Summary
Модификация существующего многоэлектродного массива или патч-зажимного оборудования делает электроретинограмму ex vivo более доступной. Улучшенные методы регистрации и поддержания световых реакций ex vivo облегчают изучение функции фоторецепторов и ON-биполярных клеток в здоровой сетчатке, животных моделей глазных заболеваний и донорской сетчатки человека.
Abstract
Измерения световых реакций нейронов сетчатки имеют решающее значение для исследования физиологии здоровой сетчатки, определения патологических изменений при заболеваниях сетчатки и тестирования терапевтических вмешательств. Электроретинограмма ex vivo (ERG) позволяет количественно оценить вклад отдельных типов клеток в изолированной сетчатке путем добавления специфических фармакологических агентов и оценки тканевых изменений независимо от системных воздействий. Световые реакции сетчатки могут быть измерены с помощью специализированного держателя образца ex vivo ERG и записывающей установки, модифицированной из существующего зажима патча или микроэлектродного массива. В частности, изучение ON-биполярных клеток, а также фоторецепторов было затруднено медленным, но прогрессирующим снижением световых реакций в EX VIVO ERG с течением времени. Повышенная скорость перфузии и регулировка температуры перфузата улучшают функцию сетчатки ex vivo и максимизируют амплитуду и стабильность отклика. Ex vivo ERG уникально позволяет изучать отдельные типы нейрональных клеток сетчатки. Кроме того, улучшения для максимизации амплитуд отклика и стабильности позволяют исследовать световые реакции в образцах сетчатки от крупных животных, а также в глазах доноров человека, что делает ex vivo ERG ценным дополнением к репертуару методов, используемых для исследования функции сетчатки.
Introduction
Электроретинография измеряет функцию сетчатки в ответ на свет1. Это неотъемлемая часть изучения физиологии и патофизиологии сетчатки, а также измерения успеха терапии заболеваний сетчатки. In vivo ERG широко используется для оценки функции сетчатки у интактных организмов, но имеет значительные ограничения 2,3. Среди них количественный анализ отдельных типов клеток сетчатки в IN VIVO ERG затруднен, поскольку он регистрирует сумму потенциальных изменений и, следовательно, наложение ответов от всех клеток сетчатки к световым стимулам4. Кроме того, он не позволяет добавлять лекарства к сетчатке, уязвим к системным воздействиям и имеет относительно низкое отношение сигнал/шум. Эти недостатки устраняются в ex vivo ERG, который исследует функцию изолированной сетчатки 2,3,5,6. EX vivo ERG позволяет регистрировать большие и стабильные ответы от конкретных типов клеток сетчатки путем добавления фармакологических ингибиторов и легкой оценки терапевтических агентов, которые могут быть добавлены к суперфузату. В то же время он устраняет влияние системных эффектов и устраняет физиологический шум (например, сердцебиение или дыхание).
В EX VIVO ERG сетчатку или образцы сетчатки изолируют и устанавливают фоторецепторной стороной вверх на куполе держателя образца 3,5. Держатель образца собирается, подключается к перфузионной системе, которая снабжает сетчатку нагретой, насыщенной кислородом средой, и помещается на сцену микроскопа, который был модифицирован для доставки управляемых компьютером световых стимулов. Для записи откликов, вызванных светом, держатель образца подключается к усилителю, дигитайзеру и системе записи (рисунок 1). Этот метод позволяет выделить ответы от палочковых и колбочек фоторецепторов, ON-биполярных клеток и глии Мюллера путем изменения параметров световых раздражителей и добавления фармакологических агентов.
Существующий зажим или многоэлектродный массив (MEA) может быть преобразован для записи ex vivo ERG либо в сочетании с коммерчески доступным адаптером ex vivo ERG, либо с пользовательским поликарбонатным держателем для образцов с числовым программным управлением (ЧПУ) для измерения световых реакций в сетчатке от моделей мелких животных, таких как мыши. Данная модификация повышает доступность ex vivo ERG при минимизации потребности в специализированном оборудовании. Конструкция держателя образца упрощает технику монтажа и интегрирует электроды, устраняя необходимость манипуляций с микроэлектродами по сравнению с ранее сообщенными трансретинальными методами ex vivo ERG7. Скорость перфузии и температура внутри держателя образца являются важными факторами, которые влияют на свойства ответа фоторецепторов и ON-биполярных клеток. Регулируя эти условия, EX VIVO ERG может быть надежно зарегистрирован из изолированной сетчатки мыши в течение длительных периодов времени. Оптимизированные экспериментальные условия позволяют записывать EX VIVO ERG в удары сетчатки от более крупных сетчаток, включая большие глаза животных и глаза донора человека8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты с использованием мышей проводились в соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены Институциональным комитетом по изучению животных в Университете штата Юта. Глаза свиней для демонстрации этого видео были получены посмертно со скотобойни (Sustainable Swine Resources, Johnsonville). Глаза были получены от человеческих доноров после смерти мозга или сердца с согласия на исследовательское использование через Utah Lions Eye Bank, San Diego Eye Bank или Lifesharing, которые полностью аккредитованы FDA, Ассоциацией организаций по закупке органов (AOPO) и Ассоциацией глазных банков Америки. Использование человеческих донорских глаз имело статус освобожденного в Университете штата Юта (IRB No 00106658) и ScrippsHealth IRB (IRB No 16-6781).
1. Настройка ex vivo ERG
- Для преобразования многоэлектродной установки матрицы подключите держатель образца ex vivo ERG через головной каскад к дифференциальному усилителю, который подключается к аналоговому входу интерфейсной платы системы многоэлектродных массивов. Используйте программное обеспечение для записи многоэлектродного массива для записи и хранения входных данных из ex vivo ERG. Установите коэффициент усиления дифференциального усилителя на 100 и добавьте дополнительное 10-кратное усиление напряжения в зависимости от спецификаций дигитайзера. Установите для фильтра нижних частот значение 100 Гц.
- Чтобы преобразовать установку патч-зажима, подключите держатель образца ex vivo ERG через головной каскад к дифференциальному усилителю, который подключен к головной ступени усилителя патч-зажима. Используйте системное программное обеспечение и дигитайзер для записи и хранения входных данных из ex vivo ERG. Установите коэффициент усиления дифференциального усилителя на 100 и примените дополнительное 10-кратное усиление напряжения через каскад зажимной головки. Установите для фильтра нижних частот значение 100 Гц.
- Подключите светодиоды с соответствующими длинами волн (например, приблизительно 530 нм, чтобы вызвать стержневой фоторецептор и ON-биполярные клеточные реакции) с микроскопом. Управляйте светодиодами с помощью записывающего программного обеспечения, которое позволяет запускать световые стимулы. Для управления световыми раздражителями используйте светодиодный драйвер, управляемый аналоговыми выходами дигитайзера.
- Откалибруйте световой поток светодиодов в положении сетчатки в держателе образца с помощью фотодиода. При необходимости вставьте фильтры нейтральной плотности в световой контур, чтобы приглушить интенсивность света.
- Используйте коммерчески доступный или изготовленный на заказ держатель образца ex vivo ERG.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чертежи для обработки с ЧПУ из поликарбоната можно получить у авторов по запросу. - Чтобы подготовить электрод, вставьте пеллетный электрод Ag/AgCl в резьбовой соединитель luer. Заполните внутреннюю часть разъема luer горячим клеем и вставьте гнездо 2 мм в горячий клей с нерезной стороны. Припаяйте серебряную проволоку электрода EP1 к разъему 2 мм. Вкрутите готовый электрод с уплотнительным кольцом на резьбе в электродные порты держателя образца ex vivo ERG.
ПРИМЕЧАНИЕ: Электроды можно использовать в течение длительного времени. Если поверхность гранул накапливает грязь и / или темнеет (это может вызвать высокое напряжение смещения и / или электрический дрейф), ее можно «отполировать» с помощью мелкой наждачной бумаги. - По крайней мере, за 1 день до начала экспериментов приклейте фильтровальную бумагу на купола держателя образца ex vivo ERG с помощью эпоксидного клея, гарантируя, что клей не загораживает канал электрода (см. видео см. 3 ).
2. Подготовка животных
- Темные животные приспосабливаются в течение не менее 6 ч или на ночь.
3. Подготовка оборудования
- Заполните перфузионную линию ex vivo ERG средой Эймса, наполненной 5% углекислого газа и 95% кислорода. Подключите перфузионную линию к нагревательному элементу с источником постоянного тока или регулятором тепла рядом с держателем образца, чтобы нагреть среду Эймса, чтобы сетчатка поддерживалась при температуре примерно 35-38 °C.
- Заполните обе половины держателя образца ex vivo ERG раствором электрода, запечатайте перфузионную линию пробками luer, соедините электроды и соберите держатель образца четырьмя винтами (см. видео см. 3).
- Проверьте сопротивление и смещение напряжения между электродами в собранном образце держателя, вставив датчики мультиметра в электроды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если нет засоров, а электроды находятся в хорошем состоянии, сопротивление должно быть ниже 100 кОм и напряжение смещения ниже 5 мВ. - Подключите собранный держатель образца к линии перфузии и поместите на сцену микроскопа, настроенного для доставки световых вспышек. Убедитесь, что держатель образца и перфузионная линия не содержат пузырьков воздуха.
4. Подготовка тканей
- Принесите в жертву животное с CO2 и немедленно энуклеируйте глаза, или получите крупные глаза животного или человека-донора.
- Очистите земной шар от оставшейся соединительной ткани и экстраокулярных мышц. Обрежьте зрительный нерв.
- На фильтровальную бумагу аккуратно поместите небольшой разрез лезвием бритвы вдоль ora serrata, примерно в 1 мм от лимбуса в глазу мыши. Вставьте тонкие ножницы vannas в разрез и вырежьте вдоль конечности, чтобы удалить переднюю часть глаза с помощью хрусталика.
- Переместите чашку для глаз в блюдо, содержащее среду Эймса. Обхватите склеру тонкими щипцами, следя за тем, чтобы не коснуться сетчатки. Вставьте ножницы vannas между сетчаткой и склерой и отрежьте склеру от периферической к центральной части. Следите за тем, чтобы не коснуться и не повредить сетчатку.
- Обездвижите склеру, удерживая одну сторону разреза ножницами vannas о дно тарелки для рассечения. Захватите склеру щипцами по другую сторону разреза. Удалите склеру, не касаясь и не повреждая сетчатку, раздвигая склеру по обе стороны разреза, чтобы обеспечить изоляцию сетчатки с минимальным повреждением ткани.
- Удалите передний сегмент хрусталиком из другого глаза и храните глазную чашку при комнатной температуре в растворе Эймса, наполненном 5% углекислым газом и 95% кислородом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Функциональные световые реакции от глаз, хранящихся таким образом, могут быть получены в течение нескольких часов. - В больших глазах, включая глаза донора человека, очищают глобус от оставшейся соединительной ткани и удаляют передний сегмент и хрусталик, аналогично процедуре, описанной для глаза мыши. Используйте скальпель, чтобы сделать разрез примерно в 3 мм от лимбуса. Вставьте изогнутые ножницы для рассечения в разрез и разрезайте вдоль лимбуса, чтобы удалить переднюю часть глаза с помощью хрусталика. Получить образцы сетчатки для электроретинографии ex vivo с помощью одноразового биопсийного перфоратора 3-6 мм.
5. Крепление ткани на держатель образца
- Поместите нижнюю половину держателя образца в большую чашку Петри и наполните насыщенной кислородом средой Эймса, чтобы купол держателя образца был просто погружен.
- Осторожно захватите край сетчатки тонкими щипцами и перенесите сетчатку на купол держателя образца ex vivo , стороной фоторецептора лицом вверх.
- Поднимите держатель образца из раствора Эймса, заботясь о том, чтобы сетчатка оставалась на месте.
- Полностью высушите пластину держателя образца, чтобы свести к минимуму шум, электрические перекрестные помехи и маневрирование сигнала.
- Соберите обе половины держателя образца четырьмя винтами и соедините перфузионную линию. Высушите электрод в нижней половине держателя образца и подключите анодный кабель к внутренней стороне сетчатки, а катодный кабель со стороны фоторецептора.
- Наполните держатель образца не менее чем 1 мл/мин насыщенной кислородом среды Эймса в течение 10-20 мин, чтобы дать время для стабилизации световых реакций.
6. Запись функции нейрональных клеток сетчатки
- Записывайте семейства реакций, подвергая сетчатку световым вспышкам возрастающей интенсивности. Например, регистрируются семейства реакций фоторецепторов мышиных стержней с интенсивностью света в диапазоне от примерно 10 до 1000 фотонов/мкм2 и из ОН-биполярных клеток мыши с интенсивностью света в диапазоне примерно от 0,6 до 20 фотонов / мкм2.
- Измерение световых откликов фоторецепторов (a-волна) в присутствии 100 мкМ хлорида бария, который блокирует калиевые каналы в глиальных клетках Мюллера, и 40 мкМ DL-AP4, который блокирует передачу глутаматергического сигнала в ON-биполярные клетки (рисунок 2B).
- Чтобы выделить b-волну, которая возникает из функции ON-биполярных клеток, сначала зафиксируйте комбинированные световые реакции как от фоторецепторных, так и от ON-биполярных клеток в присутствии только хлорида бария (рисунок 2A). Затем перфьюируйте в течение 5-10 мин средой Эймса, содержащей хлорид бария, а также DL-AP4, и записывайте реакции фоторецепторов на те же световые стимулы, что и раньше (рисунок 2B). Вычтите реакции фоторецепторов из комбинированных реакций фоторецепторных и ON-биполярных клеток, таким образом вычисляя только световые реакции ON-биполярных клеток (рисунок 2C).
7. Оптимизация on-биполярной функции клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: B-волна, которая исходит от ON-биполярных клеток, очень чувствительна к температуре в держателе образца и скорости перфузии.
- Поддерживайте скорость перфузии не менее 0,5 мл/мин для получения b-волны.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокая скорость перфузии 1-2 мл/мин предпочтительна для поддержания большого и стабильного ответа от ON-биполярных клеток. - Убедитесь, что для данной скорости перфузии температура в держателе образца вблизи сетчатки близка к температуре тела (т.е. приблизительно 35-38 °C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно отрегулировать температуру перфусата, который нагревается до того, как он достигнет держателя образца ex vivo ERG, чтобы он находился в оптимальном температурном диапазоне на сетчатке. - Храните глазные чашки для последующих экспериментов, защищенные от света и в насыщенной кислородом среде Эймса при комнатной температуре, чтобы поддерживать нормальные a- и b-волны в течение нескольких часов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ex vivo ERG позволяет регистрировать воспроизводимые и стабильные световые реакции фоторецепторов и ON-биполярных клеток, например, от сетчатки мыши (рисунок 2A-C). Регистрация реакций фоторецепторов от донорской сетчатки человека возможна при посмертной задержке энуклеации до 5 ч (рисунок 2D) и реакций ON-биполярных клеток с задержкой энуклеации <20 мин (рисунок 2E). Важные параметры для получения больших ответов включают тщательную технику рассечения, высокую скорость перфузии и температуру перфузии, близкую к физиологическим значениям (35-38 ° C в сетчатке млекопитающих). В этих условиях амплитуды ответа и кинетика в обоих типах клеток были относительно стабильными с течением времени, но медленно снижались примерно через 40-45 мин после того, как сетчатка была установлена на держателе образца (рисунок 3).
По сравнению с фоторецепторами, функция ON-биполярных клеток легче нарушается, например, повреждением сетчатки во время рассечения и монтажа или падением температуры и/или скорости перфузии. В то время как снижение температуры в держателе образца значительно замедляло кинетику как фоторецепторов, так и ON-биполярных клеток, оно уменьшало амплитуду b-волны, но не a-волны (рисунок 4A). И наоборот, замедление скорости перфузии с 2,1 мл/мин до 0,6 мл/мин уменьшало амплитуды как фоторецепторных, так и ON-биполярных клеточных реакций, но не влияло на неявное время (время от начала стимула до пика ответа) ни a-, ни b-волны (рисунок 4B). Прекращение перфузии в течение 10 мин с последующей реперфузией приводило к полной потере функции ON-биполярных клеток с сохраненными реакциями фоторецепторов (рисунок 5).
Рисунок 1: Держатель образца электроретинограммы Ex vivo и установка записи. (A,B) Держатель образца ex vivo ERG содержит купол для крепления изолированной сетчатки, которая соединена с линией перфузии для непрерывной доставки среды Эймса. Электроды соединяются через узкие каналы как с фоторецепторной стороной сетчатки через перфузионную линию, так и с внутренней сетчаткой через фильтровальную бумагу, приклеенную к куполу. Эти электроды подключены к дифференциальному усилителю, что позволяет измерять разности потенциалов в сетчатке в ответ на световые раздражители. (C) Держатель образца помещается на ступень микроскопа, который был модифицирован для подачи световых вспышек и подключен к линии перфузии, которая доставляет нагретую, насыщенную кислородом среду Эймса под действием силы тяжести. Вся установка записи экранирована клеткой Фарадея для минимизации электрического шума. Эта цифра была изменена с 9. Аббревиатура: ERG = электроретинограмма. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Пример следов фоторецепторных и ON-биполярных клеточных реакций. Добавление фармакологических агентов к перфусату позволяет количественно оценить вклад отдельных типов клеток сетчатки в электроретинограмму ex vivo. Световые реакции фоторецепторов (PR) выделяют в присутствии 100 мкМ хлорида бария (BaCl2), блокатора каналов K+, экспрессируемого глиальными клетками Мюллера, а также 40 мкМ DL-AP4, блокатора рецепторов глутамата, который ингибирует передачу сигнала от фоторецепторов к ON-биполярным клеткам (B). Функцию ON-биполярной клетки (ON-BPC) (C) определяют путем вычитания фоторецепторного компонента (B) из комбинированного фоторецептора и ON-биполярного клеточного ответа в присутствии только хлорида бария (A). Световые реакции фоторецепторов могут быть получены от донорской сетчатки человека с задержкой от смерти к энуклеации <5 ч (D), тогда как сетчатки, энуклеированные в течение 20 мин после смерти, часто также дают ON-биполярные клеточные ответы (E) (см. 8 для получения дополнительной информации). Рисунок 2А-С изменен с 9. Сокращения: PR = фоторецептор; ON-BPC = ON-биполярная клетка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Стабильность функции фоторецепторов и ON-биполярных клеток в электроретинограмме ex vivo с течением времени. (A) Световые реакции регистрировались каждую минуту только от фоторецепторов в присутствии как 100 мкМ хлорида бария, так и 40 мкМ DL-AP4. (B) В вспышках тусклого света в присутствии 100 мкМ только хлорида бария в значительной степени доминирует функция ON-биполярных клеток, хотя они содержат небольшой компонент фоторецептора. Световые реакции от изолированных сетчаток обычно стабилизируются после перфузии держателя образца ex vivo в течение 15-20 минут и были стабильными в течение по крайней мере 20-25 минут, прежде чем начать снижаться. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Комбинированные реакции фоторецепторов и ON-биполярных клеток при различных температурах и скоростях перфузии. (A) Понижение температуры внутри держателя образца с 37 °C до комнатной температуры значительно замедлило кинетику фоторецепторов и ON-биполярных клеток, но только уменьшило амплитуду ON-биполярных клеток в смешанном фоторецепторе и реакции ON-биполярных клеток. (B) Снижение скорости перфузии с 2,1 мл/мин до 0,6 мл/мин привело к снижению амплитуд фоторецепторов и ON-биполярных клеток, но не к изменению кинетики ответа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Реакции ON-биполярных клеток более чувствительны к прекращению перфузии. (A) Большие ответы фоторецепторов и ON-биполярных клеток регистрировались после перфузии с 2,1 мл / мин в течение 20 мин. (B) После прекращения перфузии в течение 10 мин с последующей реперфузией в течение 10 мин при 2,1 мл / мин присутствовали реакции фоторецепторов, тогда как ответы ON-биполярных клеток были полностью потеряны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Первоначально разработанный в 1865 году Холмгреном для измерения световых реакций сетчатки от амфибиисетчатки 10, технические ограничения первоначально препятствовали широкому использованию ERG. Тем не менее, основополагающие исследования Рагнара Гранита и других выявили клеточное происхождение ЭРГ и измерили фоторецепторные и ON-биполярные клеточные реакции ex vivo 11,12,13. С тех пор усовершенствованные методы позволили более широко использовать записи ex vivo ERG14,15, хотя амплитуды ответа, особенно из ON-биполярных клеток, оставались сравнительно небольшими16. Чтобы преодолеть эти ограничения, функция сетчатки сегодня чаще измеряется с помощью in vivo ERG, несмотря на экспериментальные ограничения и более сложную интерпретацию зарегистрированных форм сигналов. Хотя ex vivo ERG пытается воспроизвести физиологические состояния как можно ближе, он, тем не менее, измеряет функцию сетчатки в искусственной среде и при отсутствии системных факторов и патологических изменений. Однако в сочетании с IN VIVO ERG это ограничение может быть использовано для ответа на важные вопросы, например, являются ли изменения в функции сетчатки при заболевании присущи клеткам сетчатки или вызваны системными изменениями17.
Недавно недавно разработанные держатели образцов ex vivo ERG упростили методологию, сделав ex vivo ERG доступным для более широкого исследовательского сообщества 2,3,5,18. Модификации существующего патч-зажима или многоэлектродного оборудования, описанного в этом протоколе, позволят большему количеству лабораторий выполнять EX VIVO ERG с минимальными финансовыми вложениями и требованиями к пространству. В частности, последние разработки в технологии ex vivo ERG усилили реакцию изолированных сетчаток млекопитающих и привели к превосходному соотношению сигнал/шум, которое остается хорошим, несмотря на дополнительные этапы усиления, описанные в этом протоколе. Тем не менее, снижение световых реакций, главным образом от ON-биполярных клеток19, возможно, препятствует более широкому использованию EX VIVO ERG. Использование среды Эймса или Локка приводит к более крупным фоторецепторным и ON-биполярным клеточным ответам, что делает их предпочтительными, например, по сравнению с HEPES-буферизованным раствором Рингера для ex vivo ERG3. Другие лаборатории стабилизировали ex vivo ON-биполярную функцию клеток путем добавления глутамина или глутамата19. В этом отчете показано, как получить большие и стабильные световые реакции от изолированных сетчаток, в том числе от глаз донора человека, как сообщалось ранее8.
К важным экспериментальным параметрам можно отнести температуру сетчатки, которую следует держать в пределах физиологического диапазона, и быструю скорость перфузии. Наиболее заметными эффектами снижения температуры в держателе образца ex vivo ERG являются более медленная кинетика ответа как в фоторецепторах, так и в ON-биполярных клетках и ослабленная Амплитуда ON-биполярных клеток. Хотя снижение температуры, по-видимому, мало влияет на амплитуду фоторецептора в комбинированном ответе фоторецепторов и ON-биполярных клеток, это может быть артефактом из-за дифференциальных изменений кинетики ответа от обоих типов клеток.
Достаточная скорость перфузии, по-видимому, особенно важна для функции сетчатки, скорее всего, для снабжения кислородом и питательными веществами и удаления отходов. В то время как амплитуды фоторецепторных и ON-биполярных клеток несколько уменьшаются за счет умеренного снижения скорости перфузии, даже короткое прекращение перфузии отменяет ON-биполярную, но не фоторецепторную функцию. Это означает, что реакции фоторецепторов более надежны и могут быть легче сохранены в глазах, которые подвергаются экспериментам со значительной задержкой, таких как глаза донора человека8. В этом контексте примечательно, что функция ON-биполярных клеток не уменьшается при хранении глазных чашек в насыщенной кислородом среде Эймса в течение нескольких часов. Поэтому мы предполагаем, что потеря функции ON-биполярных клеток при остановке перфузии в держателе образца ex vivo может быть вызвана быстрым истощением кислорода и других питательных веществ в небольшом объеме, окружающем сетчатку в держателе образца. Это подтверждается сообщениями о том, что короткая задержка от смерти до энуклеации имеет решающее значение для регистрации реакций фоторецепторов и, в частности, ON-биполярных клеток от сетчатки человека, и что посмертная гипоксия является наиболее вероятным кандидатом на необратимое повреждение функции нейронов сетчатки8. В то время как экспериментальные параметры для ex vivo ERG были оптимизированы в сетчатке мыши, они, тем не менее, успешно улучшили условия записи образцов сетчатки от крупных животных и глаз доноров человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ни у одного из авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами Национального института глаз EY02665 и EY031706 и Международным фондом исследований сетчатки доктору Винбергу, основным грантом Национальных институтов здравоохранения (EY014800) и неограниченным грантом от исследований по предотвращению слепоты, Нью-Йорк, нью-йорк, департаменту офтальмологии и визуальных наук Университета штата Юта. Д-р Франс Винберг также является лауреатом исследования по предотвращению слепоты / Dr. H. James and Carole Free Career Development Award, а д-р Силке Беккер - гранта ARVO EyeFind. Мы благодарим д-ра Энн Ханнекен из Научно-исследовательского института Скриппса за предоставление донорского глаза, используемого для записей, показанных на рисунке 2E.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mm socket | WPI | 2026-10 | materials to prepare electrode |
| Ag/AgCl Electrode | World Precision Instruments | EP1 | materials to prepare electrode |
| Ames' medium | Sigma Aldrich | A1420 | perfusion media |
| barium chloride | Sigma Aldrich | B0750 | potassium channel blocker |
| DL-AP4 | Tocris | 0101 | broad spectrum glutamatergic antagonist |
| OcuScience Ex Vivo ERG Adapter | OcuScience | n/a | ex vivo ERG specimen holder |
| Threaded luer connector | McMaster-Carr | 51525K222 or 51525K223 | materials to prepare electrode |
References
- Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , (1995).
- Bonezzi, P. J., Tarchick, M. J., Renna, J. M. Ex vivo electroretinograms made easy: performing ERGs using 3D printed components. Journal of Physiology. 598 (21), 4821-4842 (2020).
- Vinberg, F., Kefalov, V. Simultaneous ex vivo functional testing of two retinas by in vivo electroretinogram system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52855 (2015).
- Heckenlively, J. R., Arden, G. B. Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision. , MIT Press. (2006).
- Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Research. 101, 108-117 (2014).
- Winkler, B. S. Calcium and the fast and slow components of P3 of the electroretinogram of the isolated rat retina. Vision Research. 14 (1), 9-15 (1974).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs. Visual Neuroscience. 16 (4), 727-741 (1999).
- Abbas, F., et al. Revival of light signalling in the postmortem mouse and human retina. Nature. , (2022).
- Becker, S., Carroll, L. S., Vinberg, F. Diabetic photoreceptors: Mechanisms underlying changes in structure and function. Visual Neuroscience. 37, (2020).
- Kantola, L., Piccolino, M., Wade, N. J. The action of light on the retina: Translation and commentary of Holmgren (1866). Journal of the History of the Neurosciences. 28 (4), 399-415 (2019).
- Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161 (3840), 487-489 (1968).
- Hamasaki, D. I. The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog. Journal of Physiology. 167 (1), 156-168 (1963).
- Granit, R. The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve. Journal of Physiology. 77 (3), 207-239 (1933).
- Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria). Acta Physiologica Scandinavica. 134 (4), 535-541 (1988).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision Research. 39 (13), 2165-2177 (1999).
- Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Research Protocols. 16 (1-3), 27-36 (2005).
- Becker, S., Carroll, L. S., Vinberg, F. Rod phototransduction and light signal transmission during type 2 diabetes. BMJ Open Diabetes Research and Care. 8 (1), 001571 (2020).
- Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (6), 2583-2588 (2006).
- Winkler, B. S., Kapousta-Bruneau, N., Arnold, M. J., Green, D. G. Effects of inhibiting glutamine synthetase and blocking glutamate uptake on b-wave generation in the isolated rat retina. Visual Neuroscience. 16 (2), 345-353 (1999).
