Summary
Här beskrivs ett protokoll för pseudovirusförpackning och mätning av antikroppsneutraliserande aktivitet.
Abstract
Sedan 1996 har A/goose/Guangdong/1/96-härstamning högpatogen aviär influensa (HPAI) H5-virus orsakat influensautbrott hos fjäderfä och vilda fåglar. Ibland faller människor också offer för det, vilket resulterar i hög dödlighet. Ändå hindras HPAI-virusforskning ofta, med tanke på att den måste hanteras inom biosäkerhetsnivå 3-laboratorier. För att ta itu med detta problem antas pseudovirus som ett alternativ till vildtypvirus i vissa experiment av H5 HPAI-studier. Pseudovirus visar sig vara de perfekta verktygen för att studera neutraliserande antikroppar mot H5 HPAI-virus. Detta protokoll beskriver procedurer och kritiska steg för H5 HPAI-pseudoviruspreparat och pseudovirusneutralisationsanalyser. Den diskuterar också felsökning, begränsning och modifieringar av dessa analyser.
Introduction
Sedan 1996 har A/goose/Guangdong/1/96-härstamning högpatogen aviär influensa (HPAI) H5-virus orsakat kontinuerliga influensautbrott hos fjäderfä och vilda fåglar, vilket står för enorma socioekonomiska förluster i den globala fjäderfäindustrin. Ibland blir människor också smittade med det, inför en hög dödlighet 1,2. HPAI-virusforskning hindras dock ofta, eftersom den inte kan hanteras utanför biosäkerhetsnivå 3-laboratorier. För att ta itu med detta problem antas pseudovirus som ett alternativ till vildtypvirus i vissa experiment av H5 HPAI-studier. Pseudovirus är tillräckligt säkra för att träna i biosäkerhetsnivå 2-laboratorier.
H5 HPAI-pseudovirus tillhör chimära virus som består av surrogatviruskärnor, lipidhöljen med ytglykoproteiner från influensavirus och reportergener. Pseudoviruskärnor härrör vanligtvis från lentiviralt humant immunbristvirus (HIV), retrovirus såsom murint leukemivirus (MLV) och vesikulärt stomatitvirus (VSV)3. Specifikt används HIV-1-förpackningssystemet i stor utsträckning för att producera influensapseudovirus, där de primära generna som tillhandahålls är gag och pol. HIV-gag-genen uttrycker kärnproteiner. Pol-genen uttrycker integras och omvänt transkriptas, vilka båda är nödvändiga för uttrycket av rapportgenen i transducerade celler. Genom att efterlikna surrogatvirusets genom omfamnas reportergenen i pseudoviruskärnan i RNA-form. Reportergenen kommer att uttrycka proteinet i värdceller. Genuttrycksnivåerna för rapportgener kan användas för att mäta pseudovirusinfektionseffektivitet 3,4. Den primära rapportören är firefly-luciferas för att mäta de relativa luminiscensenheterna (RLU) eller den relativa luciferasaktiviteten (RLA) i transducerade celler. Andra reportrar som lacZ, Gaussia och Renilla luciferase används också, bara i mindre utsträckning5.
Pseudovirus är idealiska verktyg för att studera neutraliserande antikroppar mot H5 HAPI-virus. För att mäta den neutraliserande antikroppspotensen används pseudovirusneutralisering (PN) analyser6. Hemagglutinin (HA) och neuraminidas (NA) är glykoproteiner på ytan av influensa A-virus 7,8. HA består av en globulär huvuddomän för receptorbindning och en stamdomän för membranfusion. NA-proteinet har sialidasaktiviteten för att underlätta virusfrisättning 7,8. En PN-analys kan mäta neutraliserande antikroppar riktade mot HA-proteiner. Neutraliserande antikroppar riktade mot huvud- och stamregionen av HA kan också detekteras genom virusbindning och ingångsanalyser. Jämfört med vildtypvirus har pseudovirusneutraliseringsexperiment känsligare detektionsvärden, kan hanteras säkert i ett nivå 2-biosäkerhetslaboratorium och är i allmänhet lättare att använda i praktiken.
Detta protokoll presenterar i detalj procedurerna och kritiska steg för H5 HPAI-pseudoviruspreparat och PN-analyser. Den diskuterar också felsökning, begränsning och modifieringar av dessa analyser. I denna studie användes A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH)-stammen från H5N1 HPAI-virus som exempel. För att erhålla immunserum som används i analyser valde detta protokoll HA-proteinet från TH-stammen som immunogen för att immunisera möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla pseudovirusrelaterade experimentella operationer utfördes under ABSL2-tillstånd i Institut Pasteur of Shanghai Chinese Academy of Sciences (IPS, CAS). Djurförsök utfördes baserat på Institutional Animal Care and Use Committee-godkända djurprotokoll från IPS, CAS.
1. Pseudovirusförpackning med kalciumfosfattransfektion
- Gör encellssuspensioner av HEK293FT celler (9 x 105 per ml) i komplett DMEM-medium (tabell 1). Tillsätt 10 ml encellssuspensioner till en T75-kolv, inkubera cellerna i en 37 °C, 5 % koldioxidinkubator (CO2) i 20 timmar före transfektionen.
OBS: HEK293FT låg passage (<20 passager) rekommenderas. Se till att cellmonolagret är 80-90% sammanflytande. - Byt ut mediet mot 10 ml färskt komplett medium innehållande klorokin (100 μM) 2 timmar före transfektion.
- Blanda reagenserna och plasmid-DNA enligt tabell 2 och figur 1:ddH2O, pCMV/R-HA, pCMV/R-NA, pHR-Luc, pCMV Δ 8,9, 2,5 M CaCl2 och 2x HEPES-buffert. Pipettera upp och ner 5 gånger försiktigt, inkubera blandningen vid rumstemperatur (RT) i 20 minuter.
- Överför blandningen till mediet ovanför cellerna och vagga kolven försiktigt. Inkubera cellerna i cellinkubatorn i 15 timmar.
- Byt ut mediet mot 15 ml färskt komplett DMEM-medium. Inkubera cellerna i en 37 °C, 5% CO2-inkubator i 65 timmar.
OBS: Mediets färg kommer att vara ljusorange eller något gul, och minst 80% av cellen ska visa den cytopatiska effekten (CPE) under det inverterade ljusmikroskopet. - Skörda supernatanten och centrifugera den vid 2095 x g i 20 min vid 4 °C. Samla upp supernatanten, alikvotera den och förvara den vid -80 °C.
2. Påvisande av HA-, NA- och HIV-1 p24-proteinuttryck av influensapseudovirus
- Påvisa HA-proteinuttrycket med hemagglutinin (HA) -analys.
- Tillsätt 50 μL PBS i kolumnerna 2-12, raderna A, B och C på en 96-brunns rundbottenplatta.
Rad A, B och C tillhör 3 oberoende replikeringstester och kolumn 12 används som negativ kontroll. - Tillsätt 100 μl pseudovirus i brunnarna i kolumn 1. Överför 50 μl från kolumn 1 till kolumn 2, blanda väl genom pipettering upp och ner 5 gånger, utför de tvåfaldiga utspädningarna till sista kolumn 11 och kassera de extra 50 μl från kolumn 11.
- Tillsätt 50 μL 0,5% erytrocyt i varje brunn, pipettera den försiktigt upp och ner två gånger. Inkubera plattan i 30-60 minuter vid rumstemperatur eller tills erytrocyterna i den negativa kontrollen bildar de vanliga fläckarna i botten av brunnen.
- Observera och registrera HA-titrar av pseudoviruset.
OBS: HA-enheten av pseudovirusen är den högsta utspädningsfaktorn för viruset som kan orsaka 100% hemagglutination av de röda blodkropparna.
- Tillsätt 50 μL PBS i kolumnerna 2-12, raderna A, B och C på en 96-brunns rundbottenplatta.
- Detektera HA- och NA-proteinuttryck genom western-blot-analysen.
OBS: Alla western-blot-steg utförs enligt manualen för molekylär kloning (4: e upplagan). - Upptäck HIV-1 p24-proteinuttrycket med HIV-1 p24 ELISA-kit (materialtabell).
- Tillsätt 50 μl av lysbufferten till 450 μl pseudovirusprov. Blanda det noggrant.
- Tillsätt 300 μL av tvättbufferten till varje brunn på mikroplattan. Slå plattan upp och ner för att ta bort tvättbufferten helt. Upprepa tvätten 5 gånger.
- Tillsätt 200 μL av standarden och proverna till varje brunn separat. Inkubera dem vid 37 °C över natten eller i 2 timmar.
- Aspirera plattans innehåll och tvätta plattan enligt beskrivningen i steg 2.3.2.
OBS: Lämna en brunn av analysplattan tom för användning som substratämne. - Tillsätt 200 μL av p24-detektorantikropparna till varje brunn. Inkubera dem vid 37 °C i 1 timme. Aspirera och tvätta plattan enligt beskrivningen i steg 2.3.2.
- Tillsätt 100 μl av streptavidinperoxidaslösningen till varje brunn och inkubera dem vid 37 °C i 30 minuter. Aspirera och tvätta plattan enligt beskrivningen i steg 2.3.2.
- Tillsätt 100 μl av deltillståndslösningen till varje brunn, inklusive substratprovbrunnen, och inkubera dem vid 37 °C i 30 minuter.
OBS: Blå färg kommer att utvecklas i brunnarna. - Tillsätt 100 μL av stoppbufferten till varje brunn.
OBS: Den blå färgen ändras omedelbart till gul. - Avläs den optiska densiteten vid 450 nm inom 15 min. Registrera pseudovirusets p24-titrar
3. Titrering av pseudovirus
- Gör encellssuspensioner av MDCK-celler (5 x 104 per ml) i komplett DMEM-medium, tillsätt 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 och 40000 celler till olika brunnar på en 96-brunns plattbottenplatta. Inkubera cellerna i en 37 °C, 5% CO2-inkubator i 20 timmar.
- Ta ut pseudoviruset från kylskåpet -80 °C, tina det på isen och virvla pseudoviruset.
- Tillsätt 6 HAU (6x HA-enheter) pseudovirus till varje brunn med 96 brunnar rundbottenplatta och fyll på varje brunn med komplett DMEM upp till 120 μl.
- Pipettera upp och ner blandningen 5 gånger för att blanda noggrant. Inkubera blandningsplattan i en 5 % CO2-inkubator vid 37 °C i 1 timme.
- Överför 100 μL av blandningen till cellerna i 96-brunnsplattan. Sätt tillbaka cellodlingsplattan i inkubatorn i 48 timmar, 60 timmar och 72 timmar efter virusinfektion.
- Ta plattan ur inkubatorn och utför luciferasanalysen (materialtabell).
- Ta försiktigt bort mediet från plattans brunnar. Skölj cellerna med 200 μL PBS och ta bort PBS så mycket som möjligt.
OBS: Vänd plattan och kassera supernatanten genom att slå den på absorberande papper. Om testcellinjen inte kunde fästa ordentligt i botten, ta bort mediumaspirationen försiktigt. - Tillsätt 50 μL av lysbufferten till varje brunn och skaka odlingsplattan flera gånger. Förvara plattan vid -80 °C över natten.
OBS: Blanda 1 volym 5x lysbuffert med 4 volymer vatten för att göra 1x lysbufferten. Balansera 1x lysbufferten till RT före användning. Gunga plattan för att säkerställa att cellerna är täckta med lysbufferten helt. Den enda frys-tina processen kan hjälpa cellen att lyseras helt. - Ta ut plattan, balansera vid RT i 2 timmar.
OBS: Cellen ska lyseras helt. - Gunga plattan flera gånger försiktigt och överför alla celllysat till ogenomskinliga 96-brunnsplattor.
- Tillsätt 50 μL av substratet till varje brunn, skaka plattan flera gånger försiktigt och blanda substrat och lysbuffert noggrant.
- Mät ljuset som produceras inom 5 minuter med hjälp av en luminometer. Anteckna pseudovirusets luciferastitrar.
OBS: När ett korrekt substrat tillsätts avges ljus som en biprodukt via en kemisk reaktion där luciferin omvandlas till oxyluciferin av luciferasenzymet. Mängden ljus som produceras är proportionell mot mängden luciferasenzym.
4. Immun sera förberedelse
OBS: Immunserumet kommer att användas för cellrelaterade experiment, och experimentoperationen bör utföras under aseptiska förhållanden.
- Förbered 12 åtta veckor gamla kvinnliga BALB / c-möss. Dela lika mössen i två grupper.
OBS: En grupp var DDV-gruppen och den andra var den negativa kontrollgruppen. - DDV-gruppimmunisering: Prime två gånger intramuskulärt med 100 μg av en kodonoptimerad DNA-plasmid som kodar för A / Thailand / (KAN-1) / 2004 (TH) HA-protein vid vecka 0 och vecka 3 och öka en gång intraperitonealt med 512 HAU TH-virusliknande partiklar (VLP) vid vecka 6.
- Kontrollgruppsimmunisering: Fyll två gånger intramuskulärt med 100 μg tomt vektorplasmid-DNA vid vecka 0 och vecka 3 och öka en gång intraperitonealt med HIV-1 gag VLP vid vecka 6.
- Samla musblodet 2 veckor efter den sista immuniseringen.
OBS: Här bedövades mössen med pentobarbitalnatrium (65 mg / kg) vid blodinsamlingstillfället. Efter bloduppsamling från den submandibulära venen avlivades mössen omedelbart med CO2. - Håll blodet vid rumstemperatur i 2 timmar, sedan 4 °C över natten. Centrifugera vid 900 x g i 10 min vid 4 °C och samla upp supernatanten. Inaktivera serumet genom att placera det vid 56 °C i 30 minuter.
- Förvara immunserumet i ett kylskåp på -80 °C för användning.
OBS: Se kompletterande figur 1 för flödesschemat som beskriver de viktigaste procedurerna för musimmunisering.
5. Analys av pseudovirusneutralisering (PN)
- Gör encellssuspensioner av MDCK-celler (5 x 104 per ml) i komplett DMEM-medium och tillsätt 100 μL av cellsuspensionen till varje brunn på en 96-brunns plattbottenplatta. Inkubera cellerna i en 37 °C, 5% CO2-inkubator i 20 timmar.
- Ta ut pseudovirus och serum från kylskåpet på -80 °C, tina det på isen och virvla noggrant.
- Späd serumet i hela mediet 20 gånger och tillsätt 100 μl komplett DMEM-medium till brunnarna på en 96-brunns rundbottenplatta från kolumnerna 2-10.
- Tillsätt 200 μl av det utspädda serumet i brunnarna i kolumn 2, överför 100 μl från kolumn 2 till kolumn 3, späd serumet som 1:20, 1:40, 1:80 osv. till 1:10240 i tur och ordning från kolumn 2 till kolumn 10 och kassera 100 μl från kolumn 10.
- Tillsätt 100 μl DMEM komplett medium till brunnarna i kolumn 11 som negativ kontroll.
- Tillsätt 100 μl pseudovirus till varje brunn, pipettera upp och ner blandningen 5 gånger noggrant och inkubera blandningsplattan i 37 °C, 5 %CO2 i 1 timme.
- Överför 100 μl av blandningen från den runda bottenplattan med 96 brunnar till motsvarande brunn på cellodlingsplattan med 96 brunnar. Sätt tillbaka plattan i inkubatorn (37 °C, 5%CO2) i 60 timmar.
- Ta plattan ur inkubatorn. Utför luciferastestet enligt beskrivningen i steg 3.7–3.12.
6. Analys av pseudovirusbindning
- Gör encellssuspensioner av MDCK-celler (4 x 104 per ml) i komplett DMEM-medium och tillsätt 100 μL cellsuspensioner till varje brunn i en 96-brunns plattbottenplatta. Inkubera cellerna vid 37 °C, 5 %CO2 i 20 timmar.
- Inkubera pseudoviruset med serum i DMEM innehållande 1 % BSA vid 4 °C över natten.
OBS: Blandningens volym är 100 μl. - Blockera MDCK-cellerna med 100 μL DMEM per brunn innehållande 1 % BSA vid 4 °C i 1 timme.
- Inokulera pseudovirus- och serumblandningen (100 μl) på MDCK-monolagret och inkubera det vid 4 °C i 2 timmar.
- Tvätta cellplattan 4 gånger med PBS innehållande 1% BSA för att avlägsna eventuellt obundet virus.
- Lysera cellerna med 100 μl luciferaslysbuffert vid rumstemperatur i 30 minuter.
- Kvantifiera mängden bundet virus på cellerna med ett HIV-1 p24 ELISA-kit enligt beskrivningen ovan (avsnitt 2.3).
7. Bedömning av virusinträde
- Gör encellssuspensioner av MDCK-celler (5 x 104 per ml) i komplett DMEM-medium och tillsätt 100 μL av cellsuspensionen till varje brunn på en 96-brunns plattbottenplatta. Inkubera cellerna vid 37 °C, 5 %CO2 i 20 timmar före analysen.
- Inokulera pseudoviruset (100 μl) på ett MDCK-monolager i en platta med 96 brunnar vid 4 °C i 6 timmar.
- Tvätta cellplattan 4 gånger med PBS innehållande 1% BSA för att avlägsna obundna pseudovirus.
- Tillsätt 100 μl serieutspädda immunserum eller serum från skenvaccinationsmöss i DMEM som innehåller 1 % BSA till monolagret och inkubera cellen vid 4 °C i 2 timmar.
- Ta bort cellsupernatanten och tvätta cellodlingsplattan 4 gånger med PBS innehållande 1% BSA.
- Tillsätt färskt DMEM till cellerna och inkubera i 60 timmar i en 37 °C, 5% CO2-inkubator .
- Mät cellernas relativa luciferasaktivitet (RLA) enligt beskrivningen i steg 3.7-3.12.
OBS: Viral inmatning, som indikeras av RLA, uttrycktes som en procentandel av den avläsning som erhölls i frånvaro av serum, vilken fastställdes till 100%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HA, NA och HIV-1 p24 proteinuttryck av influensapseudovirus
För att identifiera virusförpackningens effektivitet upptäcktes först lager av influensapseudovirus genom HA-analys (figur 2A). HA-enheter per milliliter influensapseudovirus är 643 (tabell 3). Western-blot-analys och sandwich ELISA-analyser användes för att testa HA-, NA- och HIV-1 p24-proteinuttryck. Därefter beräknades förhållandena mellan HA-enhet och mängden gag p24 för pseudovirus. Resultaten av western-blot-analysen visade att det fanns 4 proteintyper: HA0-, HA1-, HA2- och NA-proteiner (kompletterande figur 2). Detta indikerar att omslutningsproteinerna hos influensapseudovirus liknar det hos vildtypvirus. Kvoterna för HA och Gag p24 låg inom ett normalt intervall som rapporterats (tabell 3)9.
| Pseudovirus stammar | HAU/ml | 1,00E + 05 pg / ml | Förhållandet HAU/1,00E+05 pg* |
| P A/Thailand/(KAN-1)/2004 | 642,52 ± 30,26 | 4,20 ± 0,17 | 152.98 |
| *Förhållandena mellan HA-enheterna och mängden HIV-1 Gag p24 i pseudovirus beräknades enligt följande: HA-enheter/mängden Gag p24. | |||
Tabell 3: Kvantifiering av H5-pseudovirus.
Titrering av pseudovirus
För att mäta koncentrationen av funktionella viruspartiklar detekterades relativ luciferasaktivitet (RLA) av pseudovirus. RLA-avläsningar är beroende av många variabler. För att identifiera effekten av transducerad cellmängd på RLA-avläsningar sådde vi cellerna på 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 och 40000 per brunn med 96-brunnsplatta (figur 2). Resultaten visade att RLA-avläsningar av pseudovirus är de högsta, och medelfelet är det lägsta när 5000 celler sås i en brunn med 96-brunnsplatta (figur 4A). För att identifiera effekten av inkubationstiden detekteras RLA-avläsningar vid 48 timmar, 60 timmar och 72 timmar efter virusinfektion. Resultaten visade att när de inkuberas i 60 timmar är RLA-avläsningarna av pseudovirus högre i värden och bättre i repeterbarhet med lågt standardfel i medelvärdet (figur 4B). Resultaten indikerar att det är lämpligt att sådda 5000 celler i en brunn på en 96-brunnsplatta och detektera RLA-avläsningar 60 timmar efter virusinfektion.
PN-analyser
Neutralisationstittrar av immunserum från kontrollgruppen och DDV-gruppen mättes med PN-analyser (figur 5). Som visas i figur 5A uppvisade immunserum från DDV-gruppen höga neutraliseringstitrar mot pseudovirus A/Thailand/1(KAN)-1/04-stammen. Däremot uppvisade serum från kontrollgruppen ingen neutraliseringsaktivitet (figur 5B). Jämfört med traditionella serologiska analyser (HI- och MN-analyser) är PN-analyser känsligare (data visas inte).
Analys av neutralisering av bilagor
Vissa neutraliseringsantikroppar kan hindra virusens bindning till sialinsyrareceptorerna. Dessa antikroppar riktas mot HA-huvudet och är dominerande efter immunisering genom kommersiellt vaccin eller infektion av influensavirus. För att identifiera den neutraliserande aktiviteten hos dessa antikroppar utförs bindningsneutraliseringsanalyser (figur 3). Jämfört med kontrollserum är immunseras neutraliserande aktivitet potent vilket indikerar att det finns många antikroppar riktade mot HA-huvudet i immunserumet (figur 6A).
Bedömning av virusinträde
Denna analys används för att identifiera antikroppar som hindrar fusion av virushölje och endosomala membran under influensavirusinfektion. Dessa antikroppar riktas mot HA-stjälkdomänen och är vanligtvis mindre potenta. För att mäta neutralisationstitrarna för dessa antikroppar utförs analyser efter bindning (figur 3). Det finns signifikanta skillnader mellan immunserum och kontrollserum, vilket indikerar att det finns antikroppar riktade mot HA-stamregionen i immunserumet (figur 6B).
Figur 1: Flödesschema över kalciummedierad transfektion. Detta flödesschema används för att beskriva viktiga procedurer för kalciummedierad transfektion. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Kvantifiering och titrering av pseudovirus. a) Flödesschema över pseudovirus HA-test som beskriver de viktigaste stegen i pseudovirus HA-test. b) Flödesschema över Pseudovirus P24-test som beskriver de viktigaste stegen i pseudovirus P24-testet. c) Flödesschema över titreringstest av pseudovirus som beskriver de viktigaste stegen i pseudovirustitreringstestet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Pseudovirusbaserade neutraliseringsanalyser. (A) Flödesschema över PN-test som beskriver de viktigaste stegen i PN-testet. (B) Flödesschema över pseudovirusbindningstest som beskriver de viktigaste stegen i fastsättningstestet. c) Flödesschema för bedömning av virusinträdestest som beskriver de viktigaste stegen i virusinträdestestet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Titrering av pseudovirus. (A) Olika cellmängder per brunn i en 96-brunnsplatta påverkar RLA-avläsningar. 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 och 40000 celler såddes i en 96-brunnsplatta. (B) Olika skördetid påverkar RLA-avläsningar. RLA-avläsningar detekteras vid 48 timmar, 60 timmar och 72 timmar efter virusinfektion. Data som samlats in från tre oberoende experiment presenteras som medelvärde ± SEM; felstaplar representerar medelfelet (SEM). Envägs ANOVA med Tukey-test utfördes. P < 0,0001; ns, inte signifikant. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: H5-neutraliserande antikroppssvar detekterade med pseudovirus. (A) Titrering av neutraliserande antikroppssvar från immunserum från DDV-gruppen. (B) Titrering av neutraliserande antikroppssvar från immunserum från kontrollgruppen. IC50 definieras som de ömsesidiga utspädningarna av den neutraliserande antikroppen som kan hämma 50% av pseudoviruset. Data som samlats in från tre oberoende experiment presenteras som medelvärde ± SEM; felstaplar representerar medelfelet (SEM). VSVG-pseudovirus användes som en negativ kontroll. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Detektion av antikroppsstyrka mot neutralisering genom bindnings- och virusinträdesanalyser . (A) Immunserum från DDV-gruppen, inte det från kontrollgruppen, hämmar viral bindning till celler. (B) Immunserum från DDV-gruppen, inte det från kontrollgruppen, hämmar delvis viral infektion efter bindning. Data som samlats in från tre oberoende experiment presenteras som medelvärde ± SEM; felstaplar representerar medelfelet (SEM). Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Komplett DMEM-mediumkomposition | Koncentration |
| Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) | 1x |
| Fetalt bovint serum | 10% |
| Penicillin(1 E/ml)/streptomycin | 1 μg/ ml |
Tabell 1: Komplett DMEM-mediumsammansättning.
| Material | Koncentration | Volym |
| 2x HEPES (pH 7,1) | -- | 675,0 μL |
| CaCl 2 (2,5 m) | -- | 67,5 μL |
| ddH2O | -- | 529,2 μL |
| pCMV Δ 8,9 | 1000 ng/μl | 18,9 μL |
| pCMV/R-HA | 100 ng/μl | 27,0 μL |
| pCMV/R-NA | 50 ng/μl | 13,5 μL |
| pHR-Luc | 1000 ng/μl | 18,9 μL |
Tabell 2: Förpackningssystem för pseudovirus.
Kompletterande figur 1: Flödesschema över musimmunisering. Detta flödesschema beskriver de viktigaste procedurerna för musimmunisering. Immunserumet användes som prover. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: HA, NA och HIV-1 p24-proteinuttryck av influensapseudovirus. Western-blot av pseudovirusproteiner. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HEK293FT celler används vanligtvis som förpackningsceller för att producera pseudovirus. Regelbunden mykoplasmadetektion är nödvändig under cellodlingen. Mykoplasmakontaminering kan drastiskt minska pseudovirusutbytet och ibland nära noll. Jämfört med andra föroreningar leder mykoplasmaföroreningar inte till pH-värdeförändringar eller grumlighet i cellodlingsmediet. Även en hög koncentration av mykoplasma är inte synlig med blotta ögon eller under ett mikroskop. Tre populära metoder för mykoplasmadetektion är mykoplasmaodling, DNA-färgning med fluorescerande DAPI eller Hoechst 33258 och polymeraskedjereaktion (PCR). PCR-amplifiering av mykoplasma-DNA i odlingsprover används ofta för snabb, enkel och pålitlig mykoplasmatestning10.
Kalciumfosfatmedierad transfektion har använts för influensapseudovirusförpackningar i många år på grund av dess höga effektivitet, låga kostnad och enkla användning11. Denna metod är emellertid mycket känslig för pH-värdet för en HEPES-buffrad lösning, det HEK293FT cellodlingsmediet och det dubbeldestilleradeH2O. pH-värdet påverkade fällningsbildningen och varaktigheten för fällningens vistelse på HEK293FT celler. Således kan den bestämma DNA-mängden som tas upp av HEK293FT celler. PH-värdet för en HEPES-buffrad lösning är extremt smalt begränsat, från 7,05-7,1212,13,14, i vilket tillstånd en fällning innehållande kalciumfosfat och DNA långsamt bildas i HEPES-buffrad lösning. Om pH är för högt blir fällningens storlek så stor att den till och med kan döda de HEK293T cellerna. Tvärtom, om pH är för lågt, kan fällningen inte bildas, eller fällningen blir för liten för att sätta sig ner till cellytan. Dessutom spelar pH i det HEK293FT cellodlingsmediet också en roll i transfektionseffektiviteten. Under transfektionen bör cellmediet bibehållas mellan ett pH av 7,2-7,4. Både hypersura och alkaliska medier kommer att ändra fällningens storlek och adsorptionstiden för DNA-blandningen på cellytan. Dessutom kan dubbeldestilleradH2Omed olika ursprung som används i DNA-blandningen förändra pH i en HEPES-buffrad lösning. Således är det avgörande att hålla ett stabilt pH-värde för transfektionslösning och odlingsmedium för att garantera hög transfektionseffektivitet. Dessutom påverkas transfektionseffektiviteten också av 2,5 M CaCl2-lösning och koncentrationen av koldioxid (CO2) i cellinkubatorn. Under transfektionsprocessen är det viktigt att lagra CaCl 2-lösningen ordentligt och stabilisera CO2-koncentrationen i inkubatorn.
Det mest populära förpackningssystemet för influensapseudovirus involverar en multipel plasmids samtransfektionsmetod. HA-, NA-, reporter- och lentivirala gag - och pol-gener klonas till plasmiduttrycksvektorer separat, och sedan transfekteras de in i cellerna samtidigt. För att öka proteinuttrycket tillsätts ofta en Kozak-konsensussekvens före transkriptionens startplats.
Det är nödvändigt att framställa rent, supercoiling och endotoxinfritt plasmid-DNA15. Eftersom plasmidförhållandet direkt påverkar pseudovirusutbytet. Detta protokoll optimerade plasmidförhållandet mellan "kärnan: reporter: HA: NA" till 28:28:4:1 och jämförde det med andra transfektionsmetoder. Det krävs att mängden plasmid-DNA i kalciumfosfattransfektion bör nå upp till 30,5 μg per 100 mm skål.
Pseudovirustitrar detekteras genom kvantitativ realtids-PCR (qRT-PCR), enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA), hemagglutinationsanalys och RLA-detektionsanalyser. qRT-PCR-analys används för att uppskatta antalet kopior av RNA-gener av pseudovirus inre5. ELISA-analys används för att detektera innehållet av p24-protein, vilket är huvudkomponenten i HIV-kärnan. Hemagglutinationsanalys mäter HA-spikmängden på ytan av pseudoviruspartiklarna. Dessa tre analyser används för att kvantifiera icke-funktionella viruspartiklar. RLA-detektionsanalys är den viktigaste metoden för att mäta koncentrationen av funktionella viruspartiklar som kan infektera transducerade celler och frigöra reportergener i pseudovirusbeståndet. MDCK-celler används ofta som transducerade celler. Transducerade celler såddas i 96-brunnsodlingsplattor, infekterade av pseudovirus, lyseras av lysbuffert och överförs sedan till 96-brunns luminometerplattor för att läsa värden. Olika cellmängder och inkubationstider påverkar RLA-värden. Baserat på resultaten är rapportgenuttrycket högt när 5000 celler sås per brunn på en 96-brunnsplatta och RLA detekteras vid 60 timmar efter virusinfektion.
H5 HPAI-pseudovirusneutraliseringsanalyser (PN) har använts i stor utsträckning för antikroppsdetektion på grund av deras säkerhet, högre känslighet, noggrannhet och lämplighet för screening med hög genomströmning. Ett allmänt protokoll för PN-analys innefattar följande fyra steg: pseudovirusmängder, serumutspädning, pseudovirus-antikroppsinkubation och detektering av luciferasaktivitet. Mängden pseudovirus normaliseras baserat på RLA-avläsningar. RLA-värden på 106 per brunn i en 96-brunnsplatta används för att erhålla reproducerbara experimentresultat. Startpunkten för serumprovsspädning måste vara över 40. Serumprovkomponenten ökar uppenbarligen luciferasvärdena för pseudovirus när utspädningsfaktorn för serumprovet är mindre än 40. Pseudovirus-antikroppsblandningen inkuberas i 1 timme vid 37 °C och överförs sedan till MDCK-celler, följt av RLA-avläsningar på 60 timmar. Luciferasnivåer tas i allmänhet som ett verktyg för att bestämma pseudovirusinfektion effektivitet.
I PN-analys finns det fyra viktiga element: luciferasreporterproteinet, analyskemin, en luminometer och mikroplattor16. För det första är luciferasgenen kodonoptimerad för att förbättra proteinuttrycksnivåerna i transducerade celler. Att konstruera rapportörens och vektorns ryggradsgener minskar antalet bindningsställen för konsensustranskriptionsfaktorer för att minska den avvikande transkriptionsrisken. För det andra väljs lämpliga detektionsreagens enligt experimentets syfte. PN-analyser används vanligtvis som metoder med hög genomströmning för att detektera neutraliserande svar från serum- eller antikroppsprover. Detta protokoll använde det ljusstarka Glo luciferas-analyssystemet, som erbjuder den ljusaste signalen, brett dynamiskt omfång och hög känslighet. Ännu viktigare är att signalens halveringstid är cirka 10 minuter och cellerna testas omedelbart efter att substratet har tillsatts. En luminometer används för att detektera luciferaskoncentration. Många olika typer av luminometrar tillverkas. Grundprincipen är att maskinen som används exakt kan identifiera skillnader i luciferasaktivitet mellan olika prover. Svarta eller vita polystyrenmikroplattor bör användas för opacitet och låga självlysande bakgrunder. Vita mikroplattor kan förbättra självlysande signaler och har låg bakgrundsluminiscens, medan svarta mikroplattor kan minimera ljusspridning för att minska väl till väl överhörning17.
PN-analyser är i linje med traditionella metoder för att detektera neutraliserande antikroppssvar. Men inklusive endast HA- och NA-proteiner från influensavirus av vildtyp är pseudovirus långt ifrån det vildtypade viruset. HA kan binda till mottagarcellens sialinsyrareceptor för att initiera infektion. Därefter utlöser HA-konformationsförändringarna i endosomen fusionen av virala och endosomala membran, vilket frigör de virala ribonukleoproteinerna (vRNP) i cytoplasman. Influensapseudovirus kan bara imitera dessa processer och tillämpas i relaterade undersökningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av forskningsbidragen från Innovation Capacity Building Project i Jiangsu-provinsen (BM2020019), Shenzhen Scientific and Technological Project (nr. JSGG20200225150702770), Strategic Priority Research Program of the Chinese Academy of Sciences (XDB29030103), Guangdong Scientific and Technological Project (nr 2020B1111340076) och Shenzhen Bay Laboratory Open Research Program (nr. SZBL202002271003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% Chiken Erythrocyte | Bio-channel | BC-RBC-C001 | Reagent |
| 96-well cell culture plates (flat-bottom) | Thermo fisher scientific | 167008 | consumable material |
| 96-well cell culture plates (round-bottom) | Thermo fisher scientific | 163320 | consumable material |
| Allegra X-15R | Beckman coulter | -- | Equipment/Centrifuge |
| BD Insulin Syringes | BD | 324910 | consumable material |
| Calcium Chloride Anhydrous | AMRESCO | 1B1110-500G | Reagent |
| chloroquine diphosphate | Selleck | S4157 | Reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12100-046 | Reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | Reagent |
| HEK293FT | Gibco | R700-07 | Cell line |
| HEPES FREE ACID | AMRESCO | 0511-250G | Reagent |
| HIV-1 p24 Antigen ELISA | ZeptoMetrix | 801111 | Reagent kit |
| Luciferase Assay System Freezer Pack | Promega | E4530 | Reagent kit |
| MDCK.1 | ATCC | CRL-2935 | Cell line |
| Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo fisher scientific | 509-GRD-Q | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 15 mL | Thermo fisher scientific | 339650 | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo fisher scientific | 339652 | consumable material |
| Nunc EasYFlask 75 cm2 | Thermo fisher scientific | 156499 | consumable material |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagent |
| Pipette Tips (10 μL) | Thermo fisher scientific | TF102-10-Q | consumable material |
| Pipette Tips (100 μL) | Thermo fisher scientific | TF113-100-Q | consumable material |
| Pipette Tips (1000 μL) | Thermo fisher scientific | TF112-1000-Q | consumable material |
| Serological pipets (5 mL) | Thermo fisher scientific | 170355N | consumable material |
| Serological pipets (10 mL) | Thermo fisher scientific | 170356N | consumable material |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Reagent |
| Varioskan Flash | Thermo fisher scientific | -- | Equipment/Microplate reader |
| Water Jacket Incubator | Thermo fisher scientific | 3111 | Equipment/Cell incubator |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | 57-33-0 | Reagent |
References
- Wang, G., et al. DNA prime and virus-like particle boost from a single H5N1 strain elicits broadly neutralizing antibody responses against head region of h5 hemagglutinin. The Journal of Infectious Diseases. 209 (5), 676-685 (2014).
- Wang, G., Yin, R., Zhou, P., Ding, Z. Combination of the immunization with the sequence close to the consensus sequence and two DNA prime plus one VLP boost generate H5 hemagglutinin specific broad neutralizing antibodies. Plos One. 12 (5), 0176854 (2017).
- Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28 (1), 1963 (2018).
- Duvergé, A., Negroni, M. Pseudotyping lentiviral vectors: When the clothes make the virus. Viruses. 12 (11), 1311 (2020).
- Carnell, G. W., Ferrara, F., Grehan, K., Thompson, C. P., Temperton, N. J. Pseudotype-based neutralization assays for influenza: A systematic analysis. Frontiers in Immunology. 6 (161), (2015).
- Trombetta, C., Perini, D., Mather, S., Temperton, N., Montomoli, E. Overview of serological techniques for influenza vaccine evaluation: Past, present and future. Vaccines. 2 (4), 707-734 (2014).
- Wei, C. J., et al. Next-generation influenza vaccines: opportunities and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (4), 239-252 (2020).
- Krammer, F., et al.
- Wei, C. J., et al. Induction of broadly neutralizing H1N1 influenza antibodies by vaccination. Science. 27 (329), 1060-1064 (2010).
- Chernov, V. M., Chernova, O. A., Sanchez-Vega, J. T., Kolpakov, A. I., Ilinskaya, O. N. Mycoplasma contamination of cell cultures vesicular traffic in bacteria and control over infectious agents. Acta Naturae. 6 (3), 41-51 (2014).
- Michael, R. G., Joseph, S. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2012).
- Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. Transfection of mammalian cells with calcium phosphate-DNA coprecipitates. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), (2019).
- Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R.
- Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. Transfection of DNA into eukaryotic cells. Current Protocols in Molecular Biology. 9, 11-19 (1996).
- Kachkin, D. V., Khorolskaya, J. I., Ivanova, J. S., Rubel, A. A. An efficient method for isolation of plasmid DNA for transfection of mammalian cell cultures. Methods and Protocols. 3 (4), 69 (2020).
- Luciferase assay system. , Available from: https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system (2021).
- Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates. , Available from: https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates (2021).
