Summary
إن تعديل مجموعة الأقطاب المتعددة أو معدات مشبك التصحيح الحالية يجعل مخطط كهربية الشبكية خارج الجسم الحي متاحا على نطاق أوسع. تسهل الطرق المحسنة لتسجيل استجابات الضوء خارج الجسم الحي والحفاظ عليها دراسة وظيفة مستقبلات الضوء والخلايا ثنائية القطب في شبكية العين السليمة ، والنماذج الحيوانية لأمراض العيون ، وشبكية العين من متبرع بشري.
Abstract
تعد قياسات استجابات الضوء العصبي في شبكية العين أمرا بالغ الأهمية للتحقيق في فسيولوجيا شبكية العين السليمة ، وتحديد التغيرات المرضية في أمراض الشبكية ، واختبار التدخلات العلاجية. يسمح مخطط كهربية الشبكية خارج الجسم الحي (ERG) بتحديد المساهمات من أنواع الخلايا الفردية في شبكية العين المعزولة عن طريق إضافة عوامل دوائية محددة وتقييم التغيرات الجوهرية للأنسجة بشكل مستقل عن التأثيرات الجهازية. يمكن قياس استجابات ضوء الشبكية باستخدام حامل عينة ERG متخصص خارج الجسم الحي وإعداد التسجيل ، ويتم تعديله من مشبك التصحيح الحالي أو معدات صفيف الأقطاب الكهربائية الدقيقة. على وجه الخصوص ، تم إعاقة دراسة الخلايا ثنائية القطب ON ، ولكن أيضا المستقبلات الضوئية ، بسبب الانخفاض البطيء ولكن التدريجي لاستجابات الضوء في ERG خارج الجسم الحي بمرور الوقت. تعمل زيادة سرعة التروية وتعديل درجة حرارة النفاذية على تحسين وظيفة الشبكية خارج الجسم الحي وزيادة سعة الاستجابة والاستقرار. يسمح ERG خارج الجسم الحي بشكل فريد بدراسة أنواع الخلايا العصبية الشبكية الفردية. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح التحسينات لزيادة سعة الاستجابة والاستقرار إلى أقصى حد بالتحقيق في استجابات الضوء في عينات شبكية العين من الحيوانات الكبيرة ، وكذلك عيون المتبرعين من البشر ، مما يجعل ERG خارج الجسم الحي إضافة قيمة إلى ذخيرة التقنيات المستخدمة للتحقيق في وظيفة الشبكية.
Introduction
يقيس تخطيط كهربية الشبكية وظيفة الشبكية استجابة للضوء1. إنه جزء لا يتجزأ من دراسة فسيولوجيا الشبكية والفيزيولوجيا المرضية ، وقياس نجاح علاجات أمراض الشبكية. يستخدم ERG في الجسم الحي على نطاق واسع لتقييم وظيفة الشبكية في الكائنات الحية السليمة ، ولكن له قيود كبيرة 2,3. من بين هذه ، يتم إعاقة التحليل الكمي لأنواع خلايا الشبكية الفردية في الجسم الحي ERG ، لأنه يسجل مجموع التغييرات المحتملة ، وبالتالي تراكب الاستجابات ، من جميع خلايا الشبكية إلى المنبهات الضوئية4. علاوة على ذلك ، فإنه لا يسمح بسهولة بإضافة الأدوية إلى شبكية العين ، وهو عرضة للتأثيرات الجهازية ، ولديه نسبة إشارة إلى ضوضاء منخفضة نسبيا. يتم التخلص من هذه العيوب في خارج الجسم الحي ERG الذي يبحث في وظيفة شبكية العينالمعزولة 2،3،5،6. يسمح ERG خارج الجسم الحي بتسجيل استجابات كبيرة ومستقرة من أنواع معينة من خلايا الشبكية عن طريق إضافة مثبطات دوائية وتقييم سهل للعوامل العلاجية ، والتي يمكن إضافتها إلى superfusate. في الوقت نفسه ، يزيل تأثيرات التأثيرات الجهازية ويزيل الضوضاء الفسيولوجية (مثل ضربات القلب أو التنفس).
في خارج الجسم الحي ERG ، يتم عزل شبكية العين أو عينات الشبكية وتثبيتها على جانب المستقبلات الضوئية لأعلى على قبة حامل العينة 3,5. يتم تجميع حامل العينة ، وتوصيله بنظام التروية الذي يزود شبكية العين بوسائط ساخنة ومؤكسجة ، ويوضع على مرحلة المجهر ، والذي تم تعديله لتقديم محفزات ضوئية يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر. لتسجيل الاستجابات المستنبطة بالضوء ، يتم توصيل حامل العينة بمكبر للصوت ومحول رقمي ونظام تسجيل (الشكل 1). تسمح هذه التقنية بعزل الاستجابات عن المستقبلات الضوئية للقضيب والمخروط ، والخلايا ثنائية القطب ON-القطب، و Müller glia عن طريق تغيير معلمات المحفزات الضوئية وإضافة عوامل دوائية.
يمكن تحويل مشبك التصحيح الحالي أو إعداد الصفيف متعدد الأقطاب الكهربائية (MEA) لتسجيل ERG خارج الجسم الحي ، إما بالاقتران مع محول ERG خارج الجسم الحي المتاح تجاريا أو حامل عينة مخصص للتحكم العددي بالكمبيوتر من البولي كربونات (CNC) ، لقياس استجابات الضوء في شبكية العين من نماذج الحيوانات الصغيرة ، مثل الفئران. يزيد هذا التعديل من إمكانية الوصول إلى ERG خارج الجسم الحي مع تقليل الحاجة إلى المعدات المتخصصة. يبسط تصميم حامل العينة تقنية التركيب ويدمج الأقطاب الكهربائية ، مما يلغي الحاجة إلى معالجة الأقطاب الكهربائية الدقيقة مقارنة بطرق ERG عبر الشبكية خارج الجسم الحي المبلغ عنها سابقا7. يعد معدل التروية ودرجة الحرارة داخل حامل العينة من العوامل المهمة التي تؤثر على خصائص الاستجابة من المستقبلات الضوئية والخلايا ثنائية القطب ON. من خلال ضبط هذه الظروف ، يمكن تسجيل ERG خارج الجسم الحي بشكل موثوق من شبكية الفأر المعزولة على مدى فترات طويلة من الزمن. تسمح الظروف التجريبية المحسنة بتسجيلات ERG خارج الجسم الحي في لكمات شبكية العين من شبكية أكبر ، بما في ذلك عيون الحيوانات الكبيرة وعيون المتبرع البشري8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع التجارب باستخدام الفئران وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة الدراسات الحيوانية المؤسسية في جامعة يوتا. تم الحصول على عيون الخنازير لعرض هذا الفيديو بعد الوفاة من المسلخ (موارد الخنازير المستدامة ، جونسونفيل). تم الحصول على العيون من متبرعين بشريين بعد الموت الدماغي أو القلبي بموافقة للاستخدام البحثي من خلال بنك يوتا ليونز للعيون أو بنك سان دييغو للعيون أو Lifesharing ، وهي معتمدة بالكامل من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية ورابطة منظمات شراء الأعضاء (AOPO) وجمعية بنوك العيون الأمريكية. كان لاستخدام عيون المتبرعين البشريين حالة إعفاء في جامعة يوتا (IRB رقم 00106658) و ScrippsHealth IRB (IRB رقم 16-6781).
1. إعداد ERG خارج الجسم الحي
- لتحويل إعداد صفيف متعدد الأقطاب ، قم بتوصيل حامل عينة ERG خارج الجسم الحي عبر مرحلة الرأس بمكبر صوت تفاضلي ، يتم توصيله بالإدخال التناظري للوحة الواجهة لنظام الصفيف متعدد الأقطاب الكهربائية. استخدم برنامج التسجيل للصفيف متعدد الأقطاب لتسجيل وتخزين بيانات الإدخال من ERG خارج الجسم الحي . اضبط كسب مكبر الصوت التفاضلي على 100 وأضف تضخيم جهد إضافي 10x اعتمادا على مواصفات جهاز التحويل الرقمي. اضبط مرشح الترددات المنخفضة على 100 هرتز.
- لتحويل إعداد مشبك التصحيح ، قم بتوصيل حامل عينة ERG خارج الجسم الحي عبر مرحلة الرأس بمكبر صوت تفاضلي ، متصل بمرحلة الرأس لمضخم مشبك التصحيح. استخدم برنامج نظام مشبك التصحيح والتحويل الرقمي لتسجيل وتخزين بيانات الإدخال من ex vivo ERG. اضبط كسب مكبر الصوت التفاضلي على 100 وقم بتطبيق تضخيم جهد إضافي 10x عبر مرحلة رأس مشبك التصحيح. اضبط مرشح الترددات المنخفضة على 100 هرتز.
- قم بتوصيل مصابيح LED بأطوال موجية مناسبة (على سبيل المثال ، حوالي 530 نانومتر لاستنباط مستقبلات ضوئية للقضيب واستجابات الخلايا ثنائية القطب ON) بالمجهر. تحكم في مصابيح LED باستخدام برنامج التسجيل الذي يتيح تشغيل محفزات الضوء. للتحكم في محفزات الضوء ، استخدم برنامج تشغيل LED يتم التحكم فيه بواسطة مخرجات تناظرية من محول رقمي.
- قم بمعايرة ناتج الضوء لمصابيح LED في موضع شبكية العين في حامل العينة باستخدام الصمام الثنائي الضوئي. إذا لزم الأمر ، أدخل مرشحات الكثافة المحايدة في مسار الضوء لتعتيم شدة الضوء.
- استخدم حامل عينة ERG متاح تجاريا أو مصمم خصيصا خارج الجسم الحي .
ملاحظة: يمكن الحصول على رسومات التصنيع باستخدام الحاسب الآلي من البولي كربونات من المؤلفين عند الطلب. - لتحضير القطب ، أدخل قطب حبيبات Ag / AgCl في موصل luer ملولب. املأ الجزء الداخلي من موصل luer بالغراء الساخن وأدخل مقبس 2 مم في الغراء الساخن من الجانب غير الملولب. لحام سلك فضي من القطب EP1 إلى مقبس 2 مم. قم بربط القطب النهائي ، بحلقة o على الخيط ، في منافذ القطب لحامل عينة ERG خارج الجسم الحي .
ملاحظة: يمكن استخدام الأقطاب الكهربائية لفترة طويلة. إذا تراكم سطح الحبيبات الأوساخ و / أو أصبح مظلما (يمكن أن يتسبب ذلك في ارتفاع جهد الإزاحة و / أو الانجراف الكهربائي) ، فيمكن "صقله" باستخدام ورق صنفرة ناعم. - قبل يوم واحد على الأقل من التجريب ، قم بتصفية أوراق الغراء على قباب حامل عينة ERG خارج الجسم الحي باستخدام غراء الإيبوكسي ، مما يضمن أن الغراء لا يعيق قناة القطب (انظر 3 للفيديو).
2. إعداد الحيوانات
- الظلام التكيف مع الحيوانات لمدة 6 ساعات على الأقل أو بين عشية وضحاها.
3. إعداد المعدات
- املأ خط التروية في ex vivo ERG بوسط Ames المليء ب 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 95٪ أكسجين. قم بتوصيل خط التروية بعنصر تسخين بمصدر تيار مستمر أو وحدة تحكم في الحرارة بالقرب من حامل العينة لتدفئة وسط أميس ، بحيث يتم الاحتفاظ بشبكية العين عند حوالي 35-38 درجة مئوية.
- املأ نصفي حامل عينة ERG خارج الجسم الحي بمحلول قطب كهربائي ، وأغلق خط التروية بسدادات luer ، وقم بتوصيل الأقطاب الكهربائية ، وقم بتجميع حامل العينة بأربعة براغي (انظر 3 للحصول على فيديو).
- تحقق من المقاومة وإزاحة الجهد بين الأقطاب الكهربائية في حامل العينة المجمعة عن طريق إدخال مجسات المتر المتعدد في الأقطاب الكهربائية.
ملاحظة: إذا لم يكن هناك انسداد ، وكانت الأقطاب الكهربائية في حالة جيدة ، فيجب أن تكون المقاومة أقل من 100 كيلو أوم وتعويض الجهد أقل من 5 مللي فولت. - قم بتوصيل حامل العينة المجمع بخط التروية وضعه على مرحلة المجهر الذي تم إعداده لتوصيل ومضات ضوئية. تأكد من أن حامل العينة وخط التروية لا يحتويان على أي فقاعات هواء.
4. إعداد الأنسجة
- التضحية بالحيوان مع CO2 واستئصال العينين على الفور ، أو الحصول على عيون كبيرة من الحيوانات أو المتبرعين بالبشر.
- تنظيف الكرة الأرضية من النسيج الضام المتبقية والعضلات خارج العين. تقليم العصب البصري.
- على ورق الترشيح ، ضع شقا صغيرا بعناية بشفرة حلاقة على طول ora serrata ، على بعد حوالي 1 مم من الحافة في عين الفأر. أدخل مقص الفانا الناعم في الشق واقطعه على طول الحافة لإزالة الجزء الأمامي من العين بالعدسة.
- انقل كوب العين إلى طبق يحتوي على وسط أميس. أمسك الصلبة بالملقط الناعم ، مع الحرص على عدم لمس شبكية العين. أدخل مقص الفانا بين الشبكية والصلبة وقطع الصلبة من الطرف المحيطي نحو الجزء المركزي. احرص على عدم لمس أو إتلاف الشبكية.
- شل حركة الصلبة عن طريق الإمساك بجانب واحد من الشق بمقص الفانا مقابل الجزء السفلي من طبق التشريح. أمسك الصلبة بالملقط على الجانب الآخر من الشق. قم بإزالة الصلبة دون لمس أو إتلاف الشبكية عن طريق فصل الصلبة على جانبي الشق للسماح بعزل الشبكية بأقل قدر من الضرر للأنسجة.
- قم بإزالة الجزء الأمامي بالعدسة من العين الزميلة وقم بتخزين كوب العين في درجة حرارة الغرفة في محلول أميس المليء ب 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 95٪ أكسجين.
ملاحظة: يمكن الحصول على استجابات الضوء الوظيفية من العيون المخزنة بهذه الطريقة لعدة ساعات. - في العيون الكبيرة ، بما في ذلك عيون المتبرع البشري ، قم بتنظيف الكرة الأرضية من النسيج الضام المتبقي وإزالة الجزء الأمامي والعدسة ، على غرار الإجراء الموصوف لعين الفأر. استخدم مشرطا لعمل قطع حوالي 3 مم من الليمبوس. أدخل مقص تشريح منحني في الشق واقطعه على طول الحافة لإزالة الجزء الأمامي من العين بالعدسة. الحصول على عينات شبكية العين لتخطيط كهربية الشبكية خارج الجسم الحي مع لكمة خزعة يمكن التخلص منها 3-6 مم.
5. تركيب الأنسجة على حامل العينة
- ضع النصف السفلي من حامل العينة في طبق بتري كبير واملأه بوسط أميس المؤكسج بحيث يتم غمر قبة حامل العينة.
- أمسك بعناية حافة الشبكية بالملقط الدقيق وانقل الشبكية إلى قبة حامل العينة خارج الجسم الحي ، وجانب المستقبلات الضوئية متجها لأعلى.
- ارفع حامل العينة من محلول أميس ، مع الحرص على بقاء شبكية العين في مكانها.
- جفف لوحة حامل العينة تماما لتقليل الضوضاء والحديث الكهربائي وتحويل الإشارة.
- قم بتجميع نصفي حامل العينة بأربعة براغي وقم بتوصيل خط التروية. قم بتجفيف القطب في النصف السفلي من حامل العينة وقم بتوصيل كابل الأنود بجانب الشبكية الداخلي وكابل الكاثود بجانب المستقبلات الضوئية.
- قم بتزويد حامل العينة بما لا يقل عن 1 مل / دقيقة من وسط أميس المؤكسج لمدة 10-20 دقيقة لإتاحة الوقت لاستقرار استجابات الضوء.
6. تسجيل وظيفة الخلايا العصبية في شبكية العين
- سجل عائلات الاستجابة عن طريق تعريض شبكية العين لومضات ضوئية ذات كثافة متزايدة. على سبيل المثال ، سجل عائلات استجابة المستقبلات الضوئية لقضيب الماوس مع شدة الضوء التي تتراوح من حوالي 10 إلى 1000 فوتون / ميكرومتر 2 وتلك الموجودة في خلايا الفأر ON-bipolar مع شدة الضوء التي تتراوح من 0.6 إلى 20 فوتونا / ميكرومتر2 تقريبا.
- قياس استجابات ضوء المستقبلات الضوئية (a-wave) في وجود كلوريد الباريوم 100 ميكرومتر ، الذي يمنع قنوات البوتاسيوم في خلايا مولر الدبقية ، و 40 ميكرومتر DL-AP4 ، الذي يمنع نقل إشارة الجلوتاماترجيك إلى الخلايا ثنائية القطب (الشكل 2 ب).
- لعزل الموجة b ، التي تنشأ من وظيفة الخلايا ثنائية القطب ON ، قم أولا بتسجيل استجابات الضوء المجمعة من كل من الخلايا المستقبلة للضوء والخلايا ثنائية القطب ON في وجود كلوريد الباريوم وحده (الشكل 2 أ). بعد ذلك ، استخدم لمدة 5-10 دقائق مع وسط أميس الذي يحتوي على كلوريد الباريوم ، وكذلك DL-AP4 ، وسجل استجابات المستقبلات الضوئية لنفس محفزات الضوء كما كان من قبل (الشكل 2 ب). اطرح استجابات المستقبلات الضوئية من استجابات الخلايا المستقبلة للضوء والخلايا ثنائية القطب ON-bipolar ، وبالتالي حساب استجابات ضوء الخلية ON-bipolar وحدها (الشكل 2C).
7. تحسين وظيفة الخلية ثنائية القطب ON-القطب
ملاحظة: الموجة b ، التي تنشأ من الخلايا ثنائية القطب ON ، حساسة للغاية لدرجة الحرارة في حامل العينة ومعدل التروية.
- حافظ على معدل تروية لا يقل عن 0.5 مل / دقيقة للحصول على الموجة b.
ملاحظة: يفضل معدل تروية أعلى من 1-2 مل / دقيقة للحفاظ على استجابة كبيرة ومستقرة من الخلايا ثنائية القطب. - تأكد من أنه بالنسبة لمعدل تروية معين ، تكون درجة الحرارة في حامل العينة بالقرب من الشبكية قريبة من درجة حرارة الجسم (أي حوالي 35-38 درجة مئوية).
ملاحظة: من المهم ضبط درجة حرارة perfusate ، والتي يتم تسخينها قبل أن تصل إلى حامل عينة ERG خارج الجسم الحي ، بحيث تكون ضمن نطاق درجة الحرارة المثلى في شبكية العين. - قم بتخزين أكواب العين للتجربة اللاحقة محمية من الضوء وفي وسط أميس المؤكسج في درجة حرارة الغرفة للحفاظ على موجات A و B الطبيعية لعدة ساعات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
خارج الجسم الحي يتيح ERG تسجيل مستقبلات ضوئية قابلة للتكرار ومستقرة واستجابات ضوء الخلية ثنائية القطب ON-القطب ، على سبيل المثال ، من شبكية العين (الشكل 2A-C). يمكن تسجيل استجابات المستقبلات الضوئية من شبكية العين من متبرع بشري مع تأخير يصل إلى 5 ساعات بعد الوفاة للاستئصال (الشكل 2D) واستجابات الخلايا ثنائية القطب
بالمقارنة مع المستقبلات الضوئية ، تتعطل وظيفة الخلية ثنائية القطب ON-bipolar بسهولة أكبر ، على سبيل المثال ، بسبب تلف شبكية العين أثناء التشريح والتركيب أو بسبب انخفاض درجة الحرارة و / أو سرعة التروية. في حين أن انخفاض درجة الحرارة في حامل العينة أبطأ بشكل كبير حركية كل من المستقبلات الضوئية والخلايا ثنائية القطب ON ، فقد قلل من سعة الموجة b ولكن ليس الموجة a (الشكل 4 أ). على العكس من ذلك ، أدى إبطاء معدل التروية من 2.1 مل / دقيقة إلى 0.6 مل / دقيقة إلى تقليل سعة كل من المستقبلات الضوئية واستجابات الخلايا ثنائية القطب ON ولكنه لم يؤثر على الوقت الضمني (الوقت من بداية التحفيز إلى ذروة الاستجابة) إما للموجة a أو b-wave (الشكل 4B). أدى وقف التروية لمدة 10 دقائق متبوعا بإعادة التروية إلى فقدان كامل لوظيفة الخلية ثنائية القطب ON مع استجابات مستقبلات ضوئية محفوظة (الشكل 5).
الشكل 1: حامل عينة مخطط كهربية الشبكية خارج الجسم الحي وإعداد التسجيل. (أ ، ب) يتكون حامل عينة ERG خارج الجسم الحي من قبة لتركيب شبكية العين المعزولة ، والتي ترتبط بخط تروية لتوصيل وسط أميس باستمرار. يتم توصيل الأقطاب الكهربائية من خلال قنوات ضيقة بكل من جانب المستقبلات الضوئية للشبكية عبر خط التروية والشبكية الداخلية من خلال ورقة الترشيح الملصقة بالقبة. يتم توصيل هذه الأقطاب الكهربائية بمضخم تفاضلي ، مما يتيح قياس الاختلافات المحتملة في شبكية العين استجابة لمحفزات الضوء. (ج) يتم وضع حامل العينة على مرحلة المجهر ، والذي تم تعديله لتوصيل ومضات ضوئية وتوصيله بخط التروية ، والذي يوفر وسط أميس الساخن والمؤكسج عن طريق الجاذبية. إعداد التسجيل بالكامل محمي بقفص فاراداي لتقليل الضوضاء الكهربائية. تم تعديل هذا الرقم من 9. اختصار: ERG = مخطط كهربية الشبكية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: مثال على آثار المستقبلات الضوئية خارج الجسم الحي واستجابات الخلايا ثنائية القطب. تسمح إضافة العوامل الدوائية إلى perfusate بالقياس الكمي للمساهمات من أنواع خلايا الشبكية الفردية إلى مخطط كهربية الشبكية خارج الجسم الحي. يتم عزل استجابات ضوء المستقبلات الضوئية (PR) في وجود 100 ميكرومتر كلوريد الباريوم (BaCl2) ، وهو مانع لقنوات K + التي تعبر عنها خلايا مولر الدبقية ، بالإضافة إلى 40 ميكرومتر DL-AP4 ، وهو مانع مستقبلات الغلوتامات ، والذي يمنع انتقال الإشارة من المستقبلات الضوئية إلى الخلايا ثنائية القطب (B). يتم تحديد وظيفة الخلية ثنائية القطب (ON-BPC) (C) عن طريق طرح مكون المستقبلات الضوئية (B) من المستقبلات الضوئية المدمجة واستجابة الخلية ثنائية القطب ON-القطب في وجود كلوريد الباريوم وحده (A). يمكن الحصول على استجابات ضوئية للمستقبلات الضوئية من شبكية العين من متبرع بشري مع تأخير الموت إلى الاستئصال من <5 ساعة (D) ، في حين أن شبكية العين التي يتم استئصالها في غضون 20 دقيقة من الوفاة في كثير من الأحيان تعطي أيضا استجابات الخلايا ثنائية القطب (E) (انظر 8 لمزيد من المعلومات). تم تعديل الشكل 2A-C من 9. الاختصارات: PR = مستقبلات ضوئية ؛ ON-BPC = خلية ثنائية القطب. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: استقرار المستقبلات الضوئية ووظيفة الخلية ثنائية القطب ON-القطب في مخطط كهربية الشبكية خارج الجسم الحي بمرور الوقت. (أ) سجلت استجابات الضوء كل دقيقة من المستقبلات الضوئية وحدها في وجود كلوريد الباريوم 100 μM و40 μM DL-AP4. (ب) تهيمن بشدة وظيفة الخلية ثنائية القطب ON-ثنائي القطب على ومضات الضوء الخافت في وجود 100 ميكرومتر كلوريد الباريوم وحدها، على الرغم من أنها تحتوي على مكون صغير للمستقبلات الضوئية. عادة ما تستقر الاستجابات الضوئية من شبكية العين المعزولة بعد استخدام حامل العينة خارج الجسم الحي لمدة 15-20 دقيقة ، وكانت مستقرة لمدة 20-25 دقيقة على الأقل قبل البدء في الانخفاض. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: الجمع بين المستقبلات الضوئية واستجابات الخلايا ثنائية القطب ON-bipolar عند درجات حرارة وسرعات تروية مختلفة . (أ) أدى خفض درجة الحرارة داخل حامل العينة من 37 درجة مئوية إلى درجة حرارة الغرفة إلى إبطاء حركية الخلايا الضوئية والخلايا ثنائية القطب ON-bipolar بشكل كبير ولكنه قلل فقط من سعة الخلية ثنائية القطب ON-bipolar في المستقبلات الضوئية المختلطة واستجابة الخلية ثنائية القطب ON. (ب) أدى انخفاض معدل التروية من 2.1 مل / دقيقة إلى 0.6 مل / دقيقة إلى انخفاض سعة مستقبلات الضوء والخلايا ثنائية القطب ON ولكن دون تغيير في حركية الاستجابة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: استجابات الخلايا ثنائية القطب ON-القطبين أكثر حساسية لوقف التروية. (أ) تم تسجيل مستقبلات ضوئية كبيرة واستجابات الخلايا ثنائية القطب ON-القطبين بعد التروية بمعدل 2.1 مل / دقيقة لمدة 20 دقيقة. (ب) بعد توقف التروية لمدة 10 دقائق متبوعا بإعادة التروية لمدة 10 دقائق عند 2.1 مل / دقيقة ، كانت استجابات المستقبلات الضوئية موجودة ، بينما فقدت استجابات الخلايا ثنائية القطب ON-bipolar تماما. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم تطويره في الأصل في عام 1865 بواسطة Holmgren لقياس استجابات ضوء الشبكية من شبكية العينالبرمائية 10 ، وقد حالت القيود التقنية في البداية دون استخدام ERG على نطاق واسع. ومع ذلك ، حددت الدراسات الأساسية التي أجراها راجنار جرانيت وآخرون الأصول الخلوية ل ERG وقياس المستقبلات الضوئية واستجابات الخلايا ثنائية القطب خارج الجسم الحي11،12،13. منذ ذلك الحين ، سمحت الطرق المكررة باستخدام تسجيلات ERG خارج الجسم الحي على نطاق واسع 14,15 ، على الرغم من أن سعة الاستجابة ، خاصة تلك من الخلايا ثنائية القطب ON-bipolar ، ظلت صغيرة نسبيا 16. للتغلب على هذه القيود ، يتم قياس وظيفة الشبكية اليوم بشكل أكثر شيوعا باستخدام ERG في الجسم الحي ، على الرغم من القيود التجريبية والتفسير الأكثر تعقيدا لأشكال الموجات المسجلة. على الرغم من أن ERG خارج الجسم الحي يحاول تكرار الحالات الفسيولوجية قدر الإمكان ، إلا أنه يقيس وظيفة الشبكية في بيئة اصطناعية وفي غياب العوامل النظامية والتغيرات المرضية. ومع ذلك ، عند دمجها مع ERG في الجسم الحي ، يمكن استخدام هذا القيد للإجابة على أسئلة مهمة ، مثل ما إذا كانت التغيرات في وظيفة الشبكية في المرض جوهرية لخلايا الشبكية أو ناتجة عن التغيرات الجهازية17.
في الآونة الأخيرة ، قام حاملو عينات ERG خارج الجسم الحي المصممون حديثا بتبسيط المنهجية ، مما يجعل ERG خارج الجسم الحي متاحا لمجتمع بحثي أوسع2،3،5،18. ستمكن التعديلات على مشبك التصحيح الحالي أو معدات الصفيف متعدد الأقطاب الموصوفة في هذا البروتوكول المزيد من المختبرات من أداء ERG خارج الجسم الحي بأقل قدر من الاستثمارات المالية ومتطلبات المساحة. على وجه الخصوص ، أدت التطورات الأخيرة في تقنية ERG خارج الجسم الحي إلى تضخيم استجابة شبكية العين المعزولة للثدييات وأسفرت عن نسبة إشارة إلى ضوضاء متفوقة ، والتي لا تزال جيدة على الرغم من خطوات التضخيم الإضافية الموضحة في هذا البروتوكول. ومع ذلك ، فإن انخفاض الاستجابات الضوئية ، بشكل رئيسي من الخلايا ثنائية القطبON-bipolar 19 ، ربما أعاق الاستخدام الأكثر انتشارا ل ERG خارج الجسم الحي. يؤدي استخدام وسيط Ames أو Locke إلى استجابات أكبر للمستقبلات الضوئية والخلايا ثنائية القطب ON ، مما يجعلها مفضلة ، على سبيل المثال ، على حل Ringer المخزن مؤقتا HEPES ل ex vivo ERG3. استقرت مختبرات أخرى خارج الجسم الحي ON-bipolar وظيفة الخلية ثنائية القطب عن طريق تكملة الجلوتامين أو الغلوتامات19. يوضح هذا التقرير كيفية الحصول على استجابات ضوئية كبيرة ومستقرة من شبكية العين المعزولة ، بما في ذلك من عيون المتبرع البشري ، كما ورد سابقا8.
تشمل المعلمات التجريبية المهمة درجة حرارة شبكية العين ، والتي يجب أن تبقى ضمن النطاق الفسيولوجي ، ومعدل التروية السريع. الآثار الأكثر وضوحا لخفض درجة الحرارة في حامل عينة ERG خارج الجسم الحي هي حركية الاستجابة البطيئة في كل من المستقبلات الضوئية والخلايا ثنائية القطب ON-bipolar وسعة خلية ON-bipolar الموهنة. على الرغم من أن خفض درجة الحرارة يبدو أن له تأثيرا ضئيلا على سعة المستقبلات الضوئية في الاستجابة المشتركة من المستقبلات الضوئية والخلايا ثنائية القطب ON-pol ، فقد يكون هذا قطعة أثرية بسبب التغيرات التفاضلية في حركية الاستجابة من كلا النوعين من الخلايا.
يبدو أن معدل التروية الكافي أمر بالغ الأهمية بشكل خاص لوظيفة الشبكية ، ومن المرجح أن يوفر الأكسجين والمواد المغذية ويزيل الفضلات. في حين أن سعة كل من المستقبلات الضوئية والخلايا ثنائية القطب ON-bipolar تتضاءل إلى حد ما بسبب انخفاض معتدل في معدل التروية ، حتى التوقف القصير عن التروية ألغى وظيفة ON-bipolar ولكن ليس وظيفة المستقبلات الضوئية. هذا يعني أن استجابات المستقبلات الضوئية أكثر قوة ويمكن الحفاظ عليها بسهولة أكبر في العيون التي تخضع للتجارب مع تأخير كبير ، مثل عيون المتبرع البشري8. في هذا السياق ، من الجدير بالذكر أن وظيفة الخلية ثنائية القطب ON-bipolar لا تتضاءل عن طريق تخزين أكواب العين في وسط أميس المؤكسج لعدة ساعات. لذلك نفترض أن فقدان وظيفة الخلية ثنائية القطب ON-القطب عند توقف التروية في حامل العينة خارج الجسم الحي قد يكون بسبب النضوب السريع للأكسجين والمواد المغذية الأخرى في الحجم الصغير المحيط بالشبكية في حامل العينة. ويدعم ذلك التقارير التي تفيد بأن التأخير القصير من الموت إلى الاستئصال أمر بالغ الأهمية لتسجيل المستقبلات الضوئية ، وخاصة استجابات الخلايا ثنائية القطب ON-bipolar من شبكية العين البشرية ، وأن نقص الأكسجة بعد الوفاة هو المرشح الأكثر احتمالا لتلف لا رجعة فيه لوظيفة الخلايا العصبية في شبكية العين8. في حين تم تحسين المعلمات التجريبية ل ex vivo ERG في شبكية الفأر ، إلا أنها نجحت في تحسين ظروف التسجيل لعينات شبكية العين من الحيوانات الكبيرة وعيون المتبرعين البشريين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أي من المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من خلال منح المعهد الوطني للعيون EY02665 و EY031706 والمؤسسة الدولية لأبحاث الشبكية للدكتور فينبرغ ، والمنحة الأساسية للمعاهد الوطنية للصحة (EY014800) ، ومنحة غير مقيدة من أبحاث الوقاية من العمى ، نيويورك ، نيويورك ، إلى قسم طب العيون والعلوم البصرية ، جامعة يوتا. حصل الدكتور فرانس فينبرغ أيضا على جائزة البحث لمنع العمى / جائزة الدكتور إتش جيمس وكارول للتطوير الوظيفي المجاني ، والدكتورة سيلك بيكر من منحة ARVO EyeFind. نشكر الدكتورة آن هانيكين من معهد سكريبس للأبحاث على توفير عين المتبرع المستخدمة في التسجيلات الموضحة في الشكل 2E.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mm socket | WPI | 2026-10 | materials to prepare electrode |
| Ag/AgCl Electrode | World Precision Instruments | EP1 | materials to prepare electrode |
| Ames' medium | Sigma Aldrich | A1420 | perfusion media |
| barium chloride | Sigma Aldrich | B0750 | potassium channel blocker |
| DL-AP4 | Tocris | 0101 | broad spectrum glutamatergic antagonist |
| OcuScience Ex Vivo ERG Adapter | OcuScience | n/a | ex vivo ERG specimen holder |
| Threaded luer connector | McMaster-Carr | 51525K222 or 51525K223 | materials to prepare electrode |
References
- Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , (1995).
- Bonezzi, P. J., Tarchick, M. J., Renna, J. M. Ex vivo electroretinograms made easy: performing ERGs using 3D printed components. Journal of Physiology. 598 (21), 4821-4842 (2020).
- Vinberg, F., Kefalov, V. Simultaneous ex vivo functional testing of two retinas by in vivo electroretinogram system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52855 (2015).
- Heckenlively, J. R., Arden, G. B. Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision. , MIT Press. (2006).
- Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Research. 101, 108-117 (2014).
- Winkler, B. S. Calcium and the fast and slow components of P3 of the electroretinogram of the isolated rat retina. Vision Research. 14 (1), 9-15 (1974).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs. Visual Neuroscience. 16 (4), 727-741 (1999).
- Abbas, F., et al. Revival of light signalling in the postmortem mouse and human retina. Nature. , (2022).
- Becker, S., Carroll, L. S., Vinberg, F. Diabetic photoreceptors: Mechanisms underlying changes in structure and function. Visual Neuroscience. 37, (2020).
- Kantola, L., Piccolino, M., Wade, N. J. The action of light on the retina: Translation and commentary of Holmgren (1866). Journal of the History of the Neurosciences. 28 (4), 399-415 (2019).
- Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161 (3840), 487-489 (1968).
- Hamasaki, D. I. The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog. Journal of Physiology. 167 (1), 156-168 (1963).
- Granit, R. The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve. Journal of Physiology. 77 (3), 207-239 (1933).
- Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria). Acta Physiologica Scandinavica. 134 (4), 535-541 (1988).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision Research. 39 (13), 2165-2177 (1999).
- Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Research Protocols. 16 (1-3), 27-36 (2005).
- Becker, S., Carroll, L. S., Vinberg, F. Rod phototransduction and light signal transmission during type 2 diabetes. BMJ Open Diabetes Research and Care. 8 (1), 001571 (2020).
- Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (6), 2583-2588 (2006).
- Winkler, B. S., Kapousta-Bruneau, N., Arnold, M. J., Green, D. G. Effects of inhibiting glutamine synthetase and blocking glutamate uptake on b-wave generation in the isolated rat retina. Visual Neuroscience. 16 (2), 345-353 (1999).
