Summary
Die Modifikation bestehender Multielektroden-Array- oder Patch-Clamp-Geräte macht das Ex-vivo-Elektroretinogramm breiter zugänglich. Verbesserte Methoden zur Aufzeichnung und Aufrechterhaltung von Ex-vivo-Lichtantworten erleichtern die Untersuchung der Photorezeptor- und ON-bipolaren Zellfunktion in der gesunden Netzhaut, Tiermodellen von Augenkrankheiten und menschlichen Spendernetzhaut.
Abstract
Messungen der retinalen neuronalen Lichtreaktionen sind entscheidend für die Untersuchung der Physiologie der gesunden Netzhaut, die Bestimmung pathologischer Veränderungen bei Netzhauterkrankungen und das Testen therapeutischer Interventionen. Das ex vivo Elektroretinogramm (ERG) ermöglicht die Quantifizierung von Beiträgen einzelner Zelltypen in der isolierten Netzhaut durch Zugabe spezifischer pharmakologischer Wirkstoffe und die Bewertung gewebeintrinsischer Veränderungen unabhängig von systemischen Einflüssen. Retinale Lichtantworten können mit einem speziellen Ex-vivo-ERG-Probenhalter und Aufnahmeaufbau gemessen werden, der von bestehenden Patchklemmen oder Mikroelektroden-Array-Geräten modifiziert wurde. Insbesondere die Untersuchung von ON-bipolaren Zellen, aber auch von Photorezeptoren, wurde durch den langsamen, aber fortschreitenden Rückgang der Lichtantworten im ex vivo ERG im Laufe der Zeit behindert. Die erhöhte Perfusionsgeschwindigkeit und die Einstellung der Perfusattemperatur verbessern die Ex-vivo-Netzhautfunktion und maximieren die Reaktionsamplitude und -stabilität. Das ex vivo ERG ermöglicht auf einzigartige Weise die Untersuchung einzelner retinaler neuronaler Zelltypen. Darüber hinaus ermöglichen Verbesserungen zur Maximierung der Reaktionsamplituden und -stabilität die Untersuchung von Lichtreaktionen in Netzhautproben von großen Tieren sowie menschlichen Spenderaugen, was das ex vivo ERG zu einer wertvollen Ergänzung des Repertoires an Techniken macht, die zur Untersuchung der Netzhautfunktion verwendet werden.
Introduction
Die Elektroretinographie misst die Netzhautfunktion als Reaktion auf Licht1. Es ist integraler Bestandteil des Studiums der Netzhautphysiologie und Pathophysiologie und der Messung des Erfolgs von Therapien für Netzhauterkrankungen. Das In-vivo-ERG wird häufig zur Beurteilung der Netzhautfunktion in intakten Organismen verwendet, weist jedoch signifikante Einschränkungenauf 2,3. Unter diesen wird die quantitative Analyse einzelner retinaler Zelltypen im in vivo ERG erschwert, da es die Summe der möglichen Veränderungen und damit überlagerten Reaktionen von allen Netzhautzellen zu Lichtreizen aufzeichnet4. Darüber hinaus erlaubt es nicht ohne weiteres die Zugabe von Medikamenten zur Netzhaut, ist anfällig für systemische Einflüsse und hat ein relativ niedriges Signal-Rausch-Verhältnis. Diese Nachteile werden in der ex vivo ERG eliminiert, die die Funktion der isolierten Netzhaut 2,3,5,6 untersucht. Das ex vivo ERG ermöglicht die Aufzeichnung großer und stabiler Reaktionen von spezifischen retinalen Zelltypen durch Zugabe pharmakologischer Inhibitoren und einfache Bewertung von Therapeutika, die dem Superfusat zugesetzt werden können. Gleichzeitig beseitigt es Einflüsse systemischer Effekte und eliminiert physiologische Geräusche (z.B. Herzschlag oder Atmung).
Bei der ex vivo ERG werden Netzhäute oder Netzhautproben isoliert und photorezeptorseitig nach oben auf der Kuppel des Probenhalters 3,5 montiert. Der Probenhalter wird zusammengebaut, mit einem Perfusionssystem verbunden, das die Netzhaut mit erhitzten, sauerstoffhaltigen Medien versorgt, und auf den Tisch eines Mikroskops gestellt, das modifiziert wurde, um computergesteuerte Lichtreize zu liefern. Um die durch Licht hervorgerufenen Reaktionen aufzuzeichnen, wird der Probenhalter an einen Verstärker, einen Digitizer und ein Aufzeichnungssystem angeschlossen (Abbildung 1). Diese Technik ermöglicht die Isolierung von Reaktionen von Stäbchen- und Zapfen-Photorezeptoren, ON-Bipolarzellen und Müller-Glia, indem die Parameter der Lichtstimuli verändert und pharmakologische Wirkstoffe hinzugefügt werden.
Eine vorhandene Patchklemme oder ein Multi-Elektroden-Array (MEA) kann in die Aufzeichnung von Ex-vivo-ERG umgewandelt werden, entweder in Verbindung mit einem handelsüblichen Ex-vivo-ERG-Adapter oder einem benutzerdefinierten CNC-bearbeiteten Probenhalter (Computer Numerical Control) aus Polycarbonat, um Lichtreaktionen in Netzhaut von Kleintiermodellen wie Mäusen zu messen. Diese Modifikation erhöht die Zugänglichkeit von ex vivo ERG und minimiert gleichzeitig den Bedarf an Spezialgeräten. Das Design des Probenhalters vereinfacht die Montagetechnik und integriert Elektroden, wodurch die Notwendigkeit einer Manipulation von Mikroelektroden im Vergleich zu zuvor berichteten transretinalen Ex-vivo-ERG-Methoden entfällt7. Die Perfusionsrate und die Temperatur im Probenhalter sind wichtige Faktoren, die die Reaktionseigenschaften von Photorezeptoren und ON-Bipolarzellen beeinflussen. Durch die Anpassung dieser Bedingungen kann das ex vivo ERG zuverlässig von der isolierten Netzhaut der Maus über längere Zeiträume aufgezeichnet werden. Optimierte experimentelle Bedingungen ermöglichen ex vivo ERG-Aufnahmen in Netzhautstempeln von größeren Netzhäuten, einschließlich großer Tieraugen und menschlicher Spenderaugen8.
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Protocol
Alle Experimente mit Mäusen wurden in Übereinstimmung mit dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und vom Institutional Animal Studies Committee der University of Utah genehmigt. Schweineaugen zur Demonstration dieses Videos wurden postmortal aus dem Schlachthof (Sustainable Swine Resources, Johnsonville) erhalten. Die Augen wurden von menschlichen Spendern nach Hirn- oder Herztod mit Zustimmung zur Forschungsnutzung durch die Utah Lions Eye Bank, die San Diego Eye Bank oder Lifesharing erhalten, die von der FDA, der Association of Organ Procurement Organizations (AOPO) und der Eye Banks of America Association vollständig akkreditiert sind. Die Verwendung menschlicher Spenderaugen hatte Ausnahmestatus an der University of Utah (IRB Nr. 00106658) und ScrippsHealth IRB (IRB Nr. 16-6781).
1. Einrichtung der ex vivo ERG
- Um einen Multielektroden-Array-Aufbau umzuwandeln, verbinden Sie den ex vivo ERG-Probenhalter über eine Kopfstufe mit einem Differenzverstärker, der in den Analogeingang der Schnittstellenkarte des Multielektroden-Array-Systems gesteckt wird. Verwenden Sie die Aufzeichnungssoftware für das Multielektrodenarray, um die Eingangsdaten des ex vivo ERG aufzuzeichnen und zu speichern. Stellen Sie die Verstärkung des Differenzverstärkers auf 100 ein und fügen Sie je nach Spezifikation des Digitizers eine zusätzliche 10-fache Spannungsverstärkung hinzu. Stellen Sie den Tiefpassfilter auf 100 Hz ein.
- Um einen Patch-Klemmaufbau umzurüsten, verbinden Sie den ex vivo ERG-Probenhalter über eine Kopfstufe mit einem Differenzverstärker, der mit der Kopfstufe des Patchklemmverstärkers verbunden ist. Verwenden Sie die Patchklemmsystemsoftware und den Digitizer, um die Eingangsdaten des ex vivo ERG aufzuzeichnen und zu speichern. Stellen Sie die Verstärkung des Differenzverstärkers auf 100 ein und legen Sie eine zusätzliche 10-fache Spannungsverstärkung über die Patch-Klemmkopfstufe an. Stellen Sie den Tiefpassfilter auf 100 Hz ein.
- Verbinden Sie LEDs mit den entsprechenden Wellenlängen (z. B. ca. 530 nm, um Stäbchen-Photorezeptor- und ON-Bipolarzellantworten hervorzurufen) mit dem Mikroskop. Steuern Sie die LEDs mit einer Aufnahmesoftware, die das Auslösen von Lichtreizen ermöglicht. Um Lichtreize zu steuern, verwenden Sie einen LED-Treiber, der über analoge Ausgänge eines Digitizers gesteuert wird.
- Kalibrieren Sie die Lichtleistung der LEDs an der Position der Netzhaut im Probenhalter mit einer Fotodiode. Falls erforderlich, setzen Sie Neutraldichtefilter in den Lichtpfad ein, um die Lichtintensität zu dimmen.
- Verwenden Sie einen handelsüblichen oder speziell angefertigten Ex-vivo-ERG-Probenhalter.
HINWEIS: Zeichnungen für die CNC-Bearbeitung aus Polycarbonat können auf Anfrage bei den Autoren angefordert werden. - Um die Elektrode vorzubereiten, führen Sie eine Ag/AgCl-Pelletelektrode in einen Luer-Anschluss mit Gewinde ein. Füllen Sie die Innenseite des Luer-Steckers mit Heißkleber und stecken Sie eine 2 mm Buchse von der Seite ohne Gewinde in den Heißkleber. Löten Sie einen Silberdraht der EP1-Elektrode an die 2 mm Buchse. Schrauben Sie die fertige Elektrode mit einem O-Ring am Gewinde in die Elektrodenanschlüsse des ex vivo ERG-Probenhalters.
HINWEIS: Elektroden können für eine lange Zeit verwendet werden. Wenn sich die Pelletoberfläche ansammelt und/oder dunkel wird (dies kann zu einer hohen Offsetspannung und/oder elektrischen Drift führen), kann sie mit feinem Schleifpapier "poliert" werden. - Mindestens 1 Tag vor dem Versuch Filterpapiere mit Epoxidkleber auf die Kuppeln des ex vivo ERG-Probenhalters kleben, um sicherzustellen, dass der Klebstoff den Elektrodenkanal nicht blockiert (siehe Video 3).
2. Tierische Zubereitung
- Dunkle angepasste Tiere für mindestens 6 Stunden oder über Nacht.
3. Vorbereitung der Ausrüstung
- Füllen Sie die Perfusionsleitung des ex vivo ERG mit Ames' Medium, das mit 5% Kohlendioxid und 95% Sauerstoff besprüht ist. Verbinden Sie die Perfusionsleitung mit einem Heizelement mit einer Gleichstromquelle oder einem Wärmeregler in der Nähe des Probenhalters, um das Medium des Ames zu erwärmen, so dass die Netzhaut bei ca. 35-38 °C gehalten wird.
- Füllen Sie beide Hälften des ex vivo ERG-Probenhalters mit Elektrodenlösung, verschließen Sie die Perfusionsleitung mit Luerstopfen, verbinden Sie die Elektroden und montieren Sie den Probenhalter mit vier Schrauben (siehe Video 3).
- Überprüfen Sie den Widerstand und die Offset-Spannung zwischen den Elektroden im montierten Probenhalter, indem Sie die Sonden des Multimeters in die Elektroden einführen.
HINWEIS: Wenn keine Verstopfungen vorhanden sind und die Elektroden in gutem Zustand sind, sollte der Widerstand unter 100 kΩ und die Offsetspannung unter 5 mV liegen. - Verbinden Sie den montierten Probenhalter mit der Perfusionslinie und legen Sie ihn auf den Tisch eines Mikroskops, das so eingerichtet ist, dass Lichtblitze abgegeben werden. Stellen Sie sicher, dass der Probenhalter und die Perfusionsleitung keine Luftblasen enthalten.
4. Gewebevorbereitung
- Opfern Sie das Tier mit CO2 und enukleieren Sie sofort die Augen oder erhalten Sie große Tier- oder menschliche Spenderaugen.
- Reinigen Sie die Kugel von den verbleibenden Bindegeweben und extraokularen Muskeln. Schneiden Sie den Sehnerv ab.
- Legen Sie auf Filterpapier vorsichtig einen kleinen Schnitt mit einer Rasierklinge entlang der Ora serrata, etwa 1 mm vom Limbus im Mausauge entfernt. Führen Sie eine feine Vannas-Schere in den Schnitt ein und schneiden Sie entlang des Limbus, um den vorderen Teil des Auges mit der Linse zu entfernen.
- Stellen Sie die Augenmuschel in eine Schale, die Ames' Medium enthält. Fassen Sie die Sklera mit einer feinen Pinzette und achten Sie darauf, die Netzhaut nicht zu berühren. Führen Sie eine Vannas-Schere zwischen Netzhaut und Sklera ein und schneiden Sie die Sklera von der Peripherie in Richtung des zentralen Teils. Achten Sie darauf, die Netzhaut nicht zu berühren oder zu beschädigen.
- Immobilisieren Sie die Sklera, indem Sie eine Seite des Einschnitts mit einer Vannas-Schere gegen den Boden der Präparierschale halten. Fassen Sie die Sklera mit einer Pinzette auf der anderen Seite des Einschnitts. Entfernen Sie die Sklera, ohne die Netzhaut zu berühren oder zu beschädigen, indem Sie die Sklera auf beiden Seiten des Einschnitts auseinanderziehen, um eine Isolierung der Netzhaut mit minimaler Schädigung des Gewebes zu ermöglichen.
- Entfernen Sie das vordere Segment mit der Linse vom anderen Auge und lagern Sie die Augenmuschel bei Raumtemperatur in Ames' Lösung, die mit 5% Kohlendioxid und 95% Sauerstoff beblasen ist.
HINWEIS: Funktionelle Lichtreaktionen von Augen, die auf diese Weise gespeichert werden, können für mehrere Stunden erhalten werden. - Bei großen Augen, einschließlich menschlicher Spenderaugen, reinigen Sie die Kugel des verbleibenden Bindegewebes und entfernen Sie das vordere Segment und die Linse, ähnlich wie bei dem für das Mausauge beschriebenen Verfahren. Verwenden Sie ein Skalpell, um einen Schnitt etwa 3 mm vom Limbus zu machen. Führen Sie eine gebogene Dissektionsschere in den Schnitt ein und schneiden Sie entlang des Limbus, um den vorderen Teil des Auges mit der Linse zu entfernen. Erhalten Sie Netzhautproben für die Ex-vivo-Elektroretinographie mit einem 3-6 mm Einweg-Biopsiestempel.
5. Anbringen des Gewebes am Probenhalter
- Legen Sie die untere Hälfte des Probenhalters in eine große Petrischale und füllen Sie sie mit sauerstoffreichem Ames-Medium, so dass die Kuppel des Probenhalters einfach untergetaucht ist.
- Fassen Sie den Rand der Netzhaut vorsichtig mit einer feinen Pinzette an und übertragen Sie die Netzhaut auf die Kuppel des ex vivo Probenhalters, Photorezeptorseite nach oben.
- Heben Sie den Probenhalter aus der Ames-Lösung und achten Sie darauf, dass die Netzhaut an Ort und Stelle bleibt.
- Trocknen Sie die Platte des Probenhalters vollständig ab, um Rauschen, elektrisches Übersprechen und Signalshunting zu minimieren.
- Montieren Sie beide Hälften des Probenhalters mit vier Schrauben und verbinden Sie die Perfusionsleitung. Trocknen Sie die Elektrode in der unteren Hälfte des Probenhalters und verbinden Sie das Anodenkabel mit der inneren Netzhautseite und das Kathodenkabel mit der Photorezeptorseite.
- Durchimpfen Sie den Probenhalter mit mindestens 1 ml/min sauerstoffreichem Ames-Medium für 10-20 Minuten, um Zeit für die Stabilisierung der Lichtreaktionen zu haben.
6. Erfassung der neuronalen Zellfunktion der Netzhaut
- Zeichnen Sie Antwortfamilien auf, indem Sie die Netzhaut Lichtblitzen zunehmender Intensität aussetzen. Erfassen Sie beispielsweise Maus-Stäbchen-Photorezeptor-Antwortfamilien mit Lichtintensitäten im Bereich von etwa 10 bis 1.000 Photonen / μm 2 und solche von Maus-ON-Bipolarzellen mit Lichtintensitäten von etwa 0,6 bis 20 Photonen / μm2.
- Messung der Lichtreaktionen von Photorezeptoren (a-Welle) in Gegenwart von 100 μM Bariumchlorid, das Kaliumkanäle in Müller-Gliazellen blockiert, und 40 μM DL-AP4, das die glutamaterge Signalübertragung an ON-bipolare Zellen blockiert (Abbildung 2B).
- Um die b-Welle zu isolieren, die aus der Funktion der ON-Bipolarzellen stammt, werden zunächst kombinierte Lichtreaktionen von Photorezeptor- und ON-Bipolarzellen in Gegenwart von Bariumchlorid allein aufgezeichnet (Abbildung 2A). Dann 5-10 min mit Ames' Medium, das Bariumchlorid sowie DL-AP4 enthält, durchbluten und die Photorezeptorreaktionen auf die gleichen Lichtreize wie zuvor aufzeichnen (Abbildung 2B). Subtrahieren Sie Photorezeptorantworten von kombinierten Photorezeptor- und ON-bipolaren Zellantworten und berechnen Sie so allein die ON-bipolaren Zelllichtantworten (Abbildung 2C).
7. Optimierung der ON-Bipolarzellfunktion
HINWEIS: Die b-Welle, die von den ON-Bipolarzellen ausgeht, reagiert sehr empfindlich auf die Temperatur im Probenhalter und die Perfusionsrate.
- Halten Sie eine Perfusionsrate von mindestens 0,5 ml / min aufrecht, um die b-Welle zu erhalten.
HINWEIS: Eine höhere Perfusionsrate von 1-2 ml / min ist vorzuziehen, um eine große und stabile Reaktion von ON-Bipolarzellen aufrechtzuerhalten. - Stellen Sie sicher, dass bei einer gegebenen Perfusionsrate die Temperatur im Probenhalter in der Nähe der Netzhaut nahe der Körpertemperatur liegt (d. h. ca. 35-38 °C).
HINWEIS: Es ist wichtig, die Temperatur des Perfusats einzustellen, das erhitzt wird, bevor es den ex vivo ERG-Probenhalter erreicht, so dass es sich im optimalen Temperaturbereich an der Netzhaut befindet. - Lagern Sie Augenmuscheln für spätere Experimente vor Licht geschützt und in sauerstoffreichem Ames-Medium bei Raumtemperatur, um normale A- und B-Wellen für mehrere Stunden aufrechtzuerhalten.
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Representative Results
Ex vivo ERG ermöglicht die Aufzeichnung reproduzierbarer und stabiler Photorezeptor- und ON-bipolarer Zelllichtantworten, beispielsweise von der Netzhaut der Maus (Abbildung 2A-C). Die Aufzeichnung von Photorezeptorantworten menschlicher Spendernetzhaut ist mit bis zu 5 h postmortaler Verzögerung der Enukleation (Abbildung 2D) und von ON-bipolaren Zellantworten mit einer Enukleationsverzögerung von <20 min (Abbildung 2E) möglich. Wichtige Parameter, um große Reaktionen zu erhalten, sind eine sorgfältige Dissektionstechnik, eine hohe Perfusionsrate und eine Perfusionstemperatur, die nahe an physiologischen Werten liegt (35-38 ° C in der Netzhaut von Säugetieren). Unter diesen Bedingungen waren Antwortamplituden und Kinetik in beiden Zelltypen über die Zeit relativ stabil, nahmen aber etwa 40-45 Minuten nach der Montage der Netzhaut auf dem Probenhalter langsam ab (Abbildung 3).
Im Vergleich zu Photorezeptoren wird die Funktion der ON-bipolaren Zellen leichter gestört, beispielsweise durch eine Schädigung der Netzhaut während der Dissektion und Montage oder durch einen Abfall der Temperatur und/oder Perfusionsgeschwindigkeit. Während eine reduzierte Temperatur im Probenhalter die Kinetik sowohl der Photorezeptoren als auch der ON-Bipolarzellen stark verlangsamte, verringerte sie die Amplitude der b-Welle, aber nicht der a-Welle (Abbildung 4A). Umgekehrt reduzierte die Verlangsamung der Perfusionsrate von 2,1 ml / min auf 0,6 ml / min die Amplituden sowohl der Photorezeptor- als auch der ON-bipolaren Zellantworten, beeinflusste jedoch nicht die implizite Zeit (Zeit vom Reizbeginn bis zum Antwortpeak) der a- oder der b-Welle (Abbildung 4B). Die Beendigung der Perfusion für 10 Minuten, gefolgt von einer Reperfusion, führte zu einem vollständigen Verlust der ON-bipolaren Zellfunktion mit erhaltenen Photorezeptorantworten (Abbildung 5).
Abbildung 1: Ex-vivo-Elektroretinogramm-Probenhalter und Aufnahmeaufbau. (A,B) Der Ex-vivo-ERG-Probenhalter umfasst eine Kuppel zur Montage der isolierten Netzhaut, die mit einer Perfusionsleitung verbunden ist, um kontinuierlich das Ames-Medium zu liefern. Elektroden sind durch schmale Kanäle sowohl mit der Photorezeptorseite der Netzhaut über die Perfusionsleitung als auch mit der inneren Netzhaut durch das an die Kuppel geklebte Filterpapier verbunden. Diese Elektroden sind mit einem Differenzverstärker verbunden, der die Messung von Potentialdifferenzen in der Netzhaut als Reaktion auf Lichtreize ermöglicht. (C) Der Probenhalter wird auf den Tisch eines Mikroskops gelegt, das modifiziert wurde, um Lichtblitze zu liefern, und mit der Perfusionsleitung verbunden ist, die erwärmtes, sauerstoffreiches Ames-Medium durch Schwerkraft abgibt. Der gesamte Aufnahmeaufbau ist durch einen Faradayschen Käfig abgeschirmt, um elektrisches Rauschen zu minimieren. Diese Zahl wurde von 9 geändert. Abkürzung: ERG = Elektroretinogramm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Beispielspuren von ex vivo Photorezeptor- und ON-bipolaren Zellantworten. Die Zugabe pharmakologischer Wirkstoffe zum Perfusat ermöglicht die Quantifizierung der Beiträge einzelner Netzhautzelltypen zum ex vivo Elektroretinogramm. Photorezeptor (PR) Lichtantworten werden in Gegenwart von 100 μM Bariumchlorid (BaCl2), einem Blocker von K+-Kanälen, exprimiert von Müller-Gliazellen, sowie 40 μM DL-AP4, einem Glutamatrezeptorblocker, isoliert, der die Signalübertragung von Photorezeptoren zu ON-Bipolarzellen hemmt (B). Die Funktion der ON-bipolaren Zellen (ON-BPC) (C) wird bestimmt, indem die Photorezeptorkomponente (B) von der kombinierten Photorezeptor- und ON-Bipolarzellantwort in Gegenwart von Bariumchlorid allein (A) subtrahiert wird. Photorezeptor-Lichtantworten können von menschlichen Spendernetzen mit einer Todes-Enukleationsverzögerung von <5 h (D) erhalten werden, während Netzhäute, die innerhalb von 20 Minuten nach dem Tod enukleiert werden, häufig auch ON-bipolare Zellantworten (E) geben (siehe 8 für weitere Informationen). Abbildung 2A-C wird von 9 geändert. Abkürzungen: PR = Photorezeptor; ON-BPC = ON-bipolare Zelle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Stabilität der Photorezeptor- und ON-bipolaren Zellfunktion im Ex-vivo-Elektroretinogramm über die Zeit . (A) Lichtantworten wurden jede Minute von Photorezeptoren allein in Gegenwart von 100 μM Bariumchlorid und 40 μM DL-AP4 aufgezeichnet. (B) Schwache Lichtblitze in Gegenwart von 100 μM Bariumchlorid allein werden stark von der ON-bipolaren Zellfunktion dominiert, obwohl sie eine kleine Photorezeptorkomponente enthalten. Lichtreaktionen von isolierten Netzhäuten stabilisieren sich typischerweise nach Perfusion des Ex-vivo-Probenhalters für 15-20 min und waren mindestens 20-25 Minuten stabil, bevor sie zu sinken begannen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Kombinierte Photorezeptor- und ON-bipolare Zellantworten bei unterschiedlichen Temperaturen und Perfusionsgeschwindigkeiten. (A) Die Absenkung der Temperatur im Probenhalter von 37 °C auf Raumtemperatur verlangsamte die Photorezeptor- und ON-bipolare Zellkinetik stark, reduzierte jedoch nur die ON-bipolare Zellamplitude in der gemischten Photorezeptor- und ON-bipolaren Zellantwort. (B) Die Reduzierung der Perfusionsrate von 2,1 ml/min auf 0,6 ml/min führte zu einer verminderten Photorezeptor- und ON-Bipolarzellamplitude, aber zu keiner Veränderung der Reaktionskinetik. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: ON-bipolare Zellantworten reagieren empfindlicher auf die Beendigung der Perfusion. (A) Große Photorezeptor- und ON-bipolare Zellantworten wurden nach Perfusion mit 2,1 ml/min für 20 min aufgezeichnet. (B) Nach Beendigung der Perfusion für 10 min, gefolgt von einer Reperfusion für 10 min bei 2,1 ml/min, waren Photorezeptorantworten vorhanden, während ON-bipolare Zellantworten vollständig verloren gingen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Ursprünglich 1865 von Holmgren entwickelt, um die retinalen Lichtantworten der Amphibiennetzhaut10 zu messen, verhinderten technische Einschränkungen zunächst eine breite Anwendung. Dennoch identifizierten wegweisende Studien von Ragnar Granit und anderen die zellulären Ursprünge des ERG und maßen Photorezeptor- und ON-bipolare Zellantworten ex vivo11,12,13. Seitdem haben verfeinerte Methoden eine breitere Verwendung von Ex-vivo-ERG-Aufzeichnungen 14,15 ermöglicht, obwohl die Antwortamplituden, insbesondere die von ON-bipolaren Zellen, vergleichsweise klein blieben16. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wird die Netzhautfunktion heute häufiger mit in vivo ERG gemessen, trotz experimenteller Einschränkungen und komplizierterer Interpretation der aufgezeichneten Wellenformen. Obwohl das ex vivo ERG versucht, physiologische Bedingungen so genau wie möglich nachzubilden, misst es dennoch die Netzhautfunktion in einer künstlichen Umgebung und in Abwesenheit von systemischen Faktoren und pathologischen Veränderungen. In Kombination mit dem In-vivo-ERG kann diese Einschränkung jedoch genutzt werden, um wichtige Fragen zu beantworten, z. B. ob Veränderungen der Netzhautfunktion bei Erkrankungen den Netzhautzellen innewohnen oder durch systemische Veränderungen verursachtwerden 17.
Vor kurzem haben neu entwickelte Ex-vivo-ERG-Probenhalter die Methodik vereinfacht und die Ex-vivo-ERG einer breiteren Forschungsgemeinschaft zugänglich gemacht 2,3,5,18. Modifikationen an bestehenden Patchklemmen oder Multielektroden-Array-Geräten, die in diesem Protokoll beschrieben werden, werden es mehr Laboratorien ermöglichen, Ex-vivo-ERG mit minimalen finanziellen Investitionen und Platzbedarf durchzuführen. Insbesondere die jüngsten Entwicklungen in der Ex-vivo-ERG-Technologie haben die Reaktionsfähigkeit isolierter Netzhaut von Säugetieren verstärkt und zu einem überlegenen Signal-Rausch-Verhältnis geführt, das trotz zusätzlicher Verstärkungsschritte, die in diesem Protokoll beschrieben werden, gut bleibt. Dennoch hat der Rückgang der Lichtantworten, hauptsächlich von ON-Bipolarzellen19, möglicherweise die breitere Verwendung des ex vivo ERG behindert. Die Verwendung von Ames' oder Lockes Medium führt zu größeren Photorezeptor- und ON-bipolaren Zellantworten, was sie beispielsweise HEPES-gepufferten Ringer-Lösung für ex vivo ERG3 vorzuziehen macht. Andere Laboratorien stabilisierten ex vivo ON-bipolare Zellfunktion durch Ergänzung mit Glutamin oderGlutamat 19. Dieser Bericht zeigt, wie große und stabile Lichtreaktionen von isolierten Netzhäuten, einschließlich von menschlichen Spenderaugen, erhalten werden können, wie bereits berichtet8.
Wichtige experimentelle Parameter sind die Temperatur der Netzhaut, die im physiologischen Bereich gehalten werden sollte, und eine schnelle Perfusionsrate. Die auffälligsten Auswirkungen einer Senkung der Temperatur im ex vivo ERG-Probenhalter sind eine langsamere Reaktionskinetik sowohl in Photorezeptoren als auch in ON-bipolaren Zellen und eine abgeschwächte ON-bipolare Zellamplitude. Obwohl die Senkung der Temperatur wenig Einfluss auf die Photorezeptoramplitude in der kombinierten Antwort von Photorezeptoren und ON-Bipolarzellen zu haben scheint, kann dies ein Artefakt aufgrund unterschiedlicher Änderungen in der Antwortkinetik beider Zelltypen sein.
Eine ausreichende Perfusionsrate scheint besonders kritisch für die Netzhautfunktion zu sein, die höchstwahrscheinlich Sauerstoff und Nährstoffe liefert und Abfallprodukte entfernt. Während sowohl Photorezeptor- als auch ON-bipolare Zellamplituden durch eine moderate Verringerung der Perfusionsrate etwas vermindert werden, hat selbst eine kurze Einstellung der Perfusion die ON-bipolare, aber nicht die Photorezeptorfunktion abgeschafft. Dies bedeutet, dass Photorezeptorreaktionen robuster sind und leichter in Augen erhalten werden können, die mit einer signifikanten Verzögerung experimentiert werden, wie z. B. menschliche Spenderaugen8. In diesem Zusammenhang ist es bemerkenswert, dass die Funktion von ON-bipolaren Zellen nicht durch die mehrstündige Lagerung von Augenmuscheln in sauerstoffreichem Ames-Medium beeinträchtigt wird. Wir stellen daher die Hypothese auf, dass der Verlust der ON-bipolaren Zellfunktion, wenn die Perfusion im Ex-vivo-Probenhalter gestoppt wird, auf eine schnelle Erschöpfung von Sauerstoff und anderen Nährstoffen in dem kleinen Volumen, das die Netzhaut im Probenhalter umgibt, zurückzuführen sein kann. Dies wird durch Berichte gestützt, dass eine kurze Verzögerung vom Tod bis zur Enukleation entscheidend ist, um Photorezeptor- und insbesondere ON-bipolare Zellantworten von menschlichen Netzhäuten aufzuzeichnen, und dass postmortale Hypoxie der wahrscheinlichste Kandidat für irreversible Schäden an der neuronalen Netzhautfunktion ist8. Während experimentelle Parameter für ex vivo ERG in der Netzhaut der Maus optimiert wurden, verbesserten sie dennoch erfolgreich die Aufnahmebedingungen für Netzhautproben von Großtieren und menschlichen Spenderaugen.
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Disclosures
Keiner der Autoren hat Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse des National Eye Institute EY02665 und EY031706 und der International Retinal Research Foundation an Dr. Vinberg, National Institutes of Health Core Grant (EY014800), und einen uneingeschränkten Zuschuss von Research to Prevent Blindness, New York, NY, an das Department of Ophthalmology & Visual Sciences, University of Utah, unterstützt. Dr. Frans Vinberg erhielt auch einen Research to Prevent Blindness/Dr. H. James and Carole Free Career Development Award und Dr. Silke Becker ein ARVO EyeFind-Stipendium. Wir danken Dr. Anne Hanneken vom Scripps Research Institute für die Bereitstellung des Spenderauges, das für die in Abbildung 2E gezeigten Aufnahmen verwendet wurde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mm socket | WPI | 2026-10 | materials to prepare electrode |
| Ag/AgCl Electrode | World Precision Instruments | EP1 | materials to prepare electrode |
| Ames' medium | Sigma Aldrich | A1420 | perfusion media |
| barium chloride | Sigma Aldrich | B0750 | potassium channel blocker |
| DL-AP4 | Tocris | 0101 | broad spectrum glutamatergic antagonist |
| OcuScience Ex Vivo ERG Adapter | OcuScience | n/a | ex vivo ERG specimen holder |
| Threaded luer connector | McMaster-Carr | 51525K222 or 51525K223 | materials to prepare electrode |
References
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