Summary
我々は、酵母 サッカロミセスセレビシエにおける水溶性代謝産物の主要クラスの同定と定量のためのプロトコルを提示する。記載された方法は、汎用性、堅牢性、および高感度です。これは、構造異性体と水溶性代謝物の立体異性体の分離を可能にします。
Abstract
メタボロミクスは、細胞、組織、臓器、生体、または生物内の多くの低分子中間体および代謝産物の同定と定量に使用される方法論である。メタボロミクスは伝統的に水溶性代謝産物に焦点を当てています。水溶性のメタボロメは、様々なゲノム、エピゲノム、トランスクリプトーム、プロテオミクス、および環境因子を統合する複雑な細胞ネットワークの最終生成物です。したがって、メタボロミック分析は、様々な生物内の生物学的プロセスの多くのこれらの要因の作用の結果を直接評価する。これらの生物の一つは、出芽酵母 サッカロミセスセレビシエ、完全に配列されたゲノムを持つ単細胞真核生物です。 S.cerevisiae は包括的な分子解析に適しているため、真核細胞内の多くの生物学的プロセスの根底にあるメカニズムを解剖するモデルとして使用されています。水溶性のメタボロムの堅牢で、敏感で、正確な定量的評価のための多目的な分析方法は、これらのメカニズムを解剖するための不可欠な方法論を提供するであろう。ここでは 、S.セレビシエ 細胞からの代謝活性の活性化および水溶性代謝産物抽出の最適化条件に関するプロトコルを提示する。このプロトコルはまた、抽出された水溶性代謝産物の定量分析のためのタンデム質量分析(LC-MS/MS)と結合された液体クロマトグラフィーの使用を記述する。ここで説明する非標的メタボロミクスのLC-MS/MS法は、汎用性と堅牢性があります。それはこれらの代謝物の異なった構造異性体および立体異性体形態を含む多様な構造、物理的、および化学的特性を有する370以上の水溶性代謝産物の識別そして定量化を可能にする。これらの代謝産物は、種々のエネルギー担体分子、ヌクレオチド、アミノ酸、単糖類、解糖の中間体、および三カルボン酸サイクル中間体を含む。LC-MS/MS法は、非標的メタボロミクスの感度が高く、0.05 pmol/μLの低濃度で水溶性代謝物の同定と定量を可能にします。この方法は、異なる条件下で培養した野生型および変異酵母細胞の水溶性メタボロメの評価に成功して使用されている。
Introduction
水溶性代謝産物は、低分子の中間体であり、必須の細胞プロセスに寄与する代謝産物です。これらの進化的に保存されたプロセスには、栄養素の使用可能エネルギーへの変換、高分子の合成、細胞増殖およびシグナル伝達、細胞周期制御、遺伝子発現調節、ストレス応答、代謝の翻訳後調節、ミトコンドリア機能の維持、静脈細胞密売、オートファジー、細胞老化、および調節細胞死1、2、3が含まれる。
水溶性代謝産物のこれらの本質的な役割の多くは、出芽酵母S.cerevisiae1、3、4、7、9、14、15、16、17、18、19、20、21、22の研究によって発見されています。この単細胞真核生物は、高度な生化学的、遺伝的、および分子生物学的解析23、24、25、26へのアメナビリティによる細胞プロセスに水溶性代謝物が寄与する解剖機構を解剖するための有用なモデル生物である。非標的メタボロミクスのLC-MS法は、出芽酵母3、18、22、27における水溶性代謝産物の役割を研究するために使用されてきたが、この種の分析では、その汎用性、堅牢性、感度、およびこれらの代謝産物の異なる構造異性体と立体異性体形態を区別する能力の向上が必要である。
近年、非標的メタボロミクスのLC-MS/MS法を生体内の水溶性代謝産物のプロファイリングに適用する際の大きな進歩が顕著である。しかし、この方法論を使用する上での多くの課題は、2、28、29、30、31、32、33、34、35、36のままです。これらの課題には、次のようなものがあります。まず、多くの水溶性代謝産物の細胞内濃度が、現在使用されている方法に対する感受性の閾値を下回る。第二に、代謝活性の改善の効率が低すぎると、細胞内代謝産物の焼入れ関連細胞漏出の程度は、現在の方法では高すぎる。したがって、現在使用されている水溶性代謝産物の細胞内濃度を過小評価する方法。第三に、既存の方法では、特定の代謝物の構造異性体(すなわち、同じ化学式を持つ分子が原子結合性が異なる分子)や立体異性体(すなわち、同じ化学式と原子結合性を有する分子)を区別することはできません。これにより、現在使用されているメソッドによる特定の代謝物の正しい注釈がなくなります。第4に、親イオン(MS1)と二次イオン(MS2)の既存の質量スペクトルオンラインデータベースは不完全です。これは、現在のメソッドの助けを借りて生成された未加工の LC-MS/MS データを使用して、特定の代謝産物の正しい識別と定量に影響します。第五に、既存の方法は、水溶性代謝産物のすべてのまたはほとんどのクラスを回復するために単一のタイプの代謝産物抽出を使用することはできません。第六に、既存の方法は、水溶性代謝産物の全てのクラスまたはほとんどのクラスを互いに分離するために、単一のタイプのLCカラムを使用することはできません。
ここでは 、S.セレビシエ 細胞内の代謝活性を改善し、抽出前にこれらの細胞内の水溶性代謝産物の大部分を維持し、酵母細胞からほとんどのクラスの水溶性代謝産物を抽出するための条件を最適化した。我々は 、S.セレビシエ 細胞から抽出された370以上の水溶性代謝産物のLC-MS/MSベースの同定と定量のための汎用性、堅牢で高感度な方法を開発しました。非標的化メタボロミクスのこの方法は、種々のエネルギーキャリア分子、ヌクレオチド、アミノ酸、単糖、解糖の中間体、および三カルボン酸サイクル中間体の細胞内濃度を評価することを可能にする。開発されたLC-MS/MS法により、多様な構造、物理的、化学的特性を有する水溶性代謝産物の異なる構造異性体および立体異性体の同定と定量化が可能です。
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Protocol
1. 酵母を育てる培地を製造し、殺菌する
- 完全な酵母エキスの180 mLをバクトペプトン(YP)培地で作ります。完全なYP培地は、1%(w / v)酵母エキスと2%(w / v)バクトペプトンが含まれています。
- 180 mLのYP培地を4つの250 mLのエルレンマイヤーフラスコに均等に分配します。これらのフラスコのそれぞれは、YP培地の45 mLを含む。
- 15 psi/121 °Cで45分間オートクレーブすることにより、YP培地でフラスコを殺菌します。
2. 野生型酵母菌株
- BY4742(MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0)株を使用します。
3. 2%グルコースを含むYP培地中の酵母の成長
- 15 psi/121 °Cで45分間オートクレーブすることにより、グルコースの20%(w/v)ストック溶液を殺菌します。
- 45 mLの滅菌されたYP培地を用いて、2つのエルレンマイヤーフラスコのそれぞれにグルコースのオートクレーブ20%(w/v)ストック溶液の5 mLを加えます。YP培地中の最終濃度グルコースは2%(w/v)である。
- 2%グルコースを含むYP培地で、酵母細胞を2つのエルレンマイヤーフラスコのそれぞれに接種するために、微生物学的ループを使用してください。
- 200rpmに設定した回転シェーカーで、酵母細胞を30°Cで一晩成長させます。
- 酵母文化のアリコートを取る。培養のmL当たりの酵母細胞の総数を決定する。ヘモサイトメーターを使用して細胞を数えます。
4. 細胞への移動と細胞は、2%グルコースを有するYP培地で成長する
- 殺菌した20%(w/v)ストック溶液の5 mLを、オートクレーブされたYP培地を用いて残りの2つのエルレンマイヤーフラスコのそれぞれに添加する。グルコースの最終的な濃度は2%(w/v)です。
- 合計5.0 x107細胞 を含む2%のグルコースを含む2%のグルコースを有するYP培地中の一晩酵母培養物の体積を、2%グルコースを含むYP培地を用いた2つのエルレンマイヤーフラスコのそれぞれに移す。細胞の移動に滅菌ピペットを使用してください。
- 200rpmに設定した回転シェーカーで30°Cで酵母細胞を少なくとも24時間(または実験が必要な場合は以上)成長させます。
5. 試薬の製造、ラボウェアの準備、細胞焼入れ装置の設置
- 以下を準備する:1)クエンチング溶液(60%高グレード(>99.9%)メタノール155mM重炭酸アンモニウム(ABC)緩衝液、pH = 8.0);2)氷冷ABC溶液(pH = 8.0);3)-20 °Cまで測定することができるデジタル温度計;4)500 mL大遠心分離機ボトル。5)事前に冷却された高速遠心分離機、あらかじめ冷却されたローターと、このローター用の500 mL遠心分離ボトルを-5 °Cで冷却。6)代謝物抽出管(ポリテトラフルオロエチレン裏地付きキャップ付き15 mL高速ガラス遠心管)。7)ドライアイス。
6. 細胞の焼入れ
- 血球体を使用して、2%グルコース培養でYPのmL当たりの酵母細胞数を決定します。
- 5.0 x 108 細胞の総数を含む2%のグルコースを含むYP培地の培養液の体積を、冷却済みの500 mL遠心分離機ボトルに移します。
- 細胞を含む遠心分離器ボトルを200mLの体積まで、-20°Cに保存された消光液で素早く満たします。
- -5 °Cで3分間、11,325 x gの高速遠心分離機でボトルを遠心分離します。
- 迅速かつ優しく遠心分離機からボトルを回復します。蓋を緩めて外し、ペレットを邪魔することなく上清を取り除きます。
- 10 mLの氷冷ABCバッファーで細胞ペレットを素早く再懸濁し、代謝物抽出用のポリテトラフルオロエチレン裏地付きキャップを備えた15mL高速ガラス遠心管に懸濁液を移管します。
- 0°Cで3分間3,000 x gの臨床遠心分離で遠心分離によって細胞を収集します。
- 上清を素早く取り除き、ドライアイスにチューブを置いて、代謝物の抽出を開始するか、抽出するまで-80 °Cでチューブを保管します。
7. 代謝物抽出用の試薬、実験器具、装置の調製
- 以下を準備します: 1) LC-MSグレードクロロホルム;2)LC-MSグレードメタノール;3)LCグレードナノ純水;4) LC-MSグレード (ACN);5)ガラスビーズ(酸洗浄、425-600 μm);6)リテーナー付きフォームチューブホルダーキット付き渦。7)ポリテトラフルオロエチレン裏地付きキャップ付き15 mL高速ガラス遠心分離管;8)MSバイアル。9)ドライアイス;10)1.5mLチューブをエタノールで1回、ACNで1回、ナノ純水で1回洗浄した。
注:有機溶剤に対して耐性のあるポリプロピレン製のマイクロピペットチップとチューブのみを使用してください。
8. 代謝物抽出
- ドライアイスに保管するか、ステップ6.7から-80°Cのチューブで保存した代謝物に、次の1)2 mLのクロロホルムを-20°Cで保存します。2) -20 °Cで保存されたメタノールの1 mL;3)氷冷ナノ純水の1 mL;4)425-600 μmの酸洗浄ガラスビーズの200 μL。
- チューブの口をアルミホイルで覆い、閉じます。リテーナーと渦を持つフォームチューブホルダーキットにチューブを置き、中速で30分間(すなわち、6に設定された速度で、12は渦の最高速度)4°Cで、代謝物の抽出を容易にします。
- チューブを氷上で15分間インキュベートし(ドライアイスではありません!)、タンパク質の沈殿と下側の有機相からの上水域の分離を促進します。
- 4°Cで10分間3,000 x gの臨床遠心分離機でチューブを遠心分離します。 この遠心分離ステップは、上層水相(水溶性代謝物を含む)を中間層(細胞の破片およびタンパク質を含む)および下の有機相(主に脂質を含む)から分離することを可能にする。
- マイクロピペットを使用して、上の水相(400 μL)を洗浄し、-20°Cで保存した800 μLのACNを含む1.5mLチューブに転写します。
注:ACNに上水相を加えた後、白雲の降水量が-20°Cに保たれています。 - サンプルをテーブル上の遠心分離機で13,400 x gで4°Cで10分間遠心します。
注:遠心分離後、白雲の降水量は消えます。 - チューブ内の液体の上部からラベル付きMSバイアルに800 μLを移します。LC-MS/MSで分析されるまで0°Cで保存してください。
9. LC用試薬・ラボウェア・装置の製造
- 以下を準備します: 1) 渦。2)超音波超音波処理器。3)MSガラスバイアル。4)バイナリポンプ、脱ガッサー、およびオートサンプラーを装備したLCシステム。5) ジウテリオニック相クロマトグラフィーカラム(5 μmポリマー、150 x 2.1 mm)を 材料表に記載。6)カラムヒーター。7)移動相、相A(5:95 ACN:水(v/v)20 mM酢酸アンモニウム、pH = 8.0)および相B(100%ACN)を含む。
10. LCによる抽出された代謝物の分離
- MSバイアルの内容を15分間超音波処理します。
- 室温(RT)で10秒間MSバイアル3倍を渦。
- MSバイアルをウェルプレートに入れなさい。
- クロマトグラフ中は、カラムを45 °C、流量0.250 mL/minに保ちます。試料は、0°Cのウェルプレートに保管してください。 クロマトグラフィーで使用する必要がある LC 勾配については、 表 1 を参照してください。
注:野生型株BY4742の細胞から抽出した水溶性代謝物の代表的な全イオンクロマトグラムを 図1に示す。LCによって分離された代謝産物を同定し、ステップ11について説明したように、正イオン化[ESI(+)]モードで行った質量分析によって定量化した。
11. LCによって分離された代謝物の質量分析
- LCで分離された水溶性代謝物の同定と定量のために、加熱エレクトロスプレーイオン化(HESI)を備えた質量分析計を使用してください。MS1イオン用の質量分析計とMS2イオン用の質量分析計の検出器を使用します。 MS1およびMS2 イオンのデータ依存的な取得については、表2および 表3 に示す設定を使用します。
- ESI(+)モードとESI(-)モードの両方で、注入には10 μLのサンプルボリュームを使用します。
12. LC-MS/MSからの生データ処理による異なる代謝物の同定と定量
- 材料表に記載されているソフトウェアを使用して、生の LC-MS/MS ファイルから異なる水溶性代謝物の同定と定量を行います。このソフトウェアは、代謝物の定量にMS1、代謝物の同定にMS2を使用します。ソフトウェアは、最も広範囲にキュレーション質量スペクトル断片化ライブラリを利用して、MSスペクトルを一致させることによってLC-MS/MS生データを使用して代謝物にアナティケートします。このソフトウェアはまた、オンラインデータベースを使用して代謝物にアナプトするためにMS1と同位体パターンマッチの正確な質量を使用しています。詳細については、図 2を参照してください。
- オンラインで自由に利用できるデータベースとスペクトルのライブラリ(https://www.mzcloud.org)を使用して、生データのMS2スペクトルを検索します。
13. ヨウ化プロピジウム(PI)染色法および蛍光顕微鏡による膜完全性測定
- ステップ6について説明したように細胞の焼入れを行った後、焼入れ細胞を15mLのABCバッファーで十分に洗浄し、焼入れ溶液を除去する。0°Cで5分間3,000xgで遠心分離して細胞を採取する。
- ABCバッファーの1 mLで細胞ペレットを再懸濁し、PI溶液(0.5 mg/mL)の0.5 mLを加えます。
- 10 sのサンプル3xでチューブをボルテックスし、暗闇と氷の上で10分間インキュベートします。
- サンプルをテーブル上の遠心分離機で13,400 x gで4°Cで10分間遠心します。
- 上清を取り除き、ABCバッファーの1mLでペレットを再懸濁します。
- チューブを13,400 x gで4°Cで10分間遠心し、上清を取り除く。この手順をさらに 2 回繰り返して、セル表面にバインドされた PI を削除します。
- ABCバッファーの300 μLでペレットを再懸濁します。10 μLのサスペンションを顕微鏡スライドの表面に置きます。
- 微分干渉コントラスト(DIC)と蛍光顕微鏡画像を蛍光顕微鏡で撮影します。励起波長と発光波長が593nmと636nm(それぞれ)に設定されたフィルタを使用します。
- ソフトウェアを使用して、総細胞数(DICモード)と蛍光染色細胞数をカウントします。また、このソフトウェアを使用して、個々の細胞の染色の強度を決定します。
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Representative Results
酵母細胞内の水溶性代謝産物の定量的評価を改善するために、代謝産物検出のための細胞焼入れ条件を最適化した。この目的のための細胞の焼入れは、細胞31、33、37、38内のすべての酵素反応の迅速な逮捕を伴う。このような細胞代謝活性の停止は、生体内の水溶性代謝産物の定量に必要な方法の不可欠な工程であり、それらの細胞内濃度31、33、37、38の過少推定を防ぐので、代謝産物評価のための細胞の焼入れは、常に、細胞膜(PM)(および細胞壁(CW)の完全性を損なう場合、存在する場合は、その後、細胞壁の完全性を損なう。これは、セル31、33、37、38から代謝物漏れを引き起こします。この方法は、このような障害を最小限に抑える細胞急行条件を採用し、それによって細胞内代謝産物の焼入れ関連細胞漏出を著しく減少させる。実際、細胞クエンチングの最新の方法の大部分は、特定の温度(すなわち、-20°C、-40°C、-60°C)の特定の温度で、メタノールの一定の濃度(すなわち、40%(v/v)、60%(v/v)、または100%(v/v))を使用することを含む37のバッファを有する。現在使用されている細胞の消し込み方法の1つについて、PMとCW障害の効率を比較しました(すなわち、細胞処理により、−40°Cで−40°Cで−40°Cで−40°Cでメタノールを用いて処理し、それに対して、改変細胞クエンチ法(すなわち、pH= 8.0でABCの等張液の存在下で−20°Cで60%(v/v)メタノールでの細胞処理によって。PIは、無傷の細胞に不透過性である蛍光色素です。PM (および CW の) の整合性が損なわれる場合にのみセルに入ることができます39。また、PIによる蛍光発光の強度は、DNAまたはRNA39に結合すると30倍に上昇する。従って、PI染色アッセイは、酵母細胞のPM及びCWが損傷した場合にのみ細胞外空間に漏れ出し得るため、細胞内代謝産物の焼入に関連する細胞漏出の効率を評価するために用いることができる。改変細胞の焼入れ方法は、−40°Cで非緩衝80%(v/v)メタノールによる細胞処理による焼入れ法よりもPMおよびCWへの損傷を著しく低くすることがわかった(図3)。実際、この方法を用いて焼入れを行った細胞のほとんど全てが、PM及びCWが損傷していない酵母細胞に特徴的な赤色蛍光発光を示した(図3)。これに対し、他の方法を用いて焼入れを行った細胞のほとんどすべてが、PM及びCWが著しく損傷している酵母細胞の緑色蛍光発光特性を示した(図3)。最も強い赤色蛍光は、強い赤色蛍光と軽度の赤い蛍光放出を区別するソフトウェアによって緑色蛍光に変換された。
改変細胞クエンチン化法は、酵母細胞からの水溶性代謝物の漏出を、-40°Cで非緩衝型80%(v/v)メタノールで細胞処理することにより顕著に低い。 我々は、pH = 8.0でABCの等張緩衝溶液の存在下で-20°Cで60%(v/v)メタノールでの細胞処理によって、同数の酵母細胞を焼入れさせる。図4)または他の方法(すなわち、-40°Cで非緩衝80%(v/v)メタノールで細胞処理によって;図 5.細胞外溶液への焼入関連細胞漏出の程度を、LC-MS/MSの助けを借りて特定の水溶性代謝産物について評価した。細胞外溶液中の異なるアミノ酸クラス(すなわち、大および小酸性、塩基性、中性非極性、中性極性アミノ酸)の濃度を、細胞外の焼入れ前および後に測定した。細胞クエンチ法は、これらの全てのアミノ酸クラスの他の方法(図4)より細胞外溶液への漏出が著しく低いことを発見した(図5)。
酵母細胞内の水溶性代謝産物の定量的評価のためのLC-MS/MS法は、すべての水溶性代謝物クラスのクロマトグラフィー分離のためにカラムの単一のタイプを使用します。この列は、材料表で名前が付けられたジウテリオニックフェーズ列です。このコラムは、表(補足表1)で示された逆相カラムよりも、水溶性代謝物の異なるクラスの分離をはるかに効率的に提供することがわかりました。実際、水溶性代謝物標準(すなわち、NAD+、AMP、GMP、アルギニン、グルタミン酸)の保持時間(RT)シフト値は有意に低く、逆相カラム(補足表1)と比較して、ツウィッテリオニック相カラムのピーク形状が実質的に鋭かった。逆相カラムに対するすべての代謝産物のクロマトグラフィー分離に用いられるLC条件(すなわち、水溶性および水不溶性)は補足表2に記載されている。
LC-MS/MS法のもう一つの利点は、上記のジウテリオニック相カラム上のクロマトグラフィー分離が、多様な構造、物理的、化学的特性を持つ異なる水溶性代謝産物を効率的に分離する能力にある。これらの水溶性代謝産物は、次の代謝物クラスを含む:1)酸性、塩基性、中性極性、および非中性極性アミノ酸、それらの異なる構造異性体を含む(図6);2)細胞内で重要な機能を実行する安定かつ不安定なヌクレオチドとその誘導体(図7);3)様々な単糖、異なる立体異性体形態を含む(図8)。
重要なことに、酵母細胞内の水溶性代謝産物の定量的評価のためのLC-MS/MS法は、汎用性と堅牢性がありました。2%グルコースを最初に含む完全なYP培地で培養した セレビシエ 細胞の多様な構造、物理的、化学的特性を有する374個の水溶性代謝産物を同定し、定量化することができた(補足表3)。240の代謝物が正イオン化モードで検出され、134の代謝産物が陰イオン化モードで検出された。これらの水溶性代謝産物の全ての同定は、正と負のイオン化モードで獲得したデータ依存的な取得(DDA)MS2断片をMS2 mzCloudスペクトルライブラリに一致させることによって確認された。このオンラインライブラリには、MS1 と DDA MS2 パラメータが異なる代謝産物標準のスペクトルが含まれています。サンプルのMS2スペクトルをオンラインスペクトルライブラリと一致させる範囲を最大化するために、異なるDDA MS2パラメータを使用しました。これらのパラメータは 補足表 4に示されています。同じサンプルに対する約6,000の特徴(推定代謝産物)は、上位5 MS2イベント、35個の衝突エネルギー値、および10ms活性化時間を使用して、高エネルギー誘発衝突解離(HCD)または衝突誘発解離(CID)断片化法の助けを借りて取得された。95% MS2のマッチングと90%のMS1同位体パターンの一致基準> >を持つ結果のファイルをフィルタリングした後、HCD断片化条件下で162の代謝産物とCID断片化条件下で142の代謝産物のみが同定された。162 個の代謝物のうち 81 個は HCD 断片化法に固有であったのに対し、142 個中 42 個は CID フラグメンテーション方法に固有でした ( 補足表 4の「T5_35E__10 ms_HCD vs CID」というシートを参照)。そこで、LC-MS/MS法の助けを借りて水溶性代謝物の正しい注釈を使用するには、多くの異なるDDA MS2パラメータを使用する必要があると結論付けました。
LC-MS/MS法も高感度です。0.05 pmol/μLの低濃度で水溶性代謝物を同定し定量することができます(表4のフェニルアラニンのデータを参照)。この定量限界は、代謝物クラスごとに広範囲の濃度内で変化する(表4)。
ここで使用するMSシステムは、様々な代謝物の濃度を測定するための広い(少なくとも2桁の)線形ダイナミックレンジを有する(補足表5)。
図1:野生型株BY4742の細胞から抽出した水溶性代謝物の液体クロマトグラフィー/質量分析(LC-MS)データからのイオンクロマトグラム(TIC)の全量。 代謝物は、 材料表で命名されたジウテリオニック相クロマトグラフィーカラム上のLCによって分離されました。代謝物は、正のエレクトロスプレーイオン化モードを使用して作成された親イオン(MS1)のMSによって検出されました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2: 材料表に記載されているソフトウェアの助けを借りて水溶性代謝物の分析に使用されるワークフロー。 MS生データに基づいてすべてのパラメータが自動的に修正されました: 1) 「化合物を検出」タブ: 設定最小, ピーク強度 10,000;2)「検索ChemSpider」タブ:4つのオンラインデータベースは、バイオサイク、ヒトメタボロームデータベース、KEGG、酵母メタボロームデータベースを含む代謝産物の同定のために選択されました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:差動干渉コントラスト(DIC;上段)および蛍光(下段)の酵母細胞の顕微鏡画像は、炭酸水素アンモニウム(ABC)緩衝液(pH=8.0;対照)または異なる焼入溶液で消光した。 細胞クエンチ後、同数の細胞を暗黒および氷上で10分間PI溶液でインキュベートした。最も強い赤色蛍光は、強い赤色蛍光と軽度の赤い蛍光放出を区別するためにソフトウェアによって緑色蛍光に変換された。PMおよびCWへの損傷の効率を、細胞クエンチン化の方法(すなわち、pH=8.0でABCの等張性緩衝溶液の存在下で−20°Cで60%(v/v)メタノールでの細胞処理によって、および現在使用されている方法の1つ(すなわち、80%(v/v)の細胞処理によってC°Cの緩衝液で比較した。スケール バーが表示されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:細胞を焼成する方法に対する異なるアミノ酸クラスの漏れ率を 5.0 x108 の酵母細胞は、pH=8.0でABCの等張性緩衝溶液の存在下で−20°Cで60%(v/v)メタノールで処理することにより焼入を行った。異なるアミノ酸クラスの漏れ率をLC-MS/MSを用いて、焼入れの前後の細胞外溶液中の濃度を測定した。SDと個々±データポイントの平均値が表示されます(n = 3)。* p < 0.05. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:現在使用されている細胞クエンチ法の1つに対する異なるアミノ酸クラスの漏れ率を有する5.0 x 108の酵母細胞は、緩衝液の無い場合に−40°Cで−40°Cのメタノールでの処理により焼入を行った。異なるアミノ酸クラスの漏れ率をLC-MS/MSを用いて、焼入れの前後の細胞外溶液中の濃度を測定した。SDと個々±データポイントの平均値が表示されます(n = 3)。* p < 0.05.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:材料表に記載されているジウテリオニック相カラム上の2つの構造異性体(すなわち、ロイシンおよびイソロイシン)を含む酸性、塩基性、中性極性および非中性極性アミノ酸クラスの効率的なクロマトグラフィー分離。これらのアミノ酸はすべて正イオン化[ESI(+)]モードでMS/MSによって検出された。 ジウテリオニック相クロマトグラフィーカラムのLCの条件は 、表1に記載されている。MS/MS の条件については、 表 2 および 表 3 を参照してください。すべてのアミノ酸標準は商業的に購入されます (例えば, シグマ).3つの独立したクロマトグラフィーの間の保持時間のずれは、±10秒未満です。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:エネルギー的に不安定なヌクレオチド(ヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸)および電子担体分子(NADHおよびNAD+)を含む異なるクラスのヌクレオチドの効率的なクロマトグラフィー分離を、材料表に記載されているゼッテリオニック相カラムに記載した。これらのヌクレオチドはすべて、正イオン化[ESI(+)]モードでMS/MSによって検出された。ジウテリオニック相クロマトグラフィーカラムのLCの条件は、表1に記載されている。MS/MS の条件については、表 2および表 3 を参照してください。すべてのヌクレオチド標準は商業的に購入される(例えば、シグマ)。3つの独立したクロマトグラフィーの間の保持時間のずれは、±10秒未満です。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8:アルドとケトヘキソス(フルクトース、マンノース、ガラクトース)の構造異性体および立体異性体形態、およびアルドキトース(リボースおよびアラビノース)を含む単糖の異なるクラスの効率的なクロマトグラフィー分離これらの単糖はすべて正イオン化[ESI(+)]モードでMS/MSによって検出されました。ジウテリオニック相クロマトグラフィーカラムのLCの条件は、表1に記載されている。MS/MS の条件については、表 2および表 3 を参照してください。すべての単糖類の標準は商業的に購入されます(例えば、シグマ)。3つの独立したクロマトグラフィーの間の保持時間のずれは、±10秒未満です。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 列の種類 | SeQuant ZIC-pHILIC 5μmポリマー150 x 2.1 mm | ||
| ソルベントA | LC-MSグレードH2O:ACN(95:5、v/v) 20 mM酢酸アンモニウム | ||
| ソルベントB | LC-MSグレードアセトニトリル(ACN) | ||
| 圧力限界 | 最大 = 300 バー | 最小値 = 0 | |
| HPLCグラデーションプログラム | |||
| 時間(分) | 流量(0.25 ml/分) | 組成 | |
| A% | B% | ||
| 0.5 | 0.25 | 5 | 95 |
| 26 | 0.25 | 40 | 60 |
| 30 | 0.25 | 70 | 30 |
| 31 | 0.25 | 70 | 30 |
| 31.1 | 0.4 | 5 | 95 |
| 43.9 | 0.4 | 5 | 95 |
| 44 | 0.25 | 5 | 95 |
| 45 | 0.25 | 5 | 95 |
表1:材料表に記載されているジテリオニック相カラムの助けを借りて水溶性代謝物の分離に使用されるLC条件。これらの条件は、ここで説明するすべての実験で使用された。
| フルスキャン質量範囲(ダルトン) | 70-900 |
| FTMS(オービット・アナライザ)フルスキャン解像度 | 6.0 x 104 |
| FTMS (オービットラップアナライザ) HCD 解像度 | 7500 |
| FTMS フル スキャン AGC ターゲット | 1.0 x 106 |
| FTMS MSn AGC ターゲット | 5.0 x 104 |
| イオントラップ(LTQ)MSn AGCターゲット | 1.0 x 104 |
| イオン ソースの種類 | 加熱エレクトロスプレーイオン化 |
| キャピラリー温度(°C) | 275 |
| ソースヒーター温度(°C) | 250 |
| シースガスの流れ | 10 |
| オーガスの流れ | 5 |
表2:LCで分離された代謝物の分析に使用される質量分析計の設定。 これらの条件は、ここで説明するすべての実験における代謝産物の分析に使用された。略語: FTMS = フーリエ変換 (FTMS);HCD = 高エネルギーによる衝突解離;LTQ = 線形トラップ四重極;AGC = 自動ゲイン制御、MS および MS/MS のイオン母集団値。
| 計器の極性 | 正/ネガティブ |
| アクティベーションタイプ | CID/HCD |
| 最小信号が必要 | 5000 |
| 分離幅 | 2 |
| CID の正規化された衝突エネルギー | 35, 60 |
| HCD の正規化された衝突エネルギー | 35, 45, 55 |
| 既定の充電状態 | 1 |
| CID (ミリ秒) のアクティブ化時間 | 10, 30 |
| HCD のアクティブ化時間 (ミリ秒) | 10 |
| CID 内の MS/MS イベントの数 | トップ3、トップ5、トップ10 |
| HCD 内の MS/MS イベントの数 | トップ5 |
| HCD および CID の両方で使用されるマイクロ スキャンの数 | 1 |
表3:二次イオン(MS2)の検出に使用する質量分析計の設定。 略語: HCD = 高エネルギーによる衝突解離;CID = 衝突による解離;ミリ秒 = ミリ秒。
| Std代謝物 | M.W. (g/モル) | [M+H]+1 | [M-H]-1 | 検出モード | 検出された最低濃度(pmol/μL) |
| グリシン | 75.03203 | 76.03931 | 74.02475 | P | 7.43E+00 |
| トリプトファン | 204.08988 | 205.09716 | 203.0826 | P | 5.56E-02 |
| フェニルアラニン | 165.07898 | 166.08626 | 164.0717 | P | 5.14E-02 |
| アルギニン | 174.11168 | 175.11896 | 173.1044 | P | 7.14E-02 |
| スレオンニン* | 119.05824 | 120.06552 | 118.05096 | P | |
| セリン | 105.04259 | 106.04987 | 104.03531 | P | 4.66E+00 |
| グルタミン酸 | 147.05316 | 148.06044 | 146.04588 | P | 4.20E-01 |
| メチオニン | 149.05105 | 150.05833 | 148.04377 | P | 1.96E+00 |
| アスパラギン | 133.03751 | 134.04479 | 132.03023 | P | 3.75E+00 |
| バリン | 117.07898 | 118.08626 | 116.0717 | P | 1.49E+00 |
| イソロイシン | 131.09463 | 132.10191 | 130.08735 | P | 1.84E+00 |
| ロイシン | 131.09463 | 132.10191 | 130.08735 | P | 2.26E+00 |
| ヒスチジン | 155.06948 | 156.07676 | 154.0622 | P | 2.53E+00 |
| チロシン | 181.07389 | 182.08117 | 180.06661 | P | 8.72E-02 |
| リジン | 146.10553 | 147.11281 | 145.09825 | P | 1.43E-01 |
| アラニン | 89.04768 | 90.05496 | 88.0404 | P | 1.12E+00 |
| プロリン | 115.06333 | 116.07061 | 114.05605 | P | 1.05E+00 |
| システイン | 121.01975 | 122.02703 | 120.01247 | P | 8.22E-01 |
| アスパラギン | 132.05349 | 133.06077 | 131.04621 | P | 1.08E+00 |
| グルタミン | 146.06914 | 147.07642 | 145.06186 | P | 1.92E+00 |
| グアニン | 151.04941 | 152.05669 | 150.04213 | P | 5.47E+00 |
| グアノシン | 283.09167 | 284.09895 | 282.08439 | P | 3.67E-01 |
| GMP | 363.058 | 364.06528 | 362.05072 | P | 7.17E-01 |
| 国内総生産 | 443.02434 | 444.03162 | 442.01706 | P | 2.57E+00 |
| GTP | 522.99067 | 523.99795 | 521.98339 | P | 2.27E +00 |
| アンプ | 347.06309 | 348.07037 | 346.05581 | P | 5.25E-01 |
| ADP | 427.02942 | 428.0367 | 426.02214 | P | 1.32E+00 |
| ATP | 506.99575 | 508.00303 | 505.98847 | P | 1.77E+00 |
| ナドフ | 665.12478 | 666.13206 | 664.1175 | P | 1.47E+00 |
| NAD+ | 663.10912 | 664.1164 | 662.10184 | P | 3.03E+00 |
| グルコース** | 180.06339 | 181.07067 | 179.05611 | ||
| フルクトース*** | 180.06339 | 181.07067 | 179.05611 | N | 5.67E-01 |
| マンノース*** | 180.06339 | 181.07067 | 179.05611 | N | 1.05E+00 |
| ガラクトース*** | 180.06339 | 181.07067 | 179.05611 | N | 9.00E-01 |
| リボース*** | 150.05283 | 151.06011 | 149.04555 | N | 1.10E+00 |
| アラビノーズ*** | 150.05283 | 151.06011 | 149.04555 | N | 1.23E+00 |
| フルクトース-6-リン酸*** | 260.02972 | 261.037 | 259.02244 | N | 6.60E+00 |
| グルコース-6-リン酸*** | 260.02972 | 261.037 | 259.02244 | N | 4.27E+00 |
| クエン酸 | 192.12 g | 193.034279 | 191.019726 | N | 9.33E-01 |
| リンゴ酸 | 134.09 | 135.0288 | 133.014247 | N | 1.23E+00 |
| ピルビン酸 | 88.06 | 89.02332 | 87.008768 | N | 2.77E+00 |
LC-MS/MS法で同定し定量できる、水溶性代謝産物の標準の最低濃度。各代謝産物標準のMS1ピーク面積を使用して、この代謝産物の定量化可能な最も低い濃度を推定した。2つの独立した実験の平均値が示される。2つの独立した実験のそれぞれについて3つの技術的複製が行われた。注:スレオニン*は検出できますが、スレオニンの化学異性体であるホモセリンとの共溶出のために定量化することはできません。グルコース**は、複数のクロマトグラフィーピークを作成するため、特定できません。代謝産物の標準***は、個々のサンプルでのみ同定および定量することができるが、代謝産物標準または代謝産物の生物学的混合物では同定され、定量化されない。
補足表1:保持時間(RT)は、列の平衡後に、ジリテリオニック相列および逆相カラム(材料表を参照)の代謝物の同じセットの値をシフトする。この表は、ジウテリリアニック相カラムと逆相カラムの保持再現性を比較し、異なる代謝産物セットについて、親水性と疎水性において互いに異なる。これらの代謝産物は、LC-MS/MSの助けを借りて同定された親水性代謝物(すなわち、NAD+、AMP、GMP、アルギニン、グルタミン酸)のRTシフト値が有意に低く、逆相カラムと比較して、ツウィッテリオニック相カラムのピーク形状が実質的に鋭いことに注意してください。対照的に、疎水性代謝物(すなわち、ステアリン酸、ラウリン酸、およびデカノ酸)のRTシフト値は有意に低く、ピーク形状は、双胞相カラムと比較して、逆相カラムについて実質的にシャープである。ジウテリオニック相カラムと逆相カラムの助けを借りて代謝産物のクロマトグラフィー分離の条件を、それぞれ表1および補足表2に詳述する。ここで報告されたRTシフト値は、異なるバイアルから採取された20種類のサンプルの測定値に基づいています。カラム平衡後にサンプルを分析した。各サンプル中の代謝産物を5.0×108個の酵母細胞から抽出した。RTシフト値は、20種類のサンプル(n=20)の手段です。非対 t 検定から得られた p 値を使用して、2 つの列と両方のサンプルタイプ間の等分散を比較しました。こちらの表をダウンロードしてください。
補足表2:材料表で命名された逆相8列のLC条件を、本研究で異なる代謝物を分離するために使用した。 カラム特性は、150 x 2.1 mm、5 μmポリマーである。 こちらの表をダウンロードしてください。
補足表3:LC-MS/MS法を用いて回収し、アサイン化した374種類の水溶性代謝産物のリスト。 全ての代謝物は、同じLC勾配実行から回収され、 補足表4に記載されたデータ依存的取得(DDA)断片化アルゴリズムを受け、 表に記載されたソフトウェアを使用してアポイントニングした。211 個の代謝物の MS1 ピークシェイプ (テーブル内の状態は空白として示されています) は、定量に使用するのに適しており、それぞれの MS2 スペクトルは mzCloud スペクトル ライブラリと完全に一致していました。38 個の代謝産物の MS2 スペクトル (テーブル内の状態が d として示されている) は、オンラインスペクトル ライブラリと完全に一致していました。それでも、MS1ピーク形状は定量化に適していなかった。125 個の代謝産物の MS2 スペクトル (テーブル内の状態が n として示されている) は、オンラインスペクトル ライブラリと完全に一致しませんでした。これらの代謝物は、次のように記述されました:1)「構成ノードを予測する」(MS1値の正確な一致、一致した同位体と見逃した同位体の数、および理論参照標準の強度と一致する同位体%強度に基づいて代謝物にコメントを付ける)を使用します。2)を使用して、"ChemSpiderノード"(MS1値とオンラインスペクトルの類似一致スコアの正確な一致に基づいて代謝物にコメントを付けます。3)代謝物の保持時間(RT)シフト値を使用して(これらの値は、代謝産物の物理的構造および化学的特性に依存する)。表に記載されている代謝物は、3つの生物学的複製のすべてで見つかり、RTシフト値は<0.2分です 。
補足表4:水溶性代謝物のアノテーションに使用されたデータ依存型取得(DDA)断片化アルゴリズムは、表に記載されているソフトウェアの助けを借りて、ここで使用されました。
補足表5:材料表に記載されたMS系の助けを借りて、異なるアミノ酸の濃度を測定した際に観測した典型的な線形ダイナミックレンジ。 ここで使用されるMSシステムは、様々な代謝産物の濃度を測定するための幅広い(少なくとも2桁の)線形ダイナミックレンジを有する。 こちらの表をダウンロードしてください。
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Discussion
ここで説明するプロトコルを正常に使用するには、以下に説明する予防措置に従ってください。クロロホルムとメタノールは、実験室のプラスチック製品から様々な物質を抽出します。したがって、慎重にそれらを処理します。これら2つの有機溶剤と接触するステップでのプラスチックの使用を避けてください。これらのステップには、ホウケイ酸ガラスピペットを使用してください。使用前にクロロホルムとメタノールでこれらのピペットを上げます。有機溶剤に対して耐性のあるポリプロピレン製のマイクロピペットチップとチューブのみを使用してください。LC-MS/MSのサンプル調製中に、ウェルプレートに挿入する前に、ガラスバイアル内のすべての気泡を除去します。
ここで使用されるzwitterionic相カラムは、RTシフトを最小限に抑えるために、各実行後に大規模な再コンディショニングを必要とします。列の再調整では、列の約 20 ボリュームである再調整ソリューションのボリュームを使用することをお勧めします。列は、0.4 mL/minの増加流量で15分間、初期移動相で再調整する必要があります。再コンディショニング中にカラムが損傷しないように、カラムの圧力をメーカーが推奨する圧力の上限以下に保ちます。
注意すべきは、逆相モードで動作するいくつかの混合分離クロマトグラフィーカラムは、荷電代謝物40,41の分解能を可能にする。これらの混合分離カラムは、ここで使用されている逆相カラム(材料表を参照)に基づいており、電荷40,41に基づいて代謝物を分離できる極性組込グループを含んでいます。
ここでは、酵母細胞から抽出された多くの水溶性代謝産物の定量分析のための非標的メタボロミクスのLC-MS/MSベースの方法について述べた。この方法は、この目的のために現在使用されている非標的メタボロミクスのLC-MS/MSメソッドに対していくつかの利点を提供します。これらの利点には、以下のものが含まれる。まず、この方法は感度が高く、0.05 pmol/μLの低濃度で水溶性代謝産物の同定と定量を可能にします。既存の LC-MS/MS メソッドの報告された感度は、低い3、 22、27、42です。第2に、この方法は、現在使用されている手順31、33、38に対して報告されたものよりも、細胞内代謝産物の漏出を有意に低く引き出す細胞焼入法を用いる。したがって、細胞クエンチングのために開発した手順は、現在使用されている手順が水溶性代謝産物の細胞内濃度を過小評価する程度を下げます。第三に、既存のLC-MS/MS法2、31、33とは異なり、この方法は、多くの代謝産物の異なる構造異性体と立体異性体を区別する。これらの代謝産物は、種々のエネルギー担体分子、ヌクレオチド、アミノ酸、単糖類、解糖の中間体、および三カルボン酸サイクル中間体を含む。第4に、この方法を用いて、MS1とMS2の広範な質量スペクトルデータベースを作成し、生のLC-MS/MSデータを用いた広範囲の特定の代謝産物の正確な同定と定量を行った。対照的に、MS1 と MS2 の既存の質量スペクトル オンライン データベースは不完全です43,44,45.第五に、この方法は、単一のタイプの代謝産物抽出を使用して、多様な構造、物理的、化学的特性を有する水溶性代謝産物を回収する。これらの代謝産物の多様性は、酵母細胞3、22、27、46からの水溶性代謝産物の単段階抽出のための代替方法の多様性を有意に上回る。6つは、既存のLC-MS/MS法3、22、47、48とは異なり、この方法は、水溶性代謝物の様々な構造および機能的クラスを互いに分離するためにLCカラムの単一のタイプを使用する。7、この方法により、酵母細胞から抽出された370以上の水溶性代謝産物の同定と定量が可能となる。この識別可能かつ定量可能な代謝産物の数は、酵母3、22、27、49、50における非標的メタボロミクスの他の方法について報告された代謝産物の数を超えている。
この方法には、いくつかの制限があります。これらの制限は以下の通りです。LCによる代謝物分離に使用されるジウテリオニック相カラムは、各実行後に大規模な再コンディショニングが必要です。さらに、この方法は、水溶性の親水性代謝産物の非標的メタボロミクスに対してのみ効率的である。さらに、炭水化物の異性体形態(フルクトース、グルコース、ガラクトースの異性体を含む)は、この方法の助けを借りて定量化することはできません。これは、この方法で使用されるジウテリオニック相カラムが、他の代謝産物との混合物中に存在する場合、これらの炭水化物異性体を互いに分離することができないからである。また、この炭水化物は、この方法で使用されるジウテリオニック相カラムのクロマトグラフィー中に複数のピークを作成するため、グルコースを同定するためにこの方法を利用することはできません。最後に、クロマトグラフィーによる代謝物分離中の異性体ホモセリンとの共溶出により、この方法の助けを借りてスレオニンを定量化することはできません。
このLC-MS/MS法を用いて、出芽酵母 S.セレビシエの水溶性メタボロムにおける老化に関連する変化を研究します。また、この方法を用いて、老化の遅れを起こしている遺伝的、食事的、薬理的介入が、年代順の老化の際に酵母細胞の水溶性のメタボロームに及ぼす影響を調べる。LC-MS/MS法は、その多様性、堅牢性、および感度を備え、進化的に遠く離れた真核生物における水溶性メタボロムの定量的評価にうまく使用できます。
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Disclosures
著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。
Acknowledgments
ティトレンコ研究所の現在および元メンバーの話し合いに感謝しています。我々は、質量分析の生物学的応用センター、構造機能ゲノム研究センター、および顕微鏡・細胞イメージングセンター(すべてコンコルディア大学)が優れたサービスを提供することを認める。この研究は、カナダの自然科学工学研究評議会(NSERC)(RGPIN 2014-04482およびCRDPJ 515900 - 17)からの助成金によって支えられた。K.Mは、コンコルディア大学アーマンドC.アルシャンボーフェローシップとコンコルディア大学芸術科学学部優秀賞の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| L-histidine | Sigma | H8125 | |
| L-leucine | Sigma | L8912 | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Propidium iodide | Thermo Scientific | R37108 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Hardware equipment | |||
| 500 ml centrifuge bottles | Beckman | 355664 | |
| Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
| Beckman Coulter Centrifuge | Beckman | 6254249 | |
| Beckman Coulter Centrifuge Rotor | Beckman | JA-10 | |
| Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
| Digital thermometer | Omega | HH509 | |
| Foam Tube Holder Kit with Retainer | Thermo Scientific | 02-215-388 | |
| SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm) | Sigma Milipore | 150460 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µm | Agilent Technologies | 883725-901 | |
| Laboratory materials | |||
| 2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| Glass beads (acid-washed, 425-600 μm) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| 15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
| Software | |||
| Compound Discoverer 3.1 | Fisher Scientific | V3.1 | |
| Yeast strain | |||
| Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 |
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