Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Verpackung von Pseudoviren und die Messung der Antikörper-neutralisierenden Aktivität.
Abstract
Seit 1996 verursachen hochpathogene H5-Viren der A/Gans/Guangdong/1/96-Linie Grippeausbrüche bei Geflügel und Wildvögeln. Gelegentlich fallen ihr auch Menschen zum Opfer, was zu einer hohen Sterblichkeit führt. Nichtsdestotrotz wird die HPAI-Virusforschung oft behindert, wenn man bedenkt, dass sie in Laboratorien der biologischen Sicherheitsstufe 3 durchgeführt werden muss. Um dieses Problem zu lösen, werden Pseudoviren als Alternative zu Wildtyp-Viren in einigen Experimenten von H5-HPAI-Studien eingesetzt. Pseudoviren erweisen sich als ideale Werkzeuge, um neutralisierende Antikörper gegen H5-HPAI-Viren zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren und kritischen Schritte von H5-HPAI-Pseudovirus-Präparaten und Pseudovirus-Neutralisationsassays. Außerdem werden die Fehlerbehebung, die Einschränkung und die Modifikationen dieser Assays erörtert.
Introduction
Seit 1996 verursachen hochpathogene H5-Viren der A/Goose/Guangdong/1/96-Linie der aviären Influenza (HPAI) kontinuierliche Grippeausbrüche bei Geflügel und Wildvögeln, die für enorme sozioökonomische Verluste in der globalen Geflügelindustrie verantwortlich sind. Manchmal infizieren sich auch Menschen damit, was mit einer hohen Sterblichkeitsrate konfrontiert ist 1,2. Die HPAI-Virusforschung wird jedoch häufig behindert, da sie nicht außerhalb von Laboratorien der Biosicherheitsstufe 3 durchgeführt werden kann. Um dieses Problem zu lösen, werden Pseudoviren als Alternative zu Wildtyp-Viren in einigen Experimenten von H5-HPAI-Studien eingesetzt. Pseudoviren sind sicher genug, um in Laboratorien der Biosicherheitsstufe 2 praktiziert zu werden.
H5 HPAI-Pseudoviren gehören zu den chimären Viren, die aus Surrogatviruskernen, Lipidhüllen mit den Oberflächenglykoproteinen von Influenzaviren und Reportergenen bestehen. Pseudoviruskerne stammen in der Regel vom lentiviralen humanen Immundefizienzvirus (HIV), Retroviren wie dem murinen Leukämievirus (MLV) und dem vesikulären Stomatitisvirus (VSV)3. Insbesondere das HIV-1-Verpackungssystem wird häufig zur Herstellung von Influenza-Pseudoviren verwendet, wobei die primären Gene gag und pol sind. Das HIV-Gag-Gen exprimiert Kernproteine. Das pol-Gen exprimiert die Integrase und die reverse Transkriptase, die beide für die Expression des Reportergens in transduzierten Zellen notwendig sind. In Anlehnung an das Genom des Surrogatvirus wird das Reportergen in RNA-Form in den Pseudoviruskern aufgenommen. Das Reportergen exprimiert das Protein in den Wirtszellen. Die Genexpressionsniveaus von Reportergenen können verwendet werden, um die Effizienz von Pseudovirusinfektionen zu messen 3,4. Der primäre Reporter ist die Glühwürmchen-Luciferase zur Messung der relativen Lumineszenzeinheiten (RLU) oder der relativen Luciferase-Aktivität (RLA) in transduzierten Zellen. Andere Reporter wie lacZ, Gaussia und Renilla luciferase werden ebenfalls verwendet, nur in geringerem Maße5.
Pseudoviren sind ideale Werkzeuge, um neutralisierende Antikörper gegen H5-HAPI-Viren zu untersuchen. Um die Potenz der neutralisierenden Antikörper zu messen, werden Pseudovirus-Neutralisations-Assays (PN)6 verwendet. Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA) sind Glykoproteine auf der Oberfläche des Influenza-A-Virus 7,8. Die HA besteht aus einer globulären Kopfdomäne für die Rezeptorbindung und einer Stammdomäne für die Membranfusion. Das NA-Protein hat die Sialidase-Aktivität, um die Virusfreisetzung zu erleichtern 7,8. Ein PN-Assay kann neutralisierende Antikörper messen, die gegen HA-Proteine gerichtet sind. Neutralisierende Antikörper, die auf den Kopf- und Stammbereich der HA gerichtet sind, können auch durch virale Attachment- und Eintrittsassays nachgewiesen werden. Im Vergleich zu Wildtyp-Viren haben Pseudovirus-Neutralisationsexperimente empfindlichere Nachweiswerte, können in einem Biosicherheitslabor der Stufe 2 sicher durchgeführt werden und sind in der Praxis im Allgemeinen einfacher zu bedienen.
In diesem Protokoll werden die Verfahren und kritischen Schritte von H5-HPAI-Pseudoviruspräparaten und PN-Assays detailliert beschrieben. Außerdem werden die Fehlerbehebung, die Einschränkung und die Modifikationen dieser Assays erörtert. In dieser Arbeit wurde der Stamm A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH) von H5N1 HPAI-Viren als Beispiel verwendet. Um die in Assays verwendeten Immunseren zu erhalten, wählte dieses Protokoll das aus dem TH-Stamm stammende HA-Protein als Immunogen für die Immunisierung von Mäusen aus.
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Protocol
Alle Pseudovirus-bezogenen experimentellen Operationen wurden unter ABSL2-Bedingungen im Institut Pasteur der Shanghai Chinese Academy of Sciences (IPS, CAS) durchgeführt. Die Tierversuche wurden auf der Grundlage der vom Institutional Animal Care and Use Committee genehmigten Tierprotokolle von IPS, CAS durchgeführt.
1. Pseudovirusverpackung mit Calciumphosphat-Transfektion
- Einzelzellsuspensionen von HEK293FT Zellen (9 x 10,5 pro ml) in vollständigem DMEM-Medium herstellen (Tabelle 1). Geben Sie 10 ml der einzelligen Suspensionen in einen T75-Kolben und inkubieren Sie die Zellen in einem 37 °C heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid (CO2) für 20 h vor der Transfektion.
HINWEIS: HEK293FT niedriger Durchgang (<20 Durchgänge) wird empfohlen. Stellen Sie sicher, dass die Zellmonoschicht zu 80-90% konfluent ist. - Ersetzen Sie das Medium 2 h vor der Transfektion durch 10 ml frisches Komplettmedium mit Chloroquin (100 μM).
- Mischen Sie die Reagenzien und die Plasmid-DNA wie in Tabelle 2 und Abbildung 1 gezeigt: ddH 2 O, pCMV/R-HA, pCMV/R-NA, pHR-Luc, pCMV Δ 8,9, 2,5 M CaCl2und 2x HEPES-Puffer. Pipettieren Sie 5 Mal vorsichtig auf und ab, inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur (RT) für 20 Minuten.
- Übertragen Sie die Mischung in das Medium über den Zellen und schaukeln Sie den Kolben vorsichtig. Inkubieren Sie die Zellen im Zellinkubator für 15 h.
- Ersetzen Sie das Medium durch 15 ml frisches, vollständiges DMEM-Medium. Inkubieren Sie die Zellen in einem Inkubator mit 37 °C und 5 % CO2 -Anteil für 65 h.
HINWEIS: Die Farbe des Mediums ist hellorange oder leicht gelblich, und mindestens 80 % der Zelle sollten unter dem inversen Lichtmikroskop den zytopathischen Effekt (CPE) zeigen. - Ernten Sie den Überstand und zentrifugieren Sie ihn bei 2095 x g für 20 Minuten bei 4 °C. Den Überstand auffangen, aliquotieren und bei -80 °C lagern.
2. Nachweis der HA-, NA- und HIV-1-p24-Proteinexpression des Influenza-Pseudovirus
- Nachweis der HA-Proteinexpression mittels Hämagglutinin (HA)-Assay.
- Geben Sie 50 μl PBS in die Spalten 2-12, Zeilen A, B und C einer 96-Well-Platte mit rundem Boden.
HINWEIS: Die Zeilen A, B und C gehören zu 3 unabhängigen Replikationstests, und Spalte 12 wird als Negativkontrolle verwendet. - Geben Sie 100 μl Pseudovirus in die Vertiefungen von Spalte 1. Übertragen Sie 50 μl von Säule 1 in Säule 2, mischen Sie gut, indem Sie 5 Mal auf und ab pipettieren, führen Sie die zweifachen Verdünnungen bis zur letzten Säule 11 durch und verwerfen Sie die zusätzlichen 50 μl aus Säule 11.
- Geben Sie 50 μl 0,5%ige Erythrozyten in jede Vertiefung und pipettieren Sie sie zweimal vorsichtig auf und ab. Inkubieren Sie die Platte für 30-60 min bei RT oder bis die Erythrozyten der Negativkontrolle die regelmäßigen Flecken am Boden der Vertiefung bilden.
- Beobachten und notieren Sie die HA-Titer des Pseudovirus.
HINWEIS: Die HA-Einheit der Pseudoviren ist der höchste Verdünnungsfaktor des Virus, der eine 100%ige Hämagglutination der roten Blutkörperchen verursachen kann.
- Geben Sie 50 μl PBS in die Spalten 2-12, Zeilen A, B und C einer 96-Well-Platte mit rundem Boden.
- Nachweis der HA- und NA-Proteinexpression mit dem Western-Blot-Assay.
HINWEIS: Alle Western-Blot-Schritte werden gemäß dem Handbuch der molekularen Klonierung (4. Auflage) durchgeführt. - Nachweis der HIV-1 p24 Proteinexpression mit dem HIV-1 p24 ELISA Kit (Table of Materials).
- Geben Sie 50 μl des Lysepuffers in 450 μl Pseudovirusprobe. Mischen Sie es gründlich.
- Geben Sie 300 μl des Waschpuffers in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte. Schlagen Sie die Platte auf den Kopf, um den Waschpuffer vollständig zu entfernen. Wiederholen Sie den Waschgang 5 Mal.
- Geben Sie 200 μl des Standards und der Proben separat in jede Welle. Bei 37 °C über Nacht oder 2 h inkubieren.
- Saugen Sie den Inhalt der Platte ab und waschen Sie die Platte wie in Schritt 2.3.2 beschrieben.
Anmerkungen: Lassen Sie eine Vertiefung der Assay-Platte leer, um sie als leeres Substrat zu verwenden. - Geben Sie 200 μl der p24-Detektorantikörper in jede Welle. Bei 37 °C 1 h inkubieren. Aspirieren und waschen Sie die Platte wie in Schritt 2.3.2 beschrieben.
- In jede Vertiefung werden 100 μl der Streptavidin-Peroxidase-Arbeitslösung gegeben und bei 37 °C für 30 min inkubiert. Aspirieren und waschen Sie die Platte wie in Schritt 2.3.2 beschrieben.
- Geben Sie 100 μl der Arbeitslösung des Unterzustands in jede Vertiefung, einschließlich der Substrat-Blindvertiefung, und inkubieren Sie sie bei 37 °C für 30 min.
Anmerkungen: In den Vertiefungen entwickelt sich eine blaue Farbe. - Geben Sie 100 μl des Stopppuffers in jede Vertiefung.
Anmerkungen: Die blaue Farbe ändert sich sofort in Gelb. - Lesen Sie die optische Dichte bei 450 nm innerhalb von 15 Minuten ab. Erfassen Sie die p24-Titer des Pseudovirus
3. Pseudovirus-Titration
- Stellen Sie Einzelzellsuspensionen von MDCK-Zellen (5 x 104 pro ml) in vollständigem DMEM-Medium her, fügen Sie 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 und 40000 Zellen zu verschiedenen Vertiefungen einer 96-Well-Flachbodenplatte hinzu. Inkubieren Sie die Zellen in einem Inkubator mit 37 °C und 5 % CO2 -Anteil für 20 h.
- Nehmen Sie das Pseudovirus aus dem -80 °C warmen Kühlschrank, tauen Sie es auf dem Eis auf und wirbeln Sie das Pseudovirus vor.
- Fügen Sie 6 HAU-Pseudoviren (6x HA-Einheiten) zu jeder Vertiefung der 96-Well-Rundbodenplatte hinzu und füllen Sie jede Vertiefung mit vollständigem DMEM bis zu 120 μl auf.
- Pipettieren Sie die Mischung 5 Mal auf und ab, um sie gründlich zu mischen. Inkubieren Sie die Mischplatte in einem 37 °C, 5 % CO2 - Inkubator für 1 Stunde.
- Übertragen Sie 100 μl der Mischung auf die Zellen in der 96-Well-Platte. Legen Sie die Zellkulturplatte nach der Virusinfektion für 48 h, 60 h und 72 h wieder in den Inkubator.
- Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und führen Sie den Luciferase-Test durch (Materialtabelle).
- Entfernen Sie das Medium vorsichtig aus den Vertiefungen der Platte. Spülen Sie die Zellen mit 200 μl PBS und entfernen Sie das PBS so weit wie möglich.
Anmerkungen: Drehen Sie die Platte um und entsorgen Sie den Überstand, indem Sie ihn rückwärts auf saugfähiges Papier schlagen. Wenn die Testzelllinie nicht fest am Boden haften konnte, entfernen Sie die Aspiration des Mediums vorsichtig. - Geben Sie 50 μl des Lysepuffers in jede Vertiefung und schaukeln Sie die Kulturplatte mehrmals. Lagern Sie die Platte über Nacht bei -80 °C.
Anmerkungen: Mischen Sie 1 Volumen 5x Lysepuffer mit 4 Volumen Wasser, um den 1x Lysepuffer herzustellen. Äquilibrieren Sie den 1x Lysepuffer vor der Verwendung mit RT. Schaukeln Sie die Platte, um sicherzustellen, dass die Zellen vollständig mit dem Lysepuffer bedeckt sind. Der einzelne Gefrier-Auftau-Prozess kann dazu beitragen, dass die Zelle vollständig lysiert wird. - Platte herausnehmen, 2 h bei RT äquilibrieren.
HINWEIS: Die Zelle sollte vollständig lysiert sein. - Schaukeln Sie die Platte mehrmals vorsichtig und übertragen Sie alle Zelllysate auf undurchsichtige 96-Well-Platten.
- Geben Sie 50 μl des Substrats in jede Vertiefung, schaukeln Sie die Platte mehrmals vorsichtig und mischen Sie Substrat und Lysepuffer gründlich.
- Messen Sie das erzeugte Licht innerhalb von 5 Minuten mit einem Luminometer. Notieren Sie die Luciferase-Titer des Pseudovirus.
Anmerkungen: Wenn ein geeignetes Substrat hinzugefügt wird, wird Licht als Nebenprodukt über eine chemische Reaktion emittiert, bei der Luciferin durch das Luciferase-Enzym in Oxyluciferin umgewandelt wird. Die erzeugte Lichtmenge ist proportional zur Menge des Luciferase-Enzyms.
4. Vorbereitung der Immunseren
HINWEIS: Das Immunserum wird für zellbezogene Experimente verwendet, und der experimentelle Betrieb sollte unter aseptischen Bedingungen durchgeführt werden.
- Bereiten Sie 12 acht Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse vor. Teilen Sie die Mäuse gleichmäßig in zwei Gruppen ein.
HINWEIS: Eine Gruppe war die DDV-Gruppe und die andere war die Negativkontrollgruppe. - Immunisierung der DDV-Gruppe: Zweimal intramuskulär mit 100 μg eines Codon-optimierten DNA-Plasmids, das für das HA-Protein A/Thailand/(KAN-1)/2004 (TH) HA kodiert, in Woche 0 und Woche 3 und einmal intraperitoneal mit 512 HAU TH-Virus-ähnlichen Partikeln (VLP) in Woche 6 geboostert.
- Immunisierung der Kontrollgruppe: In Woche 0 und Woche 3 zweimal intramuskulär mit 100 μg leerer Vektorplasmid-DNA primen und in Woche 6 einmal intraperitoneal mit HIV-1 gag VLP boostern.
- Sammeln Sie das Mäuseblut 2 Wochen nach der letzten Impfung.
HINWEIS: Hier wurden die Mäuse zum Zeitpunkt der Blutentnahme mit Pentobarbital-Natrium (65 mg/kg) betäubt. Nach der Blutentnahme aus der Vena submandibularis wurden die Mäuse sofort mit CO2 eingeschläfert. - Bewahren Sie das Blut 2 h bei RT auf, dann über Nacht bei 4 °C. Bei 900 x g 10 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand auffangen. Deaktivieren Sie die Seren, indem Sie sie 30 min lang bei 56 °C aussetzen.
- Lagern Sie die Immunseren zur Verwendung in einem Kühlschrank bei -80 °C.
HINWEIS: In der ergänzenden Abbildung 1 finden Sie das Flussdiagramm, das die wichtigsten Verfahren der Mäuseimmunisierung beschreibt.
5. Pseudovirus-Neutralisations-Assay (PN)
- Stellen Sie Einzelzellsuspensionen von MDCK-Zellen (5 x 104 pro ml) in vollständigem DMEM-Medium her und geben Sie 100 μl der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 96-Well-Flachbodenplatte. Inkubieren Sie die Zellen in einem Inkubator mit 37 °C und 5 % CO2 -Anteil für 20 h.
- Nehmen Sie das Pseudovirus und die Seren aus dem -80 °C warmen Kühlschrank, tauen Sie es auf dem Eis auf und wirbeln Sie es gründlich vor.
- Verdünnen Sie die Seren 20-mal im gesamten Medium und geben Sie 100 μl des vollständigen DMEM-Mediums in die Vertiefungen einer 96-Well-Rundbodenplatte aus den Säulen 2-10.
- Geben Sie 200 μl der verdünnten Seren in die Vertiefungen von Spalte 2, übertragen Sie 100 μl von Spalte 2 in Spalte 3, verdünnen Sie die Seren nacheinander von Spalte 2 bis Spalte 10 auf 1:10240 und verwerfen Sie die 100 μl aus Spalte 10.
- Als Negativkontrolle werden 100 μl DMEM-Komplettmedium in die Vertiefungen der Säule 11 gegeben.
- Geben Sie 100 μl Pseudoviren in jede Vertiefung, pipettieren Sie das Gemisch 5 Mal gründlich auf und ab und inkubieren Sie die Gemischplatte bei 37 °C, 5 % CO2 für 1 h.
- Übertragen Sie 100 μl des Gemisches von der 96-Well-Rundbodenplatte in die entsprechende Vertiefung der 96-Well-Zellkulturplatte. Legen Sie die Platte für 60 h wieder in den Inkubator (37 °C, 5 %CO 2).
- Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator. Führen Sie den Luciferase-Assay wie in den Schritten 3.7-3.12 beschrieben durch.
6. Assay zur Anhängung von Pseudoviren
- Stellen Sie Einzelzellsuspensionen von MDCK-Zellen (4 x 104 pro ml) in vollständigem DMEM-Medium her und fügen Sie 100 μl Zellsuspensionen zu jeder Vertiefung in einer 96-Well-Flachbodenplatte hinzu. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5% CO2 für 20 h.
- Inkubieren Sie das Pseudovirus mit Seren in DMEM mit 1% BSA bei 4 °C über Nacht.
Anmerkungen: Das Volumen der Mischung beträgt 100 μl. - Blockieren Sie die MDCK-Zellen mit 100 μl DMEM mit 1 % BSA pro Well bei 4 °C für 1 h.
- Das Pseudovirus-Serum-Gemisch (100 μL) wird auf die MDCK-Monoschicht geimpft und bei 4 °C für 2 h inkubiert.
- Waschen Sie die Zellplatte 4 Mal mit PBS, das 1 % BSA enthält, um ungebundene Viren zu entfernen.
- Lyse der Zellen mit 100 μL Luciferase-Lysepuffer bei RT für 30 min.
- Quantifizieren Sie die Menge des gebundenen Virus auf den Zellen mit einem HIV-1 p24 ELISA-Kit wie oben beschrieben (Abschnitt 2.3).
7. Beurteilung des Viruseintritts
- Stellen Sie Einzelzellsuspensionen von MDCK-Zellen (5 x 104 pro ml) in vollständigem DMEM-Medium her und geben Sie 100 μl der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 96-Well-Flachbodenplatte. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5 % CO2 für 20 h vor dem Assay.
- Inokulieren Sie das Pseudovirus (100 μL) auf einer MDCK-Monoschicht in einer 96-Well-Platte bei 4 °C für 6 h.
- Waschen Sie die Zellplatte 4 Mal mit PBS, das 1% BSA enthält, um ungebundene Pseudoviren zu entfernen.
- 100 μl der seriell verdünnten Immunseren oder Seren von Scheinimpfmäusen in DMEM mit 1 % BSA in die Monoschicht geben und die Zelle bei 4 °C für 2 h inkubieren.
- Entfernen Sie den Zellüberstand und waschen Sie die Zellkulturplatte 4 Mal mit PBS, das 1% BSA enthält.
- Frisches DMEM in die Zellen geben und 60 h in einem Inkubator mit 37 °C und 5 % CO2 -% inkubieren.
- Messen Sie die relative Luciferase-Aktivität (RLA) der Zellen, wie in den Schritten 3.7-3.12 beschrieben.
HINWEIS: Der virale Eintrag, wie von RLA angegeben, wurde als Prozentsatz des Messwerts ausgedrückt, der in Abwesenheit von Seren erhalten wurde, was auf 100% festgelegt wurde.
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Representative Results
HA, NA und HIV-1 p24 Proteinexpression des Influenza-Pseudovirus
Um die Effizienz der Virusverpackung zu ermitteln, wurden zunächst Influenza-Pseudovirusbestände mittels HA-Assay nachgewiesen (Abbildung 2A). Die HA-Einheiten pro Milliliter Influenza-Pseudoviren betragen 643 (Tabelle 3). Western-Blot-Assays und Sandwich-ELISA-Assays wurden verwendet, um die HA-, NA- und HIV-1 p24-Proteinexpression zu testen. Anschließend wurden die Verhältnisse der HA-Einheit und der Menge an gag p24 für Pseudoviren berechnet. Die Ergebnisse des Western-Blot-Assays zeigten, dass es 4 Proteintypen gab: HA0-, HA1-, HA2- und NA-Proteine (ergänzende Abbildung 2). Dies deutet darauf hin, dass die Hüllproteine von Influenza-Pseudoviren denen von Wildtyp-Viren ähneln. Die Verhältnisse von HA und Knebel p24 lagen wie berichtet im Normbereich (Tabelle 3)9.
| Pseudovirus-Stämme | HAU/mL | 1,00E + 05 pg/ml | Verhältnis von HAU/1.00E+05 pg* |
| P A/Thailand/(KAN-1)/2004 | 642,52 ± 30,26 | 4.20 ± 0.17 | 152.98 |
| *Die Verhältnisse der HA-Einheiten und der Menge an HIV-1 Gag p24 in Pseudoviren wurden wie folgt berechnet: HA-Einheiten/die Menge an Gag p24. | |||
Tabelle 3: Quantifizierung des H5-Pseudovirus.
Pseudovirus-Titration
Um die Konzentration der funktionellen Viruspartikel zu messen, wurde die relative Luciferase-Aktivität (RLA) des Pseudovirus nachgewiesen. RLA-Messwerte hängen von vielen Variablen ab. Um den Einfluss der transduzierten Zellmenge auf die RLA-Messwerte zu ermitteln, haben wir die Zellen von 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 und 40000 pro Well einer 96-Well-Platte ausgesät (Abbildung 2). Die Ergebnisse zeigten, dass die RLA-Messwerte des Pseudovirus am höchsten sind und der Standardfehler des Mittelwerts am niedrigsten ist, wenn 5000 Zellen in einer Vertiefung mit einer 96-Well-Platte ausgesät werden (Abbildung 4A). Um den Einfluss der Inkubationszeit zu identifizieren, werden RLA-Messwerte 48 h, 60 h und 72 h nach der Virusinfektion detektiert. Die Ergebnisse zeigten, dass bei einer Inkubationsdauer von 60 h die RLA-Messwerte des Pseudovirus höhere Werte und eine bessere Wiederholbarkeit bei geringem Standardfehler des Mittelwerts aufweisen (Abbildung 4B). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass es geeignet ist, 5000 Zellen in einer Vertiefung einer 96-Well-Platte auszusäen und RLA-Messwerte 60 Stunden nach der Virusinfektion zu erkennen.
PN-Assays
Die Neutralisationstiter von Immunseren aus der Kontrollgruppe und der DDV-Gruppe wurden mittels PN-Assays gemessen (Abbildung 5). Wie in Abbildung 5A dargestellt, wiesen die Immunseren aus der DDV-Gruppe hohe Neutralisationstiter gegen den Stamm Pseudovirus A/Thailand/1(KAN)-1/04 auf. Im Gegensatz dazu zeigten die Seren der Kontrollgruppe keine Neutralisationsaktivität (Abbildung 5B). Im Vergleich zu herkömmlichen serologischen Assays (HI- und MN-Assays) sind PN-Assays empfindlicher (Daten werden nicht angezeigt).
Assay zur Neutralisierung von Attachments
Einige Neutralisationsantikörper können die Anheftung von Viren an die Sialinsäurerezeptoren behindern. Diese Antikörper richten sich gegen den HA-Kopf und sind nach Immunisierung mit kommerziellem Impfstoff oder Infektion mit Influenzaviren vorherrschend. Um die neutralisierende Aktivität dieser Antikörper zu identifizieren, werden Attachment-Neutralisations-Assays durchgeführt (Abbildung 3). Im Vergleich zu den Kontrollseren ist die neutralisierende Aktivität der Immunseren hoch, was darauf hindeutet, dass in den Immunseren viele Antikörper gegen den HA-Kopf gerichtet sind (Abbildung 6A).
Beurteilung des Viruseintritts
Dieser Assay wird verwendet, um Antikörper zu identifizieren, die die Fusion von Virushülle und endosomalen Membranen während einer Influenzavirusinfektion behindern. Diese Antikörper richten sich gegen die HA-Stieldomäne und sind in der Regel weniger wirksam. Um die Neutralisationstiter dieser Antikörper zu messen, werden Post-Attachment-Assays durchgeführt (Abbildung 3). Es gibt signifikante Unterschiede zwischen den Immunseren und den Kontrollseren, was darauf hindeutet, dass in den Immunseren Antikörper vorhanden sind, die gegen die HA-Stammregion gerichtet sind (Abbildung 6B).
Abbildung 1: Flussdiagramm der Calcium-vermittelten Transfektion. Dieses Flussdiagramm wird verwendet, um die wichtigsten Verfahren der Calcium-vermittelten Transfektion zu beschreiben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Quantifizierung und Titration von Pseudoviren . (A) Flussdiagramm des Pseudovirus-HA-Assays, das die wichtigsten Schritte des Pseudovirus-HA-Assays beschreibt. (B) Flussdiagramm des Pseudovirus-P24-Assays, das die wichtigsten Schritte des Pseudovirus-P24-Assays beschreibt. (C) Flussdiagramm des Pseudovirus-Titrationsassays, das die wichtigsten Schritte des Pseudovirus-Titrationstests beschreibt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Pseudovirus-basierte Neutralisationsassays. (A) Flussdiagramm des PN-Assays, das die wichtigsten Schritte des PN-Assays beschreibt. (B) Flussdiagramm des Pseudovirus-Attachment-Assays, das die wichtigsten Schritte des Attachment-Assays beschreibt. (C) Flussdiagramm zur Bewertung des Viruseintrittsassays, das die wichtigsten Schritte des Viruseintrittstests beschreibt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Pseudovirus-Titration. (A) Unterschiedliche Zellmengen pro Well in einer 96-Well-Platte beeinflussen die RLA-Messwerte. 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 und 40000 Zellen wurden in einer 96-Well-Platte ausgesät. (B) Unterschiedliche Erntezeiten beeinflussen die RLA-Messwerte. RLA-Messwerte werden 48 h, 60 h und 72 h nach Virusinfektion erkannt. Die Daten aus drei unabhängigen Experimenten werden als Mittelwert ± REM dargestellt; Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dar. Es wurde eine einfaktorielle ANOVA mit Tukey-Test durchgeführt. P < 0,0001; ns, nicht signifikant. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: H5-neutralisierende Antikörperantworten, die mit Pseudoviren nachgewiesen wurden. (A) Titration neutralisierender Antikörperantworten der Immunseren aus der DDV-Gruppe. (B) Titration der neutralisierenden Antikörperantworten der Immunseren aus der Kontrollgruppe. Die IC 50 ist definiert als die reziproke Verdünnung des neutralisierenden Antikörpers, der50 % des Pseudovirus hemmen kann. Die Daten aus drei unabhängigen Experimenten werden als Mittelwert ± REM dargestellt; Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dar. Als Negativkontrolle wurde das VSVG-Pseudovirus verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Nachweis der Neutralisationsantikörperpotenz durch Bindungs- und Viruseintrittsassays . (A) Immunseren aus der DDV-Gruppe, nicht aus der Kontrollgruppe, hemmen die Anheftung von Viren an Zellen. (B) Immunseren aus der DDV-Gruppe, nicht aus der Kontrollgruppe, hemmen teilweise die virale Post-Attachment-Infektion. Die Daten aus drei unabhängigen Experimenten werden als Mittelwert ± REM dargestellt; Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Vollständige Zusammensetzung des DMEM-Mediums | Konzentration |
| Dulbeccos modifizierter Adler Medium (DMEM) | 1x |
| Fötales Kälberserum | 10% |
| Penicillin (1 U/ml)/Streptomycin | 1 μg/ml |
Tabelle 1: Vollständige Zusammensetzung des DMEM-Mediums.
| Materialien | Konzentration | Volumen |
| 2x HEPES (pH 7,1) | -- | 675.0 μL |
| CaCl 2 (2,5 m) | -- | 67,5 μL |
| ddH2O | -- | 529,2 μL |
| pCMV Δ 8,9 | 1000 ng/μL | 18,9 μL |
| pCMV/R-HA | 100 ng/μL | 27,0 μL |
| pCMV/R-NA | 50 ng/μL | 13,5 μL |
| pHR-Luc | 1000 ng/μL | 18,9 μL |
Tabelle 2: Pseudovirus-Verpackungssystem.
Ergänzende Abbildung 1: Flussdiagramm der Immunisierung von Mäusen. Dieses Flussdiagramm beschreibt die wichtigsten Verfahren der Mäuseimmunisierung. Die Immunseren wurden als Proben verwendet. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: HA-, NA- und HIV-1-p24-Proteinexpression des Influenza-Pseudovirus. Western-Blot von Pseudovirus-Proteinen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
HEK293FT Zellen werden in der Regel als Verpackungszellen zur Herstellung von Pseudoviren verwendet. Ein regelmäßiger Mykoplasmennachweis ist während der Zellkultur unerlässlich. Eine Mykoplasmenkontamination kann die Ausbeute an Pseudoviren drastisch verringern und manchmal nahe Null liegen. Im Vergleich zu anderen Kontaminationen führen Mykoplasmen-Kontaminationen nicht zu pH-Wert-Veränderungen oder Trübungen des Zellkulturmediums. Selbst eine hohe Konzentration von Mykoplasmen ist mit bloßem Auge oder unter dem Mikroskop nicht sichtbar. Drei gängige Methoden des Mykoplasmennachweises sind die Mykoplasmenkultur, die DNA-Färbung mit fluoreszierendem DAPI oder Hoechst 33258 und die Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Die PCR-Amplifikation der Mykoplasmen-DNA in Kulturproben wird häufig für schnelle, einfache und zuverlässige Mykoplasmentests verwendet10.
Die Calciumphosphat-vermittelte Transfektion wird aufgrund ihrer hohen Effizienz, geringen Kosten und einfachen Bedienung seit vielen Jahren für die Verpackung von Influenza-Pseudoviren verwendet11. Diese Methode ist jedoch sehr empfindlich gegenüber dem pH-Wert einer HEPES-gepufferten Lösung, dem HEK293FT Zellkulturmedium und dem doppelt destilliertenH2O. Der pH-Wert beeinflusste die Bildung von Niederschlag und die Verweildauer des Niederschlags auf HEK293FT Zellen. So kann es die DNA-Menge bestimmen, die von HEK293FT Zellen aufgenommen wird. Der pH-Wert für eine HEPES-gepufferte Lösung ist extrem eng begrenzt und reicht von 7,05 bis 7,1212,13,14, wobei sich in HEPES-gepufferter Lösung langsam ein Niederschlag bildet, der Calciumphosphat und DNA enthält. Wenn der pH-Wert zu hoch ist, wird die Größe des Niederschlags so groß, dass er sogar die HEK293T Zellen abtöten kann. Im Gegenteil, wenn der pH-Wert zu niedrig ist, kann der Niederschlag nicht gebildet werden, oder der Niederschlag ist zu klein, um sich an der Zelloberfläche abzusetzen. Darüber hinaus spielt auch der pH-Wert des HEK293FT Zellkulturmediums eine Rolle für die Transfektionseffizienz. Während der Transfektion sollte das Zellmedium zwischen einem pH-Wert von 7,2-7,4 gehalten werden. Sowohl hypersaure als auch alkalische Medien verändern die Größe des Niederschlags und die Adsorptionszeit des DNA-Gemisches auf der Zelloberfläche. Darüber hinaus kann doppelt destilliertesH2Ounterschiedlicher Herkunft, das in der DNA-Mischung verwendet wird, den pH-Wert einer HEPES-gepufferten Lösung verändern. Daher ist die Aufrechterhaltung eines stabilen pH-Wertes der Transfektionslösung und des Nährmediums entscheidend, um eine hohe Transfektionseffizienz zu gewährleisten. Darüber hinaus wird die Transfektionseffizienz auch durch 2,5 MCaCl2-Lösung und die Konzentration von Kohlendioxid (CO2) im Zellinkubator beeinflusst. Während des Transfektionsprozesses ist es entscheidend, die CaCl 2 -Lösung richtig zu lagern und die CO2 -Konzentration im Inkubator zu stabilisieren.
Das am weitesten verbreitete Verpackungssystem für Influenza-Pseudoviren beinhaltet einen Co-Transfektionsansatz mit mehreren Plasmiden. HA-, NA-, Reporter- und lentivirale gag- und pol-Gene werden separat in Plasmid-Expressionsvektoren kloniert und dann gleichzeitig in die Zellen transfiziert. Um die Proteinexpression zu erhöhen, wird häufig eine Kozak-Konsensussequenz vor der Transkriptionsstartstelle hinzugefügt.
Es ist notwendig, reine, supercoiling- und endotoxinfreie Plasmid-DNAherzustellen 15. Denn das Plasmidverhältnis wirkt sich direkt auf die Pseudovirus-Ausbeute aus. Dieses Protokoll optimierte das Plasmidverhältnis des "core: reporter: HA: NA" zu 28:28:4:1 und verglich es mit anderen Transfektionsmethoden. Es ist erforderlich, dass die Menge der Plasmid-DNA in der Calciumphosphat-Transfektion bis zu 30,5 μg pro 100-mm-Schale erreicht.
Pseudovirustiter werden mittels quantitativer Real-Time-PCR (qRT-PCR), Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), Hämagglutinationsassay und RLA-Detektionsassays nachgewiesen. Der qRT-PCR-Assay wird verwendet, um die Kopienzahlen von RNA-Genen im Inneren des Pseudovirus zu schätzen5. Der ELISA-Assay wird verwendet, um den Gehalt des p24-Proteins nachzuweisen, das die Hauptkomponente des HIV-Kerns ist. Der Hämagglutinationsassay misst die HA-Spike-Menge auf der Oberfläche der Pseudoviruspartikel. Diese drei Assays werden verwendet, um funktionsuntüchtige Viruspartikel zu quantifizieren. Der RLA-Nachweisassay ist die wichtigste Methode zur Messung der Konzentration funktioneller Viruspartikel, die transduzierte Zellen infizieren und Reportergene in Pseudovirusbeständen freisetzen können. MDCK-Zellen werden häufig als transduzierte Zellen verwendet. Transduzierte Zellen werden in 96-Well-Kulturplatten ausgesät, mit Pseudoviren infiziert, mit Lysepuffer lysiert und dann auf 96-Well-Luminometerplatten übertragen, um Werte abzulesen. Unterschiedliche Zellmengen und Inkubationszeiten beeinflussen die RLA-Werte. Basierend auf den Ergebnissen ist die Expression des Reportergens hoch, wenn 5000 Zellen pro Well auf einer 96-Well-Platte ausgesät werden, und RLA wird 60 h nach der Virusinfektion nachgewiesen.
H5-HPAI-Pseudovirus-Neutralisations-Assays (PN) werden aufgrund ihrer Sicherheit, höheren Sensitivität, Genauigkeit und Eignung für das Hochdurchsatz-Screening häufig für den Antikörpernachweis eingesetzt. Ein allgemeines Protokoll des PN-Assays umfasst die folgenden vier Schritte: Pseudovirusmengen, Serumverdünnung, Pseudovirus-Antikörper-Inkubation und Nachweis der Luciferase-Aktivität. Die Mengen des Pseudovirus werden auf der Grundlage der RLA-Messwerte normalisiert. RLA-Werte von 106 pro Well in einer 96-Well-Platte werden verwendet, um reproduzierbare Versuchsergebnisse zu erhalten. Der Startpunkt der Verdünnung der Serumprobe muss über 40 liegen. Die Serumprobenkomponente erhöht offensichtlich die Luciferase-Werte des Pseudovirus, wenn der Verdünnungsfaktor der Serumprobe weniger als 40 beträgt. Das Pseudovirus-Antikörper-Gemisch wird für 1 h bei 37 °C inkubiert und dann auf MDCK-Zellen übertragen, gefolgt von der Detektion von RLA-Messwerten in 60 h. Der Luciferase-Spiegel wird im Allgemeinen als Instrument zur Bestimmung der Effizienz von Pseudovirusinfektionen verwendet.
Im PN-Assay gibt es vier wichtige Elemente: das Luciferase-Reporterprotein, die Assay-Chemie, ein Luminometer und Mikrotiterplatten16. Erstens ist das Luciferase-Gen Codon-optimiert, um die Proteinexpression in transduzierten Zellen zu verbessern. Durch die Entwicklung der Reporter- und Vektor-Backbone-Gene wird die Anzahl der Konsensus-Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen reduziert, um das anomale Transkriptionsrisiko zu verringern. Zweitens werden geeignete Nachweisreagenzien entsprechend dem Ziel des Experiments ausgewählt. PN-Assays werden im Allgemeinen als Hochdurchsatzmethoden verwendet, um neutralisierende Reaktionen von Serum- oder Antikörperproben nachzuweisen. Bei diesem Protokoll wurde das Bright-Glo-Luciferase-Assay-System verwendet, das das hellste Signal, einen großen Dynamikbereich und eine hohe Empfindlichkeit bietet. Noch wichtiger ist, dass die Halbwertszeit des Signals etwa 10 Minuten beträgt und die Zellen sofort nach der Zugabe des Substrats getestet werden. Ein Luminometer wird verwendet, um die Luciferase-Konzentration zu bestimmen. Es werden viele verschiedene Arten von Luminometern hergestellt. Das Grundprinzip besteht darin, dass die eingesetzte Maschine Unterschiede in der Luciferase-Aktivität zwischen verschiedenen Proben präzise erkennen kann. Schwarze oder weiße Polystyrol-Mikrotiterplatten sollten für Opazität und schwach lumineszierende Hintergründe verwendet werden. Weiße Mikrotiterplatten können Lumineszenzsignale verstärken und haben eine geringe Hintergrundlumineszenz, während schwarze Mikrotiterplatten die Lichtstreuung minimieren können, um das Übersprechen von Well zu Well zu reduzieren17.
PN-Assays entsprechen herkömmlichen Methoden zum Nachweis neutralisierender Antikörperantworten. Da Pseudoviren jedoch nur HA- und NA-Proteine von Influenza-Wildtyp-Viren enthalten, sind sie weit vom Wildtyp-Virus entfernt. HA kann an den Sialinsäurerezeptor der Empfängerzelle binden, um eine Infektion auszulösen. Dann lösen die HA-Konformationsänderungen im Endosom die Fusion der viralen und endosomalen Membran aus, wodurch die viralen Ribonukleoproteine (vRNPs) in das Zytoplasma freigesetzt werden. Influenza-Pseudoviren können diese Prozesse nur imitieren und werden in verwandten Forschungen eingesetzt.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch die Forschungsstipendien des Innovation Capacity Building Project der Provinz Jiangsu (BM2020019), des Shenzhen Scientific and Technological Project (Nr. JSGG20200225150702770), Strategic Priority Research Program der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (XDB29030103), Guangdong Scientific and Technological Project (Nr. 2020B1111340076) und das Shenzhen Bay Laboratory Open Research Program (Nr. SZBL202002271003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% Chiken Erythrocyte | Bio-channel | BC-RBC-C001 | Reagent |
| 96-well cell culture plates (flat-bottom) | Thermo fisher scientific | 167008 | consumable material |
| 96-well cell culture plates (round-bottom) | Thermo fisher scientific | 163320 | consumable material |
| Allegra X-15R | Beckman coulter | -- | Equipment/Centrifuge |
| BD Insulin Syringes | BD | 324910 | consumable material |
| Calcium Chloride Anhydrous | AMRESCO | 1B1110-500G | Reagent |
| chloroquine diphosphate | Selleck | S4157 | Reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12100-046 | Reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | Reagent |
| HEK293FT | Gibco | R700-07 | Cell line |
| HEPES FREE ACID | AMRESCO | 0511-250G | Reagent |
| HIV-1 p24 Antigen ELISA | ZeptoMetrix | 801111 | Reagent kit |
| Luciferase Assay System Freezer Pack | Promega | E4530 | Reagent kit |
| MDCK.1 | ATCC | CRL-2935 | Cell line |
| Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo fisher scientific | 509-GRD-Q | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 15 mL | Thermo fisher scientific | 339650 | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo fisher scientific | 339652 | consumable material |
| Nunc EasYFlask 75 cm2 | Thermo fisher scientific | 156499 | consumable material |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagent |
| Pipette Tips (10 μL) | Thermo fisher scientific | TF102-10-Q | consumable material |
| Pipette Tips (100 μL) | Thermo fisher scientific | TF113-100-Q | consumable material |
| Pipette Tips (1000 μL) | Thermo fisher scientific | TF112-1000-Q | consumable material |
| Serological pipets (5 mL) | Thermo fisher scientific | 170355N | consumable material |
| Serological pipets (10 mL) | Thermo fisher scientific | 170356N | consumable material |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Reagent |
| Varioskan Flash | Thermo fisher scientific | -- | Equipment/Microplate reader |
| Water Jacket Incubator | Thermo fisher scientific | 3111 | Equipment/Cell incubator |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | 57-33-0 | Reagent |
References
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