Summary
هنا نصف بروتوكولا لتغليف الفيروسات الكاذبة وقياس نشاط تحييد الأجسام المضادة.
Abstract
ومنذ عام 1996، تتسبب فيروسات أنفلونزا الطيور H5 الشديدة الإمراض A/goose/Guangdong/1/96 في تفشي الأنفلونزا بين الدواجن والطيور البرية. في بعض الأحيان ، يقع البشر أيضا ضحية لها ، مما يؤدي إلى ارتفاع معدل الوفيات. ومع ذلك، غالبا ما يتم إعاقة أبحاث فيروس أنفلونزا الطيور شديدة الانفلونزا، بالنظر إلى أنه يجب التعامل معها داخل مختبرات مستوى السلامة الأحيائية 3. لمعالجة هذه المشكلة ، تم اعتماد الفيروسات الكاذبة كبديل للفيروسات البرية في بعض تجارب دراسات H5 HPAI. تثبت الفيروسات الزائفة أنها الأدوات المثالية لدراسة الأجسام المضادة المعادلة ضد فيروسات H5 HPAI. يصف هذا البروتوكول الإجراءات والخطوات الحاسمة لاستعدادات الفيروس الكاذب H5 HPAI ومقايسات تحييد الفيروس الكاذب. كما يناقش استكشاف الأخطاء وإصلاحها وتقييدها وتعديلها لهذه المقايسات.
Introduction
ومنذ عام 1996، تتسبب فيروسات أنفلونزا الطيور H5 الشديدة الإمراض A/goose/Guangdong/1/96 في تفشي الأنفلونزا بشكل مستمر بين الدواجن والطيور البرية، مما يتسبب في خسائر اجتماعية واقتصادية هائلة في صناعة الدواجن العالمية. في بعض الأحيان ، يصاب البشر أيضا به ، ويواجهون معدل وفيات مرتفع 1,2. ومع ذلك، غالبا ما يتم إعاقة أبحاث فيروس أنفلونزا الطيور شديدة الانفلونزا، نظرا لأنه لا يمكن معالجتها خارج مختبرات مستوى السلامة الأحيائية 3. لمعالجة هذه المشكلة ، تم اعتماد الفيروسات الكاذبة كبديل للفيروسات البرية في بعض تجارب دراسات H5 HPAI. الفيروسات الزائفة آمنة بما يكفي للممارسة في مختبرات السلامة الأحيائية من المستوى 2.
تنتمي الفيروسات الكاذبة H5 HPAI إلى فيروسات وهمية تتكون من نوى فيروسات بديلة ، ومغلفات دهنية مع البروتينات السكرية السطحية من فيروسات الأنفلونزا ، وجينات المراسل. عادة ما يتم اشتقاق نوى الفيروسات الكاذبة من فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) ، والفيروسات القهقرية مثل فيروس سرطان الدم الفئران (MLV) ، وفيروس التهاب الفم الحويصلي (VSV) 3. على وجه التحديد ، يستخدم نظام التعبئة والتغليف HIV-1 على نطاق واسع لإنتاج فيروس الأنفلونزا الكاذب ، حيث الجينات الأساسية المقدمة هي gag و pol. يعبر جين هفوة فيروس نقص المناعة البشرية عن البروتينات الأساسية. يعبر جين بول عن إنزيم الانتراز وإنزيم النسخ العكسي، وكلاهما ضروري للتعبير عن جين المراسل في الخلايا المحولة. محاكاة جينوم الفيروس البديل ، يتم احتضان جين المراسل في قلب الفيروس الكاذب في شكل الحمض النووي الريبي. سيعبر جين المراسل عن البروتين في الخلايا المضيفة. يمكن استخدام مستويات التعبير الجيني لجينات المراسل لقياس كفاءة عدوى الفيروس الكاذب 3,4. المراسل الأساسي هو لوسيفيراز اليراع لقياس وحدات التلألؤ النسبية (RLU) أو نشاط اللوسيفيراز النسبي (RLA) في الخلايا المحولة. كما يتم استخدام مراسلين آخرين مثل lacZ و Gaussia و Renilla luciferase ، فقط بدرجة أقل5.
الفيروسات الزائفة هي أدوات مثالية لدراسة الأجسام المضادة المعادلة ضد فيروسات H5 HAPI. لقياس قوة تحييد الأجسام المضادة ، يتم استخدام مقايسات تحييد الفيروس الكاذب (PN)6. الهيماجلوتينين (HA) والنورامينيداز (NA) هي بروتينات سكرية على سطح فيروس الأنفلونزاA 7,8. يتكون HA من مجال رأس كروي لربط المستقبلات ومجال جذعي للاندماج الغشائي. يحتوي بروتين NA على نشاط sialidase لتسهيل إطلاق الفيروس 7,8. يمكن لفحص PN قياس الأجسام المضادة المعادلة الموجهة إلى بروتينات HA. يمكن أيضا اكتشاف الأجسام المضادة المعادلة الموجهة إلى الرأس ومنطقة الجذع من HA عن طريق فحوصات الارتباط الفيروسي والدخول. بالمقارنة مع الفيروسات البرية ، فإن تجارب تحييد الفيروس الكاذب لها قيم كشف أكثر حساسية ، ويمكن التعامل معها بأمان في مختبر السلامة البيولوجية من المستوى 2 ، وهي عموما أسهل في العمل في الممارسة العملية.
يعرض هذا البروتوكول بالتفصيل الإجراءات والخطوات الحاسمة لمستحضرات الفيروس الكاذب H5 HPAI وفحوصات PN. كما يناقش استكشاف الأخطاء وإصلاحها وتقييدها وتعديلها لهذه المقايسات. وفي هذه الدراسة، استخدمت كمثال على ذلك السلالة A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH) من فيروسات H5N1 HPAI. للحصول على الأمصال المناعية المستخدمة في المقايسات ، اختار هذا البروتوكول بروتين HA الناشئ من سلالة TH كمناعي لتحصين الفئران.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء جميع العمليات التجريبية المتعلقة بالفيروس الكاذب تحت حالة ABSL2 في معهد باستور التابع لأكاديمية شنغهاي الصينية للعلوم (IPS ، CAS). تم إجراء التجارب على الحيوانات بناء على بروتوكولات الحيوانات المعتمدة من لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية من IPS ، CAS.
1. تغليف الفيروسات الكاذبة مع نقل الكالسيوم والفوسفات
- قم بعمل معلقات أحادية الخلية لخلايا HEK293FT (9 × 105 لكل مل) في وسط DMEM كامل (الجدول 1). أضف 10 مل من المعلقات أحادية الخلية إلى دورق T75 ، واحتضن الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون (CO2) لمدة 20 ساعة قبل النقل.
ملاحظة: يوصى باستخدام HEK293FT ممر منخفض (<20 مقطعا). تأكد من أن الطبقة الأحادية للخلية متقاربة بنسبة 80-90٪. - استبدل الوسط ب 10 مل من الوسط الطازج الكامل الذي يحتوي على الكلوروكين (100 ميكرومتر) قبل 2 ساعة من النقل.
- امزج الكواشف والحمض النووي البلازميد كما هو موضح في الجدول 2 والشكل 1: ddH 2 O ، pCMV / R-HA ، pCMV / R-NA ، pHR-Luc ، pCMV Δ 8.9 ، 2.5 M CaCl2 ، و 2x HEPES buffer. ماصة صعودا وهبوطا 5 مرات بلطف ، احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 20 دقيقة.
- انقل الخليط إلى الوسط فوق الخلايا ، وهز القارورة برفق. احتضان الخلايا في حاضنة الخلايا لمدة 15 ساعة.
- استبدل الوسط ب 15 مل من وسط DMEM الكامل الطازج. احتضان الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 65 ساعة.
ملاحظة: سيكون لون الوسط برتقاليا فاتحا أو أصفر قليلا ، ويجب أن يظهر 80٪ على الأقل من الخلية تأثير الاعتلال الخلوي (CPE) تحت المجهر الضوئي المقلوب. - احصد المادة الطافية ، وطردها مركزيا عند 2095 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. اجمع المادة الطافية ، وقسمها ، واحفظها في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
2. الكشف عن تعبير بروتين HA و NA و HIV-1 p24 للفيروس الكاذب للأنفلونزا
- الكشف عن تعبير بروتين HA عن طريق مقايسة الهيماجلوتينين (HA).
- أضف 50 ميكرولتر من PBS إلى الأعمدة 2-12 ، الصفوف A و B و C من لوحة مستديرة القاع ذات 96 بئرا.
ملاحظة: ينتمي الصف A و B و C إلى 3 اختبارات نسخ متماثل مستقلة ، ويتم استخدام العمود 12 كعنصر تحكم سالب. - أضف 100 ميكرولتر من الفيروس الكاذب إلى آبار العمود 1. انقل 50 ميكرولتر من العمود 1 إلى العمود 2 ، واخلطه جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 5 مرات ، وقم بإجراء التخفيفات ذات الشقين حتى العمود الأخير 11 ، وتجاهل 50 ميكرولتر الإضافية من العمود 11.
- أضف 50 ميكرولتر من كريات الدم الحمراء 0.5٪ في كل بئر ، وقم بسحبها لأعلى ولأسفل برفق مرتين. احتضان اللوحة لمدة 30-60 دقيقة في RT أو حتى تشكل كريات الدم الحمراء للتحكم السلبي البقع العادية في قاع البئر.
- مراقبة وتسجيل عيار HA للفيروس الكاذب.
ملاحظة: وحدة HA للفيروسات الكاذبة هي أعلى عامل تخفيف للفيروس يمكن أن يسبب تراصا دمويا بنسبة 100٪ لخلايا الدم الحمراء.
- أضف 50 ميكرولتر من PBS إلى الأعمدة 2-12 ، الصفوف A و B و C من لوحة مستديرة القاع ذات 96 بئرا.
- كشف تعبير بروتين HA و NA عن طريق مقايسة اللطخة الغربية.
ملاحظة: يتم تنفيذ جميع خطوات اللطخة الغربية وفقا لدليل الاستنساخ الجزيئي(الطبعة 4). - اكتشف تعبير بروتين HIV-1 p24 بواسطة مجموعة HIV-1 p24 ELISA (جدول المواد).
- أضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل إلى 450 ميكرولتر من عينة الفيروس الكاذب. امزجه جيدا.
- أضف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل إلى كل بئر من الصفيحة الدقيقة. اضرب اللوحة المقلوبة لإزالة المخزن المؤقت للغسيل تماما. كرر الغسيل 5 مرات.
- أضف 200 ميكرولتر من المعيار والعينات إلى كل بئر على حدة. احتضانها عند 37 درجة مئوية طوال الليل أو لمدة 2 ساعة.
- نضح محتويات اللوحة واغسل اللوحة كما هو موضح في الخطوة 2.3.2.
ملاحظة: اترك بئرا واحدا من لوحة الفحص فارغا لاستخدامه كركيزة فارغة. - أضف 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة لكاشف p24 إلى كل بئر. احتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. نضح وغسل اللوحة كما هو موضح في الخطوة 2.3.2.
- أضف 100 ميكرولتر من محلول عمل الستربتافيدين بيروكسيديز إلى كل بئر ، واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. نضح وغسل اللوحة كما هو موضح في الخطوة 2.3.2.
- أضف 100 ميكرولتر من محلول العمل الفرعي إلى كل بئر ، بما في ذلك بئر الركيزة الفارغة ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: سوف يتطور اللون الأزرق في الآبار. - أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتوقف إلى كل بئر.
ملاحظة: سيتغير اللون الأزرق إلى اللون الأصفر على الفور. - اقرأ الكثافة البصرية عند 450 نانومتر في غضون 15 دقيقة. سجل عيار p24 للفيروس الكاذب
3. معايرة الفيروس الكاذب
- قم بعمل معلقات أحادية الخلية لخلايا MDCK (5 × 104 لكل مل) في وسط DMEM كامل ، أضف 1250 و 2500 و 5000 و 10000 و 20000 و 40000 خلية إلى آبار مختلفة من صفيحة مسطحة القاع 96 بئرا. احتضان الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 20 ساعة.
- أخرج الفيروس الكاذب من الثلاجة -80 درجة مئوية ، وقم بإذابة الجليد ، ودوامة الفيروس الكاذب.
- أضف 6 فيروسات كاذبة HAU (6x HA) إلى كل بئر من 96 صفيحة مستديرة القاع وجدد كل بئر ب DMEM الكامل حتى 120 ميكرولتر.
- ماصة أعلى وأسفل الخليط 5 مرات لخلط جيدا. احتضان لوحة الخليط في حاضنة 37 °C ، 5 ٪ CO2 لمدة 1 ساعة.
- نقل 100 ميكرولتر من الخليط إلى الخلايا في لوحة 96 بئر. ضع لوحة زراعة الخلايا مرة أخرى في الحاضنة لمدة 48 ساعة و 60 ساعة و 72 ساعة بعد الإصابة بالفيروس.
- أخرج اللوحة من الحاضنة وقم بإجراء فحص luciferase (جدول المواد).
- قم بإزالة الوسط من آبار اللوحة بعناية. شطف الخلايا مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وإزالة برنامج تلفزيوني قدر الإمكان.
ملاحظة: اقلب اللوحة وتخلص من المادة الطافية عن طريق صفعها عكسيا على ورق ماص. إذا لم يتمكن خط خلية الاختبار من الالتصاق بإحكام بالأسفل ، فقم بإزالة الشفط المتوسط بعناية. - أضف 50 ميكرولتر من مخزن التحلل إلى كل بئر ، وقم بهز لوحة الاستزراع عدة مرات. يخزن الطبق في درجة حرارة -80 درجة مئوية طوال الليل.
ملاحظة: امزج حجما واحدا من محلول التحلل 5x مع 4 مجلدات من الماء لعمل المخزن المؤقت للتحلل 1x. قم بموازنة المخزن المؤقت للتحلل 1x إلى RT قبل الاستخدام. هز اللوحة للتأكد من أن الخلايا مغطاة بمحلول التحلل بالكامل. يمكن أن تساعد عملية التجميد والذوبان المفردة في تحلل الخلية تماما. - أخرج اللوحة ، وازن عند RT لمدة 2 ساعة.
ملاحظة: يجب تحليل الخلية بالكامل. - هز اللوحة عدة مرات برفق ، وانقل جميع الخلايا المحللة إلى ألواح غير شفافة من 96 بئرا.
- أضف 50 ميكرولتر من الركيزة إلى كل بئر ، وقم بهز اللوحة عدة مرات برفق ، واخلط الركيزة ومحلول التحلل جيدا.
- قم بقياس الضوء الناتج في غضون 5 دقائق باستخدام مقياس الإضاءة. سجل عيار لوسيفيراز للفيروس الكاذب.
ملاحظة: عند إضافة ركيزة مناسبة ، ينبعث الضوء كمنتج ثانوي عبر تفاعل كيميائي يتم فيه تحويل لوسيفيرين إلى أوكسي لوسيفيرين بواسطة إنزيم لوسيفيراز. تتناسب كمية الضوء الناتجة مع كمية إنزيم لوسيفيراز.
4. إعداد الأمصال المناعية
ملاحظة: سيتم استخدام المصل المناعي للتجارب المتعلقة بالخلايا ، ويجب إجراء العملية التجريبية في ظل ظروف معقمة.
- تحضير 12 أنثى فأر BALB / c تبلغ من العمر ثمانية أسابيع. قسم الفئران بالتساوي إلى مجموعتين.
ملاحظة: كانت إحدى المجموعتين هي مجموعة DDV والأخرى كانت مجموعة التحكم السلبية. - تحصين مجموعة DDV: يتم التعزيز مرتين في العضل باستخدام 100 ميكروغرام من ترميز بلازميد الحمض النووي المحسن للكودون A / Thailand / (KAN-1) / 2004 (TH) بروتين HA في الأسبوع 0 والأسبوع 3 ويتم تعزيزه مرة واحدة داخل الصفاق ب 512 جسيما شبيها بالفيروس HAU TH (VLP) في الأسبوع 6.
- تحصين المجموعة الضابطة: رئيس مرتين في العضل مع 100 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد الفارغ في الأسبوع 0 والأسبوع 3 وتعزيز مرة واحدة داخل الصفاق مع فيروس نقص المناعة البشرية -1 هفوة VLP في الأسبوع 6.
- جمع دم الفأر 2 أسابيع بعد التحصين الأخير.
ملاحظة: هنا ، تم تخدير الفئران بصوديوم بنتوباربيتال (65 مجم / كجم) في وقت جمع الدم. بعد جمع الدم من الوريد تحت الفك السفلي ، تم القتل الرحيم للفئران على الفور باستخدام CO2. - الحفاظ على الدم في RT لمدة 2 ساعة ، ثم 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. أجهزة الطرد المركزي في 900 × غرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وجمع الطاف. قم بتعطيل الأمصال بوضعها على درجة حرارة 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- قم بتخزين الأمصال المناعية في ثلاجة -80 درجة مئوية للاستخدام.
ملاحظة: راجع الشكل التكميلي 1 للاطلاع على المخطط الانسيابي الذي يصف الإجراءات الرئيسية لتحصين الفئران.
5. مقايسة تحييد الفيروس الكاذب (PN)
- قم بعمل معلقات أحادية الخلية لخلايا MDCK (5 × 104 لكل مل) في وسط DMEM كامل ، وأضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر من صفيحة مسطحة القاع مكونة من 96 بئرا. احتضان الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 20 ساعة.
- أخرج الفيروس الكاذب والأمصال من الثلاجة -80 درجة مئوية ، وقم بإذابة الثلج على الجليد ، ودوامة جيدا.
- قم بتخفيف الأمصال في الوسط الكامل 20 مرة ، وأضف 100 ميكرولتر من وسط DMEM الكامل إلى آبار صفيحة مستديرة القاع مكونة من 96 بئرا من الأعمدة 2-10.
- أضف 200 ميكرولتر من الأمصال المخففة إلى آبار العمود 2 ، وانقل 100 ميكرولتر من العمود 2 إلى العمود 3 ، وقم بتخفيف الأمصال مثل 1:20 ، 1:40 ، 1:80 ، وما إلى ذلك ، إلى 1: 10240 على التوالي من العمود 2 إلى العمود 10 ، وتجاهل 100 ميكرولتر من العمود 10.
- أضف 100 ميكرولتر من الوسط الكامل DMEM إلى آبار العمود 11 كعنصر تحكم سلبي.
- أضف 100 ميكرولتر من الفيروسات الكاذبة إلى كل بئر ، ماصة لأعلى ولأسفل الخليط 5 مرات جيدا ، واحتضن لوحة الخليط في 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 1 ساعة.
- نقل 100 ميكرولتر من الخليط من الصفيحة ذات القاع المستدير 96 بئرا إلى البئر المقابلة للوحة زراعة الخلايا المكونة من 96 بئرا. ضع اللوحة مرة أخرى في الحاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) لمدة 60 ساعة.
- أخرج اللوحة من الحاضنة. قم بإجراء اختبار لوسيفيراز كما هو موضح في الخطوات 3.7-3.12.
6. فحص مرفق الفيروس الكاذب
- قم بعمل معلقات أحادية الخلية لخلايا MDCK (4 × 104 لكل مل) في وسط DMEM كامل ، وأضف معلقات خلية 100 ميكرولتر إلى كل بئر في صفيحة مسطحة القاع مكونة من 96 بئرا. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 20 ساعة.
- احتضان الفيروس الكاذب مع الأمصال في DMEM التي تحتوي على 1٪ BSA عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
ملاحظة: حجم الخليط 100 ميكرولتر. - سد خلايا MDCK ب 100 ميكرولتر لكل بئر من DMEM تحتوي على 1٪ BSA عند 4 درجات مئوية لمدة ساعة واحدة.
- تلقيح الفيروس الكاذب وخليط المصل (100 ميكرولتر) على طبقة MDCK الأحادية واحتضانها عند 4 درجات مئوية لمدة 2 ساعة.
- اغسل لوحة الخلية 4 مرات باستخدام برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ BSA لإزالة أي فيروس غير مرتبط.
- تحلل الخلايا ب 100 ميكرولتر من محلول تحلل لوسيفيراز في RT لمدة 30 دقيقة.
- حدد كمية الفيروس المرتبط على الخلايا باستخدام مجموعة HIV-1 p24 ELISA كما هو موضح أعلاه (القسم 2.3).
7. تقييم دخول الفيروس
- قم بعمل معلقات أحادية الخلية لخلايا MDCK (5 × 104 لكل مل) في وسط DMEM كامل ، وأضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر من صفيحة مسطحة القاع مكونة من 96 بئرا. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 20 ساعة قبل الفحص.
- قم بتلقيح الفيروس الكاذب (100 ميكرولتر) على طبقة أحادية MDCK في صفيحة 96 بئرا عند 4 درجات مئوية لمدة 6 ساعات.
- اغسل لوحة الخلية 4 مرات باستخدام برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ BSA لإزالة الفيروسات الزائفة غير المرتبطة.
- أضف 100 ميكرولتر من الأمصال المناعية المخففة بشكل متسلسل أو الأمصال من فئران التطعيم الوهمية في DMEM التي تحتوي على 1٪ BSA إلى الطبقة الأحادية ، واحتضان الخلية عند 4 درجات مئوية لمدة 2 ساعة.
- قم بإزالة طاف الخلية ، واغسل لوحة زراعة الخلايا 4 مرات باستخدام برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ BSA.
- أضف DMEM الطازج إلى الخلايا واحتضانه لمدة 60 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 .
- قم بقياس نشاط لوسيفيراز النسبي (RLA) للخلايا كما هو موضح في الخطوات 3.7-3.12.
ملاحظة: تم التعبير عن الدخول الفيروسي ، كما هو موضح من قبل RLA ، كنسبة مئوية من القراءة التي تم الحصول عليها في غياب الأمصال ، والتي تم تحديدها على أنها 100٪.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HA و NA و HIV-1 p24 تعبير البروتين عن الفيروس الكاذب للأنفلونزا
لتحديد كفاءة التعبئة الفيروسية ، تم اكتشاف مخزونات الفيروس الكاذب للأنفلونزا لأول مرة بواسطة اختبار HA (الشكل 2 أ). وحدات HA لكل ملليلتر من فيروسات الأنفلونزا الكاذبة هي 643 (الجدول 3). تم استخدام مقايسة اللطخة الغربية ومقايسات ELISA للشطيرة لاختبار تعبير بروتين HA و NA و HIV-1 p24. ثم تم حساب نسب وحدة HA وكمية الكمامة p24 للفيروسات الكاذبة. أظهرت نتائج مقايسة اللطخة الغربية أن هناك 4 أنواع من البروتين: بروتينات HA0 و HA1 و HA2 و NA (الشكل التكميلي 2). يشير هذا إلى أن البروتينات المغلفة لفيروسات الأنفلونزا الكاذبة تشبه تلك الموجودة في الفيروسات البرية. كانت نسب HA و Gag p24 ضمن النطاق الطبيعي كما هو مذكور (الجدول 3)9.
| سلالات الفيروس الكاذب | HAU / مل | 1.00E + 05 بيكوغرام / مل | نسبة HAU / 1.00E + 05 بيكوغرام * |
| P A/تايلند/(KAN-1)/2004 | 642.52 ± 30.26 | 4.20 ± 0.17 | 152.98 |
| * تم حساب نسب وحدات HA وكمية HIV-1 Gag p24 في الفيروسات الكاذبة على النحو التالي: وحدات HA / مقدار Gag p24. | |||
الجدول 3: القياس الكمي للفيروس الكاذب H5.
معايرة الفيروس الكاذب
لقياس تركيز الجسيمات الفيروسية الوظيفية ، تم الكشف عن نشاط لوسيفيراز النسبي (RLA) للفيروس الكاذب. تعتمد قراءات RLA على العديد من المتغيرات. لتحديد تأثير كمية الخلايا المحولة على قراءات RLA ، قمنا بزرع خلايا 1250 و 2500 و 5000 و 10000 و 20000 و 40000 لكل بئر من 96 صفيحة بئر (الشكل 2). أظهرت النتائج أن قراءات RLA للفيروس الكاذب هي الأعلى ، والخطأ المعياري للمتوسط هو الأدنى عندما يتم زرع 5000 خلية في بئر من صفيحة 96 بئرا (الشكل 4 أ). لتحديد تأثير وقت الحضانة ، يتم الكشف عن قراءات RLA في 48 ساعة و 60 ساعة و 72 ساعة بعد الإصابة بالفيروس. أظهرت النتائج أنه عند تحضينها لمدة 60 ساعة ، تكون قراءات RLA للفيروس الكاذب أعلى في القيم وأفضل في التكرار مع خطأ معياري منخفض للمتوسط (الشكل 4B). تشير النتائج إلى أنه مناسب لزرع 5000 خلية في بئر من صفيحة 96 بئرا واكتشاف قراءات RLA بعد 60 ساعة من الإصابة بالفيروس.
مقايسات PN
تم قياس عيار تحييد الأمصال المناعية من المجموعة الضابطة ومجموعة DDV بواسطة مقايسات PN (الشكل 5). كما هو موضح في الشكل 5 أ ، أظهرت الأمصال المناعية من مجموعة DDV عيارا عالي التحييد ضد سلالة الفيروس الكاذب A / Thailand / 1 (KAN) -1/04. في المقابل ، لم تظهر الأمصال من المجموعة الضابطة أي نشاط تحييد (الشكل 5 ب). بالمقارنة مع المقايسات المصلية التقليدية (مقايسات HI و MN) ، فإن فحوصات PN أكثر حساسية (لا يتم عرض البيانات).
مقايسة تحييد المرفقات
يمكن لبعض الأجسام المضادة المعادلة أن تعيق ارتباط الفيروسات بمستقبلات حمض السياليك. يتم توجيه هذه الأجسام المضادة إلى رأس HA وهي سائدة بعد التحصين بواسطة لقاح تجاري أو عدوى فيروس الأنفلونزا. لتحديد نشاط تحييد هذه الأجسام المضادة ، يتم إجراء فحوصات تحييد التعلق (الشكل 3). بالمقارنة مع الأمصال الضابطة ، فإن النشاط المعادل للأمصال المناعية قوي مما يشير إلى وجود الكثير من الأجسام المضادة الموجهة إلى رأس HA في الأمصال المناعية (الشكل 6 أ).
تقييم دخول الفيروس
يستخدم هذا الفحص لتحديد الأجسام المضادة التي تعيق اندماج غلاف الفيروس والأغشية الداخلية أثناء الإصابة بفيروس الأنفلونزا. يتم توجيه هذه الأجسام المضادة إلى مجال ساق HA وعادة ما تكون أقل قوة. لقياس عيار التحييد لهذه الأجسام المضادة ، يتم إجراء فحوصات ما بعد التعلق (الشكل 3). هناك اختلافات ذات دلالة إحصائية بين الأمصال المناعية والأمصال الضابطة ، مما يشير إلى وجود أجسام مضادة موجهة إلى المنطقة الجذعية HA في الأمصال المناعية (الشكل 6B).
الشكل 1: مخطط انسيابي للانتقال بوساطة الكالسيوم. يستخدم هذا المخطط الانسيابي لوصف الإجراءات الرئيسية للنقل بوساطة الكالسيوم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: القياس الكمي للفيروس الكاذب ومعايرته . (أ) مخطط انسيابي لمقايسة HA للفيروس الكاذب يصف الخطوات الرئيسية لمقايسة HA للفيروس الكاذب. (ب) مخطط انسيابي لمقايسة الفيروس الكاذب P24 يصف الخطوات الرئيسية لمقايسة الفيروس الكاذب P24. (ج) مخطط انسيابي لمقايسة معايرة الفيروس الكاذب يصف الخطوات الرئيسية لمقايسة معايرة الفيروس الكاذب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مقايسات التحييد القائمة على الفيروس الكاذب. (أ) مخطط انسيابي لمقايسة PN يصف الخطوات الرئيسية لمقايسة PN. (ب) مخطط انسيابي لمقايسة ارتباط الفيروس الكاذب يصف الخطوات الرئيسية لمقايسة التعلق. (ج) مخطط انسيابي لتقييم مقايسة الدخول الفيروسي الذي يصف الخطوات الرئيسية لمقايسة الدخول الفيروسي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: معايرة الفيروس الكاذب. (أ) تؤثر كميات الخلايا المختلفة لكل بئر في لوحة 96 بئرا على قراءات RLA. تم زرع 1250 و 2500 و 5000 و 10000 و 20000 و 40000 خلية في صفيحة 96 بئرا. (ب) يؤثر وقت الحصاد المختلف على قراءات RLA. تم الكشف عن قراءات RLA في 48 ساعة و 60 ساعة و 72 ساعة بعد الإصابة بالفيروس. يتم تقديم البيانات التي تم جمعها من ثلاث تجارب مستقلة كمتوسط ± SEM ؛ تمثل أشرطة الخطأ الخطأ القياسي للمتوسط (SEM). تم إجراء ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار Tukey. P < 0.0001 ؛ NS ، ليست كبيرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: استجابات الأجسام المضادة المعادلة للفيروس H5 المكتشفة بالفيروس الكاذب. أ: معايرة استجابات الأجسام المضادة المعادلة للأمصال المناعية من مجموعة DDV. ب: معايرة استجابات الأجسام المضادة المعادلة للأمصال المناعية من المجموعة الضابطة. يتم تعريف IC 50 على أنه التخفيفات المتبادلة للجسم المضاد المعادل الذي يمكن أن يمنع50٪ من الفيروس الكاذب. يتم تقديم البيانات التي تم جمعها من ثلاث تجارب مستقلة كمتوسط ± SEM ؛ تمثل أشرطة الخطأ الخطأ القياسي للمتوسط (SEM). تم استخدام الفيروس الكاذب VSVG كعنصر تحكم سلبي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: الكشف عن قوة الأجسام المضادة المعادلة عن طريق مقايسات الارتباط والدخول الفيروسي. (أ) الأمصال المناعية من مجموعة DDV ، وليس من المجموعة الضابطة ، تمنع الارتباط الفيروسي بالخلايا. (ب) الأمصال المناعية من مجموعة DDV ، وليس من المجموعة الضابطة ، تمنع جزئيا العدوى الفيروسية بعد التعلق. يتم تقديم البيانات التي تم جمعها من ثلاث تجارب مستقلة كمتوسط ± SEM ؛ تمثل أشرطة الخطأ الخطأ القياسي للمتوسط (SEM). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| تكوين متوسط DMEM كامل | تركيز |
| وسيط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) | 1x |
| مصل الجنين البقري | 10% |
| البنسلين (1 وحدة / مل) / الستربتومايسين | 1 ميكروغرام / مل |
الجدول 1: تكوين متوسط DMEM كامل.
| المواد | تركيز | حجم |
| 2x HEPES (درجة الحموضة 7.1) | -- | 675.0 ميكرولتر |
| كلوريد الصوديوم 2 (2.5 م) | -- | 67.5 ميكرولتر |
| ddH2O | -- | 529.2 ميكرولتر |
| pCMV Δ 8.9 | 1000 نانوغرام / ميكرولتر | 18.9 ميكرولتر |
| pCMV / R-HA | 100 نانوغرام / ميكرولتر | 27.0 ميكرولتر |
| pCMV / R-NA | 50 نانوغرام/ميكرولتر | 13.5 ميكرولتر |
| pHR-لوك | 1000 نانوغرام / ميكرولتر | 18.9 ميكرولتر |
الجدول 2: نظام تغليف الفيروسات الكاذبة.
الشكل التكميلي 1: مخطط انسيابي لتحصين الفئران. يصف هذا المخطط الانسيابي الإجراءات الرئيسية لتحصين الفئران. تم استخدام الأمصال المناعية كعينات. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 2: تعبير بروتين HA و NA و HIV-1 p24 لفيروس الأنفلونزا الكاذب. لطخة غربية من بروتينات الفيروس الكاذب. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
عادة ما تستخدم الخلايا HEK293FT كخلايا تغليف لإنتاج فيروسات كاذبة. الكشف المنتظم عن الميكوبلازما ضروري أثناء زراعة الخلايا. يمكن أن يقلل تلوث الميكوبلازما بشكل كبير من غلة الفيروس الكاذب وأحيانا يقترب من الصفر. بالمقارنة مع الملوثات الأخرى ، لا تؤدي ملوثات الميكوبلازما إلى تغيرات في قيمة الأس الهيدروجيني أو تعكر وسط زراعة الخلية. حتى التركيز العالي للميكوبلازما غير مرئي بالعين المجردة أو تحت المجهر. ثلاث طرق شائعة للكشف عن الميكوبلازما هي ثقافة الميكوبلازما ، وتلطيخ الحمض النووي باستخدام DAPI الفلوري أو Hoechst 33258 ، وتفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي يضخم الحمض النووي للميكوبلازما في عينات المستنبتة على نطاق واسع لاختبار الميكوبلازما بسرعة وسهولة وموثوقية10.
تم استخدام النقل بوساطة فوسفات الكالسيوم لتعبئة فيروسات الأنفلونزا الكاذبة لسنوات عديدة نظرا لكفاءتها العالية وتكلفتها المنخفضة وسهولة تشغيلها11. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة حساسة للغاية لقيمة الأس الهيدروجيني لمحلول HEPES المخزن مؤقتا ، ووسط زراعة الخلايا HEK293FT ، وقيمة الأس الهيدروجيني H2O. المقطر المزدوج أثرت على تكوين الراسب ومدة بقاء الراسب على خلايا HEK293FT. وبالتالي ، يمكنه تحديد كمية الحمض النووي التي تمتصها الخلايا HEK293FT. الرقم الهيدروجيني لمحلول HEPES المخزن مقيد للغاية ، ويتراوح من 7.05-7.1212،13،14 ، وفي هذه الحالة ، يتشكل راسب يحتوي على فوسفات الكالسيوم والحمض النووي ببطء في محلول HEPES المخزن مؤقتا. إذا كان الرقم الهيدروجيني مرتفعا جدا، فسيصبح حجم الراسب كبيرا جدا لدرجة أنه يمكن أن يقتل الخلايا HEK293T. على العكس من ذلك، إذا كان الأس الهيدروجيني منخفضا جدا، فلا يمكن تكوين الراسب، أو سيكون الراسب أصغر من أن يستقر على سطح الخلية. علاوة على ذلك ، يلعب الرقم الهيدروجيني لوسط زراعة الخلايا HEK293FT أيضا دورا في كفاءة النقل. أثناء النقل ، يجب الحفاظ على وسط الخلية بين درجة الحموضة من 7.2-7.4. سيغير كل من الوسط الحمضي والقلوي المفرط حجم الراسب ووقت امتزاز خليط الحمض النووي (DNA) على سطح الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يؤدي H2O المقطر المزدوج مع أصول مختلفة مستخدمة في خليط الحمض النووي إلى تغيير الرقم الهيدروجيني لمحلول HEPES المخزن مؤقتا. وبالتالي ، فإن الحفاظ على قيمة الأس الهيدروجيني المستقرة لمحلول النقل ووسط الاستزراع أمر بالغ الأهمية لضمان كفاءة نقل عالية. بالإضافة إلى ذلك ، تتأثر كفاءة النقل أيضا بمحلول 2.5 M CaCl 2 وتركيز ثاني أكسيد الكربون (CO2) في حاضنة الخلايا. أثناء عملية النقل ، من الضروري تخزين محلول CaCl 2 بشكل صحيح وتثبيت تركيز CO2 في الحاضنة.
يتضمن نظام التغليف الأكثر شيوعا لفيروس الأنفلونزا الكاذب نهجا للنقل المشترك للبلازميدات المتعددة. يتم استنساخ جينات HA و NA و Reporter و lentiviral gag و pol في ناقلات تعبير البلازميد بشكل منفصل ، ثم يتم نقلها إلى الخلايا في وقت واحد. لزيادة تعبير البروتين ، غالبا ما تتم إضافة تسلسل إجماع Kozak قبل موقع بدء النسخ.
من الضروري تحضير DNA15 البلازميد النقي والفائق والخالي من السموم الداخلية. منذ نسبة البلازميد يؤثر بشكل مباشر على غلة الفيروس الكاذب. قام هذا البروتوكول بتحسين نسبة البلازميد ل "core: reporter: HA: NA" إلى 28: 28: 4: 1 ومقارنتها بطرق النقل الأخرى. يجب أن تصل كمية الحمض النووي البلازميد في نقل فوسفات الكالسيوم إلى 30.5 ميكروغرام لكل طبق 100 مم.
يتم الكشف عن عيار الفيروس الكاذب عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (qRT-PCR) ، ومقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) ، ومقايسة التراص الدموي ، ومقايسات الكشف عن RLA. يستخدم اختبار qRT-PCR لتقدير أعداد نسخ جينات الحمض النووي الريبي للفيروس الكاذبالداخلي 5. يستخدم اختبار ELISA للكشف عن محتوى بروتين p24 ، وهو المكون الرئيسي لنواة فيروس نقص المناعة البشرية. يقيس مقايسة التراص الدموي كمية ارتفاع HA على سطح جزيئات الفيروس الكاذب. يتم استخدام هذه المقايسات الثلاثة لتحديد الجسيمات الفيروسية غير الوظيفية. مقايسة الكشف عن RLA هي الطريقة الرئيسية لقياس تركيز الجسيمات الفيروسية الوظيفية التي يمكن أن تصيب الخلايا المنقولة وتطلق جينات المراسل في مخزون الفيروسات الزائفة. تستخدم خلايا MDCK بشكل شائع كخلايا محولة. يتم زرع الخلايا المحولة في صفائح استزراع 96 بئرا ، مصابة بالفيروس الكاذب ، ويتم تحللها بواسطة مخزن التحلل المؤقت ، ثم يتم نقلها إلى ألواح مقياس الإنارة ذات 96 بئرا لقراءة القيم. تؤثر كميات الخلايا المختلفة وأوقات الحضانة على قيم RLA. بناء على النتائج ، يكون التعبير الجيني للمراسل مرتفعا عندما يتم زرع 5000 خلية لكل بئر على صفيحة 96 بئرا ، ويتم اكتشاف RLA في 60 ساعة بعد الإصابة بالفيروس.
تم تطبيق فحوصات تحييد الفيروس الكاذب H5 HPAI (PN) على نطاق واسع للكشف عن الأجسام المضادة بسبب سلامتها وحساسيتها العالية ودقتها وملاءمتها للفحص عالي الإنتاجية. يتضمن البروتوكول العام لمقايسة PN الخطوات الأربع التالية: كميات الفيروس الكاذب ، وتخفيف المصل ، وحضانة الأجسام المضادة للفيروس الكاذب ، واكتشاف نشاط لوسيفيراز. يتم تطبيع كميات الفيروس الكاذب بناء على قراءات RLA. تستخدم قيم RLA من 106 لكل بئر في لوحة 96 بئرا للحصول على نتائج تجربة قابلة للتكرار. يجب أن تكون نقطة البداية لتخفيف عينة المصل أكثر من 40. من الواضح أن مكون عينة المصل سيزيد من قيم لوسيفيراز للفيروس الكاذب عندما يكون عامل التخفيف لعينة المصل أقل من 40. يتم تحضين خليط الأجسام المضادة للفيروس الكاذب لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية ثم يتم نقله إلى خلايا MDCK ، يليه اكتشاف قراءات RLA في 60 ساعة. تؤخذ مستويات لوسيفيراز بشكل عام كأداة لتحديد كفاءة عدوى الفيروس الكاذب.
في اختبار PN ، هناك أربعة عناصر مهمة: بروتين مراسل لوسيفيراز ، وكيمياء الفحص ، ومقياس اللمعان ، والألواح الدقيقة16. أولا، جين لوسيفيراز محسن من الكودون لتحسين مستويات التعبير البروتيني في الخلايا المحولة. تقلل هندسة جينات العمود الفقري للمراسل والمتجه من عدد مواقع ربط عامل النسخ التوافقي لتقليل مخاطر النسخ الشاذة. ثانيا ، يتم اختيار كواشف الكشف المناسبة وفقا لهدف التجربة. تستخدم فحوصات PN بشكل عام كطرق عالية الإنتاجية للكشف عن الاستجابات المعادلة لعينات المصل أو الأجسام المضادة. استخدم هذا البروتوكول نظام فحص luciferase الساطع ، والذي يوفر ألمع إشارة ونطاق ديناميكي واسع وحساسية عالية. والأهم من ذلك ، أن عمر النصف للإشارة يبلغ حوالي 10 دقائق ، ويتم اختبار الخلايا على الفور بعد إضافة الركيزة. يستخدم مقياس الإنارة للكشف عن تركيز لوسيفيراز. يتم تصنيع العديد من أنواع أجهزة قياس الإضاءة المختلفة. المبدأ الأساسي هو أن الجهاز المستخدم يمكنه تحديد الاختلافات في نشاط luciferase بدقة بين العينات المختلفة. يجب استخدام ألواح البوليسترين الدقيقة السوداء أو البيضاء للعتامة والخلفيات المضيئة المنخفضة. يمكن للصفائح الدقيقة البيضاء تحسين إشارات الإنارة ولها تلألؤ منخفض في الخلفية ، بينما يمكن للألواح الدقيقة السوداء تقليل تشتت الضوء لتقليل الحديث المتبادل من بئر إلىبئر 17.
تتماشى فحوصات PN مع الطرق التقليدية للكشف عن استجابات الأجسام المضادة المعادلة. ومع ذلك ، بما في ذلك بروتينات HA و NA فقط من فيروسات الأنفلونزا البرية ، فإن الفيروسات الزائفة بعيدة كل البعد عن الفيروس البري. يمكن أن يرتبط حمض الهيالورونيك بمستقبل حمض السياليك للخلية المتلقية لبدء العدوى. ثم تؤدي التغيرات التوافقية HA في الإندوسوم إلى اندماج الأغشية الفيروسية والاندوسومية ، مما يؤدي إلى إطلاق البروتينات النووية الريبية الفيروسية (vRNPs) في السيتوبلازم. يمكن للفيروسات الكاذبة للأنفلونزا تقليد هذه العمليات فقط ويتم تطبيقها في الأبحاث ذات الصلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من خلال المنح البحثية المقدمة من مشروع بناء القدرات الابتكارية لمقاطعة جيانغسو (BM2020019) ، ومشروع شنتشن العلمي والتكنولوجي (No. JSGG20200225150702770) ، وبرنامج البحوث ذات الأولوية الاستراتيجية للأكاديمية الصينية للعلوم (XDB29030103) ، ومشروع قوانغدونغ العلمي والتكنولوجي (رقم 2020B1111340076) وبرنامج البحوث المفتوحة لمختبر خليج شنتشن (رقم. SZBL202002271003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% Chiken Erythrocyte | Bio-channel | BC-RBC-C001 | Reagent |
| 96-well cell culture plates (flat-bottom) | Thermo fisher scientific | 167008 | consumable material |
| 96-well cell culture plates (round-bottom) | Thermo fisher scientific | 163320 | consumable material |
| Allegra X-15R | Beckman coulter | -- | Equipment/Centrifuge |
| BD Insulin Syringes | BD | 324910 | consumable material |
| Calcium Chloride Anhydrous | AMRESCO | 1B1110-500G | Reagent |
| chloroquine diphosphate | Selleck | S4157 | Reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12100-046 | Reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | Reagent |
| HEK293FT | Gibco | R700-07 | Cell line |
| HEPES FREE ACID | AMRESCO | 0511-250G | Reagent |
| HIV-1 p24 Antigen ELISA | ZeptoMetrix | 801111 | Reagent kit |
| Luciferase Assay System Freezer Pack | Promega | E4530 | Reagent kit |
| MDCK.1 | ATCC | CRL-2935 | Cell line |
| Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo fisher scientific | 509-GRD-Q | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 15 mL | Thermo fisher scientific | 339650 | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo fisher scientific | 339652 | consumable material |
| Nunc EasYFlask 75 cm2 | Thermo fisher scientific | 156499 | consumable material |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagent |
| Pipette Tips (10 μL) | Thermo fisher scientific | TF102-10-Q | consumable material |
| Pipette Tips (100 μL) | Thermo fisher scientific | TF113-100-Q | consumable material |
| Pipette Tips (1000 μL) | Thermo fisher scientific | TF112-1000-Q | consumable material |
| Serological pipets (5 mL) | Thermo fisher scientific | 170355N | consumable material |
| Serological pipets (10 mL) | Thermo fisher scientific | 170356N | consumable material |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Reagent |
| Varioskan Flash | Thermo fisher scientific | -- | Equipment/Microplate reader |
| Water Jacket Incubator | Thermo fisher scientific | 3111 | Equipment/Cell incubator |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | 57-33-0 | Reagent |
References
- Wang, G., et al. DNA prime and virus-like particle boost from a single H5N1 strain elicits broadly neutralizing antibody responses against head region of h5 hemagglutinin. The Journal of Infectious Diseases. 209 (5), 676-685 (2014).
- Wang, G., Yin, R., Zhou, P., Ding, Z. Combination of the immunization with the sequence close to the consensus sequence and two DNA prime plus one VLP boost generate H5 hemagglutinin specific broad neutralizing antibodies. Plos One. 12 (5), 0176854 (2017).
- Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28 (1), 1963 (2018).
- Duvergé, A., Negroni, M. Pseudotyping lentiviral vectors: When the clothes make the virus. Viruses. 12 (11), 1311 (2020).
- Carnell, G. W., Ferrara, F., Grehan, K., Thompson, C. P., Temperton, N. J. Pseudotype-based neutralization assays for influenza: A systematic analysis. Frontiers in Immunology. 6 (161), (2015).
- Trombetta, C., Perini, D., Mather, S., Temperton, N., Montomoli, E. Overview of serological techniques for influenza vaccine evaluation: Past, present and future. Vaccines. 2 (4), 707-734 (2014).
- Wei, C. J., et al. Next-generation influenza vaccines: opportunities and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (4), 239-252 (2020).
- Krammer, F., et al.
- Wei, C. J., et al. Induction of broadly neutralizing H1N1 influenza antibodies by vaccination. Science. 27 (329), 1060-1064 (2010).
- Chernov, V. M., Chernova, O. A., Sanchez-Vega, J. T., Kolpakov, A. I., Ilinskaya, O. N. Mycoplasma contamination of cell cultures vesicular traffic in bacteria and control over infectious agents. Acta Naturae. 6 (3), 41-51 (2014).
- Michael, R. G., Joseph, S. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2012).
- Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. Transfection of mammalian cells with calcium phosphate-DNA coprecipitates. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), (2019).
- Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R.
- Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. Transfection of DNA into eukaryotic cells. Current Protocols in Molecular Biology. 9, 11-19 (1996).
- Kachkin, D. V., Khorolskaya, J. I., Ivanova, J. S., Rubel, A. A. An efficient method for isolation of plasmid DNA for transfection of mammalian cell cultures. Methods and Protocols. 3 (4), 69 (2020).
- Luciferase assay system. , Available from: https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system (2021).
- Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates. , Available from: https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates (2021).
