Summary
在这里，我们描述了假病毒包装和抗体中和活性测量的协议。
Abstract
自1996年以来，A/Goose/广东/1/96谱系高致病性禽流感（HPAI）H5病毒一直在家禽和野生鸟类中引起流感疫情。有时，人类也会成为它的受害者，从而导致高死亡率。尽管如此，高致病性禽流感病毒研究往往受到阻碍，因为它必须在生物安全3级实验室内处理。为了解决这个问题，在H5 HPAI研究的一些实验中，假病毒被采用作为野生型病毒的替代品。假病毒被证明是研究针对 H5 HPAI 病毒的中和抗体的理想工具。该协议描述了H5 HPAI假病毒制备和假病毒中和测定的程序和关键步骤。此外，它还讨论了这些测定的故障排除、限制和修改。
Introduction
自1996年以来，A/goose/广东/1/96谱系高致病性禽流感（HPAI）H5病毒在家禽和野生鸟类中持续暴发流感，给全球家禽业造成了巨大的社会经济损失。有时，人类也会感染它，面临高死亡率1，2。然而，高致病性禽流感病毒研究往往受到阻碍，因为它不能在生物安全3级实验室之外处理。为了解决这个问题，在H5 HPAI研究的一些实验中，假病毒被采用作为野生型病毒的替代品。假病毒足够安全，可以在生物安全2级实验室进行实践。
H5 HPAI 假病毒属于嵌合病毒，由替代病毒核心、带有流感病毒表面糖蛋白的脂质包膜和报告基因组成。假病毒核心通常来源于慢病毒人类免疫缺陷病毒 （HIV）、逆转录病毒（如鼠白血病病毒 （MLV） 和水疱性口炎病毒 （VSV）3。具体来说，HIV-1包装系统被广泛用于产生流感假病毒，其中提供的主要基因是 gag 和 pol。HIVgag基因表达核心蛋白。pol基因表达整合酶和逆转录酶，这两者都是报告基因在转导细胞中表达所必需的。模仿替代病毒的基因组，报告基因以RNA形式被拥抱到假病毒核心中。报告基因将在宿主细胞中表达蛋白质。报告基因的基因表达水平可用于测量假病毒感染效率3，4。主要报告基因是萤火虫荧光素酶，用于测量转导细胞中的相对发光单位（RLU）或相对荧光素酶活性（RLA）。其他报告基因如lacZ，Gaussia和Renilla荧光素酶也被使用，只是程度较小5。
假病毒是研究针对H5 HAPI病毒的中和抗体的理想工具。为了测量中和抗体的效力，使用假病毒中和（PN）测定6。血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）是甲型流感病毒7，8表面的糖蛋白。HA由用于受体结合的球状头部结构域和用于膜融合的干结构域组成。NA蛋白具有促进病毒释放的唾液酸酶活性7，8。PN 测定可以测量针对 HA 蛋白的中和抗体。针对HA头部和茎区域的中和抗体也可以通过病毒附着和进入测定来检测。与野生型病毒相比，假病毒中和实验具有更灵敏的检测值，可以在2级生物安全实验室中安全处理，并且在实践中通常更容易操作。
该协议详细介绍了H5 HPAI假病毒制备和PN测定的程序和关键步骤。此外，它还讨论了这些测定的故障排除、限制和修改。本研究以H5N1高致病性禽流感病毒的A/Thailand/1（KAN）-1/2004（TH）毒株为例。为了获得测定中使用的免疫血清，该方案选择源自TH菌株的HA蛋白作为免疫原来免疫小鼠。
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Protocol
所有假病毒相关实验操作均在中国科学院上海巴斯德研究所（IPS，CAS）的ABSL2条件下进行。动物实验是根据机构动物护理和使用委员会批准的IPS，CAS动物方案进行的。
1. 磷酸钙转染假病毒包装
- 在完整的DMEM培养基中制备HEK293FT细胞的单细胞悬液（每毫升9 x 105）（表1）。将10mL单细胞悬液加入T75烧瓶中，在转染前将细胞在37°C，5%二氧化碳（CO2）培养箱中孵育20小时。
注意：建议HEK293FT低通道（<20通道）。确保细胞单层80-90%汇合。 - 转染前2小时用10mL含有氯喹（100μM）的新鲜完全培养基替换培养基。
- 如 表 2和 图1所示混合试剂和质粒DNA：ddH2O，pCMV/R-HA，pCMV/R-NA，pHR-Luc，pCMV Δ 8.9，2.5 M CaCl2和2x HEPES缓冲液。轻轻上下移液5次，将混合物在室温（RT）下孵育20分钟。
- 将混合物转移到细胞上方的培养基中，轻轻摇动烧瓶。将细胞在细胞培养箱中孵育15小时。
- 用 15 mL 新鲜的完整 DMEM 培养基替换培养基。将细胞在37°C，5%CO2 培养箱中孵育65小时。
注意：培养基的颜色为浅橙色或微黄色，并且至少80%的细胞应在倒置光学显微镜下显示细胞病变效应（CPE）。 - 收获上清液，并在4°C下以2095× g 离心20分钟。 收集上清液，等分，并将其储存在-80°C。
2.检测流感假病毒的HA、NA和HIV-1 p24蛋白表达
- 通过血凝素 （HA） 测定检测 HA 蛋白表达。
- 将 50 μL PBS 加入 96 孔圆底板的第 2-12 列 A、B 和 C 行中。
注意：行 A、B 和 C 属于 3 个独立的重复测试，第 12 列用作阴性对照。 - 将 100 μL 假病毒加入第 1 列的孔中。将 50 μL 从第 1 列转移到第 2 列中，通过上下移液 5 次充分混合，进行两次稀释直至最后一列 11，然后丢弃第 11 列中多余的 50 μL。
- 向每个孔中加入 50 μL 0.5% 红细胞，轻轻上下移液两次。将板在室温下孵育30-60分钟或直到阴性对照的红细胞在孔底部形成规则斑点。
- 观察并记录假病毒的HA滴度。
注意：假病毒的HA单位是病毒的最高稀释因子，可导致红细胞100%血凝。
- 将 50 μL PBS 加入 96 孔圆底板的第 2-12 列 A、B 和 C 行中。
- 通过蛋白质印迹测定检测 HA 和 NA 蛋白表达。
注意：所有蛋白质印迹步骤均根据分子克隆手册（第 4版）进行。 - 通过 HIV-1 p24 ELISA 试剂盒检测 HIV-1 p24 蛋白表达（材料表）。
- 将 50 μL 裂解缓冲液加入 450 μL 假病毒样品中。充分混合。
- 向微孔板的每个孔中加入 300 μL 洗涤缓冲液。倒置击打板以完全去除洗涤缓冲液。重复洗涤5次。
- 分别向每个孔中加入 200 μL 标准品和样品。将它们在37°C孵育过夜或2小时。
- 吸出板的内容物并按照步骤2.3.2中所述洗涤板。
注意：将测定板的一个孔留空以用作底物空白。 - 向每个孔中加入 200 μL p24 检测器抗体。将它们在37°C孵育1小时。如步骤2.3.2所述吸出并洗涤板。
- 向每个孔中加入100μL链霉亲和素-过氧化物酶工作溶液，并在37°C下孵育30分钟。如步骤2.3.2所述吸出并洗涤板。
- 向每个孔中加入 100 μL 亚状态工作溶液，包括底物空白孔，并在 37 °C 下孵育 30 分钟。
注意：蓝色将在井中形成。 - 向每个孔中加入 100 μL 终止缓冲液。
注意：蓝色将立即变为黄色。 - 在15分钟内读取450nm处的光密度。记录假病毒的 p24 滴度
3.假病毒滴定
- 在完整的DMEM培养基中制备MDCK细胞的单细胞悬液（每毫升5 x 104 ），将1250、2500、5000、10000、20000和40000个细胞添加到96孔平底板的不同孔中。将细胞在37°C，5%CO2 培养箱中孵育20小时。
- 从-80°C冰箱中取出假病毒，在冰上解冻，涡旋假病毒。
- 向 96 孔圆底板的每个孔中加入 6 个 AU（6x HA 单位）假病毒，并用高达 120 μL 的完整 DMEM 补充每个孔。
- 上下移液混合物 5 次以充分混合。将混合物板在37°C，5%CO2 培养箱中孵育1小时。
- 将 100 μL 混合物转移到 96 孔板中的细胞中。病毒感染后将细胞培养板放回培养箱中48小时，60小时和72小时。
- 将板从培养箱中取出并进行荧光素酶测定（材料表）。
- 小心地从板的孔中取出培养基。用 200 μL PBS 冲洗细胞并尽可能多地去除 PBS。
注意：翻转板并通过将其反向拍打在吸收纸上来丢弃上清液。如果测试细胞系无法牢固地附着在底部，请小心地取出培养基抽吸物。 - 向每个孔中加入 50 μL 裂解缓冲液，并摇动培养板数次。将板在-80°C下储存过夜。
注意：将 1 体积的 5x 裂解缓冲液与 4 体积的水混合，制成 1x 裂解缓冲液。使用前将1x裂解缓冲液平衡至室温。摇动平板以确保细胞完全被裂解缓冲液覆盖。单次冻融过程可以帮助细胞完全裂解。 - 取出板，在室温下平衡2小时。
注意：细胞应完全裂解。 - 轻轻摇动板数次，并将所有细胞裂解物转移到不透明的 96 孔板中。
- 向每个孔中加入 50 μL 底物，轻轻摇动板数次，并彻底混合底物和裂解缓冲液。
- 使用光度计测量5分钟内产生的光。记录假病毒的荧光素酶滴度。
注意：当添加适当的底物时，光通过化学反应作为副产物发射，其中荧光素通过荧光素酶转化为氧化荧光素。产生的光量与荧光素酶的量成正比。
4. 免疫血清制备
注意：免疫血清将用于细胞相关实验，实验操作应在无菌条件下进行。
- 准备12只八周龄的雌性BALB / c小鼠。将小鼠平均分为两组。
注意：一组是DDV组，另一组是阴性对照组。 - DDV 组免疫：在第 0 周和第 3 周用编码 A/Thailand/（KAN-1）/2004 （TH） HA 蛋白的密码子优化 DNA 质粒肌内注射两次，在第 6 周用 512 个 HAU TH 病毒样颗粒 （VLP） 腹膜内增强一次。
- 对照组免疫：在第 0 周和第 3 周用 100 μg 空载体质粒 DNA 肌内注射两次，并在第 6 周用 HIV-1 gag VLP 腹膜内增强一次。
- 最后一次免疫后2周收集小鼠血液。
注意：在这里，小鼠在采血时用戊巴比妥钠（65mg / kg）麻醉。从下颌下静脉采集血液后，立即用CO2对小鼠实施安乐死。 - 将血液在室温下保持2小时，然后4°C过夜。在4°C下以900× g 离心10分钟并收集上清液。通过在56°C下放置30分钟来灭活血清。
- 将免疫血清储存在-80°C冰箱中使用。
注意：有关描述小鼠免疫主要程序的流程图，请参阅 补充图1 。
5. 假病毒中和 （PN） 测定
- 在完整的DMEM培养基中制备MDCK细胞的单细胞悬液（每毫升5 x 104 ），并向96孔平底板的每个孔中加入100μL细胞悬液。将细胞在37°C，5%CO2 培养箱中孵育20小时。
- 从-80°C冰箱中取出假病毒和血清，在冰上解冻，彻底涡旋。
- 将血清在完全培养基中稀释 20 倍，然后将 100 μL 完整的 DMEM 培养基添加到第 2-10 列的 96 孔圆底板的孔中。
- 将 200 μL 稀释的血清加入第 2 列的孔中，将 100 μL 从第 2 列转移到第 3 列，将血清稀释为 1：20、1：40、1：80 等，从第 2 列依次稀释至 1：10240，然后从第 10 列丢弃 100 μL。
- 向第 11 列的孔中加入 100 μL DMEM 完全培养基作为阴性对照。
- 向每个孔中加入 100 μL 假病毒，彻底上下移液混合物 5 次，并将混合物板在 37 °C、5% CO2 中孵育 1 小时。
- 将 100 μL 混合物从 96 孔圆底板转移到 96 孔细胞培养板的相应孔中。将板放回培养箱（37°C，5%CO2）中60小时。
- 将板从培养箱中取出。按照步骤3.7-3.12中所述进行荧光素酶测定。
6. 假病毒附着测定
- 在完整的DMEM培养基中制备MDCK细胞的单细胞悬液（每毫升4 x 104 ），并在96孔平底板中的每个孔中加入100μL细胞悬液。将细胞在37°C，5%CO2 下孵育20小时。
- 将假病毒与含有1%BSA的DMEM中的血清在4°C孵育过夜。
注意：混合物的体积为100μL。 - 在4°C下用每孔100μL含有1%BSA的DMEM封闭MDCK细胞1小时。
- 将假病毒和血清混合物（100μL）接种到MDCK单层上，并在4°C下孵育2小时。
- 用含有1%BSA的PBS洗涤细胞板4次，以去除任何未结合的病毒。
- 在室温下用 100 μL 荧光素酶裂解缓冲液裂解细胞 30 分钟。
- 如上所述，使用HIV-1 p24 ELISA试剂盒定量细胞上结合病毒的数量（第2.3节）。
7. 病毒进入评估
- 在完整的DMEM培养基中制备MDCK细胞的单细胞悬液（每毫升5 x 104 ），并向96孔平底板的每个孔中加入100μL细胞悬液。测定前将细胞在37°C，5%CO2 下孵育20小时。
- 将假病毒（100μL）接种到4°C的96孔板中的MDCK单层上6小时。
- 用含有1%BSA的PBS洗涤细胞板4次，以去除未结合的假病毒。
- 将100μL连续稀释的免疫血清或来自含有1%BSA的DMEM中的假疫苗接种小鼠血清添加到单层中，并将细胞在4°C孵育2小时。
- 除去细胞上清液，并用含有1%BSA的PBS洗涤细胞培养板4次。
- 向细胞中加入新鲜的DMEM，并在37°C，5%CO2 培养箱中孵育60小时。
- 如步骤3.7-3.12中所述测量细胞的相对荧光素酶活性（RLA）。
注意：如RLA所示，病毒进入表示为在没有血清的情况下获得的读数的百分比，该读数设置为100%。
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Representative Results
流感假病毒的HA、NA和HIV-1 p24蛋白表达
为了确定病毒包装效率，首先通过HA测定检测流感假病毒储液（图2A）。每毫升流感假病毒的HA单位为643（表3）。蛋白质印迹测定和夹心ELISA测定用于测试HA，NA和HIV-1 p24蛋白表达。然后计算假病毒HA单位与gag p24量的比值。蛋白质印迹测定的结果表明有4种蛋白质类型：HA0，HA1，HA2和NA蛋白（补充图2）。这表明流感假病毒的包膜蛋白与野生型病毒的包膜蛋白相似。HA和Gag p24的比率在正常范围内，如表3所示9。
| 假病毒株 | HAU/mL | 1.00E + 05 皮克/毫升 | HAU/1.00E+05 pg* 的比例* |
| P A/泰国/（KAN-1）/2004 | 642.52±30.26 | 4.20 ± 0.17 | 152.98 |
| *假病毒中HA单位和HIV-1 Gag p24量的比率计算如下：HA单位/Gag p24的量。 | |||
表3：H5假病毒的定量。
假病毒滴定
为了测量功能性病毒颗粒的浓度，检测了假病毒的相对荧光素酶活性（RLA）。RLA读数取决于许多变量。为了确定转导细胞量对RLA读数的影响，我们接种了96孔板每孔1250、2500、5000、10000、20000和40000的细胞（图2）。结果表明，当将5000个细胞接种在96孔板的孔中时，假病毒的RLA读数最高，平均值的标准误差最低（图4A）。为了确定孵育时间的影响，在病毒感染后48小时，60小时和72小时检测RLA读数。结果表明，当孵育60 h时，假病毒的RLA读数值更高，重复性更好，平均值的标准误差较低（图4B）。结果表明，它适合在96孔板的孔中接种5000个细胞，并在病毒感染后60小时检测RLA读数。
PN 检测
通过PN测定法测量对照组和DDV组免疫血清的中和滴度（图5）。 如图5A所示，DDV组免疫血清对假病毒A/泰国/1（KAN）-1/04株表现出较高的中和滴度。相比之下，对照组的血清没有表现出任何中和活性（图5B）。与传统的血清学检测（HI和MN检测）相比，PN检测更敏感（数据未显示）。
附着中和测定
一些中和抗体会阻碍病毒附着在唾液酸受体上。这些抗体针对HA头部，在通过商业疫苗免疫或感染流感病毒后占主导地位。为了鉴定这些抗体的中和活性，进行附着中和测定（图3）。与对照血清相比，免疫血清的中和活性是有效的，这表明免疫血清中有很多针对HA头的抗体（图6A）。
病毒进入评估
该测定用于鉴定在流感病毒感染期间阻碍病毒包膜和内体膜融合的抗体。这些抗体针对HA茎结构域，通常效力较低。为了测量这些抗体的中和滴度，进行附着后测定（图3）。免疫血清和对照血清之间存在显着差异，这表明免疫血清中存在针对HA茎区域的抗体（图6B）。
图1：钙介导转染的流程图。 该流程图用于描述钙介导转染的主要程序。请点击此处查看此图的大图。
图 2：假病毒的定量和滴定。 （A）假病毒HA测定流程图，描述了假病毒HA测定的主要步骤。（B）假病毒P24测定流程图，描述了假病毒P24测定的主要步骤。（C） 描述假病毒滴定测定主要步骤的假病毒滴定测定流程图。请点击此处查看此图的大图。
图 3：基于假病毒的中和测定。 （A）描述PN测定主要步骤的PN测定流程图。（B）假病毒附着测定流程图，描述了附着测定的主要步骤。（C）描述病毒进入测定主要步骤的病毒进入测定评估流程图。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：假病毒滴定。 （A）96孔板中每孔的不同细胞量会影响RLA读数。将 1250、2500、5000、10000、20000 和 40000 个细胞接种在 96 孔板中。（B）不同的收获时间会影响RLA读数。在病毒感染后48小时，60小时和72小时检测到RLA读数。从三个独立实验中收集的数据以平均± SEM表示;误差线表示平均值的标准误差 （SEM）。使用Tukey检验进行单因素方差分析。P < 0.0001;ns，不重要。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：假病毒检测到的 H5 中和抗体反应。 （A）滴定DDV组免疫血清的中和抗体反应。（B）滴定对照组免疫血清的中和抗体反应。IC 50定义为可以抑制50 %假病毒的中和抗体的相互稀释。从三个独立实验中收集的数据以平均± SEM表示;误差线表示平均值的标准误差 （SEM）。VSVG假病毒用作阴性对照。 请点击此处查看此图的大图。
图 6：通过结合和病毒进入测定检测中和抗体效力 。 （A）来自DDV组的免疫血清，而不是来自对照组的免疫血清，抑制病毒对细胞的附着。（B）来自DDV组的免疫血清，而不是来自对照组的免疫血清，部分抑制病毒附着后感染。从三个独立实验中收集的数据以平均± SEM表示;误差线表示平均值的标准误差 （SEM）。 请点击此处查看此图的大图。
| 完整的DMEM培养基成分 | 浓度 |
| 杜尔贝克改良鹰培养基（DMEM） | 1 倍 |
| 胎牛血清 | 10% |
| 青霉素（1 U/mL）/链霉素 | 1微克/毫升 |
表 1：完整的 DMEM 培养基组成。
| 材料 | 浓度 | 卷 |
| 2x HEPES （pH 7.1） | -- | 675.0 微升 |
| 氯化钙 2 （2.5 米） | -- | 67.5 微升 |
| ddH2O | -- | 529.2 微升 |
| 中成药浓度 Δ 8.9 | 1000 纳克/微升 | 18.9 微升 |
| pCMV/R-HA | 100 纳克/微升 | 27.0 微升 |
| pCMV/R-NA | 50 纳克/微升 | 13.5 微升 |
| pHR-Luc | 1000 纳克/微升 | 18.9 微升 |
表 2：伪病毒包装系统。
补充图1：小鼠免疫流程图。 该流程图描述了小鼠免疫的主要程序。免疫血清用作样品。 请点击此处下载此文件。
补充图2：流感假病毒的HA，NA和HIV-1 p24蛋白表达。 假病毒蛋白的蛋白质印迹。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
HEK293FT细胞通常用作包装细胞以产生假病毒。在细胞培养过程中，定期检测支原体至关重要。支原体污染可大大降低假病毒产量，有时接近于零。与其他污染相比，支原体污染不会导致细胞培养基的pH值变化或浑浊。即使是高浓度的支原体，肉眼或显微镜下也看不到。三种常用的支原体检测方法是支原体培养、荧光 DAPI 或 Hoechst 33258 DNA 染色和聚合酶链反应 （PCR）。PCR扩增培养样品中的支原体DNA广泛用于快速，简单和可靠的支原体检测10。
磷酸钙介导的转染因其效率高、成本低、操作简单等特点，多年来一直用于流感假病毒包装11。然而，该方法对HEPES缓冲溶液、HEK293FT细胞培养基和双蒸H2O的pH值非常敏感，pH值会影响沉淀物的形成和沉淀物在HEK293FT细胞上的停留时间。因此，它可以确定HEK293FT细胞吸收的DNA量。HEPES缓冲溶液的pH值限制极窄，范围为7.05-7.1212，13，14，在这种情况下，含有磷酸钙和DNA的沉淀在HEPES缓冲溶液中缓慢形成。如果pH值过高，沉淀物的大小会变得如此之大，甚至可以杀死HEK293T细胞。相反，如果pH值太低，则无法形成沉淀物，或者沉淀物将太小而无法沉降到细胞表面。此外，HEK293FT细胞培养基的pH值也会影响转染效率。在转染过程中，细胞培养基应保持在7.2-7.4的pH值之间。高酸性和碱性介质都会改变沉淀物的大小和DNA混合物在细胞表面的吸附时间。此外，DNA混合物中使用的不同来源的双蒸H2O可以改变HEPES缓冲溶液的pH值。因此，保持转染液和培养基的稳定pH值对于保证高转染效率至关重要。此外，转染效率还受2.5 M CaCl 2溶液和细胞培养箱中二氧化碳（CO2）浓度的影响。在转染过程中，正确储存CaCl 2溶液并稳定培养箱中的CO2浓度至关重要。
流感假病毒最常用的包装系统涉及多个质粒共转染方法。将HA、NA、报告基因和慢病毒 gag 和 pol 基因分别克隆到质粒表达载体中，然后同时转染到细胞中。为了增加蛋白表达，通常在转录起始位点之前添加Kozak共识序列。
有必要制备纯的、超螺旋的、无内毒素的质粒DNA15。由于质粒比例直接影响假病毒产量。该方案优化了“核心：报告基因：HA：NA”的质粒比例为28：28：4：1，并将其与其他转染方法进行了比较。要求磷酸钙转染中的质粒DNA量应达到每100 mm培养皿30.5μg。
通过实时荧光定量 PCR （qRT-PCR）、酶联免疫吸附测定 （ELISA）、血凝测定和 RLA 检测测定法检测假病毒滴度。qRT-PCR测定用于估计假病毒内部5的RNA基因拷贝数。ELISA测定用于检测p24蛋白的含量，p24蛋白是HIV核心的主要成分。血凝测定法测量假病毒颗粒表面的HA刺突量。这三种测定法用于量化无功能的病毒颗粒。RLA检测测定是测量功能性病毒颗粒浓度的主要方法，这些病毒颗粒可以感染转导细胞并在假病毒储备中释放报告基因。MDCK细胞通常用作转导细胞。将转导的细胞接种在96孔培养板中，感染假病毒，通过裂解缓冲液裂解，然后转移到96孔光度计板中以读取值。不同的细胞量和孵育时间会影响RLA值。根据结果，当在96孔板上每孔接种5000个细胞时，报告基因表达高，并且在病毒感染后60小时检测到RLA。
H5 HPAI 假病毒中和 （PN） 检测因其安全性、更高的灵敏度、准确性和高通量筛选的适用性而广泛用于抗体检测。PN 测定的一般方案包括以下四个步骤：假病毒数量、血清稀释、假病毒抗体孵育和荧光素酶活性检测。假病毒的数量根据RLA读数进行归一化。在96孔板中，RLA值为每孔106 ，以获得可重现的实验结果。血清样品稀释的起点必须超过40。当血清样品稀释因子小于40时，血清样品成分会明显增加假病毒的荧光素酶值。将假病毒 - 抗体混合物在37°C下孵育1小时，然后转移到MDCK细胞中，然后在60小时内进行RLA读数检测。荧光素酶水平通常作为确定假病毒感染效率的工具。
在PN测定中，有四个重要元素：荧光素酶报告蛋白，测定化学，光度计和微孔板16。首先，对荧光素酶基因进行密码子优化，以提高转导细胞中的蛋白质表达水平。对报告基因和载体骨架基因进行工程改造，减少共识转录因子结合位点的数量，从而降低异常转录风险。其次，根据实验目的选择合适的检测试剂。PN测定通常用作检测血清或抗体样品中和反应的高通量方法。该协议使用bright-Glo荧光素酶测定系统，该系统提供最亮的信号，宽动态范围和高灵敏度。更重要的是，信号的半衰期约为10分钟，并且在加入底物后立即测试细胞。光度计用于检测荧光素酶浓度。制造了许多不同类型的光度计。基本原理是所使用的机器可以精确识别不同样品之间荧光素酶活性的差异。黑色或白色聚苯乙烯微孔板应用于不透明度和低发光背景。白色微孔板可以增强发光信号并具有低背景发光，而黑色微孔板可以最大限度地减少光散射以减少孔间串扰17。
PN测定符合检测中和抗体反应的传统方法。然而，仅包括来自流感野生型病毒的HA和NA蛋白，假病毒与野生型病毒相去甚远。HA可以与受体细胞的唾液酸受体结合以引发感染。然后内体中的HA构象变化触发病毒和内体膜的融合，将病毒核糖核蛋白（vRNP）释放到细胞质中。流感假病毒只能模仿这些过程，并应用于相关研究。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了江苏省创新能力建设项目（BM2020019）和深圳市科技项目（No.JSGG20200225150702770）、中国科学院战略重点研究计划（XDB29030103）、广东省科技计划（编号：2020B1111340076）和深圳湾实验室开放研究计划（编号：2020B1111340076）。SZBL202002271003）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% Chiken Erythrocyte | Bio-channel | BC-RBC-C001 | Reagent |
| 96-well cell culture plates (flat-bottom) | Thermo fisher scientific | 167008 | consumable material |
| 96-well cell culture plates (round-bottom) | Thermo fisher scientific | 163320 | consumable material |
| Allegra X-15R | Beckman coulter | -- | Equipment/Centrifuge |
| BD Insulin Syringes | BD | 324910 | consumable material |
| Calcium Chloride Anhydrous | AMRESCO | 1B1110-500G | Reagent |
| chloroquine diphosphate | Selleck | S4157 | Reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12100-046 | Reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | Reagent |
| HEK293FT | Gibco | R700-07 | Cell line |
| HEPES FREE ACID | AMRESCO | 0511-250G | Reagent |
| HIV-1 p24 Antigen ELISA | ZeptoMetrix | 801111 | Reagent kit |
| Luciferase Assay System Freezer Pack | Promega | E4530 | Reagent kit |
| MDCK.1 | ATCC | CRL-2935 | Cell line |
| Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo fisher scientific | 509-GRD-Q | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 15 mL | Thermo fisher scientific | 339650 | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo fisher scientific | 339652 | consumable material |
| Nunc EasYFlask 75 cm2 | Thermo fisher scientific | 156499 | consumable material |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagent |
| Pipette Tips (10 μL) | Thermo fisher scientific | TF102-10-Q | consumable material |
| Pipette Tips (100 μL) | Thermo fisher scientific | TF113-100-Q | consumable material |
| Pipette Tips (1000 μL) | Thermo fisher scientific | TF112-1000-Q | consumable material |
| Serological pipets (5 mL) | Thermo fisher scientific | 170355N | consumable material |
| Serological pipets (10 mL) | Thermo fisher scientific | 170356N | consumable material |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Reagent |
| Varioskan Flash | Thermo fisher scientific | -- | Equipment/Microplate reader |
| Water Jacket Incubator | Thermo fisher scientific | 3111 | Equipment/Cell incubator |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | 57-33-0 | Reagent |
References
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- Wang, G., Yin, R., Zhou, P., Ding, Z. Combination of the immunization with the sequence close to the consensus sequence and two DNA prime plus one VLP boost generate H5 hemagglutinin specific broad neutralizing antibodies. Plos One. 12 (5), 0176854 (2017).
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