Summary
Modificatie van bestaande multi-elektrode array of patch clamp apparatuur maakt het ex vivo elektroretinogram breder toegankelijk. Verbeterde methoden om ex vivo lichtresponsen te registreren en te onderhouden vergemakkelijken de studie van fotoreceptor en ON-bipolaire celfunctie in het gezonde netvlies, diermodellen van oogziekten en menselijke donorvliezen.
Abstract
Metingen van retinale neuronale lichtresponsen zijn van cruciaal belang voor het onderzoeken van de fysiologie van het gezonde netvlies, het bepalen van pathologische veranderingen in retinale ziekten en het testen van therapeutische interventies. Het ex vivo elektroretinogram (ERG) maakt de kwantificering van bijdragen van individuele celtypen in het geïsoleerde netvlies mogelijk door toevoeging van specifieke farmacologische middelen en evaluatie van weefselintrinsieke veranderingen onafhankelijk van systemische invloeden. Retinale lichtresponsen kunnen worden gemeten met behulp van een gespecialiseerde ex vivo ERG-monsterhouder en opname-opstelling, aangepast van bestaande patchklem of micro-elektrode array-apparatuur. Met name de studie van ON-bipolaire cellen, maar ook van fotoreceptoren, werd belemmerd door de langzame maar progressieve afname van lichtresponsen in de ex vivo ERG in de loop van de tijd. Verhoogde perfusiesnelheid en aanpassing van de perfusaattemperatuur verbeteren de ex vivo retinale functie en maximaliseren de responsamplitude en stabiliteit. De ex vivo ERG maakt op unieke wijze de studie van individuele retinale neuronale celtypen mogelijk. Bovendien maken verbeteringen om responsamplitudes en stabiliteit te maximaliseren het onderzoek van lichtreacties in netvliesmonsters van grote dieren mogelijk, evenals menselijke donorogen, waardoor de ex vivo ERG een waardevolle aanvulling is op het repertoire van technieken die worden gebruikt om de retinale functie te onderzoeken.
Introduction
Elektroretinografie meet de retinale functie als reactie op licht1. Het is een integraal onderdeel van het bestuderen van retinale fysiologie en pathofysiologie, en het meten van het succes van therapieën voor retinale ziekten. De in vivo ERG wordt veel gebruikt om de retinale functie in intacte organismen te beoordelen, maar heeft significante beperkingen 2,3. Onder deze wordt de kwantitatieve analyse van individuele retinale celtypen in de in vivo ERG belemmerd, omdat het de som van potentiële veranderingen registreert, en dus overlappende reacties, van alle retinale cellen naar lichtstimuli4. Bovendien staat het niet gemakkelijk toevoeging van geneesmiddelen aan het netvlies toe, is het kwetsbaar voor systemische invloeden en heeft het een relatief lage signaal-ruisverhouding. Deze nadelen worden geëlimineerd in de ex vivo ERG die de functie van het geïsoleerde netvliesonderzoekt 2,3,5,6. De ex vivo ERG maakt de registratie mogelijk van grote en stabiele reacties van specifieke retinale celtypen door toevoeging van farmacologische remmers en eenvoudige evaluatie van therapeutische middelen, die aan het superfusaat kunnen worden toegevoegd. Tegelijkertijd verwijdert het invloeden van systemische effecten en elimineert het fysiologische ruis (bijv. Hartslag of ademhaling).
In de ex vivo ERG worden netvliezen of retinale monsters geïsoleerd en aan de zijkant van de fotoreceptor gemonteerd op de koepel van de monsterhouder 3,5. De monsterhouder wordt geassembleerd, verbonden met een perfusiesysteem dat het netvlies voorziet van verwarmde, zuurstofrijke media en op het podium van een microscoop geplaatst, die is aangepast om computergestuurde lichtstimuli te leveren. Om de reacties die door licht worden opgewekt vast te leggen, is de monsterhouder aangesloten op een versterker, digitizer en opnamesysteem (figuur 1). Deze techniek maakt isolatie van reacties van staaf- en kegelfotoreceptoren, ON-bipolaire cellen en Müller-glia mogelijk door de parameters van de lichtprikkels te veranderen en farmacologische middelen toe te voegen.
Een bestaande patchklem of multi-electrode array (MEA) opstelling kan worden geconverteerd om ex vivo ERG te registreren, hetzij in combinatie met een in de handel verkrijgbare ex vivo ERG-adapter of een aangepaste polycarbonaat computer numerieke controle (CNC) -gefreesde monsterhouder, om lichtreacties in netvliezen van kleine diermodellen, zoals muizen, te meten. Deze wijziging verhoogt de toegankelijkheid van ex vivo ERG terwijl de behoefte aan gespecialiseerde apparatuur wordt geminimaliseerd. Het ontwerp van de monsterhouder vereenvoudigt de montagetechniek en integreert elektroden, waardoor manipulatie van micro-elektroden in vergelijking met eerder gerapporteerde transretinale ex vivo ERG-methoden7 wordt geëlimineerd. De perfusiesnelheid en temperatuur in de monsterhouder zijn belangrijke factoren die de responseigenschappen van fotoreceptoren en ON-bipolaire cellen beïnvloeden. Door deze omstandigheden aan te passen, kan de ex vivo ERG gedurende langere tijd betrouwbaar worden geregistreerd vanaf het geïsoleerde netvlies van de muis. Geoptimaliseerde experimentele omstandigheden maken ex vivo ERG-opnames mogelijk in retinale stoten van grotere netvliezen, waaronder grote dierenogen en menselijke donorogen8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten met muizen werden uitgevoerd in overeenstemming met de NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Studies Committee aan de Universiteit van Utah. Varkensogen voor demonstratie van deze video werden postmortaal verkregen van het slachthuis (Sustainable Swine Resources, Johnsonville). Ogen werden verkregen van menselijke donoren na hersen- of hartdood met toestemming voor onderzoeksgebruik via de Utah Lions Eye Bank, de San Diego Eye Bank of Lifesharing, die volledig zijn geaccrediteerd door de FDA, de Association of Organ Procurement Organizations (AOPO) en de Eye Banks of America Association. Het gebruik van menselijke donorogen had een vrijgestelde status aan de Universiteit van Utah (IRB nr. 00106658) en ScrippsHealth IRB (IRB nr. 16-6781).
1. Het opzetten van de ex vivo ERG
- Om een multi-elektrode array-opstelling om te zetten, sluit u de ex vivo ERG-monsterhouder via een koptrap aan op een differentiële versterker, die is aangesloten op de analoge ingang van de interfacekaart van het multi-elektrodearraysysteem. Gebruik de opnamesoftware voor de multi-elektrode array om de invoergegevens van de ex vivo ERG op te nemen en op te slaan. Stel de versterking van de differentiële versterker in op 100 en voeg een extra 10x spanningsversterking toe, afhankelijk van de specificaties van de digitizer. Stel het laagdoorlaatfilter in op 100 Hz.
- Om een patchklemopstelling om te zetten, sluit u de ex vivo ERG-monsterhouder via een hoofdtrap aan op een differentiële versterker, die is aangesloten op de koptrap van de patchklemversterker. Gebruik de patchklemsysteemsoftware en digitizer om de invoergegevens van de ex vivo ERG op te nemen en op te slaan. Stel de versterking van de differentiële versterker in op 100 en pas een extra 10x spanningsversterking toe via de patchklemkoptrap. Stel het laagdoorlaatfilter in op 100 Hz.
- Verbind LED's met de juiste golflengten (bijv. Ongeveer 530 nm om staaffotoreceptor en ON-bipolaire celresponsen uit te lokken) op de microscoop. Bedien de LED's met opnamesoftware die het activeren van lichtprikkels mogelijk maakt. Om lichtprikkels te regelen, gebruikt u een LED-driver die wordt bestuurd door analoge uitgangen van een digitizer.
- Kalibreer de lichtopbrengst van de LED's op de positie van het netvlies in de monsterhouder met behulp van een fotodiode. Plaats indien nodig neutrale dichtheidsfilters in het lichtpad om de lichtintensiteit te dimmen.
- Gebruik een in de handel verkrijgbare of op maat gemaakte ex vivo ERG-monsterhouder.
OPMERKING: Tekeningen voor CNC-bewerking uit polycarbonaat kunnen op verzoek bij de auteurs worden verkregen. - Om de elektrode voor te bereiden, plaatst u een Ag/AgCl-pelletelektrode in een luerconnector met schroefdraad. Vul de binnenkant van de luerconnector met hete lijm en steek een 2 mm-aansluiting in de hete lijm vanaf de niet-schroefdraadzijde. Soldeer een zilveren draad van de EP1-elektrode aan de 2 mm-aansluiting. Schroef de afgewerkte elektrode, met een o-ring aan de schroefdraad, in de elektrodepoorten van de ex vivo ERG-monsterhouder.
OPMERKING: Elektroden kunnen lange tijd worden gebruikt. Als het pelletoppervlak vuil ophoopt en/of donker wordt (dit kan een hoge offsetspanning en/of elektrische drift veroorzaken), kan het worden "gepolijst" met fijn schuurpapier. - Lijm ten minste 1 dag voorafgaand aan het experimenteren filterpapier op de koepels van de ex vivo ERG-monsterhouder met epoxylijm, zodat de lijm het elektrodekanaal niet belemmert (zie 3 voor video).
2. Voorbereiding van dieren
- Donkere dieren passen zich aan gedurende ten minste 6 uur of 's nachts.
3. Voorbereiding van de apparatuur
- Vul de perfusielijn van de ex vivo ERG met het medium van Ames met 5% koolstofdioxide en 95% zuurstof. Sluit de perfusieleiding aan op een verwarmingselement met een gelijkstroombron of warmteregelaar in de buurt van de monsterhouder om het medium van Ames te verwarmen, zodat het netvlies op ongeveer 35-38 °C wordt gehouden.
- Vul beide helften van de ex vivo ERG-monsterhouder met elektrodeoplossing, sluit de perfusielijn af met luerstoppers, sluit de elektroden aan en monteer de monsterhouder met vier schroeven (zie 3 voor video).
- Controleer de weerstand en offsetspanning tussen de elektroden in de geassembleerde monsterhouder door de sondes van de multimeter in de elektroden te steken.
OPMERKING: Als er geen verstoppingen zijn en elektroden in goede staat zijn, moet de weerstand lager zijn dan 100 kΩ en de offsetspanning lager dan 5 mV. - Sluit de geassembleerde monsterhouder aan op de perfusielijn en plaats deze op het podium van een microscoop die is ingesteld om lichtflitsen af te geven. Zorg ervoor dat de monsterhouder en de perfusielijn geen luchtbellen bevatten.
4. Weefselvoorbereiding
- Offer het dier met CO2 en geef onmiddellijk de ogen op, of verkrijg grote dierlijke of menselijke donorogen.
- Reinig de bol van het resterende bindweefsel en extraoculaire spieren. Snijd de oogzenuw af.
- Plaats op filterpapier voorzichtig een kleine incisie met een scheermesje langs de ora serrata, ongeveer 1 mm van de limbus in het muizenoog. Steek een fijne vannasschaar in de incisie en knip langs de limbus om het voorste deel van het oog met de lens te verwijderen.
- Plaats de oogschelp in een schaal met het medium van Ames. Pak de sclera vast met een fijne tang en zorg ervoor dat je het netvlies niet aanraakt. Plaats een vannasschaar tussen het netvlies en de sclera en knip de sclera van het perifere naar het centrale deel. Zorg ervoor dat u het netvlies niet aanraakt of beschadigt.
- Immobiliseer de sclera door één kant van de incisie met een vannasschaar tegen de onderkant van de dissectieschaal te houden. Pak de sclera vast met een tang aan de andere kant van de incisie. Verwijder de sclera zonder het netvlies aan te raken of te beschadigen door de sclera aan weerszijden van de incisie uit elkaar te trekken om isolatie van het netvlies mogelijk te maken met minimale schade aan het weefsel.
- Verwijder het voorste segment met de lens van het medeoog en bewaar de oogschelp bij kamertemperatuur in de oplossing van Ames met 5% koolstofdioxide en 95% zuurstof.
OPMERKING: Functionele lichtreacties van ogen die op deze manier zijn opgeslagen, kunnen enkele uren worden verkregen. - In grote ogen, inclusief menselijke donorogen, reinigt u de bol van het resterende bindweefsel en verwijdert u het voorste segment en de lens, vergelijkbaar met de procedure die is beschreven voor het muizenoog. Gebruik een scalpel om een snee te maken op ongeveer 3 mm van de limbus. Steek een gebogen dissectieschaar in de incisie en knip langs de limbus om het voorste deel van het oog met de lens te verwijderen. Verkrijg retinale monsters voor ex vivo elektroretinografie met een 3-6 mm wegwerpbiopsie punch.
5. Montage van het weefsel op de monsterhouder
- Plaats de onderste helft van de monsterhouder in een grote petrischaal en vul met zuurstofrijk Ames' medium, zodat de koepel van de monsterhouder gewoon onder water staat.
- Pak de rand van het netvlies voorzichtig vast met een fijne tang en breng het netvlies over op de koepel van de ex vivo monsterhouder, fotoreceptorzijde naar boven gericht.
- Til de monsterhouder uit de oplossing van de Ames en zorg ervoor dat het netvlies op zijn plaats blijft.
- Droog de plaat van de monsterhouder volledig om ruis, elektrische overspraak en signaal rangeren te minimaliseren.
- Monteer beide helften van de monsterhouder met vier schroeven en sluit de perfusielijn aan. Droog de elektrode in de onderste helft van de monsterhouder en sluit de anodekabel aan op de binnenste retinale kant en de kathodekabel op de fotoreceptorzijde.
- Perfuseer de monsterhouder met ten minste 1 ml/min zuurstofrijk Ames's medium gedurende 10-20 minuten om de lichtrespons te stabiliseren.
6. Registratie van retinale neuronale celfunctie
- Registreer responsfamilies door het netvlies bloot te stellen aan lichtflitsen van toenemende intensiteit. Registreer bijvoorbeeld fotoreceptorresponsfamilies van muizenstaafjes met lichtintensiteiten variërend van ongeveer 10 tot 1.000 fotonen / μm2 en die van muis ON-bipolaire cellen met lichtintensiteiten variërend van ongeveer 0,6 tot 20 fotonen / μm2.
- Meet fotoreceptorlichtreacties (a-golf) in aanwezigheid van 100 μM bariumchloride, dat kaliumkanalen in Müller-gliacellen blokkeert, en 40 μM DL-AP4, dat glutamaterge signaaloverdracht naar ON-bipolaire cellen blokkeert (figuur 2B).
- Om de b-golf te isoleren, die afkomstig is van de functie van de ON-bipolaire cellen, registreert u eerst gecombineerde lichtresponsen van zowel fotoreceptor- als ON-bipolaire cellen in aanwezigheid van bariumchloride alleen (figuur 2A). Perfuseer vervolgens gedurende 5-10 minuten met het medium van Ames dat bariumchloride bevat, evenals DL-AP4, en registreer fotoreceptorreacties op dezelfde lichtstimuli als voorheen (figuur 2B). Trek fotoreceptorreacties af van gecombineerde fotoreceptor- en ON-bipolaire celresponsen, waardoor alleen ON-bipolaire cellichtresponsen worden berekend (figuur 2C).
7. Optimaliseren van on-bipolaire celfunctie
OPMERKING: De b-golf, die afkomstig is van de ON-bipolaire cellen, is zeer gevoelig voor de temperatuur in de monsterhouder en de perfusiesnelheid.
- Houd een perfusiesnelheid van ten minste 0,5 ml / min aan om de b-golf te verkrijgen.
OPMERKING: Een hogere perfusiesnelheid van 1-2 ml / min heeft de voorkeur om een grote en stabiele respons van ON-bipolaire cellen te behouden. - Zorg ervoor dat voor een bepaalde perfusiesnelheid de temperatuur in de monsterhouder in de buurt van het netvlies dicht bij de lichaamstemperatuur ligt (d.w.z. ongeveer 35-38 °C).
OPMERKING: Het is belangrijk om de temperatuur van het perfusaat, dat wordt verwarmd voordat het de ex vivo ERG-monsterhouder bereikt, aan te passen, zodat het zich binnen het optimale temperatuurbereik op het netvlies bevindt. - Bewaar oogschelpen voor latere experimenten beschermd tegen licht en in zuurstofrijk Ames's medium bij kamertemperatuur om normale a- en b-golven gedurende enkele uren te behouden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ex vivo ERG maakt het mogelijk om reproduceerbare en stabiele fotoreceptor- en ON-bipolaire cellichtresponsen te registreren, bijvoorbeeld vanaf het netvlies van de muis (figuur 2A-C). Registratie van fotoreceptorreacties van menselijke donorvliezen is mogelijk met een postmortale vertraging van enucleatie tot 5 uur (figuur 2D) en van ON-bipolaire celresponsen met een enucleatievertraging van < 20 minuten (figuur 2E). Belangrijke parameters om grote responsen te verkrijgen zijn een zorgvuldige dissectietechniek, een hoge perfusiesnelheid en een perfusietemperatuur die dicht bij fysiologische waarden ligt (35-38 °C in het netvlies van zoogdieren). Onder deze omstandigheden waren responsamplitudes en kinetiek in beide celtypen relatief stabiel in de loop van de tijd, maar namen langzaam af ongeveer 40-45 minuten nadat netvliezen op de monsterhouder waren gemonteerd (figuur 3).
In vergelijking met fotoreceptoren wordt de ON-bipolaire celfunctie gemakkelijker verstoord, bijvoorbeeld door schade aan het netvlies tijdens dissectie en montage of door een daling van de temperatuur en/ of perfusiesnelheid. Terwijl de verlaagde temperatuur in de monsterhouder de kinetiek van zowel fotoreceptoren als ON-bipolaire cellen sterk vertraagde, verminderde het de amplitude van de b-golf, maar niet de a-golf (figuur 4A). Omgekeerd verminderde het vertragen van de perfusiesnelheid van 2,1 ml / min naar 0,6 ml / min de amplitudes van zowel fotoreceptor- als ON-bipolaire celresponsen, maar had geen invloed op de impliciete tijd (tijd van stimulusbegin tot responspiek) van de a- of de b-golf (figuur 4B). Stopzetting van de perfusie gedurende 10 minuten gevolgd door reperfusie resulteerde in een volledig verlies van ON-bipolaire celfunctie met geconserveerde fotoreceptorresponsen (figuur 5).
Figuur 1: Ex vivo elektroretinogram monsterhouder en opname-opstelling. (A,B) De ex vivo ERG-monsterhouder bestaat uit een koepel om het geïsoleerde netvlies te monteren, dat is verbonden met een perfusielijn om continu het medium van Ames af te leveren. Elektroden zijn via smalle kanalen verbonden met zowel de fotoreceptorzijde van het netvlies via de perfusielijn als het binnenste netvlies door het filterpapier dat aan de koepel is gelijmd. Deze elektroden zijn verbonden met een differentiële versterker, die het mogelijk maakt om potentiaalverschillen in het netvlies te meten als reactie op lichtprikkels. (C) De monsterhouder wordt op het podium van een microscoop geplaatst, die is aangepast om lichtflitsen af te geven en verbonden is met de perfusielijn, die door de zwaartekracht verwarmd, zuurstofrijk Ames-medium afgeeft. De hele opname-opstelling wordt afgeschermd door een kooi van Faraday om elektrische ruis te minimaliseren. Dit cijfer is gewijzigd van 9. Afkorting: ERG = electroretinogram. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Voorbeeldsporen van ex vivo fotoreceptor en ON-bipolaire celresponsen. Toevoeging van farmacologische middelen aan het perfusaat maakt kwantificering van bijdragen van individuele retinale celtypen aan het ex vivo elektroretinogram mogelijk. Fotoreceptor (PR) lichtresponsen worden geïsoleerd in de aanwezigheid van 100 μM bariumchloride (BaCl2), een blokker van K+ kanalen uitgedrukt door Müller-gliacellen, evenals 40 μM DL-AP4, een glutamaatreceptorblokker, die de signaaloverdracht van fotoreceptoren naar ON-bipolaire cellen (B) remt. DE ON-bipolaire celfunctie (ON-BPC) (C) wordt bepaald door de fotoreceptorcomponent (B) af te trekken van de gecombineerde fotoreceptor en DE ON-bipolaire celrespons in aanwezigheid van bariumchloride alleen (A). Fotoreceptorlichtreacties kunnen worden verkregen van menselijke donorvliezen met een dood tot enucleatievertraging van <5 uur (D), terwijl netvliezen die binnen 20 minuten na overlijden worden geëucleteerd vaak ook ON-bipolaire celresponsen (E) geven (zie 8 voor meer informatie). Figuur 2A-C is gewijzigd van 9. Afkortingen: PR = fotoreceptor; ON-BPC = ON-bipolaire cel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Stabiliteit van de fotoreceptor en de ON-bipolaire celfunctie in het ex vivo elektroretinogram in de loop van de tijd. (A) Lichtresponsen werden elke minuut geregistreerd van fotoreceptoren alleen in aanwezigheid van zowel 100 μM bariumchloride als 40 μM DL-AP4. (B) Zwakke lichtflitsen in aanwezigheid van 100 μM bariumchloride alleen worden sterk gedomineerd door de ON-bipolaire celfunctie, hoewel ze een kleine fotoreceptorcomponent bevatten. Lichtresponsen van geïsoleerde netvliezen stabiliseren meestal na het perfuseren van de ex vivo monsterhouder gedurende 15-20 minuten en waren stabiel gedurende ten minste 20-25 minuten voordat ze begonnen af te nemen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Gecombineerde fotoreceptor- en ON-bipolaire celresponsen bij verschillende temperaturen en perfusiesnelheden. (A) Verlaging van de temperatuur in de monsterhouder van 37 °C tot kamertemperatuur vertraagde de fotoreceptor en ON-bipolaire celkinetiek sterk, maar verminderde alleen de ON-bipolaire celamplitude in de gemengde fotoreceptor en ON-bipolaire celrespons. (B) Verlaging van de perfusiesnelheid van 2,1 ml/min naar 0,6 ml/min resulteerde in verminderde fotoreceptor- en ON-bipolaire celamplitudes, maar geen verandering in de responskinetiek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: ON-bipolaire celresponsen zijn gevoeliger voor het stoppen met perfusie. (A) Grote fotoreceptor- en ON-bipolaire celresponsen werden geregistreerd na perfusie met 2,1 ml/min gedurende 20 minuten. (B) Na stopzetting van de perfusie gedurende 10 minuten gevolgd door reperfusie gedurende 10 minuten bij 2,1 ml/min, waren fotoreceptorresponsen aanwezig, terwijl on-bipolaire celresponsen volledig verloren gingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Oorspronkelijk ontwikkeld in 1865 door Holmgren om retinale lichtresponsen van het netvlies van amfibieën te meten10, verhinderden technische beperkingen aanvankelijk dat de ERG op grote schaal werd gebruikt. Niettemin identificeerden baanbrekende studies door Ragnar Granit en anderen de cellulaire oorsprong van de ERG en maten fotoreceptor en ON-bipolaire celresponsen ex vivo 11,12,13. Sindsdien hebben verfijnde methoden een wijdverbreider gebruik van ex vivo ERG-opnames14,15 mogelijk gemaakt, hoewel responsamplitudes, met name die van ON-bipolaire cellen, relatief kleinbleven 16. Om deze beperkingen te overwinnen, wordt de retinale functie tegenwoordig vaker gemeten met in vivo ERG, ondanks experimentele beperkingen en meer gecompliceerde interpretatie van de geregistreerde golfvormen. Hoewel de ex vivo ERG probeert fysiologische omstandigheden zo goed mogelijk te repliceren, meet het toch de retinale functie in een kunstmatige omgeving en bij afwezigheid van systemische factoren en pathologische veranderingen. In combinatie met de in vivo ERG kan deze beperking echter worden gebruikt om belangrijke vragen te beantwoorden, zoals of veranderingen in de retinale functie bij ziekte intrinsiek zijn aan retinale cellen of worden veroorzaakt door systemische veranderingen17.
Onlangs hebben nieuw ontworpen ex vivo ERG-monsterhouders de methodologie vereenvoudigd, waardoor de ex vivo ERG toegankelijk is geworden voor een bredere onderzoeksgemeenschap 2,3,5,18. Aanpassingen aan bestaande patchklem- of multi-elektrode-arrayapparatuur die in dit protocol wordt beschreven, zullen meer laboratoria in staat stellen om ex vivo ERG uit te voeren met minimale financiële investeringen en ruimtevereisten. Met name recente ontwikkelingen in ex vivo ERG-technologie hebben het reactievermogen van geïsoleerde netvliezen van zoogdieren versterkt en geresulteerd in een superieure signaal-ruisverhouding, die goed blijft ondanks aanvullende versterkingsstappen die in dit protocol worden beschreven. Niettemin heeft de afname van de lichtresponsen, voornamelijk van ON-bipolaire cellen19, misschien het meer wijdverspreide gebruik van de ex vivo ERG belemmerd. Het gebruik van het medium van Ames of Locke resulteert in grotere fotoreceptor- en ON-bipolaire celresponsen, waardoor ze de voorkeur verdienen boven bijvoorbeeld HEPES-gebufferde Ringer-oplossing voor ex vivo ERG3. Andere laboratoria stabiliseerden ex vivo ON-bipolaire celfunctie door aan te vullen met glutamine of glutamaat19. Dit rapport laat zien hoe grote en stabiele lichtreacties kunnen worden verkregen van geïsoleerde netvliezen, inclusief van menselijke donorogen, zoals eerder gemeld8.
Belangrijke experimentele parameters zijn de temperatuur van het netvlies, die binnen het fysiologische bereik moet worden gehouden, en een snelle perfusiesnelheid. De meest opvallende effecten van het verlagen van de temperatuur in de ex vivo ERG-monsterhouder zijn tragere responskinetiek in zowel fotoreceptoren als ON-bipolaire cellen en een verzwakte ON-bipolaire celamplitude. Hoewel het verlagen van de temperatuur weinig effect lijkt te hebben op de amplitude van de fotoreceptor in de gecombineerde respons van fotoreceptoren en ON-bipolaire cellen, kan dit een artefact zijn als gevolg van differentiële veranderingen in de responskinetiek van beide celtypen.
Een voldoende perfusiesnelheid lijkt vooral van cruciaal belang te zijn voor de retinale functie, met de meeste kans om zuurstof en voedingsstoffen te leveren en afvalproducten te verwijderen. Terwijl zowel fotoreceptor als ON-bipolaire celamplitudes enigszins worden verminderd door een matige vermindering van de perfusiesnelheid, schafte zelfs een korte stopzetting van de perfusie de ON-bipolaire maar niet fotoreceptorfunctie af. Dit impliceert dat fotoreceptorreacties robuuster zijn en gemakkelijker kunnen worden bewaard in ogen die experimenten ondergaan met een aanzienlijke vertraging, zoals menselijke donorogen8. In deze context is het opmerkelijk dat de ON-bipolaire celfunctie niet wordt verminderd door oogcups gedurende enkele uren in zuurstofrijk Ames's medium te bewaren. We veronderstellen daarom dat het verlies van ON-bipolaire celfunctie wanneer de perfusie in de ex vivo monsterhouder wordt gestopt, te wijten kan zijn aan een snelle uitputting van zuurstof en andere voedingsstoffen in het kleine volume rond het netvlies in de monsterhouder. Dit wordt ondersteund door rapporten dat een korte vertraging van dood tot enucleatie van cruciaal belang is om fotoreceptor en, in het bijzonder, ON-bipolaire celreacties van menselijke netvliezen vast te leggen, en dat postmortale hypoxie de meest waarschijnlijke kandidaat is voor onomkeerbare schade aan de retinale neuronale functie8. Hoewel experimentele parameters voor ex vivo ERG werden geoptimaliseerd in het netvlies van muizen, verbeterden ze niettemin met succes de opnameomstandigheden voor retinale monsters van grote dieren en menselijke donorogen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen van de auteurs heeft belangenconflicten bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door national eye institute subsidies EY02665 en EY031706 en International Retinal Research Foundation aan Dr. Vinberg, National Institutes of Health Core Grant (EY014800), en een onbeperkte subsidie van onderzoek om blindheid te voorkomen, New York, NY, aan de afdeling oogheelkunde en visuele wetenschappen, Universiteit van Utah. Dr. Frans Vinberg is ook een ontvanger van een Research to Prevent Blindness / Dr. H. James and Carole Free Career Development Award, en Dr. Silke Becker van een ARVO EyeFind-beurs. We bedanken Dr. Anne Hanneken van The Scripps Research Institute voor het verstrekken van het donoroog dat wordt gebruikt voor opnames in figuur 2E.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mm socket | WPI | 2026-10 | materials to prepare electrode |
| Ag/AgCl Electrode | World Precision Instruments | EP1 | materials to prepare electrode |
| Ames' medium | Sigma Aldrich | A1420 | perfusion media |
| barium chloride | Sigma Aldrich | B0750 | potassium channel blocker |
| DL-AP4 | Tocris | 0101 | broad spectrum glutamatergic antagonist |
| OcuScience Ex Vivo ERG Adapter | OcuScience | n/a | ex vivo ERG specimen holder |
| Threaded luer connector | McMaster-Carr | 51525K222 or 51525K223 | materials to prepare electrode |
References
- Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , (1995).
- Bonezzi, P. J., Tarchick, M. J., Renna, J. M. Ex vivo electroretinograms made easy: performing ERGs using 3D printed components. Journal of Physiology. 598 (21), 4821-4842 (2020).
- Vinberg, F., Kefalov, V. Simultaneous ex vivo functional testing of two retinas by in vivo electroretinogram system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52855 (2015).
- Heckenlively, J. R., Arden, G. B. Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision. , MIT Press. (2006).
- Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Research. 101, 108-117 (2014).
- Winkler, B. S. Calcium and the fast and slow components of P3 of the electroretinogram of the isolated rat retina. Vision Research. 14 (1), 9-15 (1974).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs. Visual Neuroscience. 16 (4), 727-741 (1999).
- Abbas, F., et al. Revival of light signalling in the postmortem mouse and human retina. Nature. , (2022).
- Becker, S., Carroll, L. S., Vinberg, F. Diabetic photoreceptors: Mechanisms underlying changes in structure and function. Visual Neuroscience. 37, (2020).
- Kantola, L., Piccolino, M., Wade, N. J. The action of light on the retina: Translation and commentary of Holmgren (1866). Journal of the History of the Neurosciences. 28 (4), 399-415 (2019).
- Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161 (3840), 487-489 (1968).
- Hamasaki, D. I. The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog. Journal of Physiology. 167 (1), 156-168 (1963).
- Granit, R. The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve. Journal of Physiology. 77 (3), 207-239 (1933).
- Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria). Acta Physiologica Scandinavica. 134 (4), 535-541 (1988).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision Research. 39 (13), 2165-2177 (1999).
- Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Research Protocols. 16 (1-3), 27-36 (2005).
- Becker, S., Carroll, L. S., Vinberg, F. Rod phototransduction and light signal transmission during type 2 diabetes. BMJ Open Diabetes Research and Care. 8 (1), 001571 (2020).
- Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (6), 2583-2588 (2006).
- Winkler, B. S., Kapousta-Bruneau, N., Arnold, M. J., Green, D. G. Effects of inhibiting glutamine synthetase and blocking glutamate uptake on b-wave generation in the isolated rat retina. Visual Neuroscience. 16 (2), 345-353 (1999).
