Summary
Modifiering av befintlig multielektrodmatris eller patchklämutrustning gör ex vivo-elektroretinogrammet mer allmänt tillgängligt. Förbättrade metoder för att registrera och upprätthålla ex vivo-ljussvar underlättar studien av fotoreceptor- och ON-bipolär cellfunktion i den friska näthinnan, djurmodeller av ögonsjukdomar och mänskliga donatornäthinnor.
Abstract
Mätningar av retinala neuronala ljussvar är avgörande för att undersöka fysiologin hos den friska näthinnan, bestämma patologiska förändringar i näthinnesjukdomar och testa terapeutiska ingrepp. Ex vivo-elektroretinogrammet (ERG) möjliggör kvantifiering av bidrag från enskilda celltyper i den isolerade näthinnan genom tillsats av specifika farmakologiska medel och utvärdering av vävnadsinneboende förändringar oberoende av systemiska influenser. Retinala ljussvar kan mätas med hjälp av en specialiserad ex vivo ERG-provhållare och inspelningsinställning, modifierad från befintlig patchklämma eller mikroelektrodmatrisutrustning. Särskilt har studien av ON-bipolära celler, men också av fotoreceptorer, hindrats av den långsamma men progressiva nedgången av ljussvar i ex vivo ERG över tid. Ökad perfusionshastighet och justering av perfusattemperaturen förbättrar ex vivo retinal funktion och maximerar responsamplituden och stabiliteten. Ex vivo ERG möjliggör unikt studier av individuella retinala neuronala celltyper. Dessutom möjliggör förbättringar för att maximera responsamplituder och stabilitet undersökning av ljussvar i näthinneprover från stora djur, såväl som mänskliga donatorögon, vilket gör ex vivo ERG till ett värdefullt tillskott till repertoaren av tekniker som används för att undersöka retinal funktion.
Introduction
Elektroretinografi mäter retinal funktion som svar på ljus1. Det är en integrerad del av att studera retinal fysiologi och patofysiologi och mäta framgången för terapier för retinala sjukdomar. ERG in vivo används ofta för att bedöma retinal funktion i intakta organismer, men den har betydande begränsningar 2,3. Bland dessa hindras den kvantitativa analysen av enskilda retinala celltyper i in vivo ERG, eftersom den registrerar summan av potentiella förändringar, och därmed överlagringssvar, från alla retinala celler till ljusstimuli4. Dessutom tillåter det inte lätt tillsats av läkemedel till näthinnan, är sårbart för systemiska influenser och har ett relativt lågt signal-brusförhållande. Dessa nackdelar elimineras i ex vivo ERG som undersöker funktionen hos den isolerade näthinnan 2,3,5,6. Ex vivo ERG möjliggör registrering av stora och stabila svar från specifika retinala celltyper genom tillsats av farmakologiska hämmare och enkel utvärdering av terapeutiska medel, som kan tillsättas superfusatet. Samtidigt tar det bort påverkan av systemiska effekter och eliminerar fysiologiskt brus (t.ex. hjärtslag eller andning).
I ERG ex vivo isoleras näthinnor eller näthinneprover och monteras fotoreceptorsidan uppåt på kupolen på provhållaren 3,5. Provhållaren är monterad, ansluten till ett perfusionssystem som förser näthinnan med uppvärmda, syresatta medier och placeras på scenen i ett mikroskop, som har modifierats för att leverera datorstyrda ljusstimuli. För att registrera svaren som framkallas av ljus är provhållaren ansluten till ett förstärkare, digitaliserare och inspelningssystem (figur 1). Denna teknik möjliggör isolering av svar från stav- och konfotoreceptorer, ON-bipolära celler och Müller glia genom att ändra parametrarna för ljusstimuli och tillsätta farmakologiska medel.
En befintlig patchklämma eller multielektroduppsättning (MEA) kan konverteras för att spela in ex vivo ERG, antingen i kombination med en kommersiellt tillgänglig ex vivo ERG-adapter eller en anpassad polykarbonatdator numerisk kontroll (CNC) -bearbetad provhållare, för att mäta ljussvar i näthinnor från små djurmodeller, såsom möss. Denna modifiering ökar tillgängligheten för ex vivo ERG samtidigt som behovet av specialutrustning minimeras. Provhållarens konstruktion förenklar monteringstekniken och integrerar elektroder, vilket eliminerar behovet av manipulation av mikroelektroder jämfört med tidigare rapporterade transretinala ex vivo ERG-metoder7. Perfusionshastigheten och temperaturen inuti provhållaren är viktiga faktorer som påverkar responsegenskaperna från fotoreceptorer och ON-bipolära celler. Genom att justera dessa förhållanden kan ex vivo ERG registreras på ett tillförlitligt sätt från den isolerade musnäthinnan under längre tidsperioder. Optimerade experimentella förhållanden möjliggör ex vivo ERG-inspelningar i retinala stansar från större näthinnor, inklusive stora djurögon och mänskliga donatorögon8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment med möss utfördes i enlighet med NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals och godkändes av Institutional Animal Studies Committee vid University of Utah. Grisögon för demonstration av denna video erhölls postmortem från slakteriet (Sustainable Swine Resources, Johnsonville). Ögon erhölls från mänskliga donatorer efter hjärn- eller hjärtdöd med samtycke för forskningsanvändning genom Utah Lions Eye Bank, San Diego Eye Bank eller Lifesharing, som är fullt ackrediterade av FDA, Association of Organ Procurement Organizations (AOPO) och Eye Banks of America Association. Användningen av mänskliga donatorögon hade undantagen status vid University of Utah (IRB nr 00106658) och ScrippsHealth IRB (IRB nr 16-6781).
1. Inrättande av erg ex vivo
- För att konvertera en multielektroduppsättningsinställning, anslut ex vivo ERG-provhållaren via ett huvudsteg till en differentiell förstärkare, som är ansluten till den analoga ingången på gränssnittskortet i multielektrodmatrissystemet. Använd inspelningsprogramvaran för multielektrodmatrisen för att spela in och lagra indata från ex vivo ERG. Ställ in förstärkningen av differentialförstärkaren till 100 och lägg till ytterligare 10x spänningsförstärkning beroende på digitaliseringsspecifikationerna. Ställ in lågpassfiltret på 100 Hz.
- För att konvertera en patchklämma, anslut ex vivo ERG-provhållaren via ett huvudsteg till en differentiell förstärkare, som är ansluten till huvudsteget på patchklämförstärkaren. Använd patchklämmans systemprogramvara och digitaliserare för att registrera och lagra indata från ex vivo ERG. Ställ in förstärkningen på differentialförstärkaren till 100 och applicera ytterligare 10x spänningsförstärkning via patchklämhuvudet. Ställ in lågpassfiltret på 100 Hz.
- Anslut lysdioder med lämpliga våglängder (t.ex. cirka 530 nm för att framkalla stavfotoreceptor och ON-bipolära cellsvar) till mikroskopet. Styr lysdioderna med inspelningsprogramvara som möjliggör utlösning av ljusstimuli. För att styra ljusstimuli, använd en LED-drivrutin som styrs av analoga utgångar från en digitaliserare.
- Kalibrera lysdiodernas ljusutgång vid näthinnans position i provhållaren med hjälp av en fotodiod. Sätt vid behov in neutrala densitetsfilter i ljusvägen för att dämpa ljusintensiteten.
- Använd en kommersiellt tillgänglig eller specialbyggd ex vivo ERG-provhållare.
OBS: Ritningar för CNC-bearbetning från polykarbonat kan erhållas från författarna på begäran. - För att förbereda elektroden, sätt in en Ag / AgCl-pelletselektrod i en gängad luerkontakt. Fyll insidan av luerkontakten med varmt lim och sätt in ett 2 mm uttag i det heta limet från den icke-gängade sidan. Löd en silvertråd av EP1-elektroden till 2 mm-uttaget. Skruva fast den färdiga elektroden, med en o-ring på gängan, i elektrodportarna på ex vivo ERG-provhållaren.
OBS: Elektroder kan användas under lång tid. Om pelletsytan ackumulerar smuts och/eller blir mörk (detta kan orsaka hög offsetspänning och/eller elektrisk avdrift) kan den "poleras" med fint sandpapper. - Minst 1 dag före experiment, limma filterpapper på kupolerna på ex vivo ERG-provhållaren med epoxilim, så att limet inte hindrar elektrodkanalen (se 3 för video).
2. Beredning av djur
- Mörka anpassa djur i minst 6 timmar eller över natten.
3. Förberedelse av utrustning
- Fyll perfusionslinjen i ex vivo ERG med Ames medium bubblat med 5% koldioxid och 95% syre. Anslut perfusionsledningen till ett värmeelement med en likströmskälla eller värmeregulator nära provhållaren för att värma Ames medium, så att näthinnan hålls vid cirka 35-38 °C.
- Fyll båda halvorna av ERG-provhållaren ex vivo med elektrodlösning, täta perfusionslinjen med luerproppar, anslut elektroderna och montera provhållaren med fyra skruvar (se 3 för video).
- Kontrollera motståndet och förskjutningsspänningen mellan elektroderna i den monterade provhållaren genom att sätta in multimeterns sonder i elektroderna.
OBS: Om det inte finns några blockeringar och elektroderna är i gott skick bör motståndet vara under 100 kΩ och offsetspänningen under 5 mV. - Anslut den monterade provhållaren till perfusionslinjen och placera på scenen i ett mikroskop som är inställt för att leverera ljusblixtar. Se till att provhållaren och perfusionslinjen inte innehåller några luftbubblor.
4. Vävnadsberedning
- Offra djuret med CO2 och omedelbart enucleate ögonen, eller få stora djur eller mänskliga donatorögon.
- Rengör jordklotet för återstående bindväv och extraokulära muskler. Trimma av synnerven.
- På filterpapper, placera försiktigt ett litet snitt med ett rakblad längs ora serrata, cirka 1 mm från limbus i musögat. Sätt in fina vannas sax i snittet och skär längs limbus för att ta bort den främre delen av ögat med linsen.
- Flytta ögonkoppen till en skål som innehåller Ames medium. Ta tag i sclera med fina pincett, var noga med att inte röra näthinnan. Sätt in vannas sax mellan näthinnan och sclera och skär sclera från periferin mot den centrala delen. Var försiktig så att du inte rör vid eller skadar näthinnan.
- Immobilisera sclera genom att hålla ena sidan av snittet med vannas sax mot botten av dissektionsskålen. Ta tag i sclera med pincett på andra sidan snittet. Ta bort sclera utan att röra eller skada näthinnan genom att dra isär sclera på vardera sidan av snittet för att möjliggöra isolering av näthinnan med minimal skada på vävnaden.
- Ta bort det främre segmentet med linsen från det andra ögat och förvara ögonkoppen vid rumstemperatur i Ames lösning bubblande med 5% koldioxid och 95% syre.
OBS: Funktionella ljussvar från ögon lagrade på detta sätt kan erhållas i flera timmar. - I stora ögon, inklusive mänskliga donatorögon, rengör jordklotet i den återstående bindväven och ta bort det främre segmentet och linsen, på samma sätt som proceduren som beskrivs för musögat. Använd en skalpell för att göra ett snitt ca 3 mm från limbus. Sätt in böjd dissektionsax i snittet och skär längs limbus för att ta bort den främre delen av ögat med linsen. Skaffa retinala prover för ex vivo elektroretinografi med en 3-6 mm engångsbiopsistans.
5. Montering av vävnaden på provhållaren
- Placera den nedre halvan av provhållaren i en stor petriskål och fyll med syresatt Ames medium så att kupolen på provhållaren bara är nedsänkt.
- Ta försiktigt tag i näthinnans kant med fina pincett och överför näthinnan till kupolen på ex vivo-provhållaren, fotoreceptorsidan uppåt.
- Lyft provhållaren från Ames lösning och se till att näthinnan håller sig på plats.
- Torka provhållarens platta helt för att minimera brus, elektrisk överhörning och signalskakning.
- Montera båda halvorna av provhållaren med fyra skruvar och anslut perfusionsledningen. Torka elektroden i den nedre halvan av provhållaren och anslut anodkabeln till den inre näthinnesidan och katodkabeln till fotoreceptorsidan.
- Genomsyra provhållaren med minst 1 ml/min syresatt Ames medium i 10-20 min för att ge tid för ljusresponsen att stabiliseras.
6. Inspelning av retinal neuronal cellfunktion
- Spela in svarsfamiljer genom att utsätta näthinnan för ljusblixtar med ökande intensitet. Registrera till exempel musstångens fotoreceptorresponsfamiljer med ljusintensiteter som sträcker sig från cirka 10 till 1 000 fotoner / μm 2 och de från mus ON-bipolära celler med ljusintensiteter från cirka 0,6 till 20 fotoner / μm2.
- Mät fotoreceptorljussvar (a-våg) i närvaro av 100 μM bariumklorid, som blockerar kaliumkanaler i Müller-gliaceller, och 40 μM DL-AP4, som blockerar glutamaterg signalöverföring till ON-bipolära celler (figur 2B).
- För att isolera b-vågen, som härstammar från funktionen hos de bipolära cellerna, registrerar först kombinerade ljussvar från både fotoreceptor- och ON-bipolära celler i närvaro av enbart bariumklorid (figur 2A). Sedan, perfuse i 5-10 min med Ames medium innehållande bariumklorid, liksom DL-AP4, och registrera fotoreceptorsvar på samma ljusstimuli som tidigare (Figur 2B). Subtrahera fotoreceptorsvar från kombinerade fotoreceptor- och ON-bipolära cellsvar, vilket beräknar ON-bipolära cellljussvar ensamt (figur 2C).
7. Optimera ON-bipolär cellfunktion
OBS: b-vågen, som härstammar från de bipolära cellerna, är mycket känslig för temperaturen i provhållaren och perfusionshastigheten.
- Håll en perfusionshastighet på minst 0,5 ml/min för att erhålla b-vågen.
OBS: En högre perfusionshastighet på 1-2 ml / min är att föredra för att upprätthålla ett stort och stabilt svar från ON-bipolära celler. - Se till att temperaturen i provhållaren nära näthinnan för en given perfusionshastighet ligger nära kroppstemperaturen (dvs. cirka 35–38 °C).
OBS: Det är viktigt justera temperaturen på perfusatet, som värms upp innan det når ERG-provhållaren ex vivo , så att det ligger inom det optimala temperaturområdet vid näthinnan. - Förvara ögonkoppar för senare experiment skyddade från ljus och i syresatt Ames medium vid rumstemperatur för att bibehålla normala a- och b-vågor i flera timmar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ex vivo ERG möjliggör registrering av reproducerbara och stabila fotoreceptor- och ON-bipolära cellljussvar, till exempel från musens näthinna (figur 2A-C). Registrering av fotoreceptorsvar från mänskliga donatornäthinnor är möjlig med upp till 5 timmars fördröjning efter döden av enucleation (figur 2D) och av ON-bipolära cellsvar med en <20 minuters enucleationsfördröjning (figur 2E). Viktiga parametrar för att få stora svar inkluderar en noggrann dissektionsteknik, hög perfusionshastighet och perfusionstemperatur nära fysiologiska värden (35-38 ° C i däggdjurs näthinnan). Under dessa förhållanden var responsamplituder och kinetik i båda celltyperna relativt stabila över tid men minskade långsamt cirka 40-45 minuter efter att näthinnorna monterats på provhållaren (figur 3).
Jämfört med fotoreceptorer störs ON-bipolär cellfunktion lättare, till exempel genom skador på näthinnan under dissektion och montering eller genom en minskning av temperaturen och / eller perfusionshastigheten. Medan minskad temperatur i provhållaren kraftigt saktade kinetiken hos både fotoreceptorer och ON-bipolära celler, minskade den b-vågens amplitud men inte a-vågen (figur 4A). Omvänt minskade sänkningen av perfusionshastigheten från 2,1 ml/min till 0,6 ml/min amplituderna för både fotoreceptor- och ON-bipolära cellsvar men påverkade inte den implicita tiden (tid från stimulansdebut till responstopp) för vare sig a- eller b-vågen (figur 4B). Upphörande av perfusion i 10 minuter följt av reperfusion resulterade i en fullständig förlust av ON-bipolär cellfunktion med bevarade fotoreceptorsvar (figur 5).
Figur 1: Ex vivo elektroretinogramprovhållare och inspelningsinställning . (A,B) Erg-provhållaren ex vivo består av en kupol för att montera den isolerade näthinnan, som är ansluten till en perfusionslinje för att kontinuerligt leverera Ames medium. Elektroder är anslutna via smala kanaler till både fotoreceptorsidan av näthinnan via perfusionslinjen och den inre näthinnan genom filterpapperet limmat på kupolen. Dessa elektroder är anslutna till en differentiell förstärkare, vilket möjliggör mätning av potentiella skillnader i näthinnan som svar på ljusstimuli. (C) Provhållaren placeras på scenen i ett mikroskop, som har modifierats för att leverera ljusblixtar och anslutits till perfusionslinjen, som levererar uppvärmt, syresatt Ames medium genom tyngdkraften. Hela inspelningsinställningen är avskärmad av en Faraday-bur för att minimera elektriskt brus. Denna siffra har modifierats från 9. Förkortning: ERG = elektroretinogram. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Exempel på spår av ex vivo fotoreceptor och ON-bipolära cellsvar. Tillsats av farmakologiska medel till perfusatet möjliggör kvantifiering av bidrag från enskilda retinala celltyper till ex vivo-elektroretinogrammet. Fotoreceptor (PR) ljussvar isoleras i närvaro av 100 μM bariumklorid (BaCl2), en blockerare av K + -kanaler uttryckta av Müller glialceller, liksom 40 μM DL-AP4, en glutamatreceptorblockerare, som hämmar signalöverföring från fotoreceptorer till ON-bipolära celler (B). ON-bipolär cell (ON-BPC) funktion (C) bestäms genom att subtrahera fotoreceptorkomponenten (B) från den kombinerade fotoreceptorn och ON-bipolära cellsvaret i närvaro av enbart bariumklorid (A). Fotoreceptorljussvar kan erhållas från mänskliga donatornäthinnor med en fördröjning av dödsfall till enucleation på <5 h (D), medan näthinnor som enukleras inom 20 minuter efter döden ofta också ger ON-bipolära cellsvar (E) (se 8 för ytterligare information). Figur 2A-C är modifierad från 9. Förkortningar: PR = fotoreceptor; ON-BPC = ON-bipolär cell. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Stabilitet hos fotoreceptorn och ON-bipolär cellfunktion i ex vivo-elektroretinogrammet över tid . (A) Ljussvar registrerades varje minut från enbart fotoreceptorer i närvaro av både 100 μM bariumklorid och 40 μM DL-AP4. (B) Svaga ljusblixtar i närvaro av enbart 100 μM bariumklorid domineras starkt av ON-bipolär cellfunktion, även om de innehåller en liten fotoreceptorkomponent. Ljussvar från isolerade näthinnor stabiliseras vanligtvis efter att ha läst ex vivo-provhållaren i 15-20 minuter och var stabila i minst 20-25 minuter innan de började minska. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Kombinerade fotoreceptor- och ON-bipolära cellsvar vid olika temperaturer och perfusionshastigheter. (A) Sänkning av temperaturen inuti provhållaren från 37 °C till rumstemperatur bromsade kraftigt fotoreceptorn och ON-bipolär cellkinetik men minskade endast ON-bipolär cellamplituden i det blandade fotoreceptor- och ON-bipolära cellsvaret. (B) Reduktion av perfusionshastigheten från 2,1 ml/min till 0,6 ml/min resulterade i minskade fotoreceptor- och ON-bipolära cellamplituder men ingen förändring i responskinetiken. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: ON-bipolära cellsvar är känsligare för upphörande av perfusion. (A) Stora fotoreceptor- och ON-bipolära cellsvar registrerades efter perfusion med 2,1 ml/min i 20 min. Efter upphörande av perfusion i 10 min följt av reperfusion i 10 min vid 2,1 ml/min var fotoreceptorsvar närvarande, medan ON-bipolära cellers svar var helt förlorade. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ursprungligen utvecklad 1865 av Holmgren för att mäta retinala ljussvar från amfibienäthinnan10, hindrade tekniska begränsningar initialt ERG från att användas i stor utsträckning. Icke desto mindre identifierade seminalstudier av Ragnar Granit och andra det cellulära ursprunget till ERG och mätte fotoreceptor- och ON-bipolära cellsvar ex vivo11,12,13. Sedan dess har förfinade metoder möjliggjort en mer utbredd användning av ex vivo ERG-registreringar 14,15, även om responsamplituderna, särskilt de från ON-bipolära celler, förblev relativt små16. För att övervinna dessa begränsningar mäts retinal funktion idag oftare med in vivo ERG, trots experimentella begränsningar och mer komplicerad tolkning av de registrerade vågformerna. Även om ERG ex vivo försöker replikera fysiologiska förhållanden så nära som möjligt, mäter den ändå retinal funktion i en artificiell miljö och i frånvaro av systemiska faktorer och patologiska förändringar. I kombination med erg in vivo kan dock denna begränsning användas för att besvara viktiga frågor, såsom om förändringar i näthinnefunktionen vid sjukdom är inneboende för näthinneceller eller orsakas av systemförändringar17.
Nyligen har nydesignade ex vivo ERG-provhållare förenklat metoden och gjort ex vivo ERG tillgänglig för ett bredare forskarsamhälle 2,3,5,18. Modifieringar av befintlig patchklämma eller multielektrodmatrisutrustning som beskrivs i detta protokoll kommer att göra det möjligt för fler laboratorier att utföra ex vivo ERG med minimala finansiella investeringar och utrymmeskrav. I synnerhet har den senaste utvecklingen inom ex vivo ERG-teknik förstärkt lyhördheten hos däggdjurs isolerade näthinnor och resulterat i ett överlägset signal-brusförhållande, vilket förblir bra trots ytterligare förstärkningssteg som beskrivs i detta protokoll. Ändå har nedgången i ljussvaren, främst från ON-bipolära celler19, kanske hindrat den mer utbredda användningen av ex vivo ERG. Användningen av Ames eller Lockes medium resulterar i större fotoreceptor- och ON-bipolära cellsvar, vilket gör dem att föredra framför till exempel HEPES-buffrad Ringer-lösning för ex vivo ERG3. Andra laboratorier stabiliserade ex vivo ON-bipolär cellfunktion genom att komplettera med glutamin eller glutamat19. Denna rapport visar hur man kan få stora och stabila ljussvar från isolerade näthinnor, inklusive från mänskliga donatorögon, som tidigare rapporterats8.
Viktiga experimentella parametrar inkluderar näthinnans temperatur, som bör hållas inom det fysiologiska området och en snabb perfusionshastighet. De mest märkbara effekterna av att sänka temperaturen i ex vivo ERG-provhållaren är långsammare responskinetik i både fotoreceptorer och ON-bipolära celler och en dämpad ON-bipolär cellamplitud. Även om sänkning av temperaturen verkar ha liten effekt på fotoreceptoramplituden i det kombinerade svaret från fotoreceptorer och ON-bipolära celler, kan detta vara en artefakt på grund av differentiella förändringar i responskinetiken från båda celltyperna.
En tillräcklig perfusionshastighet verkar vara särskilt kritisk för näthinnans funktion, som sannolikt tillför syre och näringsämnen och tar bort avfallsprodukter. Medan både fotoreceptor- och ON-bipolära cellamplituder minskar något av en måttlig minskning av perfusionshastigheten, avskaffade även ett kort upphörande av perfusion ON-bipolär men inte fotoreceptorfunktion. Detta innebär att fotoreceptorsvar är mer robusta och lättare kan bevaras i ögon som genomgår experiment med en betydande fördröjning, såsom mänskliga donatorögon8. I detta sammanhang är det anmärkningsvärt att ON-bipolär cellfunktion inte minskar genom att lagra ögonkoppar i syresatt Ames medium i flera timmar. Vi antar därför att förlusten av ON-bipolär cellfunktion när perfusionen i ex vivo-provhållaren stoppas kan bero på snabb utarmning av syre och andra näringsämnen i den lilla volymen som omger näthinnan i provhållaren. Detta stöds av rapporter om att en kort fördröjning från död till enucleation är avgörande för att registrera fotoreceptor och särskilt ON-bipolära cellsvar från mänskliga näthinnor, och att postmortemhypoxi är den mest troliga kandidaten för irreversibel skada på retinal neuronal funktion8. Medan experimentella parametrar för ex vivo ERG optimerades i musens näthinna, förbättrade de ändå framgångsrikt registreringsförhållandena för näthinneprover från stora djur och mänskliga donatorögon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen av författarna har några intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Eye Institute-bidrag EY02665 och EY031706 och International Retinal Research Foundation till Dr. Vinberg, National Institutes of Health Core Grant (EY014800), och ett obegränsat bidrag från Research to Prevent Blindness, New York, NY, till Institutionen för oftalmologi och visuella vetenskaper, University of Utah. Dr. Frans Vinberg är också mottagare av ett Research to Prevent Blindness/Dr. H. James och Carole Free Career Development Award, och Dr. Silke Becker av ett ARVO EyeFind-stipendium. Vi tackar Dr. Anne Hanneken från The Scripps Research Institute för att ha tillhandahållit donatorögat som används för inspelningar som visas i figur 2E.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mm socket | WPI | 2026-10 | materials to prepare electrode |
| Ag/AgCl Electrode | World Precision Instruments | EP1 | materials to prepare electrode |
| Ames' medium | Sigma Aldrich | A1420 | perfusion media |
| barium chloride | Sigma Aldrich | B0750 | potassium channel blocker |
| DL-AP4 | Tocris | 0101 | broad spectrum glutamatergic antagonist |
| OcuScience Ex Vivo ERG Adapter | OcuScience | n/a | ex vivo ERG specimen holder |
| Threaded luer connector | McMaster-Carr | 51525K222 or 51525K223 | materials to prepare electrode |
References
- Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , (1995).
- Bonezzi, P. J., Tarchick, M. J., Renna, J. M. Ex vivo electroretinograms made easy: performing ERGs using 3D printed components. Journal of Physiology. 598 (21), 4821-4842 (2020).
- Vinberg, F., Kefalov, V. Simultaneous ex vivo functional testing of two retinas by in vivo electroretinogram system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52855 (2015).
- Heckenlively, J. R., Arden, G. B. Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision. , MIT Press. (2006).
- Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Research. 101, 108-117 (2014).
- Winkler, B. S. Calcium and the fast and slow components of P3 of the electroretinogram of the isolated rat retina. Vision Research. 14 (1), 9-15 (1974).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs. Visual Neuroscience. 16 (4), 727-741 (1999).
- Abbas, F., et al. Revival of light signalling in the postmortem mouse and human retina. Nature. , (2022).
- Becker, S., Carroll, L. S., Vinberg, F. Diabetic photoreceptors: Mechanisms underlying changes in structure and function. Visual Neuroscience. 37, (2020).
- Kantola, L., Piccolino, M., Wade, N. J. The action of light on the retina: Translation and commentary of Holmgren (1866). Journal of the History of the Neurosciences. 28 (4), 399-415 (2019).
- Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161 (3840), 487-489 (1968).
- Hamasaki, D. I. The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog. Journal of Physiology. 167 (1), 156-168 (1963).
- Granit, R. The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve. Journal of Physiology. 77 (3), 207-239 (1933).
- Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria). Acta Physiologica Scandinavica. 134 (4), 535-541 (1988).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision Research. 39 (13), 2165-2177 (1999).
- Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Research Protocols. 16 (1-3), 27-36 (2005).
- Becker, S., Carroll, L. S., Vinberg, F. Rod phototransduction and light signal transmission during type 2 diabetes. BMJ Open Diabetes Research and Care. 8 (1), 001571 (2020).
- Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (6), 2583-2588 (2006).
- Winkler, B. S., Kapousta-Bruneau, N., Arnold, M. J., Green, D. G. Effects of inhibiting glutamine synthetase and blocking glutamate uptake on b-wave generation in the isolated rat retina. Visual Neuroscience. 16 (2), 345-353 (1999).
