Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kwantitatieve metabolomica van Saccharomyces Cerevisiae met behulp van vloeistofchromatografie in combinatie met tandemmassaspectrometrie

Published: January 5, 2021 doi: 10.3791/62061
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biology, Concordia University, 2Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry, Concordia University

Summary

We presenteren een protocol voor de identificatie en kwantificering van belangrijke klassen van in water oplosbare metabolieten in de gist Saccharomyces cerevisiae. De beschreven methode is veelzijdig, robuust en gevoelig. Het maakt de scheiding van structurele isomeren en stereo-somerische vormen van in water oplosbare metabolieten van elkaar mogelijk.

Abstract

Metabolomics is een methodologie die wordt gebruikt voor de identificatie en kwantificering van vele tussenproducten met een laag molecuulgewicht en producten van het metabolisme in een cel, weefsel, orgaan, biologische vloeistof of organisme. Metabolomics richt zich traditioneel op in water oplosbare metabolieten. Het in water oplosbare metaboloom is het eindproduct van een complex cellulair netwerk dat verschillende genomische, epigenomische, transcriptomische, proteomische en omgevingsfactoren integreert. Vandaar dat de metabolomische analyse direct de uitkomst van de actie voor al deze factoren beoordeelt in een overvloed aan biologische processen binnen verschillende organismen. Een van deze organismen is de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae, een eencellige eukaryoot met het volledig gesequencede genoom. Omdat S. cerevisiae vatbaar is voor uitgebreide moleculaire analyses, wordt het gebruikt als een model voor het ontleden van mechanismen die ten grondslag liggen aan veel biologische processen in de eukaryote cel. Een veelzijdige analysemethode voor de robuuste, gevoelige en nauwkeurige kwantitatieve beoordeling van het in water oplosbare metaboloom zou de essentiële methodologie bieden voor het ontleden van deze mechanismen. Hier presenteren we een protocol voor de geoptimaliseerde omstandigheden van metabole activiteit doven in en in water oplosbare metabolietextractie uit S. cerevisiae-cellen. Het protocol beschrijft ook het gebruik van vloeistofchromatografie in combinatie met tandemmassaspectrometrie (LC-MS/MS) voor de kwantitatieve analyse van de geëxtraheerde in water oplosbare metabolieten. De hier beschreven LC-MS/MS-methode van niet-gerichte metabolomica is veelzijdig en robuust. Het maakt de identificatie en kwantificering mogelijk van meer dan 370 in water oplosbare metabolieten met diverse structurele, fysische en chemische eigenschappen, waaronder verschillende structurele isomeren en stereo-somerische vormen van deze metabolieten. Deze metabolieten omvatten verschillende energiedragermoleculen, nucleotiden, aminozuren, monosacchariden, tussenproducten van glycolyse en tricarbonische cyclustussenproducten. De LC-MS/MS-methode van niet-gerichte metabolomica is gevoelig en maakt de identificatie en kwantificering van sommige in water oplosbare metabolieten mogelijk bij concentraties zo laag als 0,05 pmol/μL. De methode is met succes gebruikt voor het beoordelen van in water oplosbare metabolomen van wild-type en mutante gistcellen gekweekt onder verschillende omstandigheden.

Introduction

In water oplosbare metabolieten zijn tussenproducten met een laag molecuulgewicht en producten van het metabolisme die bijdragen aan essentiële cellulaire processen. Deze evolutionair geconserveerde processen omvatten de omzetting van voedingsstoffen in bruikbare energie, synthese van macromoleculen, cellulaire groei en signalering, celcycluscontrole, regulatie van genexpressie, stressrespons, posttranslataal regulatie van het metabolisme, onderhoud van mitochondriale functionaliteit, vesiculaire cellulaire handel, autofagie, cellulaire veroudering en gereguleerde celdood1,2,3.

Veel van deze essentiële rollen van in water oplosbare metabolieten zijn ontdekt door studies in de ontluikende gist S. cerevisiae1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Deze eencellige eukaryoot is een nuttig modelorganisme voor het ontleden van mechanismen waardoor in water oplosbare metabolieten bijdragen aan cellulaire processen vanwege zijn vatbaarheid voor geavanceerde biochemische, genetische en moleculair biologische analyses23,24,25,26. Hoewel de LC-MS /MS-methoden van niet-gerichte metabolomica zijn gebruikt voor het bestuderen van de rol van in water oplosbare metabolieten in ontluikende gist3,18,22,27, vereist dit type analyse de verbetering van zijn veelzijdigheid, robuustheid, gevoeligheid en vermogen om onderscheid te maken tussen verschillende structurele isomeren en stereo-somerische vormen van deze metabolieten.

De afgelopen jaren worden gekenmerkt door aanzienlijke vooruitgang bij het toepassen van de LC-MS/MS-methoden van niet-gerichte metabolomica op de profilering van in water oplosbare metabolieten in vivo. Veel uitdagingen bij het gebruik van deze methodologie blijven echter2,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Deze uitdagingen omvatten de volgende. Ten eerste liggen de intracellulaire concentraties van veel in water oplosbare metabolieten onder een gevoeligheidsdrempel voor de momenteel gebruikte methoden. Ten tweede is de efficiëntie van het blussen van metabole activiteit te laag en is de mate van blussen-geassocieerde cellekkage van intracellulaire metabolieten te hoog voor de huidige methoden; vandaar dat de momenteel gebruikte methoden de intracellulaire concentraties van in water oplosbare metabolieten onderschatten. Ten derde kunnen de bestaande methoden geen onderscheid maken tussen de structurele isomeren (d.w.z. moleculen met dezelfde chemische formule maar verschillende atomaire connectiviteit) of stereo-isomeren (d.w.z. moleculen met dezelfde chemische formule en atomaire connectiviteit, maar met de verschillende atomaire opstelling in de ruimte) van specifieke metabolieten; dit voorkomt de juiste annotatie van bepaalde metabolieten door de momenteel gebruikte methoden. Ten vierde zijn de bestaande massaspectrale online databases van ouderionen (MS1) en secundaire ionen (MS2) onvolledig; dit beïnvloedt de juiste identificatie en kwantificering van specifieke metabolieten met behulp van de ruwe LC-MS/MS-gegevens die met behulp van de huidige methoden zijn geproduceerd. Ten vijfde kunnen de bestaande methoden geen enkel type metabolietextractie gebruiken om alle of de meeste klassen van in water oplosbare metabolieten te herstellen. Ten zesde kunnen de bestaande methoden geen enkel type van de LC-kolom gebruiken om alle of de meeste klassen van in water oplosbare metabolieten van elkaar te scheiden.

Hier hebben we de omstandigheden geoptimaliseerd voor het blussen van metabole activiteit in S. cerevisiae-cellen, het handhaven van de meeste in water oplosbare metabolieten in deze cellen vóór extractie en het extraheren van de meeste klassen van in water oplosbare metabolieten uit gistcellen. We ontwikkelden een veelzijdige, robuuste en gevoelige methode voor de op LC-MS/MS gebaseerde identificatie en kwantificering van meer dan 370 in water oplosbare metabolieten geëxtraheerd uit S. cerevisiae-cellen. Deze methode van niet-gerichte metabolomica maakt het mogelijk om de intracellulaire concentraties van verschillende energiedragermoleculen, nucleotiden, aminozuren, monosacchariden, glycolysetussenproducten en tricarbonylcyclustussenproducten te beoordelen. De ontwikkelde LC-MS/MS-methode maakt de identificatie en kwantificering mogelijk van verschillende structurele isomeren en stereo-somerische vormen van in water oplosbare metabolieten met diverse structurele, fysische en chemische eigenschappen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Het maken en steriliseren van een medium voor het kweken van gist

  1. Maak 180 ml van een compleet gistextract met bactopepton (YP) medium. Het volledige YP medium bevat 1% (w/v) gistextract en 2% (w/v) bactopepton.
  2. Verdeel 180 ml van het YP-medium gelijkmatig over vier Erlenmeyers van 250 ml. Elk van deze kolven bevat 45 ml van het YP-medium.
  3. Steriliseer de kolven met YP-medium door autoclaveren bij 15 psi/121 °C gedurende 45 minuten.

2. Wild-type giststam

  1. Gebruik de BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) stam.

3. Groeiende gist in het YP-medium met 2% glucose

  1. Steriliseer een 20% (w/v) stamoplossing van glucose door autoclaveren bij 15 psi/121 °C gedurende 45 minuten.
  2. Voeg 5 ml van de geautoclaveerde 20% (w/v) stamoplossing van glucose toe aan elk van de twee Erlenmeyers met 45 ml van het gesteriliseerde YP-medium. De uiteindelijke concentratie glucose in het YP-medium is 2% (w/v).
  3. Gebruik een microbiologische lus om gistcellen in elk van de twee Erlenmeyers te enten met het YP-medium dat 2% glucose bevat.
  4. Kweek de gistcellen een nacht bij 30 °C in een roterende shaker bij 200 rpm.
  5. Neem een aliquot van gistcultuur. Bepaal het totale aantal gistcellen per ml cultuur. Tel cellen met behulp van een hemocytometer.

4. Celoverdracht naar en cel groeit in het YP-medium met 2% glucose

  1. Voeg 5 ml van de gesteriliseerde 20% (w/v) stamoplossing van glucose toe aan elk van de resterende twee Erlenmeyers met het geautoclaveerde YP-medium. De uiteindelijke glucoseconcentratie is 2% (w/v).
  2. Breng een volume van de nachtelijke gistcultuur in YP-medium met 2% glucose dat het totale aantal van 5,0 x 107 cellen bevat over in elk van de twee Erlenmeyers met het YP-medium dat 2% glucose bevat. Gebruik een steriele pipet voor de celoverdracht.
  3. Kweek de gistcellen gedurende ten minste 24 uur (of langer, indien het experiment dat vereist) bij 30 °C in een roterende shaker bij 200 tpm.

5. Reagentia maken, labware voorbereiden en apparatuur instellen voor het blussen van cellen

  1. Bereid het volgende voor: 1) een blusoplossing (60% hoogwaardige (>99,9%) methanol in 155 mM ammoniumbicarbonaat (ABC) buffer, pH = 8,0); 2) een ijskoude ABC-oplossing (pH = 8,0); 3) een digitale thermometer die tot -20 °C kan meten; 4) 500 ml grote centrifugeflessen; 5) een voorgekoelde hogesnelheidscentrifuge met een voorgekoelde rotor en voorgekoelde centrifugeflessen van 500 ml voor deze rotor, allemaal bij -5 °C; 6) metabolietextractiebuizen (15 ml glazen centrifugebuizen met hoge snelheid met polytetrafluorethyleen beklede doppen); en 7) droogijs.

6. Cel doven

  1. Gebruik een hemocytometer om het aantal gistcellen per ml YP te bepalen met 2% glucosekweek.
  2. Breng een volume van de cultuur in YP-medium met 2% glucose dat het totale aantal van 5,0 x 108 cellen bevat over in voorgekoelde centrifugeflessen van 500 ml.
  3. Vul de centrifugefles met de cellen snel tot een volume van 200 ml met een blusoplossing die is opgeslagen bij -20 °C.
  4. Centrifugeer de flessen in een snelle centrifuge bij 11.325 x g gedurende 3 minuten bij -5 °C.
  5. Snel en teder de fles uit de centrifuge halen; Schroef het deksel voorzichtig los en verwijder het bovennatuurlijk zonder de pellet te verstoren.
  6. Resuspend de celkorrel snel in 10 ml ijskoude ABC-buffer en breng de suspensie over in een 15 ml hoge snelheid glazen centrifugebuis met een met polytetrafluorethyleen beklede dop voor metabolietextractie.
  7. Verzamel cellen door centrifugatie in een klinische centrifuge bij 3.000 x g gedurende 3 minuten bij 0 °C.
  8. Verwijder snel het supernatant en plaats de buis op droogijs om te beginnen met de extractie van metabolieten of bewaar de buis bij -80 °C tot de extractie.

7. Bereiding van reagentia, laboratoriumartikelen en apparatuur voor de extractie van metabolieten

  1. Bereid het volgende voor: 1) LC-MS-kwaliteit chloroform; 2) Methanol van LC-MS-kwaliteit; 3) LC-kwaliteit nano-zuiver water; 4) LC-MS-graad (ACN); 5) glasparels (zuurgewassen, 425-600 μm); 6) een vortex met een schuimbuishouder kit met retainer; 7) 15 ml hoge snelheid glazen centrifugebuizen met polytetrafluorethyleen beklede doppen; 8) MS injectieflacons; 9) droogijs; en 10) buizen van 1,5 ml eenmaal gewassen met ethanol, eenmaal met ACN en eenmaal met nanozuiver water.
    OPMERKING: Gebruik alleen micropipette tips en buizen gemaakt van polypropyleen dat bestand is tegen organische oplosmiddelen.

8. Extractie van metabolieten

  1. Voeg aan de metabolieten die vanaf stap 6.7 op droogijs worden bewaard of bij een buis van -80 °C worden bewaard, het volgende toe: 1) 2 ml chloroform opgeslagen bij -20 °C; 2) 1 ml methanol opgeslagen bij -20 °C; 3) 1 ml ijskoud nanozuiver water; en 4) 200 μL van 425-600 μm zuurgewassen glasparels.
  2. Dek af en sluit de mond van een buis met aluminiumfolie. Plaats buizen in een schuimbuishouderset met houder en vortex ze gedurende 30 minuten op gemiddelde snelheid (d.w.z. met een snelheid die is ingesteld op 6, waarbij 12 de maximale snelheid van een vortex is) bij 4 °C om de extractie van metabolieten te vergemakkelijken.
  3. Incubeer de buis gedurende 15 minuten op ijs (GEEN droogijs!) om eiwitneerslag en de scheiding van het bovenste waterige van de onderste organische fase te bevorderen.
  4. Centrifugeer de buis in een klinische centrifuge bij 3.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Deze centrifugatiestap maakt het mogelijk om de bovenste waterige fase (die in water oplosbare metabolieten bevat) te scheiden van de middelste laag (die celresten en eiwitten bevat) en van de onderste organische fase (die voornamelijk lipiden bevat).
  5. Gebruik een micropipette om de bovenste waterige fase (400 μL) over te brengen naar een gewassen en gelabelde buis van 1,5 ml met 800 μL ACN die werd bewaard bij -20 °C.
    OPMERKING: Er zal witte wolkenneerslag zijn na het toevoegen van de bovenste waterige fase aan ACN, die op -20 °C wordt gehouden.
  6. Centrifugeer de buis met het monster in een tafelcentrifuge bij 13.400 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
    OPMERKING: De witte wolkenneerslag verdwijnt na centrifugeren.
  7. Breng 800 μL over van het bovenste gedeelte van een vloeistof in de buis naar een gelabelde MS-injectieflacon. Bewaar het monster bij 0 °C totdat het wordt geanalyseerd met LC-MS/MS.

9. Voorbereiding van reagentia, labware en apparatuur voor LC

  1. Bereid het volgende voor: 1) een vortex; 2) een ultrasone sonicator; 3) MS glazen injectieflacons; 4) een LC-systeem uitgerust met een binaire pomp, ontgasser en autosampler; 5) een zwitterionische fasechromatografiekolom (5 μm polymeer, 150 x 2,1 mm) genoemd in de tabel met materialen; 6) een kolomverwarming; en 7) mobiele fasen, waaronder fase A (5:95 ACN:water (v/v) met 20 mM ammoniumacetaat, pH = 8,0) en fase B (100% ACN).

10. Scheiding van geëxtraheerde metabolieten door LC

  1. Onderwerp de inhoud van de MS-injectieflacon gedurende 15 minuten aan ultrasone ultrasoonapparaat.
  2. Vortex de MS injectieflacon 3x gedurende 10 sec bij kamertemperatuur (RT).
  3. Plaats de MS injectieflacon in de putplaat.
  4. Houd tijdens de chromatograaf de kolom op 45 °C en een debiet van 0,250 ml/min. Bewaar het monster in de putplaat bij 0 °C. Raadpleeg tabel 1 voor de LC-gradiënten die tijdens chromatografie moeten worden gebruikt.
    OPMERKING: Een representatief totaal ionchromatogram van in water oplosbare metabolieten die zijn geëxtraheerd uit cellen van de wildtype stam BY4742 is weergegeven in figuur 1. De metabolieten gescheiden door LC werden geïdentificeerd en gekwantificeerd door massaspectrometrische analyse die werd uitgevoerd in positieve ionisatie [ESI (+)] modus, zoals beschreven voor stap 11.

11. Massaspectrometrische analyse van metabolieten gescheiden door LC

  1. Gebruik een massaspectrometer uitgerust met verwarmde elektrospray-ionisatie (HESI) voor de identificatie en kwantificering van in water oplosbare metabolieten die werden gescheiden door LC. Gebruik de analyser van de massaspectrometer voor MS1-ionen en de detector van de massaspectrometer voor MS2-ionen. Gebruik de instellingen in tabel 2 en tabel 3 voor de gegevensafhankelijke acquisitie van respectievelijk MS1- en MS2-ionen.
  2. Gebruik een monstervolume van 10 μL voor de injectie in zowel de ESI-modus (+) als de ESI-modus (-).

12. Identificatie en kwantificering van verschillende metabolieten door de verwerking van ruwe gegevens van LC-MS/MS

  1. Gebruik de software die wordt genoemd in de Tabel met materialen om de identificatie en kwantificering van verschillende in water oplosbare metabolieten uit ruwe LC-MS /MS-bestanden uit te voeren. Deze software gebruikt MS1 voor metabolietkwantificering en MS2 voor metabolietidentificatie. De software maakt gebruik van de meest uitgebreid samengestelde massaspectrale fragmentatiebibliotheek om de metabolieten te annoteren met behulp van de ruwe gegevens van LC-MS / MS door MS-spectra te matchen. Deze software maakt ook gebruik van de exacte massa van MS1 en isotopenpatroon match om metabolieten te annoteren met behulp van online databases. Zie figuur 2 voor meer informatie.
  2. Gebruik de bibliotheek van databases en spectra, die vrij online beschikbaar is (https://www.mzcloud.org), om te zoeken naar MS2-spectra van de onbewerkte gegevens.

13. Membraanintegriteitstest door propidiumjodide (PI) kleuring en fluorescentiemicroscopie

  1. Nadat de cel is geblust zoals beschreven voor stap 6, wast u de gebluste cellen grondig met 15 ml ABC-buffer om de blusoplossing te verwijderen. Verzamel cellen door centrifugeren bij 3.000 x g gedurende 5 minuten bij 0 °C.
  2. Resuspend de celkorrel in 1 ml ABC-buffer en voeg 0,5 ml van de PI-oplossing (0,5 mg/ml) toe.
  3. Vortex een buis met het monster 3x gedurende 10 s en incubeer het gedurende 10 minuten in het donker en op ijs.
  4. Centrifugeer de buis met het monster in een tafelcentrifuge bij 13.400 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  5. Verwijder het supernatant en suspens de pellet in 1 ml ABC-buffer.
  6. Centrifugeer de buis bij 13.400 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatant. Herhaal deze stap nog 2 keer om de PI te verwijderen die aan het celoppervlak is gebonden.
  7. Resuspend de pellet in 300 μL ABC-buffer. Plaats 10 μL van de suspensie op het oppervlak van een microscoopglaasje.
  8. Leg de differentiële interferentiecontrast (DIC) en fluorescentiemicroscopiebeelden vast met een fluorescentiemicroscoop. Gebruik een filter dat is ingesteld op de excitatie- en emissiegolflengten van respectievelijk 593 nm en 636 nm.
  9. Gebruik een software om het totale celnummer (in de DIC-modus) en het aantal fluorescerend gekleurde cellen te tellen. Gebruik deze software ook om de intensiteit van kleuring voor individuele cellen te bepalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Om een kwantitatieve beoordeling van in water oplosbare metabolieten in een gistcel te verbeteren, hebben we de omstandigheden van celuitroeiing geoptimaliseerd voor metabolietdetectie. Cel doven voor dit doel omvat een snelle arrestatie van alle enzymatische reacties binnen een cel31,33,37,38. Een dergelijke stopzetting van cellulaire metabole activiteit is een essentiële stap van elke methode voor de kwantificering van in water oplosbare metabolieten in vivo, omdat het de onderschatting van hun intracellulaire concentratiesvoorkomt 31,33,37,38. Celblussing voor metabolietbeoordeling schaadt altijd de integriteit van het plasmamembraan (PM) (en van de celwand (CW), indien aanwezig); dit veroorzaakt metabolietlekkage uit de cel31,33,37,38. De methode maakt gebruik van celblussende omstandigheden die een dergelijke aantasting minimaliseren, waardoor de quenching-geassocieerde cellekkage van intracellulaire metabolieten aanzienlijk wordt verminderd. De meeste huidige methoden voor het blussen van cellen omvatten immers het gebruik van een bepaalde concentratie methanol (d.w.z. 40% (v/v), 60% (v/v), 80% (v/v) of 100% (v/v)) bij specifieke temperatuur (d.w.z. -20 °C, -40 °C of -60 °C), met of zonder buffer31,33,37,38. We vergeleken de efficiëntie van de PM- en CW-stoornis voor een van de momenteel gebruikte celblusmethodes (d.w.z. door celbehandeling met 80% (v/v) methanol bij -40 °C bij afwezigheid van een buffer38) met die voor de gemodificeerde celblusmethode (d.w.z. door celbehandeling met 60% (v/v) methanol bij -20 °C in aanwezigheid van een isotone gebufferde oplossing van ABC bij pH = 8,0). PI is een fluorescerende kleurstof die ondoordringbaar is voor intacte cellen; het kan alleen de cel binnengaan als de integriteit van de PM (en van de CW, indien aanwezig) is aangetast39. Bovendien stijgt de intensiteit van fluorescentie-emissie door PI met 30-voudig wanneer het is gebonden aan DNA of RNA39. Zo kan een PI-kleuringstest worden gebruikt voor het beoordelen van de efficiëntie van het blussen van geassocieerde cellekkage van intracellulaire metabolieten, omdat deze metabolieten alleen in de extracellulaire ruimte kunnen lekken als de PM en CW van een gistcel zijn beschadigd39. We ontdekten dat de gemodificeerde celblusmethode significant minder schade aan de PM en CW veroorzaakt dan de blusmethode door celbehandeling met niet-gebufferde 80% (v / v) methanol bij -40 ° C (figuur 3). Inderdaad, bijna alle cellen die met behulp van de methode werden geblust, vertoonden rode fluorescentie-emissie, wat kenmerkend is voor de gistcellen waarvan pm en CW niet zijn beschadigd(figuur 3). Daarentegen vertoonden bijna alle cellen die met behulp van de andere methode werden geblust, groene fluorescentie-emissiekarakteristiek van de gistcellen waarvan pm en CW aanzienlijk beschadigd zijn(figuur 3). De meest intense rode fluorescentie werd omgezet in groene fluorescentie door een software om onderscheid te maken tussen de sterke rode fluorescentie en milde rode fluorescentie-emissies.

De gemodificeerde celblusmethode veroorzaakte significant minder lekkage van in water oplosbare metabolieten uit gistcellen dan de - blusmethode door celbehandeling met niet-gebufferde 80% (v/v) methanol bij -40 °C. We onderwierpen evenveel gistcellen aan doven met behulp van de methode (d.w.z. door celbehandeling met 60% (v/v) methanol bij -20 °C in aanwezigheid van een isotone gebufferde oplossing van ABC bij pH = 8,0; Figuur 4) of de andere methode (d.w.z. door celbehandeling met niet-gebufferde 80% (v/v) methanol bij -40 °C; Figuur 5). De mate van quenching-geassocieerde cellekkage in de extracellulaire oplossing werd beoordeeld op specifieke in water oplosbare metabolieten met behulp van LC-MS/MS. De concentraties van verschillende aminozuurklassen (d.w.z. grote en kleine zure, basische, neutraal-niet-polaire en neutrale polaire aminozuren) in de extracellulaire oplossing werden gemeten voor en na het blussen van de cel. We ontdekten dat de celblusmethode significant minder lekkage van al deze aminozuurklassen in de extracellulaire oplossing veroorzaakt (figuur 4) dan de andere methode (figuur 5).

De LC-MS/MS-methode voor een kwantitatieve beoordeling van in water oplosbare metabolieten in een gistcel maakt gebruik van één type kolom voor chromatografische scheiding van alle in water oplosbare metabolietklassen. Deze kolom is de zwitterionische fasekolom die wordt genoemd in Tabel van materialen. We ontdekten dat deze kolom een veel efficiëntere scheiding van verschillende klassen van in water oplosbare metabolieten biedt dan de kolom met omgekeerde fasen die wordt genoemd in de tabel met materialen (aanvullende tabel 1). Inderdaad, de retentietijd (RT) verschuivingswaarden van in water oplosbare metabolietstandaarden (d.w.z. NAD +, AMP, GMP, arginine en glutaminezuur) waren significant lager en de piekvormen waren aanzienlijk scherper voor de zwitterionische fasekolom, in vergelijking met de kolom met omgekeerde fase(aanvullende tabel 1). LC-omstandigheden die worden gebruikt voor chromatografische scheiding van alle metabolieten (d.w.z. in water oplosbaar en in water onoplosbaar) voor de kolom met omgekeerde fase zijn opgenomen in aanvullende tabel 2.

Een ander voordeel van de LC-MS/MS-methode bestaat uit het vermogen van chromatografische scheiding op de bovenstaande zwitterionische fasekolom om verschillende in water oplosbare metabolieten met diverse structurele, fysische en chemische eigenschappen efficiënt van elkaar te scheiden. Deze in water oplosbare metabolieten omvatten de volgende metabolietklassen: 1) zure, basische, neutrale polaire en niet-neutrale polaire aminozuren, met inbegrip van hun verschillende structurele isomeren(figuur 6); 2) stabiele en onstabiele nucleotiden en hun derivaten die vitale functies in een cel vervullen (figuur 7); en 3) verschillende monosachariden, waaronder hun verschillende stereo-somerische vormen(figuur 8).

Belangrijk is dat de LC-MS/MS-methode voor een kwantitatieve beoordeling van in water oplosbare metabolieten in een gistcel veelzijdig en robuust was. Het stelde ons in staat om 374 in water oplosbare metabolieten met diverse structurele, fysische en chemische eigenschappen in S. cerevisiae-cellen te identificeren en te kwantificeren die werden gekweekt in het volledige YP-medium dat aanvankelijk 2% glucose bevat(aanvullende tabel 3). 240 metabolieten werden gedetecteerd in de positieve ionisatiemodus en 134 metabolieten werden gedetecteerd in de negatieve ionisatiemodus. De identiteit van al deze in water oplosbare metabolieten werd bevestigd door hun data-afhankelijke acquisitie (DDA) MS2-fragmenten die zowel in de positieve als negatieve ionisatiemodi werden verkregen, te matchen met de MS2 mzCloud spectrale bibliotheek. Deze online bibliotheek bevat de spectra van metabolietstandaarden die verschillen in hun MS1- en DDA MS2-parameters. Om de mate van matching van de MS2-spectra van het monster met de online spectrale bibliotheek te maximaliseren, gebruikten we verschillende DDA MS2-parameters. Deze parameters zijn opgenomen in aanvullende tabel 4. Bijna 6.000 kenmerken (vermeende metabolieten) voor hetzelfde monster werden verkregen met behulp van de high-energy-induced-collision-dissociation (HCD) of collision-induced dissociation (CID) fragmentatiemethode, met behulp van top 5 MS2-gebeurtenissen, 35 botsingsenergiewaarden en activeringstijden van 10 ms. Na het filteren van de resulterende bestanden met > 95% MS2-matching en > 90% MS1 isotopische patroonmatchingcriteria, werden slechts 162 metabolieten onder HCD-gefragmenteerde conditie en 142 metabolieten onder CID-gefragmenteerde toestand geïdentificeerd. 81 van de 162 metabolieten waren uniek voor de HCD-fragmentatiemethode, terwijl 42 van de 142 uniek waren voor de CID-fragmentatiemethode (zie een blad met de naam "T5_35E__10 ms_HCD vs CID" in aanvullende tabel 4). Daarom concludeerden we dat de juiste annotatie van in water oplosbare metabolieten met behulp van de LC-MS /MS-methode het gebruik van veel verschillende DDA MS2-parameters vereist.

Ook de LC-MS/MS methode is zeer gevoelig. Het maakt het mogelijk om sommige in water oplosbare metabolieten te identificeren en te kwantificeren bij concentraties zo laag als 0,05 pmol/μL (zie gegevens voor fenylalanine in tabel 4). Deze kwantificeringsgrens varieert binnen een breed scala van concentraties voor verschillende metabolietklassen(tabel 4).

Het hier gebruikte MS-systeem heeft een breed (ten minste twee ordes van grootte) lineair dynamisch bereik voor het meten van de concentraties van verschillende metabolieten(aanvullende tabel 5).

Figure 1
Figuur 1: Het totale ionchromatogram (TIC) uit vloeistofchromatografie/massaspectrometrie (LC-MS) gegevens van in water oplosbare metabolieten die werden geëxtraheerd uit cellen van de wildtype stam BY4742. De metabolieten werden gescheiden door LC op de zwitterionische fasechromatografiekolom genoemd in de Tabel van Materialen. De metabolieten werden gedetecteerd door MS van ouderionen (MS1) die werden gemaakt met behulp van de positieve elektrospray-ionisatiemodus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Een workflow die wordt gebruikt voor de analyse van in water oplosbare metabolieten met behulp van de software die wordt genoemd in de tabel met materialen. Alle parameters werden automatisch gecorrigeerd door de software op basis van de ruwe MS-gegevens, behalve de volgende: 1) tabblad "Detect Compounds": set min, piekintensiteit 10.000; en 2) tabblad "Search ChemSpider": 4 online databases werden geselecteerd voor de identificatie van metabolieten, waaronder de BioCyc, Human Metabolome Database, KEGG en Yeast Metabolome Database. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Differentieel interferentiecontrast (DIC; bovenste rij) en fluorescentie (onderste rij) microscopische beelden van gistcellen geblust met ammoniumbicarbonaat (ABC) buffer (pH = 8,0; controle) of met een andere blusoplossing. Na het blussen van cellen werden evenveel cellen geïncubeerd met de PI-oplossing gedurende 10 minuten in het donker en op ijs. De meest intense rode fluorescentie werd door software omgezet in groene fluorescentie om onderscheid te maken tussen de sterke rode fluorescentie en milde rode fluorescentie-emissies. De efficiëntie van schade aan de PM en CW werd vergeleken voor de methode van celblussen (d.w.z. door celbehandeling met 60% (v/v) methanol bij -20 °C in aanwezigheid van een isotone gebufferde oplossing van ABC bij pH = 8,0) en een van de momenteel gebruikte methoden (d.w.z. door celbehandeling met 80% (v/v) methanol bij -40 °C bij afwezigheid van een buffer). Er wordt een schaalbalk weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Het lekkagepercentage van verschillende aminozuurklassen voor de methode van celblussing. 5,0 x 108 van de gistcellen werden geblust door de behandeling met 60% (v/v) methanol bij -20 °C in aanwezigheid van een isotone gebufferde oplossing van ABC bij pH = 8,0. Het lekkagepercentage van verschillende aminozuurklassen werd beoordeeld met behulp van LC-MS/MS om hun concentraties in de extracellulaire oplossing voor en na het blussen te meten. De gemiddelde waarden ± SD en individuele gegevenspunten worden weergegeven (n = 3). * p < 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Het lekkagepercentage van verschillende aminozuurklassen voor een van de momenteel gebruikte celblusmethoden. 5,0 x 108 van de gistcellen werden door de behandeling met 80% (v/v) methanol bij -40 °C geblust bij afwezigheid van een buffer. Het lekkagepercentage van verschillende aminozuurklassen werd beoordeeld met behulp van LC-MS/MS om hun concentraties in de extracellulaire oplossing voor en na het blussen te meten. De gemiddelde waarden ± SD en individuele gegevenspunten worden weergegeven (n = 3). * p < 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Efficiënte chromatografische scheiding van zure, basische, neutrale polaire en niet-neutrale polaire aminozuurklassen, met inbegrip van twee structurele isomeren (d.w.z. leucine en isoleucine), op de zwitterionische fasekolom genoemd in de Tabel der Materialen. Al deze aminozuren werden gedetecteerd door MS/MS in de positieve ionisatie [ESI (+)] modus. De omstandigheden voor LC op de zwitterionische-fasechromatografiekolom zijn beschreven in tabel 1. De voorwaarden voor ms/ms zijn beschreven in tabel 2 en tabel 3. Alle aminozuurstandaarden worden commercieel gekocht (bijv. Sigma). De retentietijdverschuivingen tussen 3 onafhankelijke chromatografieruns zijn minder dan ± 10 seconden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Efficiënte chromatografische scheiding van verschillende klassen van nucleotiden, waaronder energetisch onstabiele nucleotiden (nucleosidemonofosfaten, nucleosidedifosfaten en nucleosidetrifosfaten) en elektronendragermoleculen (NADH en NAD+), op de zwitterionische fasekolomgenoemd in de Tabel vanMaterialen. Al deze nucleotiden werden gedetecteerd door MS/MS in de positieve ionisatie [ESI (+)] modus. De omstandigheden voor LC op de zwitterionische-fasechromatografiekolom zijn beschreven in tabel 1. De voorwaarden voor ms/ms zijn beschreven in tabel 2 en tabel 3. Alle nucleotidestandaarden worden commercieel gekocht (bijv. Sigma). De retentietijdverschuivingen tussen 3 onafhankelijke chromatografieruns zijn minder dan ± 10 seconden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 8
Figuur 8: Efficiënte chromatografische scheiding van verschillende klassen van monosachariden, waaronder structurele isomeren en stereo-somerische vormen van aldo- en ketohexosen (fructose, mannose en galactose) en aldopentosen (ribose en arabinose), op de zwitterionische fasekolomgenoemd in de Tabel vanMaterialen. Al deze monosacchariden werden gedetecteerd door MS /MS in de positieve ionisatie [ESI (+)] modus. De omstandigheden voor LC op de zwitterionische-fasechromatografiekolom zijn beschreven in tabel 1. De voorwaarden voor ms/ms zijn beschreven in tabel 2 en tabel 3. Alle monosaccharide standaarden worden commercieel gekocht (bijv. Sigma). De retentietijdverschuivingen tussen 3 onafhankelijke chromatografieruns zijn minder dan ± 10 seconden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Kolomtype SeQuant ZIC-pHILIC 5μm polymeer 150 x 2.1 mm
Oplosmiddel A LC-MS kwaliteit H2O: ACN (95:5, v/v) 20 mM Ammoniumacetaat
Oplosmiddel B Acetonitril van LC-MS-kwaliteit (ACN)
Druklimiet Maximaal = 300 bar Minimum = 0
HPLC gradiënt programma
Tijd (minuten) Debiet (0,25 ml/min) Composities
A% B%
0.5 0.25 5 95
26 0.25 40 60
30 0.25 70 30
31 0.25 70 30
31.1 0.4 5 95
43.9 0.4 5 95
44 0.25 5 95
45 0.25 5 95

Tabel 1: LC-conditie gebruikt voor de scheiding van in water oplosbare metabolieten met behulp van de zwitterionische fasekolomgenoemd in de Tabel van Materialen. Deze voorwaarden werden gebruikt in alle hier beschreven experimenten.

Volledig scan massabereik (Dalton) 70-900
FTMS (Orbitrap analyzer) volledige scanresolutie 6,0 x 104
FTMS (Orbitrap analyzer) HCD resolutie 7500
FTMS volledige scan AGC-doel 1,0 x 106
FTMS MSn AGC-doel 5,0 x 104
Ionenvanger (LTQ) MSn AGC-doel 1,0 x 104
Ion bron type Verwarmde Electrospray Ionisatie
Capillaire temperatuur (°C) 275
Bronverwarming Temperatuur (°C) 250
Schede gasstroom 10
Aux Gas stroom 5

Tabel 2: De massaspectrometerinstellingen die worden gebruikt om metabolieten te analyseren die werden gescheiden door LC. Deze voorwaarden werden gebruikt voor de analyse van metabolieten in alle hier beschreven experimenten. Afkortingen: FTMS = Fourier transform (FTMS); HCD = high-energy-induced-collision-dissociation; LTQ = lineaire valviervoeter; AGC = automatische versterkingsregeling, een ionenpopulatiewaarde voor MS en MS/MS.

Polariteit van het instrument Positief/Negatief
Type activering CID/HCD
Min. signaal vereist 5000
Isolatie breedte 2
Genormaliseerde botsingsenergieën voor CID 35, 60
Genormaliseerde botsingsenergieën voor HCD 35, 45, 55
Standaard kostenstatus 1
Activeringstijd voor CID (ms) 10, 30
Activeringstijd voor HCD (ms) 10
Aantal ms/ms-gebeurtenissen in de CID Top 3, Top 5, Top 10
Aantal MS/MS-gebeurtenissen in HCD Top 5
Aantal microscans gebruikt in zowel HCD als CID 1

Tabel 3: De instellingen van de massaspectrometer die worden gebruikt om secundaire ionen te detecteren (MS2). Afkortingen: HCD = high-energy-induced-collision-dissociation; CID = collision induced dissociation; ms = milliseconden.

Soa-metabolieten M.W. (g/mol) [M+H]+1 [M-H]-1 Detectiemodus Laagste gedetecteerde concentratie (pmol/μL)
Glycine 75.03203 76.03931 74.02475 P 7,43E+00
Tryptofaan 204.08988 205.09716 203.0826 P 5,56e-02
Fenylalanine 165.07898 166.08626 164.0717 P 5,14e-02
arginine 174.11168 175.11896 173.1044 P 7,14e-02
threonine* 119.05824 120.06552 118.05096 P
Serine 105.04259 106.04987 104.03531 P 4,66E+00
Glutamaat 147.05316 148.06044 146.04588 P 4,20e-01
methionine 149.05105 150.05833 148.04377 P 1,96e+00
aspartaat 133.03751 134.04479 132.03023 P 3,75E+00
Valine 117.07898 118.08626 116.0717 P 1,49E+00
Isoleucine 131.09463 132.10191 130.08735 P 1,84e+00
Leucine 131.09463 132.10191 130.08735 P 2,26e+00
Histidine 155.06948 156.07676 154.0622 P 2,53E+00
Tyrosine 181.07389 182.08117 180.06661 P 8,72e-02
lysine 146.10553 147.11281 145.09825 P 1,43e-01
Alanine 89.04768 90.05496 88.0404 P 1,12e+00
Proline 115.06333 116.07061 114.05605 P 1,05E+00
Cysteïne 121.01975 122.02703 120.01247 P 8,22e-01
asparagine 132.05349 133.06077 131.04621 P 1,08e+00
Glutamine 146.06914 147.07642 145.06186 P 1,92E+00
Guanine 151.04941 152.05669 150.04213 P 5,47E+00
Guanosine 283.09167 284.09895 282.08439 P 3,67e-01
Gmp 363.058 364.06528 362.05072 P 7,17e-01
BBP 443.02434 444.03162 442.01706 P 2,57E+00
Gtp 522.99067 523.99795 521.98339 P 2,27e+00
AMP 347.06309 348.07037 346.05581 P 5,25e-01
ADP 427.02942 428.0367 426.02214 P 1,32e+00
ATP 506.99575 508.00303 505.98847 P 1,77e+00
Nadh 665.12478 666.13206 664.1175 P 1,47e+00
Nad+ 663.10912 664.1164 662.10184 P 3,03E+00
glucose** 180.06339 181.07067 179.05611
fructose*** 180.06339 181.07067 179.05611 N 5,67e-01
mannose*** 180.06339 181.07067 179.05611 N 1,05E+00
galactose*** 180.06339 181.07067 179.05611 N 9.00e-01
ribose*** 150.05283 151.06011 149.04555 N 1,10E+00
arabinose*** 150.05283 151.06011 149.04555 N 1,23e+00
fructose-6-fosfaat*** 260.02972 261.037 259.02244 N 6,60E+00
glucose-6-fosfaat*** 260.02972 261.037 259.02244 N 4,27E+00
citroenzuur 192.12 gr 193.034279 191.019726 N 9,33e-01
appelzuur 134.09 135.0288 133.014247 N 1,23e+00
pyruvinezuur 88.06 89.02332 87.008768 N 2,77e+00

Tabel 4:De laagste concentraties van verschillende in water oplosbare metabolietnormen die de LC-MS/MS-methode kan identificeren en kwantificeren. Het MS1-piekgebied van elke metabolietstandaard werd gebruikt om de laagste kwantificeerbare concentratie voor deze metaboliet te schatten. Gemiddelde waarden van twee onafhankelijke experimenten worden getoond. Drie technische replicaties werden uitgevoerd voor elk van de twee onafhankelijke experimenten. OPMERKING: Threonine* kan worden gedetecteerd, maar kan niet worden gekwantificeerd vanwege de co-elutie met homoserine, een chemisch isomeer van threonine. Glucose** kan niet worden geïdentificeerd omdat het meerdere chromatografiepieken veroorzaakt. Metabolietnormen*** kunnen alleen in individuele monsters worden geïdentificeerd en gekwantificeerd, maar niet in een mengsel van metabolietnormen of een biologisch mengsel van metabolieten.

Aanvullende tabel 1: Retentietijd (RT) verschuift waarden van dezelfde set metabolieten voor de zwitterionische fase en omgekeerde fase kolommen (zie Tabel van materialen) na kolom equilibratie. De tabel vergelijkt de retentiereproduceerbaarheid van de zwitterionische fase- en omgekeerde fasekolommen voor een afzonderlijke reeks metabolieten die van elkaar verschillen in hun hydrofilie en hydrofobiciteit. Deze metabolieten werden geïdentificeerd met behulp van LC-MS/MS. Merk op dat de RT-verschuivingswaarden van hydrofiele metabolieten (d.w.z. NAD+, AMP, GMP, arginine en glutaminezuur) significant lager zijn en dat de piekvormen aanzienlijk scherper zijn voor de zwitterionische fasekolom, in vergelijking met de omgekeerde fasekolom. Daarentegen zijn de RT-verschuivingswaarden van hydrofobe metabolieten (d.w.z. stearinezuur, laurinezuur en decanoïnezuur) aanzienlijk lager en zijn de piekvormen aanzienlijk scherper voor de kolom met de omgekeerde fase, in vergelijking met de zwitterionische fasekolom. De voorwaarden voor de chromatografische scheiding van metabolieten met behulp van de zwitterionische fase en omgekeerde fasekolommen worden beschreven in respectievelijk tabel 1 en aanvullende tabel 2. De hier gerapporteerde RT-ploegwaarden zijn gebaseerd op de meting van 20 verschillende monsters genomen uit verschillende injectieflacons. De monsters werden geanalyseerd na kolom equilibratie. De metabolieten in elk monster werden geëxtraheerd uit 5,0 × 108 gistcellen. RT-ploegwaarden zijn de gemiddelden van 20 verschillende monsters (n = 20). De p-waarden afgeleid van de ongepaarde t-test werden gebruikt om de twee kolommen te vergelijken met de gelijke variantie tussen beide monstertypen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel 2: LC-voorwaarden voor de kolom reverse-fase 8 genoemd in de tabel met materialen en gebruikt om verschillende metabolieten in dit onderzoek te scheiden. Kolomeigenschappen waren als volgt: 150 x 2,1 mm, 5 μm polymeer. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel 3: Een lijst van alle 374 in water oplosbare metabolieten die zijn teruggewonnen en geannoteerd met behulp van de LC-MS/MS-methode. Alle metabolieten werden teruggevonden uit dezelfde LC-gradiëntrun, onderworpen aan een data-dependent acquisition (DDA) fragmentatiealgoritme beschreven in Supplemental Table 4en geannoteerd met behulp van de software die wordt genoemd in Table of Materials. De MS1-piekvormen van 211 metabolieten (waarvan de status in de tabel als blanco wordt aangegeven) waren geschikt om te worden gebruikt voor kwantificering en hun respectieve MS2-spectra hadden volledige overeenkomsten met de mzCloud-spectrale bibliotheek. MS2-spectra van 38 metabolieten (waarvan de status in de tabel wordt aangegeven als een d) hadden volledige overeenkomsten met de online spectrale bibliotheek. Toch waren hun MS1-piekvormen niet geschikt om te worden gebruikt voor kwantificering. MS2-spectra van 125 metabolieten (waarvan de status in de tabel wordt aangegeven als een n) hadden geen volledige overeenkomsten met de online spectrale bibliotheek. Deze metabolieten werden als volgt geannoteerd: 1) met behulp van het "Predict composition node" (dat metabolieten annoteert op basis van de exacte match van MS1-waarden, het aantal gematchte en gemiste isotopen en de isotoop % intensiteit die overeenkomt met die van de theoretische referentiestandaarden); 2) met behulp van de "ChemSpider node" (die metabolieten annoteert op basis van de exacte match van MS1 waarden en gelijkenis match score van MS2 spectra met de online spectrale bibliotheek); en 3) het gebruik van de retentietijd (RT) verschuivingswaarden van metabolieten (deze waarden zijn afhankelijk van de fysische structuur en chemische eigenschappen van metabolieten). De metabolieten in de tabel werden gevonden in alle 3 uitgevoerde biologische replicaties, met de RT-shiftwaarden van < 0,2 min. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel 4: Een data-dependent acquisition (DDA) fragmentatiealgoritme dat hier werd gebruikt voor de annotatie van in water oplosbare metabolieten met behulp van de software die wordt genoemd in Table of Materials. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel 5: Een typisch lineair dynamisch bereik dat we waarnamen toen we de concentraties van verschillende aminozuren maten met behulp van het MS-systeem dat wordt genoemd in de tabel met materialen. Het MS-systeem dat hier wordt gebruikt, heeft een breed (ten minste twee ordes van grootte) lineair dynamisch bereik voor het meten van de concentraties van verschillende metabolieten. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Om het hier beschreven protocol met succes te gebruiken, volgt u de hieronder beschreven preventieve maatregelen. Chloroform en methanol extraheren verschillende stoffen uit laboratoriumplastic. Ga er daarom voorzichtig mee om. Vermijd het gebruik van kunststoffen in stappen waarbij contact wordt gemaakt met een van deze twee organische oplosmiddelen. Gebruik borosilicaat glazen pipetten voor deze stappen. Verrijs deze pipetten voor gebruik met chloroform en methanol. Gebruik alleen micropipette tips en buizen gemaakt van polypropyleen dat bestand is tegen organische oplosmiddelen. Verwijder tijdens de monstervoorbereiding voor LC-MS/MS alle luchtbellen in de glazen injectieflacons voordat u ze in een putplaat plaatst.

De zwitterionische fasekolom die hier wordt gebruikt, vereist na elke run uitgebreide herconditionering om de RT-verschuiving te minimaliseren. Voor het opnieuw conditioneren van kolommen raden we aan een volume van de herconditioneringsoplossing te gebruiken dat ongeveer 20 volumes van de kolom is. De kolom moet opnieuw worden geconditioneerd met de initiële mobiele fase gedurende 15 minuten bij een verhoogd debiet van 0,4 ml / min. Om schade aan de kolom tijdens de herconditionering te voorkomen, houdt u de kolomdruk onder de door de fabrikant aanbevolen bovengrens van de druk.

Van belang is dat sommige chromatografiekolommen met gemengde scheiding die in de omgekeerde fasemodus werken, de resolutie van geladenmetabolieten 40,41 mogelijkmaken. Deze kolommen met gemengde scheiding zijn gebaseerd op de kolom met omgekeerde fase die hier wordt gebruikt (zie tabel met materialen)en bevatten polaire ingebedde groepen die metabolieten kunnen scheiden op basis van lading40,41.

Hier beschreven we een op LC-MS /MS gebaseerde methode van niet-gerichte metabolomica voor de kwantitatieve analyse van veel in water oplosbare metabolieten geëxtraheerd uit gistcellen. De methode biedt verschillende voordelen ten opzichte van de LC-MS/MS-methoden van niet-gerichte metabolomica die momenteel voor dit doel worden gebruikt. Deze voordelen omvatten het volgende. Ten eerste is de methode gevoelig en maakt het de identificatie en kwantificering van sommige in water oplosbare metabolieten mogelijk bij concentraties zo laag als 0,05 pmol / μL. De gerapporteerde gevoeligheid van de bestaande LC-MS/MS-methoden is lagerdan 3,22,27,42. Ten tweede maakt de methode gebruik van een celblussende procedure die een significant lagere lekkage van intracellulaire metabolieten uit de cel oplokt dan die gerapporteerd voor de momenteel gebruikte procedures31,33,38. De procedure die we hebben ontwikkeld voor het blussen van cellen verlaagt dus de mate waarin de momenteel gebruikte procedures de intracellulaire concentraties van in water oplosbare metabolieten onderschatten. Ten derde maakt de methode, in tegenstelling tot de bestaande LC-MS/MS-methoden2,31,33,onderscheid tussen verschillende structurele isomeren en stereo-somerische vormen van veel metabolieten. Deze metabolieten omvatten verschillende energiedragermoleculen, nucleotiden, aminozuren, monosacchariden, tussenproducten van glycolyse en tricarbonische cyclustussenproducten. Ten vierde hebben we de methode gebruikt om een uitgebreide massaspectrale database van MS1 en MS2 te creëren voor de juiste identificatie en kwantificering van een breed scala aan specifieke metabolieten met behulp van de ruwe LC-MS / MS-gegevens. Daarentegen zijn de bestaande massaspectrale online databases van MS1 en MS2 onvolledig43,44,45. Ten vijfde maakt de methode gebruik van een enkel type metabolietextractie om in water oplosbare metabolieten met diverse structurele, fysische en chemische eigenschappen te herstellen. De diversiteit van deze metabolieten overtreft aanzienlijk die van alternatieve methoden voor een eenstapsextractie van in water oplosbare metabolieten uit gistcellen3,22,27,46. Zes, in tegenstelling tot de bestaande LC-MS /MS-methoden3,22,47,48, gebruikt de methode een enkel type van de LC-kolom om verschillende structurele en functionele klassen van in water oplosbare metabolieten van elkaar te scheiden. Ten zevende maakt de methode de identificatie en kwantificering mogelijk van meer dan 370 in water oplosbare metabolieten geëxtraheerd uit gistcellen. Dit aantal identificeerbare en kwantificeerbare metabolieten overtreft het aantal metabolieten dat is gerapporteerd voor andere methoden van niet-gerichte metabolomica in gist3,22,27,49,50.

De methode heeft verschillende beperkingen. Deze beperkingen zijn als volgt. De zwitterionische fasekolom die wordt gebruikt voor metabolietscheiding door LC vereist uitgebreide herconditionering na elke run. Bovendien is de methode alleen efficiënt voor de niet-gerichte metabolomica van in water oplosbare, hydrofiele metabolieten. Bovendien kunnen verschillende isomere vormen van koolhydraten (waaronder isomeren van fructose, glucose en galactose) niet worden gekwantificeerd met behulp van de methode. Dit komt omdat de zwitterionische fasekolom die in de methode wordt gebruikt, deze koolhydraatisomeren niet van elkaar kan scheiden wanneer ze aanwezig zijn in een mengsel met andere metabolieten. Bovendien kan de methode niet worden gebruikt voor het identificeren van glucose, omdat dit koolhydraat meerdere pieken creëert tijdens chromatografie op de zwitterionische fasekolom die in de methode wordt gebruikt. Ten slotte kan threonine niet worden gekwantificeerd met behulp van de methode vanwege de co-elutie van dit aminozuur met zijn isomeer homoserine tijdens metabolietscheiding door chromatografie.

We gebruiken deze LC-MS/MS-methode om verouderingsgerelateerde veranderingen in het in water oplosbare metaboloom van de ontluikende gist S. cerevisiaete bestuderen. We gebruiken deze methode ook om te onderzoeken hoeveel verouderingsvertragende genetische, voedings- en farmacologische interventies het in water oplosbare metaboloom van gistcellen beïnvloeden tijdens hun chronologische veroudering. Vanwege zijn veelzijdigheid, robuustheid en gevoeligheid kan de LC-MS/MS-methode met succes worden gebruikt voor de kwantitatieve beoordeling van de in water oplosbare metabolomen in evolutionair verre eukaryote organismen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

We zijn huidige en voormalige leden van het Titorenko-laboratorium dankbaar voor de discussies. We erkennen het Centrum voor Biologische Toepassingen van Massaspectrometrie, het Centrum voor Structurele en Functionele Genomica en het Centrum voor Microscopie en Cellulaire Beeldvorming (allemaal aan de Concordia University) voor uitstekende diensten. Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) van Canada (RGPIN 2014-04482 en CRDPJ 515900 - 17). K.M. werd ondersteund door de Concordia University Armand C. Archambault Fellowship en de Concordia University Dean of Arts and Sciences Award of Excellence.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Acetonitrile Fisher Scientific A9554
Ammonium acetate Fisher Scientific A11450
Ammonium bicarbonate Sigma 9830
Bactopeptone Fisher Scientific BP1420-2
Chloroform Fisher Scientific C297-4
Glucose Fisher Scientific D16-10
L-histidine Sigma H8125
L-leucine Sigma L8912
L-lysine Sigma L5501
Methanol Fisher Scientific A4564
Methanol Fisher Scientific A4564
Propidium iodide Thermo Scientific R37108
Uracil Sigma U0750
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-2
Hardware equipment
500 ml centrifuge bottles Beckman 355664
Agilent 1100 series LC system Agilent Technologies G1312A
Beckman Coulter Centrifuge Beckman 6254249
Beckman Coulter Centrifuge Rotor Beckman JA-10
Centra CL2 clinical centrifuge Thermo Scientific 004260F
Digital thermometer Omega HH509
Foam Tube Holder Kit with Retainer Thermo Scientific 02-215-388
SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm) Sigma Milipore 150460
Thermo Orbitrap Velos MS Fisher Scientific ETD-10600
Ultrasonic sonicator Fisher Scientific 15337416
Vortex Fisher Scientific 2215365
ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µm Agilent Technologies 883725-901
Laboratory materials
2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps Fisher Scientific 60180A-SV9-1P
Glass beads (acid-washed, 425-600 μm) Sigma-Aldrich G8772
Hemacytometer Fisher Scientific 267110
15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps PYREX 05-550
Software
Compound Discoverer 3.1 Fisher Scientific V3.1
Yeast strain
Yeast strain BY4742 Dharmacon YSC1049

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hackett, S. R., et al. Systems-level analysis of mechanisms regulating yeast metabolic flux. Science. 354 (6311), aaf2786 (2016).
  2. Johnson, C. H., Ivanisevic, J., Siuzdak, G. Metabolomics: beyond biomarkers and towards mechanisms. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (7), 451-459 (2016).
  3. Mülleder, M., et al. Functional metabolomics describes the yeast biosynthetic regulome. Cell. 167 (2), 553-565 (2016).
  4. López-Otín, C., Galluzzi, L., Freije, J., Madeo, F., Kroemer, G. Metabolic control of longevity. Cell. 166 (4), 802-821 (2016).
  5. Krishnaiah, S. Y., et al. Clock regulation of metabolites reveals coupling between transcription and metabolism. Cell Metabolism. 25 (4), 961-974 (2017).
  6. Lee, H. J. Proteomic and metabolomic characterization of a mammalian cellular transition from quiescence to proliferation. Cell Reports. 20 (3), 721-736 (2017).
  7. Stryeck, S., Birner-Gruenberger, R., Madl, T. Integrative metabolomics as emerging tool to study autophagy regulation. Microbial Cell. 4 (8), 240-258 (2017).
  8. Babst, M. Eisosomes at the intersection of TORC1 and TORC2 regulation. Traffic. 20 (8), 543-551 (2019).
  9. Pedro, J., Sica, V., Madeo, F., Kroemer, G. Acyl-CoA-binding protein (ACBP): the elusive 'hunger factor' linking autophagy to food intake. Cell Stress. 3 (10), 312-318 (2019).
  10. Rahmani, S., Defferrari, M. S., Wakarchuk, W. W., Antonescu, C. N. Energetic adaptations: Metabolic control of endocytic membrane traffic. Traffic. 20 (12), 912-931 (2019).
  11. Viltard, M., et al. The metabolomic signature of extreme longevity: naked mole rats versus mice. Aging. 11 (14), 4783-4800 (2019).
  12. Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (7), 436-450 (2019).
  13. Morrison, A. J. Chromatin-remodeling links metabolic signaling to gene expression. Molecular Metabolism. 38, 100973 (2020).
  14. Bitterman, K. J., Medvedik, O., Sinclair, D. A. Longevity regulation in Saccharomyces cerevisiae: linking metabolism, genome stability, and heterochromatin. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 376-399 (2003).
  15. Carmona-Gutierrez, D. Apoptosis in yeast: triggers, pathways, subroutines. Cell Death and Differentiation. 17 (5), 763-773 (2010).
  16. Minois, N., Carmona-Gutierrez, D., Madeo, F. Polyamines in aging and disease. Aging. 3 (8), 716-732 (2011).
  17. Ring, J., et al. The metabolism beyond programmed cell death in yeast. Experimental Cell Research. 318 (11), 1193-1200 (2012).
  18. Ibáñez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8790-8794 (2013).
  19. Pietrocola, F., et al. Acetyl coenzyme A: a central metabolite and second messenger. Cell Metabolism. 21 (6), 805-821 (2015).
  20. Carmona-Gutierrez, D., et al. Guidelines and recommendations on yeast cell death nomenclature. Microbial Cell. 5 (1), 4-31 (2018).
  21. Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), foy020 (2018).
  22. Leupold, S., et al. Saccharomyces cerevisiae goes through distinct metabolic phases during its replicative lifespan. eLife. 8, e41046 (2019).
  23. Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , Academic Press. Burlington. (2010).
  24. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  25. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
  26. Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).
  27. Boer, V. M., et al. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular Biology of the Cell. 21 (1), 198-211 (2010).
  28. Clish, C. B. Metabolomics: an emerging but powerful tool for precision medicine. Cold Spring Harbor Molecular Case Studies. 1 (1), a000588 (2015).
  29. Fuhrer, T., Zamboni, N. High-throughput discovery metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 31, 73-78 (2015).
  30. Liu, X., Locasale, J. W. Metabolomics: A primer. Trends in Biochemical Sciences. 42 (4), 274-284 (2017).
  31. Lu, W., et al. Metabolite measurement: pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
  32. Riekeberg, E., Powers, R. New frontiers in metabolomics: from measurement to insight. F1000 Reseach. 6, 1148 (2017).
  33. Gertsman, I., Barshop, B. A. Promises and pitfalls of untargeted metabolomics. Journal of Inherited Metabolic Disease. 41 (3), 355-366 (2018).
  34. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  35. Ivanisevic, J., Want, E. J. From samples to insights into metabolism: Uncovering biologically relevant information in LC-HRMS metabolomics data. Metabolites. 9 (12), 308 (2019).
  36. Srivastava, S. Emerging insights into the metabolic alterations in aging using metabolomics. Metabolites. 9 (12), 301 (2019).
  37. Chetwynd, A. J., Dunn, W. B., Rodriguez-Blanco, G. Collection and preparation of clinical samples for metabolomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 19-44 (2017).
  38. Pinu, F. R., Villas-Boas, S. G., Aggio, R. Analysis of intracellular metabolites from microorganisms: quenching and extraction protocols. Metabolites. 7 (4), (2017).
  39. Zhang, N., et al. Cell permeability and nuclear DNA staining by propidium iodide in basidiomycetous yeasts. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 4183-4191 (2018).
  40. Tu, B. P., et al. Cyclic changes in metabolic state during the life of a yeast cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16886-16891 (2007).
  41. Walvekar, A., Rashida, Z., Maddali, H., Laxman, S. A versatile LC-MS/MS approach for comprehensive, quantitative analysis of central metabolic pathways. Wellcome Open Research. 3, 122 (2018).
  42. Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).
  43. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  44. Oberacher, H., et al. Annotating nontargeted LC-HRMS/MS data with two complementary tandem mass spectral libraries. Metabolites. 9 (1), 3 (2018).
  45. Tada, I., et al. Creating a reliable mass spectral-retention time library for all ion fragmentation-based metabolomics. Metabolites. 9 (11), 251 (2019).
  46. Villas-Bôas, S. G., et al. Global metabolite analysis of yeast: evaluation of sample preparation methods. Yeast. 22 (14), 1155-1169 (2005).
  47. Crutchfield, C. A., Lu, W., Melamud, E., Rabinowitz, J. D. Mass spectrometry-based metabolomics of yeast. Methods in Enzymology. 470, 393-426 (2010).
  48. Zhang, T., Creek, D. J., Barrett, M. P., Blackburn, G., Watson, D. G. Evaluation of coupling reversed phase, aqueous normal phase, and hydrophilic interaction liquid chromatography with Orbitrap mass spectrometry for metabolomic studies of human urine. Analytical Chemistry. 84 (4), 1994-2001 (2012).
  49. Villas-Bôas, S. G., Moxley, J. F., Akesson, M., Stephanopoulos, G., Nielsen, J. High-throughput metabolic state analysis: the missing link in integrated functional genomics of yeasts. Biochemical Journal. 388 (Pt 2), 669-677 (2005).
  50. Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).

Tags

Biochemie Nummer 167 in water oplosbare metabolieten metabolomics profilering blussen van metabole activiteit propidiumjodidekleuring fluorescentiemicroscopie extractie van metabolieten energiedragermoleculen nucleotiden aminozuren monosacchariden vloeistofchromatografie massaspectrometrie
Kwantitatieve metabolomica van <em>Saccharomyces Cerevisiae</em> met behulp van vloeistofchromatografie in combinatie met tandemmassaspectrometrie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mohammad, K., Jiang, H., Titorenko,… More

Mohammad, K., Jiang, H., Titorenko, V. I. Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (167), e62061, doi:10.3791/62061 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter