluoroetileno; 8) Frascos de MS; 9) gelo seco; e 10) tubos de 1,5 mL lavados uma vez com etanol, uma vez com ACN e uma vez com água nano-pura.
    NOTA: Utilize apenas pontas de micropipette e tubos feitos de polipropileno resistente a solventes orgânicos.

8. Extração metabólito

  1. Para os metabólitos mantidos em gelo seco ou armazenados a -80 °C a partir da etapa 6.7, adicione o seguinte: 1) 2 mL de clorofórmio armazenado a -20 °C; 2) 1 mL de metanol armazenado a -20 °C; 3) 1 mL de água nano-pura gelada; e 4) 200 μL de 425-600 μm contas de vidro lavadas com ácido.
  2. Cubra e feche a boca de um tubo com papel alumínio. Coloque os tubos em um kit portador de tubo de espuma com retentor e vórtice por 30 minutos em velocidade média (ou seja, a uma velocidade que é definida em 6, sendo 12 a velocidade máxima de um vórtice) a 4 °C para facilitar a extração metabólito.
  3. Incubar o tubo por 15 minutos no gelo (NÃO gelo seco!) para promover a precipitação proteica e a separação do aquoso superior da fase orgânica inferior.
  4. Centrifugar o tubo em uma centrífuga clínica a 3.000 x g por 10 min a 4 °C. Esta etapa de centrifugação permite separar a fase aquosa superior (que contém metabólitos solúveis em água) da camada média (que contém detritos celulares e proteínas) e da fase orgânica inferior (que contém principalmente lipídios).
  5. Use uma micropipette para transferir a fase aquosa superior (400 μL) para um tubo lavado e rotulado de 1,5 mL contendo 800 μL de ACN que foi armazenado a -20 °C.
    NOTA: Haverá precipitação de nuvens brancas após a adição da fase aquosa superior à ACN mantida em -20 °C.
  6. Centrifugar o tubo com a amostra em uma centrífuga de mesa a 13.400 x g por 10 min a 4 °C.
    NOTA: A precipitação da nuvem branca desaparecerá após a centrifugação.
  7. Transfira 800 μL da porção superior de um líquido no tubo para um frasco ms rotulado. Armazene a amostra a 0 °C até que seja analisada por LC-MS/MS.

9. Preparação de reagentes, labware e equipamentos para LC

  1. Preparar o seguinte: 1) um vórtice; 2) um sônico ultrassônico; 3) Frascos de vidro MS; 4) um sistema LC equipado com uma bomba binária, degasser e autosampler; 5) uma coluna de cromatografia em fase zwitterionica (polímero de 5 μm, 150 x 2,1 mm) nomeada em Tabela de Materiais; 6) um aquecedor de coluna; e 7) fases móveis, incluindo fase A (5:95 ACN:água (v/v) com acetato de amônio de 20 mM, pH = 8,0) e fase B (100% ACN).

10. Separação de metabólitos extraídos por LC

  1. Sujeito o conteúdo do frasco de MS à sônica ultrassônica por 15 min.
  2. Vórtice o frasco MS 3x por 10 segundos à temperatura ambiente (RT).
  3. Coloque o frasco MS na placa do poço.
  4. Durante o cromatógrafo, mantenha a coluna a 45 °C e uma vazão de 0,250 mL/min. Mantenha a amostra na placa do poço a 0 °C. Consulte a Tabela 1 para os gradientes de LC que precisam ser utilizados durante a cromatografia.
    NOTA: Um cromatograma total representativo de metabólitos solúveis em água que foram extraídos das células da cepa do tipo selvagem BY4742 é mostrado na Figura 1. Os metabólitos separados por LC foram identificados e quantificados pela análise espectrométrica de massa que foi realizada no modo ionização positiva [ESI (+)], conforme descrito para a etapa 11.

11. Análise espectrométrica em massa de metabólitos separados pela LC

  1. Use um espectrômetro de massa equipado com ionização de eletrospray aquecida (HESI) para identificação e quantitação de metabólitos solúveis em água que foram separados por LC. Use o analisador de espectrômetro de massa para íons MS1 e o detector de espectrômetro de massa para íons MS2. Utilize as configurações fornecidas na Tabela 2 e Na Tabela 3 para a aquisição dependente de dados de íons MS1 e MS2, respectivamente.
  2. Use um volume amostral de 10 μL para a injeção nos modos ESI (+) e ESI (-).

12. Identificação e quantitação de diferentes metabólitos pelo processamento de dados brutos da LC-MS/MS

  1. Use o software nomeado em Tabela de Materiais para realizar a identificação e quantitação de diferentes metabólitos solúveis em água a partir de arquivos LC-MS/MS brutos. Este software usa MS1 para quantitação metabólica e MS2 para identificação metabólica. O software explora a biblioteca de fragmentação espectral de massa mais extensivamente curada para anotar os metabólitos usando os dados brutos LC-MS/MS, combinando os espectros de MS. Este software também usa a massa exata de MS1 e o padrão de isótopos corresponde a metabólitos anotados usando bancos de dados on-line. Consulte a Figura 2 para obter detalhes.
  2. Use a biblioteca de bancos de dados e espectros, que está disponível gratuitamente online (https://www.mzcloud.org), para procurar espectros MS2 dos dados brutos.

13. Ensaio de integridade da membrana por sarampo de propidium Iodide (PI) e microscopia de fluorescência

  1. Após a saciação de células realizada como descrito para o passo 6, lave as células saciadas completamente com 15 mL de tampão ABC para remover a solução de saciamento. Coletar células por centrifugação a 3.000 x g por 5 min a 0 °C.
  2. Resuspense a pelota de célula em 1 mL de tampão ABC e adicione 0,5 mL da solução PI (0,5 mg/mL).
  3. Vórtice um tubo com a amostra 3x para 10 s e incuba-lo por 10 minutos no escuro e no gelo.
  4. Centrifugar o tubo com a amostra em uma centrífuga de mesa a 13.400 x g por 10 min a 4 °C.
  5. Remova o supernatante e resuspense a pelota em 1 mL de buffer ABC.
  6. Centrifugar o tubo a 13.400 x g por 10 min a 4 °C e remover o sobrenatante. Repita esta etapa mais 2 vezes para remover o PI ligado à superfície da célula.
  7. Resuspenda a pelota em 300 μL de buffer ABC. Coloque 10 μL da suspensão na superfície de um deslizamento de microscópio.
  8. Capture as imagens de contraste de interferência diferencial (DIC) e microscopia de fluorescência com um microscópio de fluorescência. Use um filtro configurado nos comprimentos de onda de excitação e emissão de 593 nm e 636 nm (respectivamente).
  9. Use um software para contar o número total de células (no modo DIC) e o número de células manchadas fluorescentes. Além disso, use este software para determinar a intensidade da coloração para células individuais.

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Representative Results

Para melhorar uma avaliação quantitativa de metabólitos solúveis em água dentro de uma célula de levedura, otimizamos as condições de saciamento celular para detecção metabólito. A extinção celular para este fim envolve uma prisão rápida de todas as reações enzimáticas dentro de uma célula31,33,37,38. Tal apreensão da atividade metabólica celular é um passo essencial de qualquer método para a quantitação de metabólitos solúveis em água in vivo, pois impede a subestimação de suas concentrações intracelulares31,33,37,38. A saciação celular para avaliação metabólica sempre prejudica a integridade da membrana plasmática (PM) (e da parede celular (CW), se presente); isso causa vazamento metabólico da célula31,33,37,38. O método emprega condições de extinção celular que minimizam esse prejuízo, diminuindo significativamente o vazamento celular associado à extinção de metabólitos intracelulares. De fato, a maioria dos métodos atuais para saciar células envolvem o uso de uma certa concentração de metanol (ou seja, 40% (v/v), 60% (v/v), 80% (v/v) ou 100% (v/v)) em temperatura específica (ou seja, -20 °C, -40 °C, ou -60 °C), com ou sem tampão31,33,37,38. Comparamos a eficiência do prejuízo pm e CW para um dos métodos de saciamento celular atualmente utilizado (ou seja, por tratamento celular com 80% (v/v) metanol a -40 °C na ausência de um buffer38) para aquele para o método de saciamento celular modificado (ou seja, por tratamento celular com 60% (v/v) metanol a -20 °C na presença de uma solução tamponada isotônica de ABC em pH = 8,0). Pi é um corante fluorescente que é impermeável a células intactas; só pode entrar na célula se a integridade do PM (e da CW, se presente) for prejudicada39. Além disso, a intensidade da emissão de fluorescência por PI aumenta 30 vezes quando está ligada ao DNA ou RNA39. Assim, um ensaio de coloração pi pode ser usado para avaliar a eficiência do vazamento de células associadas à extinção de metabólitos intracelulares, pois esses metabólitos só podem vazar para o espaço extracelular se o PM e o CW de uma célula de levedura estiverem danificados39. Descobrimos que o método de saciamento de células modificadas causa danos significativamente menores ao PM e à CW do que o método de saciamento por tratamento celular com metanol não tamponado de 80% (v/v) a -40 °C(Figura 3). De fato, quase todas as células submetidas à extinção utilizando o método apresentaram emissão de fluorescência vermelha, característica das células de levedura cuja PM e CW não estão danificadas(Figura 3). Em contraste, quase todas as células submetidas à extinção utilizando o outro método, apresentaram emissão de fluorescência verde característica das células de levedura cuja PM e CW estão significativamente danificadas(Figura 3). A fluorescência vermelha mais intensa foi convertida em fluorescência verde por um software para diferenciar entre a forte fluorescência vermelha e as emissões de fluorescência vermelha leve.

O método de saciamento de células modificadas causou um vazamento significativamente menor de metabólitos solúveis em água de células de levedura do que o método de saciamento por tratamento celular com metanol não tamponado de 80% (v/v) a -40 °C. Submetemos um número igual de células de levedura à saciedade usando o método (ou seja, por tratamento celular com 60% (v/v) metanol a -20 °C na presença de uma solução isotônica tamponada de ABC no pH = 8,0; Figura 4) ou o outro método (ou seja, por tratamento celular com metanol não tamponado de 80% (v/v) a -40 °C; Figura 5). A extensão do vazamento de células associada à extinção na solução extracelular foi avaliada para metabólitos solúveis em água específicos com a ajuda de LC-MS/MS. As concentrações de diferentes classes de aminoácidos (ou seja, aminoácidos acidólicos grandes e pequenos, básicos, neutros-não-polares e neutros) na solução extracelular foram medidas antes e depois da extinção celular. Descobrimos que o método de sincanificação celular causa um vazamento significativamente menor de todas essas classes de aminoácidos na solução extracelular(Figura 4) do que o outro método(Figura 5).

O método LC-MS/MS para uma avaliação quantitativa de metabólitos solúveis em água dentro de uma célula de levedura usa um único tipo da coluna para separação cromatográfica de todas as classes metabólitos solúveis em água. Esta coluna é a coluna de fase zwitterionic nomeada em Tabela de Materiais. Descobrimos que esta coluna proporciona uma separação muito mais eficiente de diferentes classes de metabólitos solúveis em água do que a coluna de fase inversa nomeada na Tabela de Materiais (Tabela Suplementar 1). De fato, os valores de mudança do tempo de retenção (RT) dos padrões metabólitos solúveis em água (i.e., NAD+, AMP, GMP, arginina e ácido glutamico) foram significativamente mais baixos e as formas de pico foram substancialmente mais nítidas para a coluna de fase zwitteriônica, em comparação com a coluna de fase inversa(Tabela Suplementar 1). As condições de LC utilizadas para separação cromatográfica de todos os metabólitos (ou seja, solúveis em água e insolúveis em água) para a coluna de fase inversa são fornecidas na Tabela Suplementar 2.

Outra vantagem do método LC-MS/MS consiste na capacidade de separação cromatográfica na coluna de fase zwitteriônica acima para separar eficientemente entre si diferentes metabólitos solúveis em água com diversas propriedades estruturais, físicas e químicas. Estes metabólitos solúveis em água incluem as seguintes classes metabólitos: 1) aminoácidos polares ácidos, básicos, neutros e não neutros, incluindo seus diferentes isômeros estruturais(Figura 6); 2) nucleotídeos estáveis e instáveis e seus derivados que executam funções vitais dentro de uma célula (Figura 7); e 3) vários monossacarídeos, incluindo suas diferentes formas estereogômicas(Figura 8).

É importante ressaltar que o método LC-MS/MS para uma avaliação quantitativa de metabólitos solúveis em água dentro de uma célula de levedura foi versátil e robusto. Permitiu identificar e quantificar 374 metabólitos solúveis em água com diversas propriedades estruturais, físicas e químicas em células de S. cerevisiae que foram cultivadas no meio YP completo inicialmente contendo 2% de glicose(Tabela Suplementar 3). 240 metabólitos foram detectados no modo de ionização positiva e 134 metabólitos foram detectados no modo de ionização negativa. As identidades de todos esses metabólitos solúveis em água foram confirmadas pela correspondência de seus fragmentos MS2 (Data-Dependent Acquisition, dependente de dados) adquiridos tanto nos modos de ionização positivo e negativo para a biblioteca espectral MS2 MZCloud. Esta biblioteca on-line inclui os espectros de padrões metabólitos que diferem em seus parâmetros MS1 e DDA MS2. Para maximizar a extensão da correspondência dos espectros MS2 da amostra com a biblioteca espectral on-line, utilizamos diferentes parâmetros DDA MS2. Esses parâmetros são fornecidos na Tabela Suplementar 4. Quase 6.000 características (metabólitos putativos) para a mesma amostra foram adquiridas com a ajuda do método de fragmentação de colisão induzida por alta energia (HCD) ou dissociação induzida por colisão (CID), utilizando os 5 principais eventos MS2, 35 valores de energia de colisão e tempos de ativação de 10 ms. Após filtrar os arquivos resultantes com > correspondência de 95% de MS2 e > critérios de correspondência de padrão isotópico de 90% MS1, apenas 162 metabólitos sob condição fragmentada de HCD e 142 metabólitos em condição fragmentada de CID foram identificados. 81 dos 162 metabólitos foram exclusivos do método de fragmentação do HCD, enquanto 42 de 142 eram exclusivos do método de fragmentação do CID (ver uma folha chamada "T5_35E__10 ms_HCD vs CID" na Tabela Suplementar 4). Portanto, concluímos que a anotação correta de metabólitos solúveis em água com a ajuda do método LC-MS/MS requer o uso de muitos parâmetros DDA MS2 diferentes.

O método LC-MS/MS também é altamente sensível. Permite identificar e quantificar alguns metabólitos solúveis em água em concentrações tão baixas quanto 0,05 pmol/μL (ver dados para fenilalanina na Tabela 4). Esse limite de quantitação varia dentro de uma ampla gama de concentrações para diferentes classes metabólicas(Tabela 4).

O sistema MS utilizado aqui possui um amplo (pelo menos duas ordens de magnitude) de alcance dinâmico linear para medir as concentrações de vários metabólitos(Tabela Suplementar 5).

Figure 1
Figura 1: O cromatógrafo de íon total (TIC) a partir de dados de cromatografia líquida/espectrometria de massa (LC-MS) de metabólitos solúveis em água que foram extraídos de células da cepa do tipo selvagem BY4742. Os metabólitos foram separados por LC na coluna de cromatografia de fase zwitteriônica nomeada em Tabela de Materiais. Os metabólitos foram detectados por MS de íons-pais (MS1) que foram criados utilizando o modo de ionização de eletrosprai positiva. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Um fluxo de trabalho utilizado para a análise de metabólitos solúveis em água com a ajuda do software nomeado em Tabela de Materiais. Todos os parâmetros foram corrigidos automaticamente pelo software com base nos dados brutos do MS, exceto os seguintes: 1) guia "Detectar compostos": definir min, intensidade máxima de 10.000; e 2) guia "Search ChemSpider": 4 bancos de dados on-line foram selecionados para identificação de metabólitos, incluindo o Banco de Dados BioCyc, Human Metabolome, KEGG e Levedura Metabolome Database. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Contraste de interferência diferencial (DIC; linha superior) e fluorescência (linha inferior) imagens microscópicas de células de levedura saciadas com tampão de bicarbonato de amônio (ABC) (pH = 8,0; controle) ou com uma solução de saciamento diferente. Após a extinção celular, o número igual de células foi incubado com a solução PI por 10 minutos no escuro e no gelo. A fluorescência vermelha mais intensa foi convertida em fluorescência verde por software para diferenciar entre a forte fluorescência vermelha e as emissões de fluorescência vermelha leve. A eficiência dos danos ao PM e à CW foi comparada com o método de saciamento celular (ou seja, por tratamento celular com 60% (v/v) metanol a -20 °C na presença de uma solução isotônica tamponada de ABC no pH = 8,0) e um dos métodos atualmente utilizados (ou seja, por tratamento celular com 80% (v/v) metanol a -40 °C na ausência de um tampão). Uma barra de escala é mostrada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: A porcentagem de vazamento de diferentes classes de aminoácidos para o método de saciedade celular. 5,0 x 108 das células de levedura foram submetidas à saciedade pelo tratamento com 60% (v/v) metanol a -20 °C na presença de uma solução tamponada isotônica de ABC no pH = 8,0. A porcentagem de vazamento de diferentes classes de aminoácidos foi avaliada utilizando-se LC-MS/MS para medir suas concentrações na solução extracelular antes e depois da extinção. Os valores médios ± SD e pontos de dados individuais são mostrados (n = 3). * p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: A porcentagem de vazamento de diferentes classes de aminoácidos para um dos métodos de saciamento celular atualmente utilizados. 5,0 x 108 das células de levedura foram submetidas à extinção pelo tratamento com 80% (v/v) metanol a -40 °C na ausência de um tampão. A porcentagem de vazamento de diferentes classes de aminoácidos foi avaliada utilizando-se LC-MS/MS para medir suas concentrações na solução extracelular antes e depois da extinção. Os valores médios ± SD e pontos de dados individuais são mostrados (n = 3). * p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Separação cromatográfica eficiente das classes de aminoácidos polares ácidos, básicos, neutros e não neutros, incluindo dois isômeros estruturais (ou seja, leucina e isoleucina), na coluna de fase zwitteriônica nomeada na Tabela de Materiais. Todos esses aminoácidos foram detectados por MS/MS no modo de ionização positiva [ESI (+)]. As condições para LC na coluna cromatografia de fase zwitteriônica estão descritas na Tabela 1. As condições para MS/MS estão descritas na Tabela 2 e Tabela 3. Todos os padrões de aminoácidos são comprados comercialmente (por exemplo, Sigma). Os turnos de retenção entre 3 corridas de cromatografia independentes são inferiores ± 10 segundos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Separação cromatográfica eficiente de diferentes classes de nucleotídeos, incluindo nucleotídeos energeticamente instáveis (monfosfatos nucleosídeos, fosfatos nucleosídeos e triptosfatos nucleosídeos) e moléculas portadoras de elétrons (NADH e NAD+), na coluna de fase zwitteriônicanomeada em Tabela de Materiais. Todos esses nucleotídeos foram detectados por MS/MS no modo de ionização positiva [ESI (+)]. As condições para LC na coluna cromatografia de fase zwitteriônica estão descritas na Tabela 1. As condições para MS/MS estão descritas na Tabela 2 e Tabela 3. Todos os padrões de nucleotídeos são comprados comercialmente (por exemplo, Sigma). Os turnos de retenção entre 3 corridas de cromatografia independentes são inferiores ± 10 segundos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: Separação cromotográfica eficiente de diferentes classes de monossacarídeos, incluindo isômeros estruturais e formas estereogômicas de aldo e cetohexoses (frutose, manejado e galactose), e aldopentoses (ribose e arabinose), na coluna de fase zwitterionicnomeada em Tabela de Materiais. Todos esses monossacarídeos foram detectados por MS/MS no modo de ionização positiva [ESI (+)]). As condições para LC na coluna cromatografia de fase zwitteriônica estão descritas na Tabela 1. As condições para MS/MS estão descritas na Tabela 2 e Tabela 3. Todos os padrões de monossacarídeos são comprados comercialmente (por exemplo, Sigma). Os turnos de retenção entre 3 corridas de cromatografia independentes são inferiores ± 10 segundos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tipo de coluna Polímero SeQuant ZIC-pHILIC 5μm 150 x 2,1 mm
Solvente A LC-MS grau H2O: ACN (95:5, v/v) 20 mM acetato de amônio
Solvente B Acetonitrila de grau LC-MS (ACN)
Limite de pressão Máximo = 300 bar Mínimo = 0
Programa de gradiente HPLC
Tempo (minutos) Taxa de fluxo (0,25 ml/min) Composições
A% B%
0.5 0.25 5 95
26 0.25 40 60
30 0.25 70 30
31 0.25 70 30
31.1 0.4 5 95
43.9 0.4 5 95
44 0.25 5 95
45 0.25 5 95

Tabela 1: Condição de LC utilizada para a separação de metabólitos solúveis em água com a ajuda da coluna de fase zwitteriônicanomeada na Tabela deMateriais. Estas condições foram usadas em todos os experimentos descritos aqui.

Alcance de massa de varredura completa (Dalton) 70-900
Resolução completa de varredura FTMS (Analisador Orbitrap) 6.0 x 104
Resolução FTMS (Analisador Orbitrap) 7500
FtMS verificação completa alvo AGC 1.0 x 106
Alvo FTMS MSn AGC 5.0 x 104
Meta de Ion trap (LTQ) MSn AGC 1.0 x 104
Tipo de fonte de íon Ionização de Eletropray Aquecida
Temperatura capilar (°C) 275
Temperatura do aquecedor de origem (°C) 250
Fluxo de Gás de Baia 10
Fluxo de gás Aux 5

Tabela 2: As configurações do espectrômetro de massa utilizadas para analisar metabólitos separados por LC. Estas condições foram utilizadas para a análise de metabólitos em todos os experimentos descritos aqui. Abreviaturas: FTMS = Fourier transform (FTMS); HCD = alta dissociação de colisão induzida por energia; LTQ = quadrúpole de armadilha linear; AGC = controle automático de ganho, valor populacional de íons para MS e MS/MS.

Polaridade do instrumento Positivo/Negativo
Tipo de ativação CID/HCD
Mínimo de sinal necessário 5000
Largura de isolamento 2
Energias de colisão normalizadas para CID 35, 60
Energias de colisão normalizadas para HCD 35, 45, 55
Estado de cobrança padrão 1
Tempo de ativação para CID (ms) 10, 30
Tempo de ativação para HCD (ms) 10
Número de eventos de MS/MS em CID Top 3, Top 5, Top 10
Número de eventos de MS/MS em HCD Top 5
Número de micro scans utilizados tanto no HCD quanto no CID 1

Tabela 3: As configurações do espectrômetro de massa utilizadas para detectar íons secundários (MS2). Abreviaturas: HCD = alta dissociação de colisão induzida por energia; CID = dissociação induzida por colisão; ms = milissegundos.

Metabólitos de Std M.W. (g/mole) [M+H]+1 [M-H]-1 Modo de detecção Menor concentração detectada (pmol/μL)
glicina 75.03203 76.03931 74.02475 P 7.43E+00
triptofano 204.08988 205.09716 203.0826 P 5.56E-02
fenilalanina 165.07898 166.08626 164.0717 P 5.14E-02
arginina 174.11168 175.11896 173.1044 P 7.14E-02
threonine* 119.05824 120.06552 118.05096 P
serina 105.04259 106.04987 104.03531 P 4.66E+00
glutamato 147.05316 148.06044 146.04588 P 4.20E-01
metionina 149.05105 150.05833 148.04377 P 1.96E+00
aspartato 133.03751 134.04479 132.03023 P 3.75E+00
valina 117.07898 118.08626 116.0717 P 1.49E+00
isoleucina 131.09463 132.10191 130.08735 P 1.84E+00
leucina 131.09463 132.10191 130.08735 P 2.26E+00
histidina 155.06948 156.07676 154.0622 P 2.53E+00
tirosina 181.07389 182.08117 180.06661 P 8.72E-02
lisina 146.10553 147.11281 145.09825 P 1.43E-01
alanina 89.04768 90.05496 88.0404 P 1.12E+00
prolina 115.06333 116.07061 114.05605 P 1.05E+00
cisteína 121.01975 122.02703 120.01247 P 8.22E-01
asparagina 132.05349 133.06077 131.04621 P 1.08E+00
glutamina 146.06914 147.07642 145.06186 P 1.92E+00
guanina 151.04941 152.05669 150.04213 P 5.47E+00
guanosina 283.09167 284.09895 282.08439 P 3.67E-01
GMP 363.058 364.06528 362.05072 P 7.17E-01
PIB 443.02434 444.03162 442.01706 P 2.57E+00
GTP 522.99067 523.99795 521.98339 P 2.27E+00
AMP 347.06309 348.07037 346.05581 P 5.25E-01
ADP 427.02942 428.0367 426.02214 P 1.32E+00
ATP 506.99575 508.00303 505.98847 P 1.77E+00
NADH 665.12478 666.13206 664.1175 P 1.47E+00
NAD+ 663.10912 664.1164 662.10184 P 3.03E+00
glicose** 180.06339 181.07067 179.05611
frutose*** 180.06339 181.07067 179.05611 N 5.67E-01
mannose*** 180.06339 181.07067 179.05611 N 1.05E+00
galactose*** 180.06339 181.07067 179.05611 N 9.00E-01
ribose*** 150.05283 151.06011 149.04555 N 1.10E+00
arabinose*** 150.05283 151.06011 149.04555 N 1.23E+00
frutose-6-fosfato*** 260.02972 261.037 259.02244 N 6.60E+00
glicose-6-fosfato*** 260.02972 261.037 259.02244 N 4.27E+00
ácido cítrico 192,12 g 193.034279 191.019726 N 9.33E-01
ácido malic 134.09 135.0288 133.014247 N 1.23E+00
ácido piruvic 88.06 89.02332 87.008768 N 2.77E+00

Tabela 4:As concentrações mais baixas de diferentes padrões metabólitos de água solúveis que o método LC-MS/MS pode identificar e quantificar. A área de pico ms1 de cada padrão metabólito foi utilizada para estimar a menor concentração quantificável para este metabólito. Valores médios de dois experimentos independentes são mostrados. Foram realizadas três réplicas técnicas para cada um dos dois experimentos independentes. NOTA: A threonine* pode ser detectada, mas não pode ser quantificada devido à sua co-elução com homoserina, um isômero químico de threonina. A glicose** não pode ser identificada porque cria múltiplos picos de cromatografia. Padrões metabólitos*** podem ser identificados e quantitados apenas em amostras individuais, mas não em uma mistura de padrões metabólitos ou uma mistura biológica de metabólitos.

Tabela suplementar 1: Tempo de retenção (RT) mudam os valores do mesmo conjunto de metabólitos para as colunas de fase zwitteriônica e de fase inversa (ver Tabela de Materiais) após o equilíbrio da coluna. A tabela compara a reprodutibilidade de retenção das colunas de fase zwitteriica e de fase inversa para um conjunto distinto de metabólitos diferentes uns dos outros em sua hidrofilicidade e hidrofobibeidade. Esses metabólitos foram identificados com a ajuda da LC-MS/MS. Observe que os valores de mudança rt de metabólitos hidrofílicos (ou seja, NAD+, AMP, GMP, arginina e ácido glutamico) são significativamente mais baixos e as formas de pico são substancialmente mais acentuadas para a coluna de fase zwitterinica, em comparação com a coluna de fase inversa. Em contraste, os valores de mudança rt de metabólitos hidrofóbicos (ou seja, ácido esteárico, ácido láurico e ácido descônico) são significativamente mais baixos e as formas de pico são substancialmente mais nítidas para a coluna de fase inversa, em comparação com a coluna de fase zwitteriônica. As condições para a separação cromatográfica dos metabólitos com a ajuda das colunas de fase zwitteriônica e de fase inversa estão detalhadas na Tabela 1 e Na Tabela Suplementar 2, respectivamente. Os valores de mudança rt relatados aqui baseiam-se na medição de 20 amostras diferentes colhidas de diferentes frascos. As amostras foram analisadas após o equilíbrio da coluna. Os metabólitos de cada amostra foram extraídos de 5,0 × 108 células de levedura. Os valores de mudança de RT são os meios de 20 amostras diferentes (n = 20). Foram utilizados os valores p derivados do teste t não pago para comparar as duas colunas com a variância igual entre ambos os tipos de amostra. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela Suplementar 2: Condições de LC para a coluna de fase inversa 8 nomeada na Tabela de Materiais e utilizada para separar diferentes metabólitos neste estudo. As propriedades da coluna foram as seguintes: 150 x 2,1 mm, polímero de 5 μm. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela suplementar 3: Uma lista de todos os 374 metabólitos solúveis em água recuperados e anotados utilizando o método LC-MS/MS. Todos os metabólitos foram recuperados da mesma execução de gradiente LC, submetidos a um algoritmo de fragmentação de aquisição dependente de dados (DDA) descrito na Tabela Suplementar 4, e anotados usando o software nomeado em Tabela de Materiais. As formas de pico MS1 de 211 metabólitos (cujo status na tabela é indicado como em branco) eram apropriadas para serem usadas para quantificação, e seus respectivos espectros MS2 tinham correspondências completas com a biblioteca espectral mzCloud. Os espectros MS2 de 38 metabólitos (cujo status na tabela é indicado como d) tinham correspondências completas com a biblioteca espectral online. Ainda assim, suas formas de pico MS1 não eram apropriadas para serem usadas para quantificação. Os espectros MS2 de 125 metabólitos (cujo status na tabela é indicado como n) não tinham correspondências completas com a biblioteca espectral online. Estes metabólitos foram anotados da seguinte forma: 1) utilizando o nó de composição "Prever" (que anota metabólitos com base na correspondência exata dos valores ms1, número de isótopos combinados e perdidos e intensidade de isótopos compatível com a das normas teóricas de referência); 2) utilizando o nó "ChemSpider" (que anota metabólitos com base na correspondência exata dos valores do MS1 e pontuação de correspondência de similaridade dos espectros MS2 com a biblioteca espectral on-line); e 3) utilizando o tempo de retenção (RT) valores de mudança de metabólitos (esses valores dependem da estrutura física e propriedades químicas dos metabólitos). Os metabólitos listados na tabela foram encontrados em todas as 3 réplicas biológicas realizadas, com os valores de mudança rt de < 0,2 min. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela suplementar 4: Um algoritmo de fragmentação de aquisição dependente de dados (DDA) que foi usado aqui para a anotação de metabólitos solúveis em água com a ajuda do software nomeado em Tabela de Materiais. Por favor, clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela Suplementar 5: Uma faixa dinâmica linear típica que observamos quando medimos as concentrações de diferentes aminoácidos com a ajuda do sistema MS nomeado na Tabela de Materiais. O sistema MS utilizado aqui tem um amplo (pelo menos duas ordens de magnitude) de alcance dinâmico linear para medir as concentrações de vários metabólitos. Clique aqui para baixar esta tabela.

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Discussion

Para utilizar com sucesso o protocolo aqui descrito, siga as medidas preventivas descritas abaixo. Clorofórmio e metanol extraem várias substâncias de plásticos de laboratório. Portanto, lide com eles com cautela. Evite o uso de plásticos em etapas que envolvam contato com qualquer um desses dois solventes orgânicos. Use pipetas de vidro borossilicato para estas etapas. Levante essas pipetas com clorofórmio e metanol antes de usar. Use apenas pontas de micropipette e tubos feitos de polipropileno resistente a solventes orgânicos. Durante a preparação da amostra para LC-MS/MS, elimine todas as bolhas de ar nos frascos de vidro antes de inseri-las em uma placa de poço.

A coluna de fase zwitteriônica utilizada aqui requer um recondicionamento extensivo após cada execução para minimizar o câmbio RT. Para recondicionamento da coluna, recomendamos o uso de um volume da solução de recondicionamento que é de cerca de 20 volumes da coluna. A coluna precisa ser recondicionada com a fase móvel inicial por 15 minutos a uma taxa de fluxo aumentada de 0,4 mL/min. Para evitar qualquer dano à coluna durante o seu recondicionamento, mantenha a pressão da coluna abaixo do limite superior de pressão recomendado pelo fabricante.

Note-se que algumas colunas de cromatografia de separação mista que operam no modo de fase inversa permitem a resolução de metabólitos carregados40,41. Estas colunas de separação mista são baseadas na coluna de fase inversa usada aqui (ver Tabela de Materiais) e contêm grupos embutidos polares que podem separar metabólitos com base na carga40,41.

Aqui, descrevemos um método baseado em LC-MS/MS de metabolômica não direcionada para a análise quantitativa de muitos metabólitos solúveis em água extraídos de células de levedura. O método fornece várias vantagens sobre os métodos LC-MS/MS de metabolômica não-direcionada atualmente utilizada para este fim. Essas vantagens incluem o seguinte. Em primeiro lugar, o método é sensível e permite a identificação e a quantitação de alguns metabólitos solúveis em água em concentrações tão baixas quanto 0,05 pmol/μL. A sensibilidade relatada dos métodos LC-MS/MS existentes é menor3,22,27,42. Em segundo lugar, o método utiliza um procedimento de sincanamento celular que provoca um vazamento significativamente menor de metabólitos intracelulares da célula do que o relatado para os procedimentos atualmente utilizados31,33,38. Assim, o procedimento que desenvolvemos para a extinção celular diminui a medida em que os procedimentos utilizados atualmente subestimam as concentrações intracelulares de metabólitos solúveis em água. Em terceiro lugar, ao contrário dos métodos LC-MS/MS existentes2,31,33, o método distingue entre diferentes isômeros estruturais e formas estereogômicas de muitos metabólitos. Estes metabólitos incluem várias moléculas portadoras de energia, nucleotídeos, aminoácidos, monossacarídeos, intermediários de glicólise e intermediários do ciclo tricarboxílico. Em quarto lugar, utilizamos o método para criar um extenso banco de dados espectral em massa de MS1 e MS2 para a identificação e quantitação correta de uma ampla gama de metabólitos específicos usando os dados brutos LC-MS/MS. Em contrapartida, as bases de dados on-line espectrais existentes de MS1 e MS2 estão incompletas43,44,45. Em quinto lugar, o método utiliza um único tipo de extração metabólito para recuperar metabólitos solúveis em água com diversas propriedades estruturais, físicas e químicas. A diversidade desses metabólitos excede significativamente a dos métodos alternativos para uma extração em passo único de metabólitos solúveis em água das células de levedura3,22,27,46. Seis, ao contrário dos métodos LC-MS/MS existentes3,22,47,48, o método utiliza um único tipo da coluna LC para separar-se entre si várias classes estruturais e funcionais de metabólitos solúveis em água. Sete, o método permite a identificação e quantificação de mais de 370 metabólitos solúveis em água extraídos de células de levedura. Este número de metabólitos identificáveis e quantificáveis excede o número de metabólitos relatados para outros métodos de metabolômica não-segmentada na levedura3,22,27,49,50.

O método tem várias limitações. Essas limitações são as seguintes. A coluna de fase zwitteriônica usada para separação metabólica por LC requer um recondicionamento extensivo após cada execução. Além disso, o método é eficiente apenas para a metabólica não direcionada de metabólitos solúveis em água. Além disso, diferentes formas isomericas de carboidratos (incluindo isômeros de frutose, glicose e galactose) não podem ser quantificadas com a ajuda do método. Isso ocorre porque a coluna de fase zwitterionic usada no método não pode separar esses isômeros de carboidratos uns dos outros quando presentes em uma mistura com outros metabólitos. Além disso, o método não pode ser explorado para identificar a glicose porque esse carboidrato cria múltiplos picos durante a cromatografia na coluna de fase zwitterionic utilizada no método. Finalmente, a threonina não pode ser quantificada com a ajuda do método devido à co-elução deste aminoácido com sua homoserina isômera durante a separação metabólito por cromatografia.

Utilizamos este método LC-MS/MS para estudar alterações associadas ao envelhecimento no metabolome solúvel em água da levedura brotante S. cerevisiae. Também utilizamos este método para investigar quantas intervenções genéticas, dietéticas e farmacológicas que retardam o envelhecimento afetam o metaboloto solúvel em água das células de levedura durante seu envelhecimento cronológico. Devido à sua versatilidade, robustez e sensibilidade, o método LC-MS/MS pode ser usado com sucesso para a avaliação quantitativa dos metabóbolmos solúveis em água solúvel em organismos eucarióticos evolutivamente distantes.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Somos gratos aos atuais e antigos membros do laboratório Titorenko pelas discussões. Reconhecemos o Centro de Aplicações Biológicas da Espectrometria de Massa, o Centro de Genômica Estrutural e Funcional e o Centro de Microscopia e Imagem Celular (todos na Universidade de Concórdia) por serviços de destaque. Este estudo foi apoiado por bolsas do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia (NSERC) do Canadá (RGPIN 2014-04482 e CRDPJ 515900 - 17). K.M. foi apoiado pela Concordia University Armand C. Archambault Fellowship e pelo Prêmio de Excelência da Universidade de Concórdia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Acetonitrile Fisher Scientific A9554
Ammonium acetate Fisher Scientific A11450
Ammonium bicarbonate Sigma 9830
Bactopeptone Fisher Scientific BP1420-2
Chloroform Fisher Scientific C297-4
Glucose Fisher Scientific D16-10
L-histidine Sigma H8125
L-leucine Sigma L8912
L-lysine Sigma L5501
Methanol Fisher Scientific A4564
Methanol Fisher Scientific A4564
Propidium iodide Thermo Scientific R37108
Uracil Sigma U0750
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-2
Hardware equipment
500 ml centrifuge bottles Beckman 355664
Agilent 1100 series LC system Agilent Technologies G1312A
Beckman Coulter Centrifuge Beckman 6254249
Beckman Coulter Centrifuge Rotor Beckman JA-10
Centra CL2 clinical centrifuge Thermo Scientific 004260F
Digital thermometer Omega HH509
Foam Tube Holder Kit with Retainer Thermo Scientific 02-215-388
SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm) Sigma Milipore 150460
Thermo Orbitrap Velos MS Fisher Scientific ETD-10600
Ultrasonic sonicator Fisher Scientific 15337416
Vortex Fisher Scientific 2215365
ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µm Agilent Technologies 883725-901
Laboratory materials
2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps Fisher Scientific 60180A-SV9-1P
Glass beads (acid-washed, 425-600 μm) Sigma-Aldrich G8772
Hemacytometer Fisher Scientific 267110
15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps PYREX 05-550
Software
Compound Discoverer 3.1 Fisher Scientific V3.1
Yeast strain
Yeast strain BY4742 Dharmacon YSC1049

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Metabolômica Quantitativa de <em>Saccharomyces Cerevisiae</em> Usando cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem
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Mohammad, K., Jiang, H., Titorenko, V. I. Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (167), e62061, doi:10.3791/62061 (2021).

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