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Biochemistry

Metabolomica quantitativa di Saccharomyces Cerevisiae mediante cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massa tandem

Published: January 5, 2021 doi: 10.3791/62061
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biology, Concordia University, 2Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry, Concordia University

Summary

Presentiamo un protocollo per l'identificazione e la quantificazione delle principali classi di metaboliti idrosolubili nel lievito Saccharomyces cerevisiae. Il metodo descritto è versatile, robusto e sensibile. Permette la separazione di isomeri strutturali e forme stereoisomeriche di metaboliti idrosolubili l'uno dall'altro.

Abstract

La metabolomica è una metodologia utilizzata per l'identificazione e la quantificazione di molti intermedi a basso peso molecolare e prodotti del metabolismo all'interno di una cellula, tessuto, organo, fluido biologico o organismo. La metabolomica si concentra tradizionalmente sui metaboliti solubili in acqua. Il metaboloma solubile in acqua è il prodotto finale di una complessa rete cellulare che integra vari fattori genomici, epigenomici, trascrittomici, proteomici e ambientali. Quindi, l'analisi metabolomica valuta direttamente l'esito dell'azione per tutti questi fattori in una pletora di processi biologici all'interno di vari organismi. Uno di questi organismi è il lievito in erba Saccharomyces cerevisiae, un eucariota unicellulare con il genoma completamente sequenziato. Poiché S. cerevisiae è suscettibile di analisi molecolari complete, viene utilizzato come modello per sezionare i meccanismi alla base di molti processi biologici all'interno della cellula eucariotica. Un metodo analitico versatile per la valutazione quantitativa robusta, sensibile e accurata del metaboloma solubile in acqua fornirebbe la metodologia essenziale per sezionare questi meccanismi. Qui presentiamo un protocollo per le condizioni ottimizzate di tempra dell'attività metabolica e l'estrazione di metaboliti solubili in acqua dalle cellule di S. cerevisiae. Il protocollo descrive anche l'uso della cromatografia liquida accoppiata con la spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) per l'analisi quantitativa dei metaboliti idrosolubili estratti. Il metodo LC-MS/MS di metabolomica non mirata qui descritto è versatile e robusto. Consente l'identificazione e la quantificazione di oltre 370 metaboliti solubili in acqua con diverse proprietà strutturali, fisiche e chimiche, tra cui diversi isomeri strutturali e forme stereoisomeriche di questi metaboliti. Questi metaboliti includono varie molecole vettore di energia, nucleotidi, amminoacidi, monosaccaridi, intermedi di glicolisi e intermedi del ciclo tricarbossilico. Il metodo LC-MS/MS di metabolomica non mirata è sensibile e consente l'identificazione e la quantificazione di alcuni metaboliti idrosolubili a concentrazioni fino a 0,05 pmol/μL. Il metodo è stato utilizzato con successo per valutare i metabolomi idrosolubili di cellule di lievito selvatiche e mutanti coltivate in condizioni diverse.

Introduction

I metaboliti idrosolubili sono intermedi a basso peso molecolare e prodotti del metabolismo che contribuiscono ai processi cellulari essenziali. Questi processi evolutivamente conservati includono la conversione dei nutrienti in energia utilizzabile, la sintesi di macromolecole, la crescita e la segnalazione cellulare, il controllo del ciclo cellulare, la regolazione dell'espressione genica, la risposta allo stress, la regolazione post-traduzionale del metabolismo, il mantenimento della funzionalità mitocondriale, il traffico cellulare vescicolare, l'autofagia, l'invecchiamento cellulare e la morte cellulare regolata1,2,3.

Molti di questi ruoli essenziali dei metaboliti idrosolubili sono stati scoperti da studi nel lievito in erba S. cerevisiae1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Questo eucariota unicellulare è un organismo modello utile per i meccanismi di dissezione attraverso i quali i metaboliti idrosolubili contribuiscono ai processi cellulari grazie alla sua suscettibilità ad analisi biochimiche, genetiche e biologiche molecolari avanzate23,24,25,26. Sebbene i metodi LC-MS/MS di metabolomica non mirata siano stati utilizzati per studiare i ruoli dei metaboliti idrosolubili nel lievito in erba3,18,22,27,questo tipo di analisi richiede il miglioramento della sua versatilità, robustezza, sensibilità e capacità di distinguere tra diversi isomeri strutturali e forme stereoisomeriche di questi metaboliti.

Gli ultimi anni sono caratterizzati da progressi significativi nell'applicazione dei metodi LC-MS/MS di metabolomica non mirata alla profilazione di metaboliti idrosolubili in vivo. Tuttavia, molte sfide nell'utilizzo di questa metodologia rimangono2,28, 29,30,31,32,33,34,35,36. Queste sfide includono quanto segue. In primo luogo, le concentrazioni intracellulari di molti metaboliti solubili in acqua sono al di sotto di una soglia di sensibilità per i metodi attualmente utilizzati. In secondo luogo, l'efficienza della tempra dell'attività metabolica è troppo bassa e l'entità della perdita cellulare associata alla tempra dei metaboliti intracellulari è troppo alta per i metodi attuali; quindi, i metodi attualmente utilizzati sottostivalutano le concentrazioni intracellulari dei metaboliti idrosolubili. In terzo luogo, i metodi esistenti non possono differenziare gli isomeri strutturali (cioè molecole con la stessa formula chimica ma diversa connettività atomica) o stereoisomeri (cioè molecole con la stessa formula chimica e connettività atomica, ma con la diversa disposizione atomica nello spazio) di metaboliti specifici; ciò impedisce la corretta annotazione di alcuni metaboliti con i metodi attualmente utilizzati. In quarto luogo, i database online spettrali di massa esistenti di ioni genitori (MS1) e ioni secondari (MS2) sono incompleti; ciò influisce sulla corretta identificazione e quantificazione di metaboliti specifici utilizzando i dati grezzi LC-MS/MS prodotti con l'aiuto dei metodi attuali. In quinto luogo, i metodi esistenti non possono utilizzare un singolo tipo di estrazione di metaboliti per recuperare tutte o la maggior parte delle classi di metaboliti solubili in acqua. Sesto, i metodi esistenti non possono utilizzare un singolo tipo di colonna LC per separare l'uno dall'altro tutte o la maggior parte delle classi di metaboliti solubili in acqua.

Qui, abbiamo ottimizzato le condizioni per la tempra dell'attività metabolica all'interno delle cellule di S. cerevisiae, mantenendo la maggior parte dei metaboliti idrosolubili all'interno di queste cellule prima dell'estrazione ed estraendo la maggior parte delle classi di metaboliti idrosolubili dalle cellule di lievito. Abbiamo sviluppato un metodo versatile, robusto e sensibile per l'identificazione e la quantificazione basata su LC-MS/MS di oltre 370 metaboliti idrosolubili estratti dalle cellule di S. cerevisiae. Questo metodo di metabolomica non mirata consente di valutare le concentrazioni intracellulari di varie molecole vettore energetico, nucleotidi, amminoacidi, monosaccaridi, intermedi di glicolisi e intermedi del ciclo tricarbossilico. Il metodo LC-MS/MS sviluppato consente l'identificazione e la quantificazione di diversi isomeri strutturali e forme stereoisomeriche di metaboliti idrosolubili con diverse proprietà strutturali, fisiche e chimiche.

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Protocol

1. Fare e sterilizzare un mezzo per la coltivazione del lievito

  1. Fare 180 ml di un estratto di lievito completo con bactopeptone (YP) mezzo. Il mezzo YP completo contiene l'1% (p/v) di estratto di lievito e il 2% (p/v) di bactopeptone.
  2. Distribuire 180 mL del mezzo YP in modo equo in quattro palloni Erlenmeyer da 250 mL. Ognuno di questi palloni contiene 45 ml del mezzo YP.
  3. Sterilizzare i palloni con YP medium mediante autoclave a 15 psi/121 °C per 45 min.

2. Ceppo di lievito selvatico

  1. Utilizzare il ceppo BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0).

3. Lievito in crescita nel mezzo YP contenente il 2% di glucosio

  1. Sterilizzare una soluzione stock di glucosio al 20% (p/v) mediante autoclave a 15 psi/121 °C per 45 min.
  2. Aggiungere 5 mL di soluzione stock di glucosio autoclavata al 20% (p/v) a ciascuno dei due palloni Erlenmeyer con 45 mL del mezzo YP sterilizzato. La concentrazione finale di glucosio nel mezzo YP è del 2% (p/v).
  3. Utilizzare un anello microbiologico per inoculare le cellule di lievito in ciascuno dei due palloni Erlenmeyer con il mezzo YP contenente il 2% di glucosio.
  4. Coltivare le cellule di lievito durante la notte a 30 °C in uno shaker rotazionale impostato a 200 giri/min.
  5. Prendi un'aliquota di coltura di lievito. Determinare il numero totale di cellule di lievito per mL di coltura. Conta le cellule usando un emocitometro.

4. Trasferimento cellulare e la cellula cresce nel mezzo YP con il 2% di glucosio

  1. Aggiungere 5 mL della soluzione stock di glucosio sterilizzata al 20% (p/v) a ciascuno dei restanti due palloni Erlenmeyer con il mezzo YP autoclavato. La concentrazione finale di glucosio è del 2% (p/v).
  2. Trasferire un volume della coltura di lievito durante la notte in terreno YP con glucosio al 2% che contiene il numero totale di 5,0 x10 7 cellule in ciascuno dei due palloni Erlenmeyer con il mezzo YP contenente il 2% di glucosio. Utilizzare una pipetta sterile per il trasferimento cellulare.
  3. Far crescere le cellule di lievito per almeno 24 ore (o più, se l'esperimento lo richiede) a 30 °C in uno shaker rotazionale impostato a 200 giri/min.

5. Produzione di reagenti, preparazione di materiale da laboratorio e installazione di attrezzature per la tempra cellulare

  1. Preparare quanto segue: 1) una soluzione di tempra (60% di metanolo di alta qualità (>99,9%) in tampone di bicarbonato di ammonio (ABC) da 155 mM, pH = 8,0); 2) una soluzione ABC ghiacciata (pH = 8,0); 3) un termometro digitale in grado di misurare fino a -20 °C; 4) Bottiglie centrifughe grandi da 500 ml; 5) una centrifuga ad alta velocità pre-raffreddata con rotore pre-raffreddato e bottiglie centrifughe pre-raffreddate da 500 mL per questo rotore, il tutto a -5 °C; 6) tubi di estrazione dei metaboliti (tubi centrifughi in vetro ad alta velocità da 15 ml con tappi rivestiti in politetrafluoroetilene); e 7) ghiaccio secco.

6. Spegnimento cellulare

  1. Utilizzare un emocitometro per determinare il numero di cellule di lievito per ml di YP con coltura di glucosio al 2%.
  2. Trasferire un volume della coltura in terreno YP con glucosio al 2% che contiene il numero totale di 5,0 x 108 cellule in flaconi di centrifuga da 500 ml pre-raffreddati.
  3. Riempire rapidamente il flacone della centrifuga contenente le celle fino al volume di 200 ml con una soluzione di tempra conservata a -20 °C.
  4. Centrifugare le bottiglie in una centrifuga ad alta velocità a 11.325 x g per 3 minuti a -5 °C.
  5. Recuperare rapidamente e teneramente la bottiglia dalla centrifuga; svitare delicatamente il coperchio e rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet.
  6. Riaspensionare rapidamente il pellet cellulare in 10 mL di tampone ABC ghiacciato e trasferire la sospensione in un tubo di centrifuga di vetro ad alta velocità da 15 mL con un tappo rivestito in politetrafluoroetilene per l'estrazione del metabolita.
  7. Raccogliere le cellule per centrifugazione in una centrifuga clinica a 3.000 x g per 3 minuti a 0 °C.
  8. Rimuovere rapidamente il surnatante e posizionare il tubo su ghiaccio secco per iniziare l'estrazione del metabolita o conservare il tubo a -80 °C fino all'estrazione.

7. Preparazione di reagenti, materiale da laboratorio e attrezzature per l'estrazione dei metaboliti

  1. Preparare quanto segue: 1) cloroformio di grado LC-MS; 2) metanolo di grado LC-MS; 3) Acqua nano-pura di grado LC; 4) Grado LC-MS (ACN); 5) perle di vetro (lavate con acido, 425-600 μm); 6) un vortice con un kit portatubi in schiuma con fermo; 7) Tubi centrifuga in vetro ad alta velocità da 15 mL con tappi rivestiti in politetrafluoroetilene; 8) flaconcini di SM; 9) ghiaccio secco; e 10) tubi da 1,5 ml lavati una volta con etanolo, una volta con ACN e una volta con acqua nano-pura.
    NOTA: Utilizzare solo punte e tubi in micropipette in polipropilene resistente ai solventi organici.

8. Estrazione del metabolita

  1. Ai metaboliti tenuti su ghiaccio secco o conservati a -80 °C dal punto 6.7, aggiungere quanto segue: 1) 2 mL di cloroformio conservato a -20 °C; 2) 1 mL di metanolo conservato a -20 °C; 3) 1 mL di acqua nanopura ghiacciata; e 4) 200 μL di 425-600 μm di perle di vetro lavate con acido.
  2. Coprire e chiudere la bocca di un tubo con un foglio di alluminio. Posizionare i tubi in un kit di supporto per tubi in schiuma con fermo e vorticizzarli per 30 minuti a velocità media (cioè a una velocità impostata su 6, con 12 che è la velocità massima di un vortice) a 4 ° C per facilitare l'estrazione del metabolita.
  3. Incubare il tubo per 15 minuti su ghiaccio (NON ghiaccio secco!) per favorire la precipitazione proteica e la separazione dell'acqua superiore dalla fase organica inferiore.
  4. Centrifugare il tubo in una centrifuga clinica a 3.000 x g per 10 minuti a 4 °C. Questa fase di centrifugazione consente di separare la fase acquosa superiore (che contiene metaboliti idrosolubili) dallo strato intermedio (che contiene detriti cellulari e proteine) e dalla fase organica inferiore (che contiene principalmente lipidi).
  5. Utilizzare una micropipetta per trasferire la fase acquosa superiore (400 μL) in un tubo da 1,5 mL lavato ed etichettato contenente 800 μL di ACN che è stato conservato a -20 °C.
    NOTA: Ci saranno precipitazioni di nuvole bianche dopo aver aggiunto la fase acquosa superiore all'ACN mantenuta a -20 °C.
  6. Centrifugare il tubo con il campione in una centrifuga da tavolo a 13.400 x g per 10 minuti a 4 °C.
    NOTA: la precipitazione della nube bianca scomparirà dopo la centrifugazione.
  7. Trasferire 800 μL dalla parte superiore di un liquido nel tubo a un flaconcino MS etichettato. Conservare il campione a 0 °C fino a quando non viene analizzato da LC-MS/MS.

9. Preparazione di reagenti, materiale da laboratorio e attrezzature per LC

  1. Preparare quanto segue: 1) un vortice; 2) un sonicatore ad ultrasuoni; 3) Flaconcini di vetro MS; 4) un sistema LC dotato di pompa binaria, degasser e autocampionatore; 5) una colonna per cromatografia in fase zwitterionica (polimero da 5 μm, 150 x 2,1 mm) nominata nella Tabella dei Materiali; 6) un riscaldatore a colonna; e 7) fasi mobili, tra cui la fase A (5:95 ACN:acqua (v/v) con 20 mM di acetato di ammonio, pH = 8,0) e la fase B (100% ACN).

10. Separazione dei metaboliti estratti mediante LC

  1. Sottoporre il contenuto della fiala MS alla sonicazione ad ultrasuoni per 15 minuti.
  2. Vorticosamente il flaconcino MS 3x per 10 secondi a temperatura ambiente (RT).
  3. Inserire il flaconcino di MS nella piastra del pozzo.
  4. Durante il cromatografo, mantenere la colonna a 45 °C e una portata di 0,250 ml/min. Conservare il campione nella piastra del pozzo a 0 °C. Fare riferimento alla Tabella 1 per i gradienti LC che devono essere utilizzati durante la cromatografia.
    NOTA: Un cromatogramma ioico totale rappresentativo dei metaboliti solubili in acqua estratti dalle cellule del ceppo wild-type BY4742 è mostrato nella Figura 1. I metaboliti separati da LC sono stati identificati e quantificati mediante analisi spettrometrica di massa che è stata eseguita in modalità di ionizzazione positiva [ESI (+)], come descritto per la fase 11.

11. Analisi spettrometrica di massa di metaboliti separati da LC

  1. Utilizzare uno spettrometro di massa dotato di ionizzazione elettrospray riscaldata (HESI) per l'identificazione e la quantificazione di metaboliti solubili in acqua che sono stati separati da LC. Utilizzare l'analizzatore dello spettrometro di massa per gli ioni MS1 e il rivelatore dello spettrometro di massa per gli ioni MS2. Utilizzare le impostazioni fornite nelle tabelle 2 e 3 per l'acquisizione dipendente dai dati degli ioni MS1 e MS2, rispettivamente.
  2. Utilizzare un volume di campione di 10 μL per l'iniezione in entrambe le modalità ESI (+) ed ESI (-).

12. Identificazione e quantificazione di diversi metaboliti mediante l'elaborazione di dati grezzi da LC-MS/MS

  1. Utilizzare il software indicato nella Tabella dei materiali per eseguire l'identificazione e la quantificazione di diversi metaboliti solubili in acqua da file LC-MS/MS grezzi. Questo software utilizza MS1 per la quantificazione dei metaboliti e MS2 per l'identificazione dei metaboliti. Il software sfrutta la libreria di frammentazione spettrale di massa più ampiamente curata per annotare i metaboliti utilizzando i dati grezzi LC-MS/MS abbinando gli spettri MS. Questo software utilizza anche la massa esatta di MS1 e la corrispondenza del modello isotopico per annotare i metaboliti utilizzando database online. Per informazioni dettagliate, vedere la Figura 2.
  2. Utilizzare la libreria di database e spettri, che è liberamente disponibile online (https://www.mzcloud.org), per cercare spettri MS2 dei dati grezzi.

13. Analisi dell'integrità della membrana mediante colorazione allo ioduro di propidio (PI) e microscopia a fluorescenza

  1. Dopo la tempra cellulare eseguita come descritto per la fase 6, lavare accuratamente le cellule temprate con 15 mL di tampone ABC per rimuovere la soluzione di tempra. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 3.000 x g per 5 minuti a 0 °C.
  2. Risuscise il pellet cellulare in 1 mL di tampone ABC e aggiungere 0,5 mL della soluzione PI (0,5 mg/mL).
  3. Vortice di una provetta con il campione 3x per 10 s e incubarlo per 10 minuti al buio e sul ghiaccio.
  4. Centrifugare il tubo con il campione in una centrifuga da tavolo a 13.400 x g per 10 minuti a 4 °C.
  5. Rimuovere il surnatante e risusediare il pellet in 1 mL di tampone ABC.
  6. Centrifugare il tubo a 13.400 x g per 10 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante. Ripetete questo passaggio altre 2 volte per rimuovere il PI associato alla superficie della cella.
  7. Risuspenare il pellet in 300 μL di tampone ABC. Posizionare 10 μL della sospensione sulla superficie di un vetrino per microscopio.
  8. Cattura le immagini al microscopio a contrasto di interferenza differenziale (DIC) e fluorescenza con un microscopio a fluorescenza. Utilizzare un filtro impostato alle lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione di 593 nm e 636 nm (rispettivamente).
  9. Utilizzare un software per contare il numero totale di celle (in modalità DIC) e il numero di celle colorate fluorescentemente. Inoltre, utilizzare questo software per determinare l'intensità della colorazione per le singole cellule.

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Representative Results

Per migliorare una valutazione quantitativa dei metaboliti solubili in acqua all'interno di una cellula di lievito, abbiamo ottimizzato le condizioni di tempra cellulare per il rilevamento dei metaboliti. La tempra cellulare per questo scopo comporta un rapido arresto di tutte le reazioni enzimatiche all'interno di una cellula31,33,37,38. Tale arresto dell'attività metabolica cellulare è un passaggio essenziale di qualsiasi metodo per la quantificazione dei metaboliti idrosolubili in vivo perché impedisce la sottovalutazione delle loro concentrazioni intracellulari31,33,37,38. La tempra cellulare per la valutazione dei metaboliti compromette sempre l'integrità della membrana plasmatica (PM) (e della parete cellulare (CW), se presente); questo provoca la fuoriuscita di metaboliti dalla cellula31,33,37,38. Il metodo impiega condizioni di tempra cellulare che riducono al minimo tale compromissione, diminuendo così significativamente la perdita cellulare associata alla tempra dei metaboliti intracellulari. In effetti, la maggior parte dei metodi attuali per la tempra cellulare comportano l'uso di una certa concentrazione di metanolo (cioè 40% (v / v), 60% (v / v), 80% (v / v) o 100% (v / v)) a temperatura specifica (cioè -20 ° C, -40 ° C o -60 ° C), con o senza tampone31,33,37,38. Abbiamo confrontato l'efficienza della compromissione di PM e CW per uno dei metodi di tempra cellulare attualmente utilizzati (cioè mediante trattamento cellulare con metanolo all'80% (v/v) a -40 °C in assenza di un tampone38) a quella per il metodo di tempra cellulare modificato (cioè mediante trattamento cellulare con metanolo al 60% (v/v) a -20 °C in presenza di una soluzione tamponata isotonica di ABC a pH = 8,0). PI è un colorante fluorescente impermeabile alle cellule intatte; può entrare nella cellula solo se l'integrità del PM (e del CW, se presente) è compromessa39. Inoltre, l'intensità dell'emissione di fluorescenza da parte di PI aumenta di 30 volte quando è legata al DNA o all'RNA39. Pertanto, un test di colorazione PI può essere utilizzato per valutare l'efficienza della perdita cellulare associata alla tempra dei metaboliti intracellulari perché questi metaboliti possono fuoriuscire nello spazio extracellulare solo se il PM e il CW di una cellula di lievito sono danneggiati39. La Corte ha riscontrato che il metodo di tempra cellulare modificato provoca danni significativamente inferiori al PM e al CW rispetto al metodo di tempra mediante trattamento cellulare con metanolo non tamponato all'80% (v/v) a -40 °C(Figura 3). Infatti, quasi tutte le cellule sottoposte a tempra con il metodo hanno mostrato un'emissione di fluorescenza rossa, che è caratteristica delle cellule di lievito il cui PM e CW non sono danneggiati (Figura 3). Al contrario, quasi tutte le cellule sottoposte a tempra utilizzando l'altro metodo, hanno mostrato un'emissione di fluorescenza verde caratteristica delle cellule di lievito il cui PM e CW sono significativamente danneggiati (Figura 3). La fluorescenza rossa più intensa è stata convertita in fluorescenza verde da un software per distinguere tra la forte fluorescenza rossa e le emissioni di fluorescenza rossa lieve.

Il metodo di tempra cellulare modificato ha causato perdite significativamente inferiori di metaboliti solubili in acqua dalle cellule di lievito rispetto al metodo di tempra mediante trattamento cellulare con metanolo non tamponato all'80% (v / v) a -40 ° C. Abbiamo sottoposto un numero uguale di cellule di lievito alla tempra utilizzando entrambi i metodi (cioè mediante trattamento cellulare con metanolo al 60% (v/v) a -20 °C in presenza di una soluzione tampone isotonica di ABC a pH = 8,0; Figura 4) o l'altro metodo (cioè mediante trattamento cellulare con metanolo non tamponato all'80% (v/v) a -40 °C; Figura 5). L'entità della perdita cellulare associata alla tempra nella soluzione extracellulare è stata valutata per specifici metaboliti idrosolubili con l'aiuto di LC-MS/MS. Le concentrazioni di diverse classi di amminoacidi (cioè grandi e piccoli amminoacidi acidi, basici, neutri-non polari e polari neutri) nella soluzione extracellulare sono state misurate prima e dopo la tempra cellulare. Abbiamo scoperto che il metodo di tempra cellulare provoca perdite significativamente inferiori di tutte queste classi di amminoacidi nella soluzione extracellulare (Figura 4) rispetto all'altro metodo (Figura 5).

Il metodo LC-MS/MS per una valutazione quantitativa dei metaboliti solubili in acqua all'interno di una cellula di lievito utilizza un singolo tipo di colonna per la separazione cromatografica di tutte le classi di metaboliti solubili in acqua. Questa colonna è la colonna di fase zwitterionica denominata in Tabella dei materiali. Abbiamo scoperto che questa colonna fornisce una separazione molto più efficiente di diverse classi di metaboliti solubili in acqua rispetto alla colonna di fase inversa denominata nella Tabella dei materiali ( Tabellasupplementare 1). In effetti, i valori di spostamento del tempo di ritenzione (RT) degli standard dei metaboliti solubili in acqua (cioè NAD+, AMP, GMP, arginina e acido glutammico) erano significativamente più bassi e le forme del picco erano sostanzialmente più nitide per la colonna della fase zwitterionica, rispetto alla colonna a fase inversa (Tabella supplementare 1). Le condizioni LC utilizzate per la separazione cromatografica di tutti i metaboliti (cioè solubili in acqua e insolubili in acqua) per la colonna inversa sono fornite nella Tabella supplementare 2.

Un altro vantaggio del metodo LC-MS/MS consiste nella capacità di separazione cromatografica sulla colonna di fase zwitterionica di cui sopra di separare in modo efficiente l'uno dall'altro diversi metaboliti solubili in acqua con diverse proprietà strutturali, fisiche e chimiche. Questi metaboliti solubili in acqua comprendono le seguenti classi di metaboliti: 1) amminoacidi acidi, basici, polari neutri e polari non neutri, compresi i loro diversi isomeri strutturali (Figura 6); 2) nucleotidi stabili e instabili e loro derivati che svolgono funzioni vitali all'interno di una cellula (Figura 7); e 3) vari monosaccaridi, comprese le loro diverse forme stereoisomeriche (Figura 8).

È importante sottolineare che il metodo LC-MS/MS per una valutazione quantitativa dei metaboliti solubili in acqua all'interno di una cellula di lievito era versatile e robusto. Ci ha permesso di identificare e quantificare 374 metaboliti solubili in acqua con diverse proprietà strutturali, fisiche e chimiche nelle cellule di S. cerevisiae che sono state coltivate nel mezzo YP completo inizialmente contenente il 2% di glucosio (Tabella supplementare 3). 240 metaboliti sono stati rilevati nella modalità di ionizzazione positiva e 134 metaboliti sono stati rilevati nella modalità di ionizzazione negativa. Le identità di tutti questi metaboliti solubili in acqua sono state confermate abbinando i loro frammenti MS2 di acquisizione data-dipendente (DDA) acquisiti sia in modalità di ionizzazione positiva che negativa alla libreria spettrale ms2 mzCloud. Questa libreria online include gli spettri degli standard dei metaboliti che differiscono nei loro parametri MS1 e DDA MS2. Per massimizzare l'estensione della corrispondenza degli spettri MS2 del campione con la libreria spettrale online, abbiamo utilizzato diversi parametri DDA MS2. Questi parametri sono forniti nella Tabella supplementare 4. Quasi 6.000 caratteristiche (metaboliti putativi) per lo stesso campione sono state acquisite con l'aiuto del metodo di frammentazione ad alta energia indotta da collisione-dissociazione (HCD) o dissociazione indotta da collisione (CID), utilizzando i primi 5 eventi MS2, 35 valori di energia di collisione e tempi di attivazione di 10 ms. Dopo aver filtrato i file risultanti con > corrispondenza MS2 al 95% e > criteri di corrispondenza del modello isotopico MS1 al 90%, sono stati identificati solo 162 metaboliti in condizione frammentata HCD e 142 metaboliti in condizione frammentata CID. 81 metaboliti su 162 erano unici per il metodo di frammentazione HCD, mentre 42 su 142 erano unici per il metodo di frammentazione CID (vedi un foglio chiamato "T5_35E__10 ms_HCD vs CID" nella Tabella supplementare 4). Pertanto, la Microsoft ha concluso che la corretta annotazione dei metaboliti solubili in acqua con l'aiuto del metodo LC-MS/MS richiede l'uso di molti parametri DDA MS2 diversi.

Anche il metodo LC-MS/MS è altamente sensibile. Permette di identificare e quantificare alcuni metaboliti idrosolubili a concentrazioni fino a 0,05 pmol/μL (vedere i dati per la fenilalanina nella Tabella 4). Questo limite di quantificazione varia all'interno di un ampio intervallo di concentrazioni per le diverse classi di metaboliti (Tabella 4).

Il sistema MS qui utilizzato ha un ampio (almeno due ordini di grandezza) gamma dinamica lineare per misurare le concentrazioni di vari metaboliti (Tabella supplementare 5).

Figure 1
Figura 1: Il cromatogramma ionico totale (TIC) dai dati di cromatografia liquida/spettrometria di massa (LC-MS) di metaboliti solubili in acqua estratti da cellule del ceppo wild-type BY4742. I metaboliti sono stati separati da LC sulla colonna di cromatografia in fase zwitterionica nominata nella Tabella dei materiali. I metaboliti sono stati rilevati dalla SM di ioni genitori (MS1) che sono stati creati utilizzando la modalità di ionizzazione elettrospray positiva. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Un flusso di lavoro utilizzato per l'analisi dei metaboliti solubili in acqua con l'aiuto del software denominato nella Tabella dei materiali. Tutti i parametri sono stati corretti automaticamente dal software in base ai dati grezzi MS, ad eccezione dei seguenti: 1) scheda "Rileva composti": set min, intensità di picco 10.000; e 2) scheda "Cerca ChemSpider": sono stati selezionati 4 database online per l'identificazione dei metaboliti, tra cui BioCyc, Human Metabolome Database, KEGG e Yeast Metabolome Database. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Contrasto di interferenza differenziale (DIC; riga superiore) e fluorescenza (riga inferiore) immagini microscopiche di cellule di lievito spente con tampone di bicarbonato di ammonio (ABC) (pH = 8,0; controllo) o con una diversa soluzione di tempra. Dopo la tempra cellulare, un numero uguale di cellule è stato incubato con la soluzione PI per 10 minuti al buio e sul ghiaccio. La fluorescenza rossa più intensa è stata convertita in fluorescenza verde dal software per distinguere tra la forte fluorescenza rossa e le lievi emissioni di fluorescenza rossa. L'efficienza del danno al PM e al CW è stata confrontata per il metodo di tempra cellulare (cioè mediante trattamento cellulare con metanolo al 60% (v/v) a -20 °C in presenza di una soluzione tampone isotonica di ABC a pH = 8,0) e uno dei metodi attualmente utilizzati (cioè mediante trattamento cellulare con metanolo all'80% (v/v) a -40 °C in assenza di tampone). Viene visualizzata una barra di scala. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Percentuale di perdite di diverse classi di amminoacidi per il metodo di tempra cellulare. 5,0 x10 8 delle cellule di lievito sono state sottoposte a tempra mediante il trattamento con metanolo al 60% (v/v) a -20 °C in presenza di una soluzione tampone isotonica di ABC a pH = 8,0. La percentuale di perdite di diverse classi di aminoacidi è stata valutata utilizzando LC-MS/MS per misurare le loro concentrazioni nella soluzione extracellulare prima e dopo la tempra. Vengono mostrati i valori medi ± SD e i singoli punti dati (n = 3). * p < 0,05. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Percentuale di perdite di diverse classi di amminoacidi per uno dei metodi di tempra cellulare attualmente utilizzati. 5,0 x10 8 delle cellule di lievito sono state sottoposte a tempra mediante il trattamento con metanolo all'80% (v/v) a -40 °C in assenza di tampone. La percentuale di perdite di diverse classi di aminoacidi è stata valutata utilizzando LC-MS/MS per misurare le loro concentrazioni nella soluzione extracellulare prima e dopo la tempra. Vengono mostrati i valori medi ± SD e i singoli punti dati (n = 3). * p < 0,05. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Separazione cromatografica efficiente delle classi di amminoacidi acidi, basici, polari neutri e non neutri polari, compresi due isomeri strutturali (cioè leucina e isoleucina), sulla colonna di fase zwitterionica nominata nella Tabella dei materiali. Tutti questi amminoacidi sono stati rilevati da MS/MS in modalità di ionizzazione positiva [ESI (+)]. Le condizioni per LC sulla colonna cromatografia in fase zwitterionica sono descritte nella Tabella 1. Le condizioni per gli SM/MS sono descritte nelle tabelle 2 e 3. Tutti gli standard di aminoacidi sono acquistati commercialmente (ad esempio, Sigma). Gli spostamenti del tempo di ritenzione tra 3 cicli cromatografici indipendenti sono inferiori a ± 10 secondi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Separazione cromatografica efficiente di diverse classi di nucleotidi, inclusi nucleotidi energeticamente instabili (nucleosidici monofosfati, nucleosidici difosfati e nucleosidici trifosfati) e molecole portanti elettroni (NADH e NAD+), sulla colonna di fase zwitterionicanominata nella Tabella dei materiali. Tutti questi nucleotidi sono stati rilevati da MS/MS in modalità di ionizzazione positiva [ESI (+)]. Le condizioni per LC sulla colonna cromatografia in fase zwitterionica sono descritte nella Tabella 1. Le condizioni per gli SM/MS sono descritte nelle tabelle 2 e 3. Tutti gli standard nucleotidici sono acquistati commercialmente (ad esempio, Sigma). Gli spostamenti del tempo di ritenzione tra 3 cicli cromatografici indipendenti sono inferiori a ± 10 secondi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: Separazione cromatografica efficiente di diverse classi di monosaccaridi, compresi gli isomeri strutturali e le forme stereoisomeriche di aldo- e chetoesosio (fruttosio, mannosio e galattosio) e aldopentosi (ribosio e arabinosio), sulla colonna di fase zwitterionicanominata nella Tabella dei materiali. Tutti questi monosaccaridi sono stati rilevati da MS/MS in modalità di ionizzazione positiva [ESI (+)]. Le condizioni per LC sulla colonna cromatografia in fase zwitterionica sono descritte nella Tabella 1. Le condizioni per gli SM/MS sono descritte nelle tabelle 2 e 3. Tutti gli standard monosaccaridi sono acquistati commercialmente (ad esempio, Sigma). Gli spostamenti del tempo di ritenzione tra 3 cicli cromatografici indipendenti sono inferiori a ± 10 secondi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tipo di colonna SeQuant ZIC-pHILIC 5μm polimero 150 x 2,1 mm
Solvente A LC-MS grado H2O: ACN (95:5, v/v) 20 mM Acetato di ammonio
Solvente B Acetonitrile grado LC-MS (ACN)
Limite di pressione Massimo = 300 bar Minimo = 0
Programma gradiente HPLC
Tempo (minuti) Portata (0,25 ml/min) Composizioni
A% B%
0.5 0.25 5 95
26 0.25 40 60
30 0.25 70 30
31 0.25 70 30
31.1 0.4 5 95
43.9 0.4 5 95
44 0.25 5 95
45 0.25 5 95

Tabella 1: Condizione LC utilizzata per la separazione dei metaboliti solubili in acqua con l'aiuto della colonna di fase zwitterionicadenominata nella Tabella dei materiali. Queste condizioni sono state utilizzate in tutti gli esperimenti qui descritti.

Gamma di massa di scansione completa (Dalton) 70-900
FTMS (analizzatore Orbitrap) risoluzione di scansione completa 6,0 x 104
FtMS (analizzatore Orbitrap) Risoluzione HCD 7500
FtMS scansione completa AGC target 1,0 x 106
Obiettivo FTMS MSn AGC 5,0 x 104
Trappola ioio (LTQ) MSn AGC target 1,0 x 104
Tipo di sorgente ioia Ionizzazione elettrospray riscaldata
Temperatura capillare (°C) 275
Temperatura del riscaldatore della sorgente (°C) 250
Flusso di gas della guaita 10
Flusso Aux Gas 5

Tabella 2: Le impostazioni dello spettrometro di massa utilizzate per analizzare i metaboliti separati da LC. Queste condizioni sono state utilizzate per l'analisi dei metaboliti in tutti gli esperimenti qui descritti. Abbreviazioni: FTMS = trasformata di Fourier (FTMS); HCD = collisione-dissociazione indotta da alta energia; LTQ = quadrupolo a trappola lineare; AGC = controllo automatico del guadagno, un valore della popolazione iota per SM e MS/MS.

Polarità dello strumento Positivo/Negativo
Tipo di attivazione CID/HCD
Segnale minimo richiesto 5000
Larghezza di isolamento 2
Energie di collisione normalizzate per CID 35, 60
Energie di collisione normalizzate per HCD 35, 45, 55
Stato di carica predefinito 1
Tempo di attivazione per CID (ms) 10, 30
Tempo di attivazione per HCD (ms) 10
Numero di eventi MS/MS nel CID Top 3, Top 5, Top 10
Numero di eventi MS/MS in HCD Top 5
Numero di micro scansioni utilizzate sia in HCD che in CID 1

Tabella 3: Le impostazioni dello spettrometro di massa utilizzate per rilevare gli ioni secondari (MS2). Abbreviazioni: HCD = dissociazione-collisione-collisione indotta da alta energia; CID = dissociazione indotta da collisione; ms = millisecondi.

Metaboliti Std M.W. (g/mole) [M+H]+1 [M-H]-1 Modalità di rilevamento Concentrazione più bassa rilevata (pmol/μL)
glicina 75.03203 76.03931 74.02475 P 7,43E+00
triptofano 204.08988 205.09716 203.0826 P 5,56E-02
fenilalanina 165.07898 166.08626 164.0717 P 5,14E-02
arginina 174.11168 175.11896 173.1044 P 7,14E-02
treonina* 119.05824 120.06552 118.05096 P
serina 105.04259 106.04987 104.03531 P 4,66E+00
glutammato 147.05316 148.06044 146.04588 P 4,20E-01
metionina 149.05105 150.05833 148.04377 P 1,96E+00
aspartato 133.03751 134.04479 132.03023 P 3,75E+00
valina 117.07898 118.08626 116.0717 P 1,49E+00
isoleucina 131.09463 132.10191 130.08735 P 1,84E+00
leucina 131.09463 132.10191 130.08735 P 2,26E+00
istidina 155.06948 156.07676 154.0622 P 2,53E+00
tirosina 181.07389 182.08117 180.06661 P 8,72E-02
lisina 146.10553 147.11281 145.09825 P 1,43E-01
alanina 89.04768 90.05496 88.0404 P 1,12E+00
prolina 115.06333 116.07061 114.05605 P 1,05E+00
cisteina 121.01975 122.02703 120.01247 P 8,22E-01
asparagina 132.05349 133.06077 131.04621 P 1,08E+00
glutammina 146.06914 147.07642 145.06186 P 1,92E+00
guanina 151.04941 152.05669 150.04213 P 5,47E+00
guanosina 283.09167 284.09895 282.08439 P 3,67E-01
GMP 363.058 364.06528 362.05072 P 7,17E-01
PIL 443.02434 444.03162 442.01706 P 2,57E+00
GTP · 522.99067 523.99795 521.98339 P 2,27E+00
AMP 347.06309 348.07037 346.05581 P 5,25E-01
ADP 427.02942 428.0367 426.02214 P 1,32E+00
ATP 506.99575 508.00303 505.98847 P 1,77E+00
NADH 665.12478 666.13206 664.1175 P 1,47E+00
NAD+ 663.10912 664.1164 662.10184 P 3,03E+00
glucosio** 180.06339 181.07067 179.05611
fruttosio*** 180.06339 181.07067 179.05611 N 5,67E-01
mannosio*** 180.06339 181.07067 179.05611 N 1,05E+00
galattosio*** 180.06339 181.07067 179.05611 N 9,00E-01
ribosio*** 150.05283 151.06011 149.04555 N 1,10E+00
arabinosio*** 150.05283 151.06011 149.04555 N 1,23E+00
fruttosio-6-fosfato*** 260.02972 261.037 259.02244 N 6,60E+00
glucosio-6-fosfato*** 260.02972 261.037 259.02244 N 4,27E+00
acido citrico 192,12 g 193.034279 191.019726 N 9,33E-01
acido malico 134.09 135.0288 133.014247 N 1,23E+00
acido piruvico 88.06 89.02332 87.008768 N 2,77E+00

Tabella 4:Le concentrazioni più basse di diversi standard di metaboliti solubili in acqua che il metodo LC-MS/MS può identificare e quantificare. L'area di picco MS1 di ciascun metabolita standard è stata utilizzata per stimare la concentrazione quantificabile più bassa per questo metabolita. Vengono mostrati i valori medi di due esperimenti indipendenti. Sono state eseguite tre repliche tecniche per ciascuno dei due esperimenti indipendenti. NOTA: La treonina* può essere rilevata ma non può essere quantificata a causa della sua coeluizione con l'omoserina, un isomero chimico della treonina. Il glucosio** non può essere identificato perché crea più picchi cromatografici. Le norme sui metaboliti*** possono essere identificate e quantificate solo in singoli campioni, ma non in una miscela di standard di metaboliti o in una miscela biologica di metaboliti.

Tabella supplementare 1: Valori di spostamento del tempo di ritenzione (RT) dello stesso insieme di metaboliti per le colonne di fase zwitterionica e fase inversa (vedere Tabella dei materiali) dopo l'equilibrio della colonna. La tabella confronta la riproducibilità di ritenzione delle colonne di fase zwitterionica e di fase inversa per un insieme distinto di metaboliti che differiscono l'uno dall'altro nella loro idrofilia e idrofobicità. Questi metaboliti sono stati identificati con l'aiuto di LC-MS/MS. Si noti che i valori di spostamento RT dei metaboliti idrofili (cioè NAD+, AMP, GMP, arginina e acido glutammico) sono significativamente più bassi e le forme di picco sono sostanzialmente più nitide per la colonna di fase zwitterionica, rispetto alla colonna di fase inversa. Al contrario, i valori di spostamento RT dei metaboliti idrofobici (cioè acido stearico, acido laurico e acido decanoico) sono significativamente più bassi e le forme del picco sono sostanzialmente più nitide per la colonna in fase inversa, rispetto alla colonna di fase zwitterionica. Le condizioni per la separazione cromatografica dei metaboliti con l'aiuto delle colonne di fase zwitterionica e di fase inversa sono dettagliate rispettivamente nella Tabella 1 e nella Tabella supplementare 2. I valori di spostamento RT riportati qui si basano sulla misurazione di 20 diversi campioni prelevati da fiale diverse. I campioni sono stati analizzati dopo l'equilibrio della colonna. I metaboliti in ciascun campione sono stati estratti da 5,0 × 108 cellule di lievito. I valori di spostamento RT sono la mezzo di 20 campioni diversi (n = 20). I valori p derivati dal test t spaiato sono stati utilizzati per confrontare le due colonne con la stessa varianza tra i due tipi di campione. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Tabella supplementare 2: Condizioni LC per la colonna 8 di fase inversa nominata nella Tabella dei materiali e utilizzata per separare diversi metaboliti in questo studio. Le proprietà della colonna erano le seguenti: 150 x 2,1 mm, polimero da 5 μm. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Tabella supplementare 3: Un elenco di tutti i 374 metaboliti solubili in acqua recuperati e annotati utilizzando il metodo LC-MS/MS. Tutti i metaboliti sono stati recuperati dalla stessa corsa del gradiente LC, sottoposti a un algoritmo di frammentazione di acquisizione dipendente dai dati (DDA) descritto nella Tabella supplementare 4e annotati utilizzando il software denominato nella Tabella dei materiali. Le forme di picco MS1 di 211 metaboliti (il cui stato nella tabella è indicato come vuoto) erano appropriate per essere utilizzate per la quantificazione e i rispettivi spettri MS2 avevano corrispondenze complete con la libreria spettrale mzCloud. Gli spettri MS2 di 38 metaboliti (il cui stato nella tabella è indicato come d) avevano una corrispondenza completa con la libreria spettrale online. Tuttavia, le loro forme di picco MS1 non erano appropriate per essere utilizzate per la quantificazione. Gli spettri MS2 di 125 metaboliti (il cui stato nella tabella è indicato come n) non avevano corrispondenze complete con la libreria spettrale online. Questi metaboliti sono stati annotati come segue: 1) utilizzando il "Predict composition node" (che annota i metaboliti in base all'esatta corrispondenza dei valori MS1, al numero di isotopi abbinati e mancati e all'intensità % isotopica abbinata a quella degli standard teorici di riferimento); 2) utilizzando il "nodo ChemSpider" (che annota i metaboliti in base all'esatta corrispondenza dei valori MS1 e al punteggio di corrispondenza di somiglianza degli spettri MS2 con la libreria spettrale online); e 3) utilizzando i valori di spostamento del tempo di ritenzione (RT) dei metaboliti (questi valori dipendono dalla struttura fisica e dalle proprietà chimiche dei metaboliti). I metaboliti elencati nella tabella sono stati trovati in tutte e 3 le repliche biologiche eseguite, con i valori di spostamento RT di < 0,2 min. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella supplementare 4: Un algoritmo di frammentazione di acquisizione dipendente dai dati (DDA) che è stato utilizzato qui per l'annotazione di metaboliti solubili in acqua con l'aiuto del software denominato nella Tabella dei materiali. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Tabella supplementare 5: Una tipica gamma dinamica lineare che abbiamo osservato quando abbiamo misurato le concentrazioni di diversi amminoacidi con l'aiuto del sistema MS nominato nella Tabella dei materiali. Il sistema MS qui utilizzato ha un'ampia gamma dinamica lineare (almeno due ordini di grandezza) per misurare le concentrazioni di vari metaboliti. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

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Discussion

Per utilizzare con successo il protocollo qui descritto, seguire le misure preventive descritte di seguito. Il cloroformio e il metanolo estraggono varie sostanze dalla plastica da laboratorio. Pertanto, maneggiarli con cautela. Evitare l'uso di materie plastiche in fasi che comportano il contatto con uno di questi due solventi organici. Utilizzare pipette in vetro borosilicato per questi passaggi. Sollevare queste pipette con cloroformio e metanolo prima dell'uso. Utilizzare solo punte e tubi in micropipette in polipropilene resistente ai solventi organici. Durante la preparazione del campione per LC-MS/MS, eliminare tutte le bolle d'aria nei flaconcini di vetro prima di inserirle in una piastra di pozzo.

La colonna in fase zwitterionica utilizzata qui richiede un ampio ricolizionamento dopo ogni corsa per ridurre al minimo lo spostamento RT. Per il ricondizionaziona della colonna, si consiglia di utilizzare un volume della soluzione di ricondizionare che è di circa 20 volumi della colonna. La colonna deve essere rico condizionata con la fase mobile iniziale per 15 minuti con una portata aumentata di 0,4 ml / min. Per evitare danni alla colonna durante il suo riassessamento, mantenere la pressione della colonna al di sotto del limite superiore di pressione raccomandato dal produttore.

Da notare, alcune colonne di cromatografia a separazione mista che operano in modalità in fase inversa consentono la risoluzione dei metaboliti carichi40,41. Queste colonne a separazione mista si basano sulla colonna di fase inversa qui utilizzata (vedi Tabella dei materiali)e contengono gruppi polari incorporati che possono separare i metaboliti in base alla carica40,41.

Qui, abbiamo descritto un metodo basato su LC-MS / MS di metabolomica non mirata per l'analisi quantitativa di molti metaboliti solubili in acqua estratti da cellule di lievito. Il metodo offre diversi vantaggi rispetto ai metodi LC-MS/MS di metabolomica non mirata attualmente utilizzati per questo scopo. Questi vantaggi includono quanto segue. In primo luogo, il metodo è sensibile e consente l'identificazione e la quantificazione di alcuni metaboliti idrosolubili a concentrazioni fino a 0,05 pmol/μL. La sensibilità riportata dei metodi LC-MS/MS esistenti è inferiorea 3,22,27,42. In secondo luogo, il metodo utilizza una procedura di tempra cellulare che provoca una perdita significativamente inferiore di metaboliti intracellulari dalla cellula rispetto a quella riportata per le procedure attualmente utilizzate31,33,38. Pertanto, la procedura che abbiamo sviluppato per la tempra cellulare riduce la misura in cui le procedure attualmente utilizzate sottostimano le concentrazioni intracellulari di metaboliti solubili in acqua. In terzo luogo, a differenza dei metodi LC-MS/MS esistenti2,31,33,il metodo distingue tra diversi isomeri strutturali e forme stereoisomeriche di molti metaboliti. Questi metaboliti includono varie molecole vettore di energia, nucleotidi, amminoacidi, monosaccaridi, intermedi di glicolisi e intermedi del ciclo tricarbossilico. In quarto luogo, abbiamo utilizzato il metodo per creare un ampio database spettrale di massa di MS1 e MS2 per la corretta identificazione e quantificazione di una vasta gamma di metaboliti specifici utilizzando i dati grezzi LC-MS / MS. Al contrario, i database online spettrali di massa esistenti di MS1 e MS2 sono incompleti43,44,45. In quinto luogo, il metodo utilizza un singolo tipo di estrazione di metaboliti per recuperare metaboliti solubili in acqua con diverse proprietà strutturali, fisiche e chimiche. La diversità di questi metaboliti supera significativamente quella dei metodi alternativi per un'estrazione in un'unica fase di metaboliti solubili in acqua dalle cellule di lievito3,22,27,46. Sei, a differenza dei metodi LC-MS/MS esistenti3,22,47,48,il metodo utilizza un singolo tipo di colonna LC per separare l'una dall'altra varie classi strutturali e funzionali di metaboliti solubili in acqua. Sette, il metodo consente l'identificazione e la quantificazione di oltre 370 metaboliti solubili in acqua estratti dalle cellule di lievito. Questo numero di metaboliti identificabili e quantificabili supera il numero di metaboliti riportati per altri metodi di metabolomica non mirata nel lievito3,22,27,49,50.

Il metodo ha diverse limitazioni. Queste limitazioni sono le seguenti. La colonna in fase zwitterionica utilizzata per la separazione dei metaboliti da parte di LC richiede un ampio ricondozionismo dopo ogni corsa. Inoltre, il metodo è efficace solo per la metabolomica non mirata di metaboliti idrofili solubili in acqua. Inoltre, diverse forme isomeriche di carboidrati (inclusi isomeri di fruttosio, glucosio e galattosio) non possono essere quantificate con l'aiuto del metodo. Questo perché la colonna di fase zwitterionica utilizzata nel metodo non può separare questi isomeri di carboidrati l'uno dall'altro quando presenti in una miscela con altri metaboliti. Inoltre, il metodo non può essere sfruttato per identificare il glucosio perché questo carboidrato crea picchi multipli durante la cromatografia sulla colonna di fase zwitterionica utilizzata nel metodo. Infine, la treonina non può essere quantificata con l'aiuto del metodo a causa della co-eluizione di questo amminoacido con il suo isomero omoserina durante la separazione del metabolita mediante cromatografia.

Utilizziamo questo metodo LC-MS/MS per studiare i cambiamenti associati all'invecchiamento nel metaboloma idrosolubile del lievito in erba S. cerevisiae. Impieghiamo anche questo metodo per studiare quanti interventi genetici, dietetici e farmacologici che ritardano l'invecchiamento influenzano il metaboloma solubile in acqua delle cellule di lievito durante il loro invecchiamento cronologico. Grazie alla sua versatilità, robustezza e sensibilità, il metodo LC-MS/MS può essere utilizzato con successo per la valutazione quantitativa dei metabolomi idrosolubili in organismi eucariotici evolutivamente distanti.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgments

Siamo grati agli attuali ed ex membri del laboratorio Titorenko per le discussioni. Riconosciamo il Centro per le applicazioni biologiche della spettrometria di massa, il Centro per la genomica strutturale e funzionale e il Centro per la microscopia e l'imaging cellulare (tutti presso la Concordia University) per i servizi eccezionali. Questo studio è stato supportato da sovvenzioni del Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) del Canada (RGPIN 2014-04482 e CRDPJ 515900 - 17). K.M. è stato sostenuto dalla Concordia University Armand C. Archambault Fellowship e dal Concordia University Dean of Arts and Sciences Award of Excellence.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Acetonitrile Fisher Scientific A9554
Ammonium acetate Fisher Scientific A11450
Ammonium bicarbonate Sigma 9830
Bactopeptone Fisher Scientific BP1420-2
Chloroform Fisher Scientific C297-4
Glucose Fisher Scientific D16-10
L-histidine Sigma H8125
L-leucine Sigma L8912
L-lysine Sigma L5501
Methanol Fisher Scientific A4564
Methanol Fisher Scientific A4564
Propidium iodide Thermo Scientific R37108
Uracil Sigma U0750
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-2
Hardware equipment
500 ml centrifuge bottles Beckman 355664
Agilent 1100 series LC system Agilent Technologies G1312A
Beckman Coulter Centrifuge Beckman 6254249
Beckman Coulter Centrifuge Rotor Beckman JA-10
Centra CL2 clinical centrifuge Thermo Scientific 004260F
Digital thermometer Omega HH509
Foam Tube Holder Kit with Retainer Thermo Scientific 02-215-388
SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm) Sigma Milipore 150460
Thermo Orbitrap Velos MS Fisher Scientific ETD-10600
Ultrasonic sonicator Fisher Scientific 15337416
Vortex Fisher Scientific 2215365
ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µm Agilent Technologies 883725-901
Laboratory materials
2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps Fisher Scientific 60180A-SV9-1P
Glass beads (acid-washed, 425-600 μm) Sigma-Aldrich G8772
Hemacytometer Fisher Scientific 267110
15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps PYREX 05-550
Software
Compound Discoverer 3.1 Fisher Scientific V3.1
Yeast strain
Yeast strain BY4742 Dharmacon YSC1049

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biochimica Numero 167 Metaboliti idrosolubili profilazione metabolomica tempra dell'attività metabolica colorazione allo ioduro di propidio microscopia a fluorescenza estrazione di metaboliti molecole portanti di energia nucleotidi amminoacidi monosaccaridi cromatografia liquida spettrometria di massa
Metabolomica quantitativa di <em>Saccharomyces Cerevisiae mediante</em> cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massa tandem
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Mohammad, K., Jiang, H., Titorenko,… More

Mohammad, K., Jiang, H., Titorenko, V. I. Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (167), e62061, doi:10.3791/62061 (2021).

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