Summary

Herstellung von pseudotypisierten H5-Aviären Influenzaviren mit Calciumphosphat-Transfektionsmethode und Messung der Antikörperneutralisationsaktivität

Published: November 22, 2021
doi:

Summary

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Verpackung von Pseudoviren und die Messung der Antikörper-neutralisierenden Aktivität.

Abstract

Seit 1996 verursachen hochpathogene H5-Viren der A/Gans/Guangdong/1/96-Linie Grippeausbrüche bei Geflügel und Wildvögeln. Gelegentlich fallen ihr auch Menschen zum Opfer, was zu einer hohen Sterblichkeit führt. Nichtsdestotrotz wird die HPAI-Virusforschung oft behindert, wenn man bedenkt, dass sie in Laboratorien der biologischen Sicherheitsstufe 3 durchgeführt werden muss. Um dieses Problem zu lösen, werden Pseudoviren als Alternative zu Wildtyp-Viren in einigen Experimenten von H5-HPAI-Studien eingesetzt. Pseudoviren erweisen sich als ideale Werkzeuge, um neutralisierende Antikörper gegen H5-HPAI-Viren zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren und kritischen Schritte von H5-HPAI-Pseudovirus-Präparaten und Pseudovirus-Neutralisationsassays. Außerdem werden die Fehlerbehebung, die Einschränkung und die Modifikationen dieser Assays erörtert.

Introduction

Seit 1996 verursachen hochpathogene H5-Viren der A/Goose/Guangdong/1/96-Linie der aviären Influenza (HPAI) kontinuierliche Grippeausbrüche bei Geflügel und Wildvögeln, die für enorme sozioökonomische Verluste in der globalen Geflügelindustrie verantwortlich sind. Manchmal infizieren sich auch Menschen damit, was mit einer hohen Sterblichkeitsrate konfrontiert ist 1,2. Die HPAI-Virusforschung wird jedoch häufig behindert, da sie nicht außerhalb von Laboratorien der Biosicherheitsstufe 3 durchgeführt werden kann. Um dieses Problem zu lösen, werden Pseudoviren als Alternative zu Wildtyp-Viren in einigen Experimenten von H5-HPAI-Studien eingesetzt. Pseudoviren sind sicher genug, um in Laboratorien der Biosicherheitsstufe 2 praktiziert zu werden.

H5 HPAI-Pseudoviren gehören zu den chimären Viren, die aus Surrogatviruskernen, Lipidhüllen mit den Oberflächenglykoproteinen von Influenzaviren und Reportergenen bestehen. Pseudoviruskerne stammen in der Regel vom lentiviralen humanen Immundefizienzvirus (HIV), Retroviren wie dem murinen Leukämievirus (MLV) und dem vesikulären Stomatitisvirus (VSV)3. Insbesondere das HIV-1-Verpackungssystem wird häufig zur Herstellung von Influenza-Pseudoviren verwendet, wobei die primären Gene gag und pol sind. Das HIV-Gag-Gen exprimiert Kernproteine. Das pol-Gen exprimiert die Integrase und die reverse Transkriptase, die beide für die Expression des Reportergens in transduzierten Zellen notwendig sind. In Anlehnung an das Genom des Surrogatvirus wird das Reportergen in RNA-Form in den Pseudoviruskern aufgenommen. Das Reportergen exprimiert das Protein in den Wirtszellen. Die Genexpressionsniveaus von Reportergenen können verwendet werden, um die Effizienz von Pseudovirusinfektionen zu messen 3,4. Der primäre Reporter ist die Glühwürmchen-Luciferase zur Messung der relativen Lumineszenzeinheiten (RLU) oder der relativen Luciferase-Aktivität (RLA) in transduzierten Zellen. Andere Reporter wie lacZ, Gaussia und Renilla luciferase werden ebenfalls verwendet, nur in geringerem Maße5.

Pseudoviren sind ideale Werkzeuge, um neutralisierende Antikörper gegen H5-HAPI-Viren zu untersuchen. Um die Potenz der neutralisierenden Antikörper zu messen, werden Pseudovirus-Neutralisations-Assays (PN)6 verwendet. Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA) sind Glykoproteine auf der Oberfläche des Influenza-A-Virus 7,8. Die HA besteht aus einer globulären Kopfdomäne für die Rezeptorbindung und einer Stammdomäne für die Membranfusion. Das NA-Protein hat die Sialidase-Aktivität, um die Virusfreisetzung zu erleichtern 7,8. Ein PN-Assay kann neutralisierende Antikörper messen, die gegen HA-Proteine gerichtet sind. Neutralisierende Antikörper, die auf den Kopf- und Stammbereich der HA gerichtet sind, können auch durch virale Attachment- und Eintrittsassays nachgewiesen werden. Im Vergleich zu Wildtyp-Viren haben Pseudovirus-Neutralisationsexperimente empfindlichere Nachweiswerte, können in einem Biosicherheitslabor der Stufe 2 sicher durchgeführt werden und sind in der Praxis im Allgemeinen einfacher zu bedienen.

In diesem Protokoll werden die Verfahren und kritischen Schritte von H5-HPAI-Pseudoviruspräparaten und PN-Assays detailliert beschrieben. Außerdem werden die Fehlerbehebung, die Einschränkung und die Modifikationen dieser Assays erörtert. In dieser Arbeit wurde der Stamm A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH) von H5N1 HPAI-Viren als Beispiel verwendet. Um die in Assays verwendeten Immunseren zu erhalten, wählte dieses Protokoll das aus dem TH-Stamm stammende HA-Protein als Immunogen für die Immunisierung von Mäusen aus.

Protocol

Alle Pseudovirus-bezogenen experimentellen Operationen wurden unter ABSL2-Bedingungen im Institut Pasteur der Shanghai Chinese Academy of Sciences (IPS, CAS) durchgeführt. Die Tierversuche wurden auf der Grundlage der vom Institutional Animal Care and Use Committee genehmigten Tierprotokolle von IPS, CAS durchgeführt. 1. Pseudovirusverpackung mit Calciumphosphat-Transfektion Einzelzellsuspensionen von HEK293FT Zellen (9 x 10,5 pro ml) in vollständigem D…

Representative Results

HA, NA und HIV-1 p24 Proteinexpression des Influenza-PseudovirusUm die Effizienz der Virusverpackung zu ermitteln, wurden zunächst Influenza-Pseudovirusbestände mittels HA-Assay nachgewiesen (Abbildung 2A). Die HA-Einheiten pro Milliliter Influenza-Pseudoviren betragen 643 (Tabelle 3). Western-Blot-Assays und Sandwich-ELISA-Assays wurden verwendet, um die HA-, NA- und HIV-1 p24-Proteinexpression zu testen. Anschließend wurden die Verhältnisse der HA-…

Discussion

HEK293FT Zellen werden in der Regel als Verpackungszellen zur Herstellung von Pseudoviren verwendet. Ein regelmäßiger Mykoplasmennachweis ist während der Zellkultur unerlässlich. Eine Mykoplasmenkontamination kann die Ausbeute an Pseudoviren drastisch verringern und manchmal nahe Null liegen. Im Vergleich zu anderen Kontaminationen führen Mykoplasmen-Kontaminationen nicht zu pH-Wert-Veränderungen oder Trübungen des Zellkulturmediums. Selbst eine hohe Konzentration von Mykoplasmen ist mit bloßem Auge oder unter de…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch die Forschungsstipendien des Innovation Capacity Building Project der Provinz Jiangsu (BM2020019), des Shenzhen Scientific and Technological Project (Nr. JSGG20200225150702770), Strategic Priority Research Program der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (XDB29030103), Guangdong Scientific and Technological Project (Nr. 2020B1111340076) und das Shenzhen Bay Laboratory Open Research Program (Nr. SZBL202002271003).

Materials

1% Chiken Erythrocyte Bio-channel BC-RBC-C001 Reagent
96-well cell culture plates (flat-bottom) Thermo fisher scientific 167008 consumable material
96-well cell culture plates (round-bottom) Thermo fisher scientific 163320 consumable material
Allegra X-15R Beckman coulter Equipment/Centrifuge
BD Insulin Syringes BD 324910 consumable material
Calcium Chloride Anhydrous AMRESCO 1B1110-500G Reagent
chloroquine diphosphate Selleck S4157 Reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 12100-046 Reagent
Fetal Bovine Serum Gibco 16000-044 Reagent
HEK293FT Gibco R700-07 Cell line
HEPES FREE ACID AMRESCO 0511-250G Reagent
HIV-1 p24 Antigen ELISA ZeptoMetrix 801111 Reagent kit
Luciferase Assay System Freezer Pack Promega E4530 Reagent kit
MDCK.1 ATCC CRL-2935 Cell line
Microcentrifuge Tubes 1.5 mL Thermo fisher scientific 509-GRD-Q consumable material
Nunc Conical Centrifuge Tubes 15 mL Thermo fisher scientific 339650 consumable material
Nunc Conical Centrifuge Tubes 50 mL Thermo fisher scientific 339652 consumable material
Nunc EasYFlask 75 cm2 Thermo fisher scientific 156499 consumable material
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122 Reagent
Pipette Tips (10 μL) Thermo fisher scientific TF102-10-Q consumable material
Pipette Tips (100 μL) Thermo fisher scientific TF113-100-Q consumable material
Pipette Tips (1000 μL) Thermo fisher scientific TF112-1000-Q consumable material
Serological pipets (5 mL) Thermo fisher scientific 170355N consumable material
Serological pipets (10 mL) Thermo fisher scientific 170356N consumable material
Trypsin/EDTA Gibco 25200-072 Reagent
Varioskan Flash Thermo fisher scientific Equipment/Microplate reader
Water Jacket Incubator Thermo fisher scientific 3111 Equipment/Cell incubator
Pentobarbital sodium salt Sigma 57-33-0 Reagent

Referenzen

  1. Wang, G., et al. DNA prime and virus-like particle boost from a single H5N1 strain elicits broadly neutralizing antibody responses against head region of h5 hemagglutinin. The Journal of Infectious Diseases. 209 (5), 676-685 (2014).
  2. Wang, G., Yin, R., Zhou, P., Ding, Z. Combination of the immunization with the sequence close to the consensus sequence and two DNA prime plus one VLP boost generate H5 hemagglutinin specific broad neutralizing antibodies. Plos One. 12 (5), 0176854 (2017).
  3. Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28 (1), 1963 (2018).
  4. Duvergé, A., Negroni, M. Pseudotyping lentiviral vectors: When the clothes make the virus. Viruses. 12 (11), 1311 (2020).
  5. Carnell, G. W., Ferrara, F., Grehan, K., Thompson, C. P., Temperton, N. J. Pseudotype-based neutralization assays for influenza: A systematic analysis. Frontiers in Immunology. 6 (161), (2015).
  6. Trombetta, C., Perini, D., Mather, S., Temperton, N., Montomoli, E. Overview of serological techniques for influenza vaccine evaluation: Past, present and future. Vaccines. 2 (4), 707-734 (2014).
  7. Wei, C. J., et al. Next-generation influenza vaccines: opportunities and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (4), 239-252 (2020).
  8. Krammer, F., et al. Influenza. Nature Reviews Disease Primers. 4 (3), (2018).
  9. Wei, C. J., et al. Induction of broadly neutralizing H1N1 influenza antibodies by vaccination. Science. 27 (329), 1060-1064 (2010).
  10. Chernov, V. M., Chernova, O. A., Sanchez-Vega, J. T., Kolpakov, A. I., Ilinskaya, O. N. Mycoplasma contamination of cell cultures vesicular traffic in bacteria and control over infectious agents. Acta Naturae. 6 (3), 41-51 (2014).
  11. Michael, R. G., Joseph, S. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).
  12. Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. Transfection of mammalian cells with calcium phosphate-DNA coprecipitates. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), (2019).
  13. Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. Calcium phosphate transfection. Current Protocols in Molecular Biology. 9, (2003).
  14. Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. Transfection of DNA into eukaryotic cells. Current Protocols in Molecular Biology. 9, 11-19 (1996).
  15. Kachkin, D. V., Khorolskaya, J. I., Ivanova, J. S., Rubel, A. A. An efficient method for isolation of plasmid DNA for transfection of mammalian cell cultures. Methods and Protocols. 3 (4), 69 (2020).
  16. . Luciferase assay system Available from: https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system (2021)
  17. . Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates Available from: https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates (2021)

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Diesen Artikel zitieren
Chang, X., Zhou, K., Liu, Y., Duan, L., Zhang, L., Zhang, G., Wang, H., Wang, G. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (177), e62626, doi:10.3791/62626 (2021).

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