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Évaluation de la bioénergétique cellulaire dans les cellules souches hématopoïétiques et progénitrices primitives de souris à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire

Published: September 24, 2021 doi: 10.3791/63045
Automatic Translation
1, 2, 2,3,4, 1,4,5
1Department of Pathology, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Cellular and Developmental Biology, University of Michigan, Ann Arbor, 4Rogel Cancer Center, University of Michigan, Ann Arbor, 5Institute of Gerontology, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

La méthode présentée ici résume les protocoles optimisés pour évaluer la bioénergétique cellulaire dans les cellules souches hématopoïétiques et progénitrices primitives (HSPC) non adhérentes de souris à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire pour mesurer le taux d’acidification extracellulaire (ECAR) et le taux de consommation d’oxygène (OCR) des HSPC en temps réel.

Abstract

À l’état d’équilibre, les cellules souches hématopoïétiques (CSH) restent en grande partie au repos et on pense qu’elles dépendent principalement de la glycolyse pour répondre à leurs besoins énergétiques. Cependant, dans des conditions de stress telles qu’une infection ou une perte de sang, les CSH deviennent prolifératifs et produisent rapidement des cellules progénitrices en aval, qui à leur tour se différencient davantage, produisant finalement des cellules sanguines matures. Au cours de ce processus de transition et de différenciation, les CSH sortent de la quiescence et subissent rapidement un passage métabolique de la glycolyse à la phosphorylation oxydative (OxPHOS). Diverses conditions de stress, telles que le vieillissement, le cancer, le diabète et l’obésité, peuvent avoir un impact négatif sur la fonction mitochondriale et peuvent donc modifier la reprogrammation métabolique et la différenciation des CSH et des progéniteurs pendant l’hématopoïèse. Des informations précieuses sur les fonctions glycolytiques et mitochondriales des CSH et des progéniteurs dans des conditions normales et de stress peuvent être obtenues grâce à l’évaluation de leur taux d’acidification extracellulaire (ECAR) et de leur taux de consommation d’oxygène (OCR), qui sont des indicateurs de la glycolyse cellulaire et de la respiration mitochondriale, respectivement.

Ici, un protocole détaillé est fourni pour mesurer l’ECAR et l’OCR dans les populations de cellules de lignée négative dérivées de la moelle osseuse de souris, qui comprennent à la fois des cellules souches hématopoïétiques et des cellules progénitrices primitives (HSPC), à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire. Ce protocole décrit des approches pour isoler les cellules de lignée négative de la moelle osseuse de souris, explique l’optimisation de la densité d’ensemencement cellulaire et des concentrations de 2-désoxy-D-glucose (2-DG, un analogue du glucose qui inhibe la glycolyse) et de divers médicaments ciblant OxPHOS (oligomycine, FCCP, roténone et antimycine A) utilisés dans ces tests, et décrit les stratégies de traitement médicamenteux. Les paramètres clés du flux glycolytique, tels que la glycolyse, la capacité glycolytique et la réserve glycolytique, et les paramètres OxPHOS, tels que la respiration basale, la respiration maximale, la fuite de protons, la production d’ATP, la capacité respiratoire de rechange et l’efficacité du couplage, peuvent être mesurés dans ces essais. Ce protocole permet des mesures ECAR et OCR sur des HSPC non adhérents et peut être généralisé pour optimiser les conditions d’analyse pour tout type de cellules de suspension.

Introduction

L’hématopoïèse est le processus par lequel divers types de cellules sanguines matures ayant des fonctions hautement spécialisées sont formés à partir deCSH 1. Les CSH sont capables de s’auto-renouveler et de se différencier en diverses populations progénitrices multipotentes et spécifiques à la lignée. Ces progéniteurs produisent finalement des cellules de lignées lymphoïdes, myéloïdes, érythroïdes et mégacarytaires. Pour maintenir leur capacité d’auto-renouvellement, les CSH restent en grande partie au repos et, comme d’autres cellules souches tissulaires, on pense qu’elles reposent sur la glycolyse plutôt que sur l’OxPHOS mitochondrial pour la production d’ATP 2,3. L’entrée dans le cycle cellulaire entraîne une amélioration de la respiration et de l’OxPHOS, ce qui entraîne des niveaux élevés d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), qui nuisent au maintien et à la fonctionHSC 3. Une division cellulaire répétée peut donc conduire à une réduction de la capacité d’auto-renouvellement des CSH et, finalement, à leur épuisement.

Dans l’hématopoïèse adulte, les CSH subissent principalement une division cellulaire asymétrique, au cours de laquelle l’une des cellules filles conserve le potentiel HSC et continue de dépendre du métabolisme glycolytique. L’autre cellule fille devient une cellule progénitrice primitive qui perd sa capacité d’auto-renouvellement mais prolifère et finit par donner naissance à des cellules hématopoïétiques fonctionnelles différenciées4. Lorsque les CSH se différencient pour produire des progéniteurs en aval, on pense qu’un passage de la glycolyse au métabolisme mitochondrial se produit pour fournir l’énergie et les blocs de construction nécessaires pour soutenir cette transition rapide5, comme le suggèrent les observations selon lesquelles les CSH possèdent une masse mitochondriale inactive 6,7,8,9 . En revanche, l’activité mitochondriale (indiquée par les niveaux de ROS liés) est beaucoup plus élevée chez les progéniteurs engagés dans la lignée que dans les CSH 9,10,11. Les changements métaboliques qui se produisent au cours de la première étape de l’hématopoïèse suggèrent donc un rôle direct et crucial des mitochondries dans la régulation du devenir du HSC.

Les mitochondries dysfonctionnelles présentes dans diverses conditions de stress, telles que le vieillissement, le cancer, le diabète et l’obésité12, peuvent interférer avec la capacité d’auto-renouvellement des CSH, induisant un déséquilibre dans la différenciation des CSH / progéniteurs en produisant des quantités excessives de ROS, en altérant la production d’ATP et / ou en modifiant d’autres processus métaboliques 9,12,13 . Les perturbations de l’homéostasie métabolique dans la différenciation HSC/progéniteur pourraient avoir un impact significatif sur l’hématopoïèse, contribuant potentiellement au développement d’anomalies hématologiques13. Compte tenu des influences critiques de la glycolyse et de l’OxPHOS mitochondrial sur la tige et la différenciation des CSH, il est intéressant d’étudier à la fois les paramètres métaboliques dans des conditions normales et de stress. Des informations précieuses sur la fonction glycolytique et mitochondriale des CSH et des cellules progénitrices peuvent être obtenues en évaluant leur ECAR et leur OCR, qui sont des indicateurs de la glycolyse cellulaire et de la respiration mitochondriale, respectivement.

L’analyseur de flux extracellulaire Seahorse est un appareil puissant équipé de deux sondes par puits pour mesurer simultanément l’ECAR et l’OCR dans les cellules vivantes et peut donc être utilisé pour évaluer la bioénergétique cellulaire en temps réel, en réponse à divers substrats ou inhibiteurs. La cartouche de dosage utilisée avec l’analyseur contient des orifices d’injection pour contenir jusqu’à quatre médicaments pour injection automatisée pendant le test. Un schéma d’un test de stress typique de glycolyse est illustré à la figure 1A. Le test commence par la mesure de l’ECAR des cellules, incubées dans un milieu de test de stress de glycolyse contenant de la glutamine mais pas du glucose ou du pyruvate. Cela représente l’acidification due aux activités non glycolytiques des cellules et est rapporté comme une acidification non glycolytique. Ceci est suivi par l’injection de glucose à une concentration saturante. Par glycolyse, le glucose dans la cellule est converti en pyruvate, qui est ensuite métabolisé dans le cytoplasme pour produire du lactate, ou dans les mitochondries pour produire du CO2 et de l’eau.

La conversion du glucose en lactate provoque une production nette et une libération ultérieure de protons dans le milieu extracellulaire, ce qui entraîne une augmentation rapide de l’ECAR 14,15,16. Ce changement stimulé par le glucose dans l’ECAR est rapporté comme glycolyse dans des conditions basales. La deuxième injection consiste en oligomycine (un inhibiteur de l’ATP synthase, alias complexe V17), qui inhibe la production mitochondriale d’ATP. Au cours de l’inhibition de l’OxPHOS médiée par l’oligomycine, les cellules régulent au maximum la glycolyse pour répondre à leurs besoins énergétiques. Cela provoque une augmentation supplémentaire de l’ECAR, révélant la capacité glycolytique maximale des cellules. La différence entre la capacité glycolytique maximale et la glycolyse basale est appelée réserve glycolytique. Enfin, le 2-DG est injecté, ce qui provoque une baisse significative de l’ECAR, généralement proche des niveaux d’acidification non glycolytique. Le 2-DG est un analogue du glucose qui se lie de manière compétitive à l’hexokinase, ce qui entraîne une inhibition de la glycolyse18. Ainsi, la diminution de l’ECAR induite par le 2-DG confirme en outre que la glycolyse est bien la source d’ECAR observée après des injections de glucose et d’oligomycine.

La figure 1B montre le schéma d’un test de stress mitochondrial typique. Le test commence par la mesure OCR de base des cellules, incubées dans un milieu de test de stress mitochondrial contenant du glucose, de la glutamine et du pyruvate. Après des mesures OCR basales, l’oligomycine est injectée dans ce test, qui inhibe le complexe V, réduisant ainsi le flux d’électrons à travers la chaîne de transport d’électrons (ETC)17. Par conséquent, l’OCR est réduite en réponse à l’injection d’oligomycine, et cette diminution de l’OCR est liée à la production mitochondriale d’ATP. La deuxième injection consiste en cyanure de carbonyle-4 (trifluorométhoxy) phénylhydrazone (FCCP), un protonophore et un découpleur d’OxPHOS17 mitochondrial. FccP effondre le gradient de protons mitochondriaux en permettant le flux de protons à travers la membrane interne mitochondriale. En raison de l’injection de FCCP, le flux d’électrons à travers l’ETC est déprimé et le complexe IV consomme de l’oxygène au niveau maximal. La différence entre l’OCR maximal et l’OCR basale est appelée capacité respiratoire de rechange, qui est une mesure de la capacité de la cellule à répondre à une demande d’énergie accrue dans des conditions de stress. Enfin, un mélange de deux inhibiteurs de l’ETC (roténone, un inhibiteur du complexe I, et antimycine A, un inhibiteur du complexe III17) est injecté, ce qui arrête complètement le flux d’électrons et l’OCR diminue à un faible niveau. L’OCR mesurée après injection de roténone et d’antimycine A correspond à l’OCR non mitochondriale entraînée par d’autres processus à l’intérieur des cellules. L’OCR non mitochondriale permet de calculer la respiration basale, la fuite de protons et la respiration maximale.

La respiration basale représente la différence entre l’OCR de base et l’OCR non mitochondriale. La fuite de protons fait référence à la différence entre l’OCR après injection d’oligomycine et l’OCR non mitochondriale. La respiration maximale représente la différence entre l’OCR après injection de FCCP et l’OCR non mitochondriale. L’efficacité du couplage est calculée comme le pourcentage du taux de production d’ATP au taux de respiration basale. Ce document de méthode fournit un protocole détaillé pour mesurer l’ECAR et l’OCR dans les HSPC à l’ordre négatif à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire Seahorse XFe96. Ce protocole décrit les approches pour isoler les HSPC négatifs à la lignée de souris, explique l’optimisation de la densité d’ensemencement cellulaire et des concentrations de divers médicaments utilisés dans les tests de flux extracellulaire et décrit les stratégies de traitement médicamenteux.

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Protocol

Toutes les expériences sur les animaux vertébrés ont été approuvées et effectuées conformément aux règlements du Comité sur l’utilisation et le soin des animaux de l’Université du Michigan.

1. Jour avant le test (Durée totale: ~ 10 min)

  1. Hydratation de la cartouche du capteur (Temps de pas: ~ 10 min)
    1. Ouvrez le kit de dosage de flux extracellulaire et retirez la cartouche de capteur et la plaque utilitaire. Enregistrez les plats du guide de chargement pour les utiliser le lendemain.
    2. Séparez manuellement la cartouche du capteur (la partie verte supérieure avec couvercle) de la plaque utilitaire (microplaque inférieure de 96 puits) et placez-la à l’envers à côté de la plaque utilitaire.
    3. À l’aide d’une pipette multicanal, remplissez chaque puits de la plaque utilitaire avec 200 μL d’calibrant, inclus avec le kit de dosage de flux.
    4. Replacez la cartouche du capteur sur la plaque utilitaire, en vous assurant d’immerger complètement les capteurs dans le calibrant.
    5. Placez la cartouche de capteur et la plaque utilitaire assemblées avec calibrant dans un incubateur sans CO2 37 °C pendant la nuit. Pour éviter l’évaporation du calibrant, assurez-vous que l’incubateur est correctement humidifié. Si vous utilisez un incubateur de four ordinaire pour des incubations sans CO2 37 °C, placez un bécher ouvert contenant de l’eau à l’intérieur de l’incubateur pour l’humidifier. Si disponible, utilisez une station de préparation XF pour toutes les incubations sans CO2 37 °C.
      REMARQUE: Alternativement, la cartouche du capteur peut être hydratée pendant la nuit avec 200 μL par puits d’eau ultrapure stérile dans un incubateur sans CO2 37 °C. Remplacer l’eau par 200 μL par puits d’étrier préavertissé à 37 °C, au moins 45 à 60 min avant de charger les orifices d’injection le jour du dosage.

2. Jour du test (Durée totale: ~9 h 30 min)

REMARQUE : Le temps total indiqué ci-dessus comprend les durées cumulées des étapes 2.1 à 2.4 en plus de l’étape 2.5 ou de l’étape 2.6.

  1. Préparation de microplaques revêtues d’adhésif cellulaire (Temps d’étape: ~ 1 h 30 min)
    REMARQUE : Effectuez toutes les étapes dans une armoire de biosécurité.
    1. Préparer 2,5 mL de la solution adhésive cellulaire (22,4 μg/mL, voir le tableau des matériaux) par microplaque de culture cellulaire à 96 puits en dissolvant 56 μg de l’adhésif cellulaire dans un volume approprié de bicarbonate de sodium de 0,1 M stérilisé par filtre (pH 8,0) et en ajoutant immédiatement 1 an d’hydroxyde de sodium à la moitié du volume de stock d’adhésif cellulaire utilisé. Vortex ou pipette de haut en bas pour mélanger.
    2. Ouvrez la microplaque de culture cellulaire à 96 puits (incluse avec le kit de dosage de flux) et distribuez 25 μL de la solution adhésive cellulaire préparée au fond de chaque puits. Couvrir la microplaque avec le couvercle et incuber pendant 30 min à température ambiante à l’intérieur de la hotte.
    3. Après l’incubation, retirez et jetez l’excès de solution adhésive cellulaire à l’aide d’une pipette ou d’un aspirateur multicanal, et lavez chaque puits deux fois avec 200 μL d’eau ultrapure stérile. Séchez la plaque à l’air libre, avec le couvercle retiré, à l’intérieur de la hotte pendant 30-45 min.
      REMARQUE: Les microplaques de culture cellulaire revêtues d’adhésif cellulaire peuvent être conservées jusqu’à une semaine à 4 ° C. Les microplaques pré-revêtues stockées à 4 °C doivent être laissées se réchauffer à température ambiante à l’intérieur de la hotte avant l’ensemencement des cellules.
  2. Préparation du milieu d’essai (temps d’étape: ~ 30 min)
    1. Préparation du milieu d’essai de test de stress de glycolyse
      1. Compléter 100 mL de milieu de base (voir le tableau des matériaux) avec 1 mL de L-glutamine de 200 mM.
        REMARQUE: La concentration finale de L-glutamine dans le milieu d’essai est de 2 mM.
      2. Réchauffer le milieu supplémenté en L-glutamine à 37 °C au bain-marie.
      3. Ajuster le pH du milieu chaud à 7,4 avec 1 N NaOH.
      4. Filtrer-stériliser le milieu avec un filtre de 0,2 μm et le maintenir à 37 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.
    2. Préparation du milieu de test de stress mitochondrial
      1. Compléter 100 mL du milieu de base avec 0,45 g de glucose, 1 mL de L-glutamine de 200 mM et 1 mL de pyruvate de sodium de 100 mM.
        REMARQUE: Le milieu d’essai final contient 25 mM de glucose, 2 mM de L-glutamine et 1 mM de pyruvate de sodium.
      2. Réchauffez le glucose, la L-glutamine et le milieu supplémenté en pyruvate de sodium jusqu’à 37 °C au bain-marie.
      3. Ajuster le pH du milieu chaud à 7,4 avec 1 N NaOH.
      4. Filtrer-stériliser le milieu avec un filtre de 0,2 μm et conserver à 37 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.
  3. Récolter des HSPC négatifs à la lignée de souris (Temps d’étape: ~ 3 h)
    1. Préparez le tampon d’essai en complétant la solution saline équilibrée de Hank avec 4% de sérum fœtal bovin. Préparer 1x tampon d’enrichissement en diluant le 5x bouillon avec de l’eau distillée stérile. Gardez les deux tampons sur la glace jusqu’à utilisation.
    2. Euthanasier sans cruauté les souris à l’aide de CO2 suivi d’une luxation cervicale et enlever les membres postérieurs avec des ciseaux. Retirez soigneusement tous les tissus des os et coupez les extrémités des deux côtés du fémur et du tibia à l’aide de ciseaux. Éliminez les cellules de la moelle osseuse du fémur et du tibia à l’aide du tampon d’essai. Faire passer les cellules rincées à travers un filtre stérile de 70 μm, centrifuger le filtrat à 200 × g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
    3. Lyser les globules rouges en resusmettant la pastille cellulaire dans 500 μL de tampon ACK (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH 7,2). Après lyse pendant 1 min sur glace, laver les échantillons en ajoutant 1 mL de tampon d’essai et centrifuger à 200 × g pendant 5 min à 4 °C. Jetez le surnageant.
    4. Après le lavage, incuber les échantillons avec un cocktail d’anticorps biotinylés dirigés contre CD2 (dilution 1:200), CD3 (dilution 1:200), CD5 (dilution 1:200), CD8 (dilution 1:200), Ter-119 (dilution 1:200), B220 (dilution 1:200) et Gr-1 (dilution 1:800) pendant 45 min sur glace dans un volume total de 500 μL de tampon d’essai.
    5. Laver les échantillons avec 1 mL de tampon d’essai avec centrifugation comme ci-dessus.
    6. Laver les échantillons avec 1 mL de tampon d’enrichissement 1x avec centrifugation comme ci-dessus.
    7. Incuber les échantillons avec 20 μL de nanobilles de streptavidine et 100 μL de tampon d’enrichissement 1x sur de la glace pendant 15 min.
    8. Laver les échantillons avec 1 mL de tampon d’enrichissement 1x avec centrifugation comme ci-dessus.
    9. Remettre les échantillons en suspension dans 2,5 mL de tampon d’enrichissement 1x. Placez-les sur un aimant de séparation pendant 5 min. Recueillir les surnageants séparément dans des tubes coniques de 15 mL.
    10. Remettez en suspension les échantillons séparés par aimant dans un tampon d’enrichissement supplémentaire de 2,5 mL 1x et replacez-les sur l’aimant de séparation pendant 5 min. Collectez et combinez les surnageants des collections précédentes dans des tubes coniques de 15 mL à partir de l’étape 2.3.9.
      REMARQUE: Les surnageants contiennent les fractions cellulaires de lignée négative.
    11. Centrifuger les tubes coniques de 15 mL contenant les cellules sélectionnées négativement pendant 5 min à 200 × g à 4 °C.
    12. Remettez en suspension les pastilles de cellules dans 1 mL de tampon d’essai et comptez le nombre de cellules à l’aide du bleu de trypan manuellement ou via un compteur de cellules automatisé tel qu’une comtesse 3.
      REMARQUE: Selon l’approche décrite ci-dessus, ~ 6 × 106 HSPC de lignée négative doivent être facilement purifiés des membres postérieurs d’une seule souris. Si des réactifs, tels que le tampon d’essai, le tampon d’enrichissement 1x et le cocktail d’anticorps spécifiques à la lignée, sont préparés la veille de l’expérience, il faut environ 2,5 à 3 h pour enrichir les HSPC de 4 souris. Cela prendrait 10 minutes supplémentaires pour chaque souris au-delà de ce nombre.
  4. Ensemencement de cellules dans des microplaques revêtues d’adhésif cellulaire (temps d’étape: ~ 1 h)
    1. Cellules de centrifugeuse de l’étape 2.3.12 à 200 × g pendant 5 min à température ambiante.
    2. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans le milieu d’essai approprié (milieu de test de stress de glycolyse ou milieu de test de stress mitochondrial). Centrifuger à 200 × g pendant 5 min à température ambiante.
    3. Répétez l’étape 2.4.2. Retirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans le milieu d’essai réchauffé approprié à la concentration de 2,5 × 105 cellules par 50 μL ou 5 × 10à 6 par mL.
    4. Pipette 50 μL de la suspension cellulaire le long du côté de chaque puits de la microplaque de culture cellulaire à 96 puits revêtue d’adhésif cellulaire à température ambiante. Pipette 50 μL du milieu d’essai dans les puits de mesure de fond d’angle. Utilisez une pipette multicanal pour le placage des cellules afin d’assurer la cohérence.
    5. Créez une plaque d’équilibre de centrifugeuse en ajoutant 50 μL d’eau par puits d’une microplaque de culture cellulaire non revêtue de 96 puits.
    6. Centrifuger les cellules de la plaque à 200 × g pendant 1 min à température ambiante. N’appliquez pas le frein. Transférer la plaque dans un incubateur sans CO2 37 °C pendant 25-30 min pour s’assurer que les cellules sont complètement fixées. Confirmez visuellement au microscope que les cellules adhèrent de manière stable à la surface de la microplaque.
      REMARQUE: Comme ~ 6 × 106 HSPC de lignée négative peuvent être récoltés à partir des membres postérieurs d’une seule souris, des HSPC isolés de 4 souris (~ 2,4 × 107 cellules) sont nécessaires pour remplir une plaque entière de 96 puits si l’objectif est de dépister plusieurs interventions ex vivo en parallèle. Cependant, si l’objectif est d’étudier l’impact d’une altération génétique ou d’une intervention sur les paramètres métaboliques des HSPC in vivo, les HSPC isolés à partir de plusieurs paires de souris témoins et testées peuvent être analysés dans plusieurs répliques techniques en parallèle à l’aide d’une seule plaque.
  5. Effectuer un test de stress de glycolyse à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire (Temps d’étape: ~ 3 h 30 min)
    1. Cartouche de capteur de chargement avec injection de composés
      1. Préparer des solutions de glucose de 100 mM, d’oligomycine de 20 μM et de 500 mM de 2-DG dans un milieu d’essai de test d’effort de glycolyse préavertissé (pH 7,4).
        REMARQUE: Toutes les solutions de composés injectables sont fabriquées à une concentration de 10x. Les concentrations finales dans le puits sont de 10 mM pour le glucose, de 2 μM pour l’oligomycine et de 50 mM pour le 2-DG (voir le tableau 1).
      2. Retirez la cartouche de capteur hydratée de l’incubateur sans CO2 37 °C de l’étape 1.1.5. Retirez les bulles d’air de l’étrier dans la plaque utilitaire en soulevant la cartouche du capteur hors de l’étrier et en la remplaçant sur la même plaque utilitaire que l’étrier.
      3. Placez le guide de chargement A/N à plat (inclus dans le kit de dosage de flux extracellulaire) sur le dessus de la cartouche du capteur, en l’orientant de manière à ce que la lettre « A » soit située dans le coin supérieur gauche pour vous assurer que seuls les ports A sont disponibles pour le chargement. À l’aide d’une pipette multicanal, distribuer 20 μL de solution de glucose de 100 mM dans les orifices A.
      4. Remplacez le guide de chargement A/N à plat par le guide de chargement B/C à plat, en vous orientant de manière à ce que la lettre « B » soit située dans le coin supérieur gauche pour vous assurer que seuls les ports B sont disponibles pour le chargement. À l’aide d’une pipette multicanal, distribuer 22 μL de solution d’oligomycine de 20 μM dans les orifices B.
      5. Réorientez le guide de chargement B/C à plat pour localiser la lettre « C » dans le coin supérieur gauche des ports de chargement C. À l’aide d’une pipette multicanal, distribuez 25 μL de solution 2-DG de 500 mM dans les ports C.
      6. Retirez et jetez les plats du guide de chargement.
        REMARQUE: Il est important que chaque série de ports des 96 puits, y compris ceux des puits de fond, soit chargée complètement avec le même volume du composé injectable.
    2. Création, étalonnage et mesures de modèles
      1. Créez ou chargez le modèle pour le test de contrainte de glycolyse sur le contrôleur. Entrez des détails concernant les stratégies d’injection, les conditions de traitement et les types de cellules, puis appuyez sur Générer des groupes. Allez sur la carte des plaques et attribuez des puits à chaque groupe à analyser. Attribuez les 4 puits d’angle pour les mesures de fond.
      2. Dans le protocole, assurez-vous que l’étalonnage et l’équilibrage sont vérifiés à l’étape d’initialisation .
      3. Pour la mesure de base et les mesures après chaque injection (glucose, oligomycine et 2-DG), définissez le nombre de cycles de mesure sur 3 et Mélangez - Attendez - Mesurez les temps à 3 min - 0 min - 3 min (voir tableau 2).
      4. Retirez le couvercle de la cartouche de capteur chargée et hydratée, immergée dans un calibrant dans la plaque utilitaire. Placez-le sur le plateau de travail de l’analyseur de flux extracellulaire et commencez la course.
        REMARQUE: La première étape est l’étalonnage, qui prend généralement ~ 20 min.
      5. Retirez la microplaque contenant les cellules de l’incubateur sans CO2 37 °C de l’étape 2.4.6 après 25 à 30 minutes d’incubation. Sans perturber les cellules, ajouter lentement 130 μL du milieu d’essai de stress de glycolyse préavertissé (pH 7,4) par puits pour augmenter le volume de milieu dans chaque puits à 180 μL et renvoyer la plaque à l’incubateur sans CO2 37 °C pendant 15 à 20 minutes supplémentaires.
        REMARQUE: Un temps d’incubation total de 45 à 60 minutes après la centrifugation est préférable.
      6. Une fois l’étalonnage terminé, remplacez la plaque utilitaire par la microplaque d’essai (sans couvercle) contenant les cellules. Appuyez sur la plaque de cellule de charge pour démarrer les mesures, ce qui prendra environ 1,5 h pour terminer le test.
      7. Une fois les mesures terminées, prélever la microplaque d’essai contenant les cellules et retirer le milieu d’essai sans perturber les cellules. Laver une fois doucement avec 250 μL de 1x solution saline tamponnée au phosphate sans déloger les cellules.
      8. Ajouter 10 μL de tampon de lyse RIPA (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 % NP-40, 0,5 % de désoxycholate de Na, dodécylsulfate de sodium à 0,1 %, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF), complété par 1x cocktail d’inhibiteurs de protéase, à chaque puits et agiter la plaque sur un agitateur pendant 10 min. Congeler toute la plaque à -80 °C.
      9. Décongelez la plaque et effectuez un test de mesure des protéines pour la normalisation des données en suivant les instructions du fabricant.
      10. Récupérez et analysez les données. Ouvrez le fichier de données à l’aide du logiciel Wave Desktop. Cliquez sur Normaliser et collez les valeurs de normalisation pour chaque puits. Cliquez sur Appliquer pour normaliser les données. Cliquez sur Exporter et sélectionnez générateur de rapports de test de stress de glycolyse pour exporter les données analysées vers un générateur de rapports. Vous pouvez également exporter les données vers une application externe.
        REMARQUE: Alternativement, la teneur totale en ADN nucléaire dans chaque puits peut être utilisée pour normaliser les données. Un colorant fluorescent, tel que CyQuant qui se lie à l’acide nucléique, peut être utilisé pour évaluer la teneur totale en ADN nucléaire par puits.
  6. Réalisation d’un test de stress mitochondrial à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire (Temps d’étape: ~ 3 h 30 min)
    1. Cartouche de capteur de chargement avec injection de composés
      1. Préparer 20 μM d’oligomycine, 20 μM de FCCP et 5 μM de roténone + 5 μM d’antimycine A dans un milieu d’essai de stress mitochondrial préavertissé (pH 7,4).
        REMARQUE: Toutes les solutions de composés injectables sont fabriquées à une concentration de 10x. Les concentrations finales dans le puits sont de 2 μM pour l’oligomycine, de 2 μM pour le FCCP et de 0,5 μM chacune pour la roténone et l’antimycine A (voir le tableau 3).
      2. Retirez la cartouche de capteur hydratée de l’incubateur à 37 °C de l’étape 1.1.5 et retirez les bulles d’air comme décrit précédemment à l’étape 2.5.1.2.
      3. En suivant les étapes 2.5.1.3 à 2.5.1.6, distribuer 20 μL d’oligomycine de 20 μM dans les ports A, 22 μL de 20 μM FCCP dans les ports B et 25 μL d’un mélange de 5 μM de roténone et de 5 μM d’antimycine A dans les ports C.
        REMARQUE: Il est important que chaque série de ports des 96 puits, y compris ceux des puits de fond, soit chargée complètement avec le même volume de composé injectable.
    2. Création, étalonnage et mesures de modèles
      1. Créez ou chargez le modèle pour le test de stress mitochondrial sur le contrôleur. Entrez des détails concernant les stratégies d’injection, les conditions de traitement et les types de cellules, puis appuyez sur Générer des groupes. Allez sur la carte des plaques et attribuez des puits à chaque groupe à analyser. Attribuez les 4 puits d’angle pour les mesures de fond.
      2. Dans le protocole, assurez-vous que l’étalonnage et l’équilibrage sont vérifiés à l’étape d’initialisation.
      3. Pour la mesure initiale et les mesures après chaque injection (oligomycine, FCCP et roténone + antimycine A), définissez le nombre de cycles de mesure sur 3 et Mélangez - Attendez - Mesurez les temps à 3 min - 0 min - 3 min (voir tableau 4).
      4. Démarrez l’exécution pour effectuer l’étalonnage comme à l’étape 2.5.2.4.
      5. Ajouter 130 μL du milieu d’essai mitochondrial préavertissé (pH 7,4) par puits ainsi qu’à l’étape 2.5.2.5.
      6. Commencez les mesures; récupérer et analyser les données comme dans les étapes 2.5.2.6 à 2.5.2.10. Exportez les données analysées vers le générateur de rapports de test de stress mitochondrial ou une application externe.

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Representative Results

En utilisant ce protocole, le nombre de cellules et les concentrations de divers médicaments ciblant OxPHOS (utilisés dans les tests de flux extracellulaire) ont été optimisés pour mesurer l’ECAR et l’OCR des HSPC isolés chez des souris femelles C57BL/6 âgées de 24 semaines. Tout d’abord, le test de stress de glycolyse a été effectué pour optimiser le nombre de cellules et la concentration d’oligomycine. Un nombre variable de HSPC par puits allant de 5 × 104 à 2,5 × 105 ont été utilisés dans ce test. Comme le montrent les figures 2A et 2C, le taux d’acidification non glycolytique augmente avec l’augmentation du nombre de cellules de 5 × 104 à 2,5 × 105 mais n’augmente que très peu entre 2 × 105 à 2,5 × 105 cellules. Comme prévu, l’injection de 10 mM de glucose stimule la glycolyse à tous les nombres de cellules, avec une augmentation maximale de l’ECAR observée à 2,5 × 105 cellules par puits. Cependant, l’injection de 2 μM d’oligomycine n’augmente pas davantage l’ECAR, comme prévu autrement. L’utilisation de 1 μM d’oligomycine a donné des résultats similaires (non montrés). Ces résultats pourraient être interprétés comme indiquant que ces concentrations d’oligomycine n’étaient pas optimales dans ces essais.

Cependant, les données OCR obtenues dans le même ensemble de tests de stress de glycolyse montrent que les deux concentrations d’oligomycine testées (1 μM et 2 μM) étaient effectivement efficaces, comme le suggère la baisse significative de l’OCR après l’injection d’oligomycine en raison de l’inhibition du complexe V (voir la figure 2B pour l’oligomycine de 2 μM; non montrée pour l’oligomycine de 1 μM). Aux deux concentrations d’oligomycine testées, des diminutions maximales de l’OCR ont été observées à 2,5 × 10à 5 cellules par puits. Enfin, l’injection de 50 mM 2-DG a entraîné une réduction significative de l’ECAR, ce qui implique que la glycolyse est la source d’ECAR observée dans ces expériences. Dans l’ensemble, on peut conclure que les HSPC atteignent une glycolyse maximale après l’injection de glucose dans ces tests, et ils possèdent peu ou pas de réserve glycolytique. Cela indique que, comme les CSH purifiés, les HSPC de lignée négative, qui comprennent la fraction HSC utilisée dans ce test, reposent également principalement sur la glycolyse pour leur production d’ATP. Dans les cellules à taux glycolytique élevé, il peut ne pas y avoir d’augmentation significative de la demande d’ATP lors de l’inhibition de la production d’ATP mitochondriale médiée par l’oligomycine. Les cellules pourraient facilement gérer la perte d’ATP mitochondrial sans réguler davantage la glycolyse19. Les paramètres du test de stress de glycolyse - acidification non glycolytique, glycolyse, capacité glycolytique et réserve glycolytique comme indiqué à la figure 2C - ont été calculés comme décrit précédemment dans les sections d’introduction et de protocole. Sur la base de ces données, 2,5 × 105 cellules par puits et 2 μM d’oligomycine ont été sélectionnés pour d’autres études.

Le test de stress mitochondrial a été utilisé pour l’optimisation de la concentration de FCCP. Dans ce test, 2,5 × 105 HSPC ont été utilisés par puits, comme optimisé précédemment via le test de stress de glycolyse. Comme le montre la figure 3A, le test commence par la mesure de l’OCR de base suivie d’une injection d’oligomycine de 2 μM, entraînant une réduction significative de l’OCR via l’inhibition du complexe V. Après des mesures OCR post-injection d’oligomycine, le FCCP a été injecté à des concentrations variables : 0,5 μM, 1 μM, 1,5 μM et 2 μM. Comme indiqué précédemment, le FCCP inverse la répression induite par l’oligomycine du flux d’électrons à travers l’ETC en découplant le transport de protons d’OxPHOS et force le complexe IV à consommer de l’oxygène au maximum. Comme le montre la figure 3A, le FCCP stimule l’OCR dans les HSPC d’une manière dose-dépendante avec une augmentation maximale de l’OCR observée à 2 μM de FCCP. Enfin, un mélange de roténone de 0,5 μM et d’antimycine A de 0,5 μM a été injecté, ce qui arrête complètement le flux d’électrons à travers l’ETC, et l’OCR diminue à son niveau minimal. L’OCR mesurée après injection de roténone et d’antimycine A correspond à la consommation d’oxygène non mitochondriale. D’autres paramètres du test de stress mitochondrial - respiration basale, respiration maximale, fuite de protons, production d’ATP, capacité respiratoire inutilisée et efficacité du couplage comme indiqué à la figure 3B - ont été calculés comme décrit précédemment dans les sections d’introduction et de protocole. Enfin, 2 μM de FCCP ont été sélectionnés pour d’autres études.

Figure 1
Figure 1 : Représentation schématique de l’évaluation de la fonction glycolytique et de la respiration mitochondriale à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire. Les séquences et les moments d’injection de divers composés effecteurs utilisés dans le test de stress glycolytique (A) et le test de stress mitochondrial (B) sont montrés. (A) Les paramètres glycolytiques, la glycolyse, la capacité glycolytique, la réserve glycolytique et l’acidification non glycolytique, et (B) les paramètres de la fonction mitochondriale, la respiration basale, la respiration liée à l’ATP, la respiration maximale, la consommation d’oxygène non mitochondriale, la fuite de protons et la capacité respiratoire inutilisée sont décrits. Abréviations: ECAR = taux d’acidification extracellulaire; 2-DG = 2-désoxy-D-glucose; OCR = taux de consommation d’oxygène; FCCP = cyanure de carbonyle-4 (trifluorométhoxy) phénylhydrazone; Pourrir. = roténone; Anti. A = antimycine A. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Évaluation de la fonction glycolytique chez les HSPC de souris. Le test d’effort de glycolyse a été effectué pour mesurer (A) les taux d’acidification extracellulaire (ECAR, mpH/min) et (B) les taux de consommation d’oxygène (OCR, pmol/min) des HSPC isolés chez des souris femelles C57BL/6 âgées de 24 semaines. Aux moments indiqués, du glucose (10 mM), de l’oligomycine (2 μM) et du 2-DG (50 mM) ont été injectés. (C) L’ECAR est calculé comme l’acidification non glycolytique, la glycolyse, la capacité glycolytique et la réserve glycolytique par 5 × 104, 1 × 105, 1,5 × 105, 2 × 105 et 2,5 × 105 HSPC/puits. Les données sont présentées comme moyennes ± SEM, n = 4. Abréviations : HSPC = cellules souches hématopoïétiques et cellules progénitrices primitives; ECAR = taux d’acidification extracellulaire; 2-DG = 2-désoxy-D-glucose; OCR = taux de consommation d’oxygène. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Évaluation de la respiration mitochondriale chez les HSPC de souris. Un test de stress mitochondrial a été effectué pour mesurer (A) les taux de consommation d’oxygène (pmol / min) des HSPC isolés chez des souris femelles C57BL / 6 âgées de 24 semaines. Aux moments indiqués, l’oligomycine (2 μM), le FCCP (0,5 μM, 1 μM, 1,5 μM, 2 μM), la roténone et l’antimycine A (Rot./AA, 0,5 μM chacun) ont été injectés. (B) L’OCR est calculée comme la consommation d’oxygène non mitochondriale, la respiration basale, la fuite de protons, la respiration maximale (par 0,5 μM, 1 μM, 1,5 μM et 2 μM FCCP), la production d’ATP, la capacité respiratoire de rechange (par 0,5 μM, 1 μM, 1,5 μM et 2 μM FCCP) et l’efficacité de couplage par 2,5 × 105 HSPC/ puits. Les données sont présentées comme moyennes ± SEM, n = 4. Abréviations : HSPC = cellules souches hématopoïétiques et cellules progénitrices primitives; OCR = taux de consommation d’oxygène; FCCP = cyanure de carbonyle-4 (trifluorométhoxy) phénylhydrazone; Pourrir. = roténone; AA = antimycine A. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Port d’injection Volume du port Composé injectable (10x concentré) Concentration finale de composé dans le puits
Un 20 μL Glucose (100 mM) 10 mM
B 22 μL Oligomycine (20 μM) 2 μM
C 25 μL 2-DG (500 mM) 50 mM

Tableau 1 : Stratégie d’injection pour le test de stress de glycolyse. Abréviation : 2-DG = 2-désoxy-D-glucose.

1 Étalonnage
2 Équilibration
3 Injections et mesures
Cycles Mélanger Attendre Mesurer
Base de référence (acidification non glycolytique) 3 fois 3 min 0 min 3 min
Inject Port A: Glucose 3 fois 3 min 0 min 3 min
Injecter Le port B : Oligomycine 3 fois 3 min 0 min 3 min
Injecter le port C: 2-DG 3 fois 3 min 0 min 3 min

Tableau 2 : Programme d’analyse de flux extracellulaire pour le test de stress de glycolyse. Abréviation : 2-DG = 2-désoxy-D-glucose.

Port d’injection Volume du port Composé injectable (10x concentré) Concentration finale de composé dans le puits
Un 20 μL Oligomycine (20 μM) 2 μM
B 22 μL FCCP (20 μM) 2 μM
C 25 μL Roténone (5 μM) + antimycine A (5 μM) 0,5 μM chacun

Tableau 3 : Stratégie d’injection pour le test de stress mitochondrial. Abréviation : FCCP = cyanure de carbonyle-4 (trifluorométhoxy) phénylhydrazone.

1 Étalonnage
2 Équilibration
3 Injections et mesures
Cycles Mélanger Attendre Mesurer
Mesures de référence 3 fois 3 min 0 min 3 min
Injecter Le port A : Oligomycine 3 fois 3 min 0 min 3 min
Port d’injection B: FCCP 3 fois 3 min 0 min 3 min
Inject port C: Roténone & Antimycine A 3 fois 3 min 0 min 3 min

Tableau 4 : Programme d’analyse de flux extracellulaire pour le test de stress mitochondrial. Abréviation : FCCP = cyanure de carbonyle-4 (trifluorométhoxy) phénylhydrazone.

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Discussion

Cet article de méthode décrit un protocole optimisé pour l’évaluation de la bioénergétique cellulaire (glycolyse et OxPHOS) dans les HSPC de souris à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire Seahorse. Cet appareil est un outil puissant qui mesure simultanément l’ECAR et l’OCR des cellules vivantes, qui sont des mesures de la glycolyse et de la respiration mitochondriale, respectivement. Ainsi, il peut être utilisé pour évaluer la bioénergétique cellulaire en temps réel. De plus, la plate-forme à base de microplaques à 96 puits offre une quantification à haut débit avec une sensibilité élevée, permettant l’analyse simultanée de plusieurs échantillons à l’aide d’une seule plaque, par rapport à un autre respiromètre à haute résolution, l’Oroboros O2k, qui ne peut analyser que 2 échantillons simultanément, ou l’électrode Clark classique20.

L’analyseur de flux extracellulaire a principalement été utilisé pour l’analyse des types de cellules adhérentes, car il nécessite la présence de cellules dans une monocouche, ce qui rend plus difficile l’analyse des cellules cultivées en suspension. De plus, après l’injection de drogue à partir du port, des turbulences se produisent pendant le cycle de mélange médicament-milieu dans les puits avant les mesures, ce qui peut déloger les cellules. Par conséquent, les cellules doivent être fermement attachées au fond du puits. Les protocoles décrits ici ont utilisé une formulation adhésive cellulaire de protéines polyphénoliques non immunogènes extraites de la moule marine, Mytilus edulis, pour préparer une monocouche adhérente de HSPC murins.

Une autre limite de cette technologie est le coût par essai, qui est très élevé par rapport à l’électrode de type Clark et à l’Oroboros O2k. Les cartouches sont relativement chères et ne peuvent pas être réutilisées. On estime que le coût de l’analyseur de flux extracellulaire lui-même est environ 4 fois plus élevé que celui de l’Oroboros O2k20. Cependant, compte tenu de la semi-automatisation et de la capacité de haut débit de l’analyseur de flux extracellulaire, une quantité beaucoup plus importante de données peut être collectée par exécution qu’avec l’O2k.

Les résultats obtenus ici montrent que 2,5 × 105 HSPC par puits sont nécessaires pour obtenir des données fiables à l’aide d’un analyseur de flux extracellulaire à 96 puits. Cela ajoute un autre défi dans la réalisation de tests de flux à l’aide de HSPC, qui sont difficiles à obtenir en grande quantité à partir d’une souris et nécessitent un tri cytométrique en flux pour obtenir une population pure. De plus, le tri en flux ajoute beaucoup de temps à l’expérience et pourrait modifier le phénotype métabolique des cellules progénitrices. Pour surmonter les limites associées à la purification basée sur la cytométrie en flux, la stratégie discutée ici a utilisé des anticorps spécifiques à la lignée liés à des billes magnétiques pour épuiser les progéniteurs engagés dans la lignée, enrichissant ainsi les HSPC négatifs à la lignée. Pour enrichir davantage les HSPC plus primitifs, une étape d’enrichissement cKit supplémentaire peut être ajoutée ; cependant, cela s’accompagne du coût d’un temps ex vivo supplémentaire (~ 1,5 h) et d’une réduction du nombre de cellules. L’utilisation d’un tel protocole nécessiterait une optimisation en dehors du champ d’application de ce protocole.

Pour maintenir leur pluripotence, les CSH doivent rester au repos et résider préférentiellement dans l’environnement hypoxique à l’intérieur de la moelle osseuse 9,21. On pense que les CSH quiescents dépendent principalement de la glycolyse pour répondre à leurs modestes besoins énergétiques, car des niveaux élevés de ROS, un sous-produit de la respiration mitochondriale, nuisent à leur tige 2,3. Les CSH possèdent une masse mitochondriale relativement élevée, mais largement inactive, maintenant les ROS cellulaires à de faibles niveaux pour permettre le maintien de la pluripotence des CSH9. Cependant, au cours de l’engagement et de la différenciation, les mitochondries deviennent la principale source de production d’ATP dans lesCSH 5,9. Ainsi, les mitochondries jouent un rôle clé dans la transition des CSH de la quiescence à l’état métaboliquement actif requis pour leur engagement et leur différenciation de la lignée. En plus de produire de l’ATP via OxPHOS, les mitochondries jouent de nombreux autres rôles importants dans l’homéostasie des cellules hématopoïétiques, notamment la régulation des ROS, l’apoptose, la signalisation du calcium et la synthèse de l’hème et de nombreux autres intermédiaires métabolites critiques9. Les altérations des fonctions mitochondriales pourraient avoir un impact significatif sur les voies de différenciation HSC /progéniteur et pourraient contribuer à divers troubles hématologiques, tels que les tumeurs malignes hématopoïétiques, la dysérythropoïèse congénitale et les anémies sidéroblastiques, et les syndromes myélodysplasiques13. Dans les cellules hématopoïétiques malignes, les mitochondries dysfonctionnelles jouent un rôle essentiel dans la résistance à l’apoptose induite par divers médicaments cytotoxiques13.

En raison du rôle central des mitochondries dans le maintien de l’homéostasie HSC / progéniteur, des informations précieuses sur l’état physiologique de ces cellules peuvent être obtenues en évaluant leur OxPHOS mitochondrial dans des conditions normales et de stress. L’identification de nouveaux modulateurs des activités mitochondriales pourrait identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des anomalies hématologiques. Le protocole décrit dans cet article peut être utilisé pour examiner les effets de composés chimiques ou de bibliothèques CRISPR métaboliques sur l’OCR et l’ECAR des CSH dans des conditions normales et pathologiques , par exemple des CSH récoltés à partir de modèles murins génétiquement modifiés de troubles hématologiques. Un tel dépistage pourrait également être utile pour élucider les voies métaboliques qui maintiennent la puissance des CSH dans leur niche hypoxique, ce qui serait utile pour concevoir des stratégies d’expansion in vitro des CSH tout en maintenant leur pluripotence à des fins thérapeutiques. Compte tenu de la nature à haut débit de cette analyse, le protocole décrit ici pourrait facilement être adapté pour dépister un grand nombre de modulateurs bioénergétiques dans les CSH, les progéniteurs hématopoïétiques et les cellules hématopoïétiques malignes.

En résumé, les méthodes présentées ici décrivent des protocoles optimisés pour mesurer l’ECAR et l’OCR dans les HSPC primaires de souris à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire. Les résultats obtenus à partir du test de stress de glycolyse ont montré que 2,5 × 105 cellules par puits et 2 μM d’oligomycine sont optimaux pour une analyse plus approfondie. En utilisant 2,5 × 105 cellules par puits et 2 μM d’oligomycine, le test de stress mitochondrial a été effectué pour optimiser la concentration de FCCP, et 2 μM de FCCP ont été trouvés pour induire une OCR maximale. Bien que la présente étude soit principalement axée sur les HSPC de souris, le protocole et cette approche pourraient facilement être adaptés pour optimiser les conditions d’analyse pour tout type de cellules de suspension.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Les travaux en laboratoire Lombard sont soutenus par les NIH (NIGMS R01GM101171, NIEHS R21ES032305), doD (CA190267, CA170628, NF170044 et ME200030) et la Glenn Foundation for Medical Research. Le travail en laboratoire Li est soutenu par les NIH (NHLBI 5R01HL150707).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 μm filter Corning 430626 Used to filter-sterilize the assay media
100 mM sodium pyruvate Life Technologies 11360-070 Component of mitochondrial stress test assay medium
15 mL conical Falcon tubes Corning 352096 Used during HSPCs harvest and to prepare assay drug solutions
200 mM L-glutamine Life Technologies 25030-081 Component of glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media
2-Deoxy-D-glucose (2-DG) Sigma-Aldrich D8375 3rd drug injection during glycolysis stress test
5x Enrichment buffer (MojoSort) Biolegend 480017 Used for washings during HSPCs harvest
Ammonium chloride (NH4Cl) Fisher Scientific A661-3 Component of ACK lysis buffer
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674 3rd drug injection during mitochondrial stress test
Bio-Rad DC protein assay kit Bio-Rad 500-0112 Used as per manufacturer's instructions
Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) Sigma-Aldrich C2920 2nd drug injection during mitochondrial stress test
Cell-Tak Corning 354240 Cell adhesive. Used for coating cell microplates
Countes 3 Automated Cell Counter ThermoFisher Scientific For cell counting
EDTA Fisher Scientific O2793-500 Component of ACK lysis buffer and RIPA lysis buffer
Falcon 70 μm filter Fisher Scientific 08-771-2 Used as cells strainer during HSPCs harvest
Gibco Fetal bovine serum (FBS) Fisher Scientific 26400044 Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest
Gibco HBSS Fisher Scientific 14175095 Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest
Glucose Sigma-Aldrich G7528 Component of mitochondrial stress test assay medium and first injection of glycolysis stress test
Oligomycin Sigma-Aldrich O4876 2nd drug injection during glycolysis stress test and 1st drug injection during mitochondrial stress test
PBS Life Technologies 10010-049 Used to wash cells after assay for protein quantification
Potassium bicarbonate (KHCO3) Fisher Scientific P235-500 Component of ACK lysis buffer
Protease Inhibitor Cocktail (PIC) Roche 11836170001 Supplied as tablets. One tablet was dissolved in 10 mL of RIPA buffer to make 1x PIC.
Rat biotin antimouse-B220, Clone ID: RA3-6B2 Biolegend 103203 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD2, Clone ID: RM2-5 Biolegend 100103 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD3, Clone ID: 17A2 Biolegend 100243 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD5, Clone ID: 53-7.3 Biolegend 100603 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD8, Clone ID: 53-6.7 Biolegend 100703 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-Gr-1, Clone ID: RB6-8C5 Biolegend 108403 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-Ter-119, Clone ID: TER-119 Biolegend 116203 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rotenone Sigma-Aldrich R8875 3rd drug injection during mitochondrial stress test
Seahorse XFe96 extracellular flux analyzer Seahorse Biosciences now Agilent For ECAR and OCR measurments in real time.
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 Used to make Cell-adhesive solution for microplate coating
Sodium chloride (NaCl) Fisher BP358 Component of RIPA lysis buffer
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750 Component of RIPA lysis buffer
Sodium Fluoride (NaF) Sigma-Aldrich S7920 Component of RIPA lysis buffer
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S8045 Prepared 1 N solution. Used for pH normalization
Streptavidin Nanobeads (MojoSort) Biolegend 480015 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Tris-HCl Fisher BP153 Component of RIPA lysis buffer
XF base medium Agilent 102353-100 base medium used to prepare glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media
XF prep station Seahorse Biosciences Used for non-CO2 37 °C incubations
XFe96 extracellular FluxPak Agilent 102416-100 or 102601-100 Includes assay cartridges with utility plates, loading guide flats for loading
drugs onto the assay cartridge, XF calibrant solution, and XF cell culture microplate

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Évaluation de la bioénergétique cellulaire dans les cellules souches hématopoïétiques et progénitrices primitives de souris à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire
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Kumar, S., Jones, M., Li, Q., Lombard, D. B. Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer. J. Vis. Exp. (175), e63045, doi:10.3791/63045 (2021).

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