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Biology

माउस हेमटोपोइएटिक स्टेम और आदिम पूर्वज कोशिकाओं में सेलुलर बायोएनर्जेटिक्स का मूल्यांकन बाह्य कोशिकीय फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग करके

Published: September 24, 2021 doi: 10.3791/63045
Automatic Translation
1, 2, 2,3,4, 1,4,5
1Department of Pathology, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Cellular and Developmental Biology, University of Michigan, Ann Arbor, 4Rogel Cancer Center, University of Michigan, Ann Arbor, 5Institute of Gerontology, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

यहां प्रस्तुत विधि गैर-अनुयायी माउस हेमटोपोइएटिक स्टेम और आदिम पूर्वज कोशिकाओं (एचएसपीसी) में सेलुलर बायोएनर्जेटिक्स का आकलन करने के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल को सारांशित करती है, जो वास्तविक समय में एचएसपीसी की बाह्य कोशिकीय अम्लीकरण दर (ईसीएआर) और ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) को मापने के लिए बाह्य कोशिकीय फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग करती है।

Abstract

स्थिर स्थिति के तहत, हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल (एचएससी) काफी हद तक क्विसेंट रहते हैं और माना जाता है कि वे अपनी ऊर्जावान जरूरतों को पूरा करने के लिए मुख्य रूप से ग्लाइकोलाइसिस पर निर्भर हैं। हालांकि, संक्रमण या रक्त की हानि जैसी तनाव की स्थिति में, एचएससी प्रोलिफेरेटिव बन जाते हैं और तेजी से डाउनस्ट्रीम पूर्वज कोशिकाओं का उत्पादन करते हैं, जो बदले में आगे अंतर करते हैं, अंततः परिपक्व रक्त कोशिकाओं का उत्पादन करते हैं। इस संक्रमण और भेदभाव प्रक्रिया के दौरान, एचएससी क्विसेंस से बाहर निकलते हैं और तेजी से ग्लाइकोलाइसिस से ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन (ऑक्सफॉस) तक एक चयापचय स्विच से गुजरते हैं। विभिन्न तनाव की स्थिति, जैसे कि उम्र बढ़ने, कैंसर, मधुमेह और मोटापा, माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकते हैं और इस प्रकार हेमटोपोइसिस के दौरान एचएससी और पूर्वजों के चयापचय रीप्रोग्रामिंग और भेदभाव को बदल सकते हैं। सामान्य और तनाव की स्थिति में एचएससी और पूर्वजों के ग्लाइकोलाइटिक और माइटोकॉन्ड्रियल कार्यों में मूल्यवान अंतर्दृष्टि को उनकी बाह्य कोशिकीय अम्लीकरण दर (ईसीएआर) और ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) के मूल्यांकन के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है, जो क्रमशः सेलुलर ग्लाइकोलाइसिस और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के संकेतक हैं।

यहां, माउस अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न वंश-नकारात्मक सेल आबादी में ईसीएआर और ओसीआर को मापने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है, जिसमें हेमटोपोइएटिक स्टेम और आदिम पूर्वज कोशिकाएं (एचएसपीसी) दोनों शामिल हैं, जो बाहरी फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग करते हैं। यह प्रोटोकॉल माउस अस्थि मज्जा से वंश-नकारात्मक कोशिकाओं को अलग करने के दृष्टिकोण का वर्णन करता है, सेल सीडिंग घनत्व और 2-डीऑक्सी-डी-ग्लूकोज (2-डीजी, एक ग्लूकोज एनालॉग जो ग्लाइकोलाइसिस को रोकता है) और विभिन्न ऑक्सएफओएस-लक्षित दवाओं (ओलिगोमाइसिन, एफसीसीपी, रोटेनोन और एंटीमाइसिन ए) के अनुकूलन की व्याख्या करता है, और इन assays में उपयोग की जाने वाली दवा उपचार रणनीतियों का वर्णन करता है। ग्लाइकोलाइटिक फ्लक्स के प्रमुख पैरामीटर, जैसे कि ग्लाइकोलाइसिस, ग्लाइकोलाइटिक क्षमता, और ग्लाइकोलाइटिक रिजर्व, और ऑक्सफॉस पैरामीटर, जैसे बेसल श्वसन, अधिकतम श्वसन, प्रोटॉन रिसाव, एटीपी उत्पादन, अतिरिक्त श्वसन क्षमता और युग्मन दक्षता, इन assays में मापा जा सकता है। यह प्रोटोकॉल गैर-अनुयायी HSPCs पर ECAR और OCR माप की अनुमति देता है और किसी भी प्रकार के निलंबन कोशिकाओं के लिए विश्लेषण शर्तों को अनुकूलित करने के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है।

Introduction

हेमटोपोइसिस वह प्रक्रिया है जिसके द्वारा एचएससी1 से अत्यधिक विशिष्ट कार्यों के साथ विभिन्न प्रकार की परिपक्व रक्त कोशिकाएं बनती हैं। एचएससी विभिन्न बहु-शक्तिशाली और वंश-विशिष्ट पूर्वज आबादी में आत्म-नवीकरण और भेदभाव करने में सक्षम हैं। ये पूर्वज अंततः लिम्फोइड, माइलॉयड, एथेरॉइड और मेगाकैरियोसाइट्स वंशों की कोशिकाओं का उत्पादन करते हैं। अपनी आत्म-नवीकरण क्षमता को बनाए रखने के लिए, एचएससी काफी हद तक क्विसेंट रहते हैं और, अन्य ऊतक स्टेम कोशिकाओं की तरह, माना जाता है कि एटीपी उत्पादन 2,3 के लिए माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सएफओएस के बजाय ग्लाइकोलाइसिस पर भरोसा करते हैं। सेल चक्र में प्रवेश से श्वसन और ऑक्सएफओएस में वृद्धि होती है, जिसके परिणामस्वरूप प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) का ऊंचा स्तर होता है, जो एचएससी रखरखाव और कार्य3 के लिए हानिकारक हैं। इस प्रकार बार-बार सेल विभाजन एचएससी की आत्म-नवीकरण क्षमता को कम कर सकता है और अंततः उनकी थकावट के लिए।

वयस्क हेमटोपोइसिस में, एचएससी मुख्य रूप से असममित सेल विभाजन से गुजरते हैं, जिसके दौरान बेटी कोशिकाओं में से एक एचएससी क्षमता को बनाए रखता है और ग्लाइकोलाइटिक चयापचय पर भरोसा करना जारी रखता है। दूसरी बेटी कोशिका एक आदिम पूर्वज कोशिका बन जाती है जो आत्म-नवीकरण क्षमता खो देती है लेकिन फैलती है और अंततः विभेदित कार्यात्मक हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं को जन्म देतीहै। जब एचएससी डाउनस्ट्रीम पूर्वजों का उत्पादन करने के लिए अंतर करते हैं, तो ग्लाइकोलाइसिस से माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय तक एक स्विच को इस तेजी से संक्रमण5 का समर्थन करने के लिए आवश्यक ऊर्जा और बिल्डिंग ब्लॉकों की आपूर्ति करने के लिए माना जाता है, जैसा कि टिप्पणियों द्वारा सुझाव दिया गया है कि एचएससी के पास निष्क्रिय माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान 6,7,8,9 है। . इसके विपरीत, माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि (लिंक्ड आरओएस स्तरों द्वारा इंगित) एचएससी 9,10,11 की तुलना में वंश-प्रतिबद्ध पूर्वजों में बहुत अधिक है। मेटाबोलिक परिवर्तन जो हेमेटोपोइसिस के शुरुआती चरण के दौरान होते हैं, इस प्रकार एचएससी भाग्य को विनियमित करने में माइटोकॉन्ड्रिया की प्रत्यक्ष और महत्वपूर्ण भूमिका का सुझाव देते हैं।

विभिन्न तनाव स्थितियों के तहत मौजूद बेकार माइटोकॉन्ड्रिया, जैसे कि उम्र बढ़ने, कैंसर, मधुमेह और मोटापा12, एचएससी आत्म-नवीकरण क्षमता में हस्तक्षेप कर सकते हैं, आरओएस की अत्यधिक मात्रा का उत्पादन करके एचएससी / पूर्वज भेदभाव में असंतुलन को प्रेरित कर सकते हैं, एटीपी उत्पादन को खराब कर सकते हैं, और / या अन्य चयापचय प्रक्रियाओं को बदलकर 9,12,13 . एचएससी / पूर्वज भेदभाव में चयापचय होमियोस्टैसिस में गड़बड़ी हेमटोपोइसिस को काफी प्रभावित कर सकती है, संभावित रूप से हेमेटोलॉजिकल असामान्यताओं के विकास में योगदानदे सकती है। एचएससी स्टेमनेस और भेदभाव पर ग्लाइकोलाइसिस और माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सएफओएस के महत्वपूर्ण प्रभावों को देखते हुए, सामान्य और तनाव की स्थिति में चयापचय दोनों मापदंडों की जांच करना दिलचस्पी है। एचएससी और पूर्वज कोशिकाओं के ग्लाइकोलाइटिक और माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन में मूल्यवान अंतर्दृष्टि उनके ईसीएआर और ओसीआर का आकलन करके प्राप्त की जा सकती है, जो क्रमशः सेलुलर ग्लाइकोलाइसिस और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के संकेतक हैं।

Seahorse extracellular flux analyzer एक शक्तिशाली उपकरण है जो लाइव कोशिकाओं में ECAR और OCR को एक साथ मापने के लिए प्रति अच्छी तरह से दो जांच से सुसज्जित है और इस प्रकार इसका उपयोग विभिन्न सब्सट्रेट या अवरोधकों के जवाब में वास्तविक समय में सेलुलर बायोएनर्जेटिक्स का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। परख कारतूस विश्लेषक के साथ इस्तेमाल किया इंजेक्शन बंदरगाहों को परख के दौरान स्वचालित इंजेक्शन के लिए चार दवाओं को पकड़ने के लिए शामिल हैं. एक विशिष्ट ग्लाइकोलाइसिस तनाव परीक्षण की एक योजना को चित्र 1 ए में दिखाया गया है। परख कोशिकाओं के ECAR के माप के साथ शुरू होता है, ग्लूटामाइन युक्त ग्लाइकोलिसिस तनाव परीक्षण माध्यम में incubated लेकिन ग्लूकोज या पाइरूवेट नहीं। यह कोशिकाओं की गैर-ग्लाइकोलाइटिक गतिविधियों के कारण होने वाले अम्लीकरण का प्रतिनिधित्व करता है और इसे गैर-ग्लाइकोलाइटिक अम्लीकरण के रूप में रिपोर्ट किया जाता है। इसके बाद संतृप्त एकाग्रता पर ग्लूकोज का इंजेक्शन लगाया जाता है। ग्लाइकोलाइसिस के माध्यम से, सेल में ग्लूकोज को पाइरूवेट में परिवर्तित किया जाता है, जिसे आगे लैक्टेट का उत्पादन करने के लिए साइटोप्लाज्म में चयापचय किया जाता है, या माइटोकॉन्ड्रिया में सीओ2 और पानी का उत्पादन करने के लिए।

लैक्टेट में ग्लूकोज का रूपांतरण शुद्ध उत्पादन और बाद में प्रोटॉन को बाह्य कोशिकीय माध्यम में जारी करने का कारण बनता है, जिसके परिणामस्वरूप ईसीएआर 14,15,16 में तेजी से वृद्धि होती है। ईसीएआर में इस ग्लूकोज-प्रेरित परिवर्तन को बेसल स्थितियों के तहत ग्लाइकोलाइसिस के रूप में रिपोर्ट किया गया है। दूसरे इंजेक्शन में ओलिगोमाइसिन (एटीपी सिंथेज़ का एक अवरोधक, उर्फ जटिल वी17) होता है, जो माइटोकॉन्ड्रियल एटीपी उत्पादन को रोकता है। ओलिगोमाइसिन-मध्यस्थता वाले ऑक्सएफओएस निषेध के दौरान, कोशिकाएं अपनी ऊर्जावान मांगों को पूरा करने के लिए ग्लाइकोलाइसिस को अधिकतम रूप से नियंत्रित करती हैं। यह ईसीएआर में एक और वृद्धि का कारण बनता है, जिससे कोशिकाओं की अधिकतम ग्लाइकोलाइटिक क्षमता का पता चलता है। अधिकतम ग्लाइकोलाइटिक क्षमता और बेसल ग्लाइकोलाइसिस के बीच के अंतर को ग्लाइकोलाइटिक रिजर्व के रूप में जाना जाता है। अंत में, 2-डीजी इंजेक्ट किया जाता है, जो ईसीएआर में एक महत्वपूर्ण गिरावट का कारण बनता है, आमतौर पर गैर-ग्लाइकोलाइटिक अम्लीकरण के स्तर के करीब होता है। 2-डीजी एक ग्लूकोज एनालॉग है जो प्रतिस्पर्धात्मक रूप से हेक्सोकिनेज को बांधता है, जिसके परिणामस्वरूप ग्लाइकोलाइसिस18 का निषेध होता है। इस प्रकार, ईसीएआर में 2-डीजी-प्रेरित कमी आगे पुष्टि करती है कि ग्लाइकोलाइसिस वास्तव में ग्लूकोज और ओलिगोमाइसिन इंजेक्शन के बाद देखे गए ईसीएआर का स्रोत है।

चित्रा 1 बी एक विशिष्ट माइटोकॉन्ड्रियल तनाव परीक्षण के लिए योजनाबद्ध प्रदर्शित करता है। परख कोशिकाओं के बेसलाइन ओसीआर माप के साथ शुरू होता है, ग्लूकोज, ग्लूटामाइन, और पाइरूवेट युक्त माइटोकॉन्ड्रियल तनाव परीक्षण माध्यम में इनक्यूबेट किया जाता है। बेसल ओसीआर माप के बाद, ओलिगोमाइसिन को इस परख में इंजेक्ट किया जाता है, जो जटिल वी को रोकता है, जिससे इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला (ईटीसी) 17 के माध्यम से इलेक्ट्रॉन प्रवाह कम हो जाता है। नतीजतन, ओलिगोमाइसिन इंजेक्शन के जवाब में ओसीआर कम हो जाता है, और ओसीआर में यह कमी माइटोकॉन्ड्रियल एटीपी उत्पादन से जुड़ी होती है। दूसरे इंजेक्शन में कार्बोनिल साइनाइड -4 (ट्राइफ्लोरोमेथोक्सी) फेनिलहाइड्राज़ोन (एफसीसीपी), एक प्रोटोनोफोर और माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सएफओएस17 का एक अनकपलर शामिल है। FCCP माइटोकॉन्ड्रियल आंतरिक झिल्ली में प्रोटॉन के प्रवाह की अनुमति देकर माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटॉन ग्रेडिएंट को ध्वस्त कर देता है। FCCP इंजेक्शन के कारण, ETC के माध्यम से इलेक्ट्रॉन प्रवाह derepressed है, और जटिल IV अधिकतम स्तर पर ऑक्सीजन की खपत करता है। अधिकतम ओसीआर और बेसल ओसीआर के बीच के अंतर को अतिरिक्त श्वसन क्षमता के रूप में जाना जाता है, जो तनाव की स्थिति में बढ़ी हुई ऊर्जा मांग का जवाब देने के लिए सेल की क्षमता का एक उपाय है। अंत में, दो ईटीसी अवरोधकों (रोटेनोन, एक जटिल आई अवरोधक, और एंटीमाइसिन ए, एक जटिल III अवरोधक17) का मिश्रण इंजेक्ट किया जाता है, जो इलेक्ट्रॉन प्रवाह को पूरी तरह से बंद कर देता है, और ओसीआर कम स्तर तक कम हो जाता है। Rotenone और antimycin के बाद मापा गया OCR एक इंजेक्शन कोशिकाओं के अंदर अन्य प्रक्रियाओं द्वारा संचालित गैर-माइटोकॉन्ड्रियल OCR से मेल खाता है। गैर-माइटोकॉन्ड्रियल ओसीआर बेसल श्वसन, प्रोटॉन रिसाव और अधिकतम श्वसन की गणना को सक्षम बनाता है।

बेसल श्वसन बेसलाइन ओसीआर और गैर-माइटोकॉन्ड्रियल ओसीआर के बीच अंतर का प्रतिनिधित्व करता है। प्रोटॉन रिसाव ओलिगोमाइसिन इंजेक्शन और गैर-माइटोकॉन्ड्रियल ओसीआर के बाद ओसीआर के बीच के अंतर को संदर्भित करता है। अधिकतम श्वसन एफसीसीपी इंजेक्शन और गैर-माइटोकॉन्ड्रियल ओसीआर के बाद ओसीआर के बीच के अंतर का प्रतिनिधित्व करता है। युग्मन दक्षता की गणना बेसल श्वसन दर के लिए एटीपी उत्पादन दर के प्रतिशत के रूप में की जाती है। यह विधि पेपर एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है ECAR और OCR वंश-नकारात्मक HSPCs में Seahorse XFe96 extracellular फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग कर मापने के लिए। यह प्रोटोकॉल माउस वंश-नकारात्मक एचएसपीसी को अलग करने के दृष्टिकोण का वर्णन करता है, सेल-सीडिंग घनत्व के अनुकूलन और बाह्य कोशिकीय फ्लक्स एसेस में उपयोग की जाने वाली विभिन्न दवाओं की सांद्रता की व्याख्या करता है, और दवा उपचार रणनीतियों का वर्णन करता है।

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Protocol

सभी कशेरुक जानवरों के प्रयोगों द्वारा अनुमोदित किया गया था और जानवरों के उपयोग और देखभाल पर मिशिगन विश्वविद्यालय समिति के नियमों के अनुसार प्रदर्शन किया गया था।

1. परख से पहले दिन (कुल समय: ~ 10 मिनट)

  1. सेंसर कारतूस के जलयोजन (कदम समय: ~ 10 मिनट)
    1. बाह्य कोशिकीय फ्लक्स परख किट खोलें और सेंसर कारतूस और उपयोगिता प्लेट विधानसभा को हटाने। अगले दिन उपयोग के लिए लोडिंग गाइड फ्लैट्स सहेजें।
    2. मैन्युअल रूप से उपयोगिता प्लेट (कम 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट) से सेंसर कारतूस (ढक्कन के साथ शीर्ष हरे रंग का हिस्सा) को अलग करें और इसे उपयोगिता प्लेट के बगल में उल्टा रखें।
    3. एक multichannel पिपेट का उपयोग कर, उपयोगिता प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से 200 μL कैलिब्रेंट के साथ भरने, फ्लक्स परख किट के साथ शामिल है.
    4. सेंसर कारतूस को उपयोगिता प्लेट पर वापस रखें, जिससे कैलिब्रेंट में सेंसर को पूरी तरह से जलमग्न करना सुनिश्चित किया जा सके।
    5. एक गैर-सीओ2 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कैलिब्रेंट के साथ इकट्ठे सेंसर कारतूस और उपयोगिता प्लेट को रातभर रखें। कैलिब्रेंट के वाष्पीकरण को रोकने के लिए, सुनिश्चित करें कि इनक्यूबेटर ठीक से ह्यूमिडिफाइड है। यदि गैर-सीओ2 37 डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन के लिए एक नियमित ओवन इनक्यूबेटर का उपयोग कर रहे हैं, तो इसे ह्यूमिडिफाई करने के लिए इनक्यूबेटर के अंदर पानी युक्त एक खुला बीकर रखें। यदि उपलब्ध हो, तो सभी गैर-सीओ2 37 डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन के लिए एक एक्सएफ प्रेप स्टेशन का उपयोग करें।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, सेंसर कारतूस को एक गैर-सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में बाँझ अल्ट्राप्योर पानी के प्रति कुएंके प्रति 200 μL के साथ रातभर हाइड्रेटेड किया जा सकता है। परख के दिन इंजेक्शन बंदरगाहों को लोड करने से पहले कम से कम 45-60 मिनट, कम से कम 45-60 मिनट, 37 डिग्री सेल्सियस prewarmed calibrant के प्रति अच्छी तरह से 200 μL के साथ पानी की जगह।

2. परख के दिन (कुल समय: ~ 9 ज 30 मिनट)

नोट:: ऊपर इंगित कुल समय या तो चरण 2.5 या चरण 2.6 के अलावा चरण 2.1-2.4 की संचयी अवधि शामिल हैं।

  1. सेल-चिपकने वाला-लेपित माइक्रोप्लेट्स की तैयारी (चरण समय: ~ 1 ज 30 मिनट)
    नोट:: एक biosafety कैबिनेट में सभी चरणों का निष्पादन करें।
    1. सेल चिपकने वाला समाधान (22.4 μg / mL, सामग्री की तालिका देखें) के 2.5 मिलीलीटर तैयार करें, प्रति 96-अच्छी तरह से सेल संस्कृति माइक्रोप्लेट फ़िल्टर-स्टरलाइज़्ड 0.1 एम सोडियम बाइकार्बोनेट (पीएच 8.0) की उचित मात्रा में सेल चिपकने वाले के 56 μg को भंग करके और तुरंत उपयोग किए गए सेल चिपकने वाले स्टॉक की आधी मात्रा में 1 एन सोडियम हाइड्रॉक्साइड जोड़कर। भंवर या पिपेट को मिश्रण करने के लिए ऊपर और नीचे।
    2. 96-अच्छी तरह से सेल संस्कृति माइक्रोप्लेट खोलें (फ्लक्स परख किट के साथ शामिल) और प्रत्येक अच्छी तरह से नीचे तैयार सेल चिपकने वाला समाधान के 25 μL वितरित करें। ढक्कन के साथ माइक्रोप्लेट को कवर करें और हुड के अंदर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. इनक्यूबेशन के बाद, एक multichannel पिपेट या aspirator का उपयोग कर अतिरिक्त सेल चिपकने वाला समाधान निकालें और त्याग दें, और बाँझ ultrapure पानी के 200 μL के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से दो बार धोएं। 30-45 मिनट के लिए हुड के अंदर, ढक्कन को हटाने के साथ प्लेट को हवा से सुखाएं।
      नोट: सेल-चिपकने वाला-लेपित सेल संस्कृति माइक्रोप्लेट्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर एक सप्ताह तक संग्रहीत किया जा सकता है। 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत प्रीकोटेड माइक्रोप्लेट्स को सीडिंग कोशिकाओं से पहले हुड के अंदर कमरे के तापमान पर गर्म करने की अनुमति दी जानी चाहिए।
  2. परख मीडिया की तैयारी (कदम समय: ~ 30 मिनट)
    1. ग्लाइकोलाइसिस तनाव परीक्षण परख माध्यम की तैयारी
      1. 200 mM L-glutamine के 1 mL के साथ आधार माध्यम के 100 mL के पूरक (सामग्री की तालिका देखें)।
        नोट: परख माध्यम में अंतिम एल ग्लूटामाइन एकाग्रता 2 mM है.
      2. एक पानी स्नान में एल-ग्लूटामाइन-पूरक माध्यम को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
      3. गर्म माध्यम के पीएच को 1 एन NaOH के साथ 7.4 पर समायोजित करें।
      4. एक 0.2 μm फिल्टर के साथ माध्यम को फ़िल्टर-निष्फल करें और उपयोग करने के लिए तैयार होने तक इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    2. माइटोकॉन्ड्रियल तनाव परीक्षण परख माध्यम की तैयारी
      1. 0.45 ग्राम ग्लूकोज के साथ आधार माध्यम के 100 एमएल, 200 एमएम एल-ग्लूटामाइन के 1 एमएल, और 100 एमएम सोडियम पाइरूवेट के 1 एमएल के पूरक।
        नोट: अंतिम परख माध्यम 25 mM ग्लूकोज, 2 mM एल ग्लूटामाइन, और 1 mM सोडियम पाइरूवेट शामिल हैं.
      2. गर्म ग्लूकोज, एल-ग्लूटामाइन, और सोडियम पाइरूवेट-पूरक माध्यम से पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस तक।
      3. गर्म माध्यम के पीएच को 1 एन NaOH के साथ 7.4 पर समायोजित करें।
      4. एक 0.2 μm फिल्टर के साथ फ़िल्टर-sterilize माध्यम और उपयोग करने के लिए तैयार होने तक 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  3. हार्वेस्ट माउस वंश-नकारात्मक HSPCs (चरण समय: ~ 3 ज)
    1. 4% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ हांक संतुलित नमक समाधान पूरक द्वारा परख बफर तैयार करें। बाँझ आसुत पानी के साथ 5x स्टॉक को पतला करके 1x संवर्धन बफर तैयार करें। उपयोग करने तक दोनों बफर को बर्फ पर रखें।
    2. मानवीय रूप से सीओ2 का उपयोग कर चूहों euthanize गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद और कैंची के साथ hindlimbs को हटाने के बाद. सावधानी से हड्डियों से सभी ऊतकों को हटा दें, और कैंची का उपयोग करके फीमर और टिबिया के दोनों किनारों से सिरों को काट लें। परख बफर का उपयोग कर फीमर और टिबिया से अस्थि मज्जा कोशिकाओं को बाहर फ्लश करें। एक बाँझ 70 μm फिल्टर के माध्यम से flushed कोशिकाओं पास, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 × जी पर फिल्टर सेंट्रीफ्यूज, और supernatant त्याग.
    3. ACK बफर के 500 μL (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA, pH 7.2) में सेल गोली को फिर से निलंबित करके लाल रक्त कोशिकाओं को लाइस करें। बर्फ पर 1 मिनट के लिए lysis के बाद, परख बफर और 200 पर सेंट्रीफ्यूज के 1 मिलीलीटर जोड़ने के द्वारा नमूनों को धोने × जी 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए. supernatant को छोड़ दें।
    4. धोने के बाद, CD2 (1: 200 कमजोर पड़ने), CD3 (1: 200 कमजोर पड़ने), CD5 (1: 200 कमजोर पड़ने), CD5 (1: 200 कमजोर पड़ने), CD8 (1: 200 कमजोर पड़ने), Ter-119 (1: 200 कमजोर पड़ने), B220 (1: 200 कमजोर पड़ने), और Gr-1 (1: 800 कमजोर पड़ने) के खिलाफ निर्देशित biotinylated एंटीबॉडी के एक कॉकटेल के साथ नमूनों को इनक्यूबेट करें, जो बर्फ पर 45 मिनट के लिए 50 μL की कुल मात्रा में 50 μL है।
    5. ऊपर के रूप में centrifugation के साथ परख बफर के 1 mL के साथ नमूनों को धोने.
    6. ऊपर के रूप में centrifugation के साथ 1x संवर्धन बफर के 1 mL के साथ नमूनों को धोएं।
    7. स्ट्रेप्टाविडिन नैनोबीड्स के 20 μL और 15 मिनट के लिए बर्फ पर 1x संवर्धन बफर के 100 μL के साथ नमूनों को इनक्यूबेट करें।
    8. ऊपर के रूप में centrifugation के साथ 1x संवर्धन बफर के 1 mL के साथ नमूनों को धोएं।
    9. 1x संवर्धन बफर के 2.5 mL में नमूनों को पुन: निलंबित करें। उन्हें 5 मिनट के लिए एक पृथक्करण चुंबक पर रखें। 15 mL शंक्वाकार ट्यूबों में अलग से supernatants ले लीजिए.
    10. 1x संवर्धन बफर के एक अतिरिक्त 2.5 मिलीलीटर में चुंबक-अलग नमूनों को फिर से निलंबित करें, और उन्हें 5 मिनट के लिए पृथक्करण चुंबक पर फिर से रखें। ले लीजिए और चरण 2.3.9 से 15 mL शंक्वाकार ट्यूबों में पूर्व संग्रह करने के लिए supernatants गठबंधन।
      नोट:: supernatants वंश-ऋणात्मक कक्ष भिन्न होते हैं।
    11. 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें जिसमें 5 मिनट के लिए नकारात्मक रूप से चयनित कोशिकाओं को 200 पर × 4 डिग्री सेल्सियस पर जी ।
    12. परख बफर के 1 मिलीलीटर में सेल छर्रों को फिर से निलंबित करें और मैन्युअल रूप से ट्राइपैन नीले रंग का उपयोग करके या एक स्वचालित सेल काउंटर जैसे काउंटेस 3 के माध्यम से सेल नंबर की गिनती करें।
      नोट: उपर्युक्त वर्णित दृष्टिकोण के बाद, ~ 6 × 106 वंश-नकारात्मक HSPCs को एक माउस के हिंडलिम्ब्स से आसानी से शुद्ध किया जाना चाहिए। यदि अभिकर्मकों, जैसे परख बफर, 1x संवर्धन बफर, और वंश-विशिष्ट एंटीबॉडी कॉकटेल, प्रयोग से पहले दिन पर तैयार किए जाते हैं, तो 4 चूहों से एचएसपीसी को समृद्ध करने के लिए लगभग 2.5-3 घंटे लगते हैं। इस संख्या से परे प्रत्येक माउस के लिए अतिरिक्त 10 मिनट लगेंगे।
  4. सेल-चिपकने वाला-लेपित माइक्रोप्लेट्स में सीडिंग कोशिकाएं (चरण समय: ~ 1 ज)
    1. 200 पर चरण 2.3.12 से सेंट्रीफ्यूज कोशिकाएं कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए × जी ।
    2. supernatant निकालें और उचित परख माध्यम (ग्लाइकोलिसिस तनाव परीक्षण माध्यम या माइटोकॉन्ड्रियल तनाव परीक्षण माध्यम) में सेल गोली resuspend. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
    3. चरण 2.4.2 को दोहराएँ। supernatant निकालें और 2.5 × 105 कोशिकाओं प्रति 50 μL या 5 × 106 प्रति mL की एकाग्रता के लिए उपयुक्त गर्म परख माध्यम में कोशिकाओं resuspend.
    4. कमरे के तापमान सेल-चिपकने वाला-लेपित 96-अच्छी तरह से सेल संस्कृति माइक्रोप्लेट के प्रत्येक कुएं के पक्ष के साथ सेल निलंबन के पिपेट 50 μL। कोने पृष्ठभूमि माप कुओं में परख माध्यम के Pipette 50 μL. स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए सेल चढ़ाना के लिए एक multichannel पिपेट का उपयोग करें।
    5. एक गैर लेपित 96-अच्छी तरह से सेल संस्कृति माइक्रोप्लेट के प्रति कुएं में पानी के 50 μL जोड़कर एक सेंट्रीफ्यूज संतुलन प्लेट बनाएँ।
    6. कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर प्लेट में कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। ब्रेक न लगाएं। प्लेट को 25-30 मिनट के लिए एक गैर-सीओ2 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि कोशिकाएं पूरी तरह से जुड़ी हुई हैं। नेत्रहीन एक माइक्रोस्कोप के तहत पुष्टि करें कि कोशिकाओं को माइक्रोप्लेट सतह पर स्थिर रूप से पालन किया जाता है।
      नोट: के रूप में ~ 6 × 106 वंश-नकारात्मक HSPCs एक माउस के hindlimbs से काटा जा सकता है, HSPCs 4 चूहों (~ 2.4 × 107 कोशिकाओं) से अलग एक पूरे 96-अच्छी तरह से प्लेट को भरने के लिए आवश्यक हैं यदि उद्देश्य समानांतर में कई हस्तक्षेप पूर्व विवो स्क्रीन करने के लिए है। हालांकि, यदि उद्देश्य एक आनुवंशिक परिवर्तन के प्रभाव की जांच करना है या विवो में एचएसपीसी के चयापचय मापदंडों पर एक हस्तक्षेप है, तो नियंत्रण और परीक्षण चूहों के कई जोड़े से अलग किए गए एचएसपीसी का विश्लेषण एक ही प्लेट का उपयोग करके समानांतर में कई तकनीकी प्रतिकृतियों में किया जा सकता है।
  5. बाह्य कोशिकीय फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग करके ग्लाइकोलाइसिस तनाव परीक्षण करना (चरण समय: ~ 3 ज 30 मिनट)
    1. इंजेक्शन यौगिकों के साथ सेंसर कारतूस लोड हो रहा है
      1. 100 mM ग्लूकोज, 20 μM oligomycin, और 500 mM 2-DG समाधान prewarmed ग्लाइकोलाइसिस तनाव परीक्षण परख माध्यम (पीएच 7.4) में तैयार करें।
        नोट:: सभी इंजेक्शन यौगिक समाधान 10x एकाग्रता पर किए जाते हैं। अंतिम अच्छी तरह से सांद्रता ग्लूकोज के लिए 10 mM, oligomycin के लिए 2 μM, और 2-DG के लिए 50 mM हैं ( तालिका 1 देखें)।
      2. चरण 1.1.5 से गैर-CO2 37 °C इनक्यूबेटर से हाइड्रेटेड सेंसर कारतूस निकालें। उपयोगिता प्लेट में कैलिब्रेंट से हवा के बुलबुले निकालें सेंसर कारतूस को कैलिब्रेंट से बाहर उठाकर और कैलिब्रेंट के साथ एक ही उपयोगिता प्लेट पर इसे बदलकर।
      3. सेंसर कारतूस के शीर्ष पर ए / डी लोडिंग गाइड फ्लैट (एक्स्ट्रासेल्युलर फ्लक्स परख किट में शामिल) रखें, इसे उन्मुख करें ताकि अक्षर 'ए' ऊपरी बाएं हाथ के कोने पर स्थित हो ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि केवल पोर्ट ए लोडिंग के लिए उपलब्ध हैं। एक multichannel पिपेट का उपयोग करते हुए, बंदरगाहों ए में 100 mM ग्लूकोज समाधान के 20 μL वितरित करें।
      4. A/D लोडिंग गाइड फ़्लैट को B/C लोडिंग गाइड फ़्लैट के साथ बदलें, ताकि यह सुनिश्चित करने के लिए कि केवल पोर्ट B लोड करने के लिए उपलब्ध हैं, ऊपरी बाएँ कोने पर अक्षर 'B' स्थित हो. एक multichannel पिपेट का उपयोग करते हुए, बंदरगाहों बी में 20 μM oligomycin समाधान के 22 μL वितरित करें।
      5. पोर्ट C लोड करने के लिए ऊपरी बाएं कोने पर अक्षर 'C' का पता लगाने के लिए B/C लोडिंग गाइड फ्लैट को फिर से उन्मुख करें। एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके, पोर्ट C में 500 mM 2-DG समाधान के 25 μL वितरित करें।
      6. निकालें और लोड हो रहा है गाइड फ्लैट्स को छोड़ दें।
        नोट: यह महत्वपूर्ण है कि सभी 96 कुओं की प्रत्येक पोर्ट श्रृंखला, जिसमें पृष्ठभूमि कुओं के लोग भी शामिल हैं, पूरी तरह से इंजेक्शन यौगिक की एक ही मात्रा के साथ लोड किया जाए।
    2. टेम्पलेट निर्माण, अंशांकन, और माप
      1. बनाएँ या नियंत्रक पर ग्लाइकोलाइसिस तनाव परीक्षण के लिए टेम्पलेट लोड करें। इंजेक्शन रणनीतियों, उपचार की स्थिति, और सेल प्रकारों के बारे में विवरण दर्ज करें, और समूह उत्पन्न करें दबाएँ। प्लेट मानचित्र पर जाएं और विश्लेषण करने के लिए प्रत्येक समूह को कुओं को असाइन करें। पृष्ठभूमि माप के लिए 4 कोने कुओं असाइन करें।
      2. प्रोटोकॉल में, सुनिश्चित करें कि अंशांकन और संतुलन प्रारंभ चरण में चेक किए गए हैं।
      3. प्रत्येक इंजेक्शन (ग्लूकोज, ओलिगोमाइसिन, और 2-डीजी) के बाद बेसलाइन माप और माप के लिए, माप चक्रों की संख्या को 3 और मिक्स - प्रतीक्षा करें - मापने के समय को 3 मिनट - 0 मिनट - 3 मिनट ( तालिका 2 देखें) पर सेट करें।
      4. लोड किए गए और हाइड्रेटेड सेंसर कारतूस, उपयोगिता प्लेट में कैलिब्रेंट में डूबे यौगिकों से ढक्कन निकालें। इसे एक्स्ट्रासेल्युलर फ्लक्स विश्लेषक के काम ट्रे पर रखें और रन शुरू करें।
        नोट: पहला कदम अंशांकन है, जो आमतौर पर ~ 20 मिनट लेता है।
      5. इनक्यूबेशन के 25-30 मिनट के बाद चरण 2.4.6 से गैर-सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से कोशिकाओं वाले माइक्रोप्लेट को बाहर निकालें। कोशिकाओं को परेशान किए बिना, धीरे-धीरे 130 μL prewarmed ग्लाइकोलाइसिस तनाव परीक्षण परख माध्यम (पीएच 7.4) प्रति अच्छी तरह से जोड़ने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से 180 μL करने के लिए मध्यम मात्रा बनाने के लिए और अतिरिक्त15-20 मिनट के लिए गैर-CO 2 37 °C इनक्यूबेटर के लिए प्लेट वापस.
        नोट: centrifugation के बाद 45-60 मिनट का कुल इनक्यूबेशन समय पसंद किया जाता है।
      6. अंशांकन खत्म होने के बाद, परख माइक्रोप्लेट (ढक्कन के बिना) कोशिकाओं युक्त के साथ उपयोगिता प्लेट की जगह. प्रेस लोड सेल प्लेट माप शुरू करने के लिए, जो परख के पूरा होने के लिए ~ 1.5 ज ले जाएगा.
      7. माप खत्म होने के बाद, कोशिकाओं युक्त परख microplate इकट्ठा और कोशिकाओं को परेशान किए बिना परख माध्यम को हटाने. कोशिकाओं को विस्थापित किए बिना 1x फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा के 250 μL के साथ धीरे से एक बार धोएं।
      8. RIPA लाइसिस बफर के 10 μL जोड़ें (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1% NP-40, 0.5% Na deoxycholate, 0.1% सोडियम dodecylsulfate, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF), प्रत्येक अच्छी तरह से 1x प्रोटीज इनहिबिटर कॉकटेल के साथ पूरक, और 10 मिनट के लिए एक शेकर पर प्लेट को उत्तेजित करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर पूरी प्लेट फ्रीज करें।
      9. प्लेट को पिघलाएं, और निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए डेटा सामान्यीकरण के लिए एक प्रोटीन माप परख करें।
      10. डेटा पुनर्प्राप्त करें और उसका विश्लेषण करें. वेव डेस्कटॉप सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डेटा फ़ाइल खोलें. Normalize पर क्लिक करें और प्रत्येक अच्छी तरह से के लिए सामान्यीकरण मूल्यों को पेस्ट करें। डेटा को सामान्य करने के लिए Apply पर क्लिक करें। निर्यात पर क्लिक करें और एक रिपोर्ट जनरेटर के लिए विश्लेषण किए गए डेटा को निर्यात करने के लिए ग्लाइकोलाइसिस तनाव परीक्षण रिपोर्ट जनरेटर का चयन करें। वैकल्पिक रूप से, डेटा को किसी बाहरी अनुप्रयोग में निर्यात करें.
        नोट: वैकल्पिक रूप से, प्रत्येक कुएं में कुल परमाणु डीएनए सामग्री का उपयोग डेटा को सामान्य करने के लिए किया जा सकता है। एक फ्लोरोसेंट डाई, जैसे कि CyQuant जो न्यूक्लिक एसिड को बांधता है, का उपयोग कुल परमाणु डीएनए सामग्री का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।
  6. एक्स्ट्रासेल्युलर फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग करके एक माइटोकॉन्ड्रियल तनाव परीक्षण करना (चरण समय: ~ 3 ज 30 मिनट)
    1. इंजेक्शन यौगिकों के साथ सेंसर कारतूस लोड हो रहा है
      1. 20 μM oligomycin, 20 μM FCCP, और 5 μM rotenone + 5 μM एंटीमाइसिन तैयार करें prewarmed माइटोकॉन्ड्रियल तनाव परीक्षण परख माध्यम (पीएच 7.4) में एक समाधान।
        नोट:: सभी इंजेक्शन यौगिक समाधान 10x एकाग्रता पर किए जाते हैं। अंतिम अच्छी तरह से सांद्रता oligomycin के लिए 2 μM, FCCP के लिए 2 μM, और rotenone और antimycin A के लिए प्रत्येक 0.5 μM हैं ( तालिका 3 देखें)।
      2. चरण 1.1.5 से 37 °C इनक्यूबेटर से हाइड्रेटेड सेंसर कारतूस निकालें और चरण 2.5.1.2 में पहले वर्णित हवा के बुलबुले को निकालें।
      3. 2.5.1.3 से 2.5.1.6 तक चरणों का पालन करके, बंदरगाहों A में 20 μM ओलिगोमाइसिन के 20 μL, बंदरगाहों B में 20 μM FCCP के 22 μL, और बंदरगाहों C में 5 μM rotenone और 5 μM एंटीमाइसिन A के मिश्रण के 25 μL को वितरित करें।
        नोट: यह महत्वपूर्ण है कि सभी 96 कुओं की प्रत्येक पोर्ट श्रृंखला, पृष्ठभूमि कुओं के उन लोगों सहित, इंजेक्शन यौगिक की एक ही मात्रा के साथ पूरी तरह से लोड किया जाना चाहिए।
    2. टेम्पलेट निर्माण, अंशांकन, और माप
      1. बनाएँ या नियंत्रक पर माइटोकॉन्ड्रियल तनाव परीक्षण के लिए टेम्पलेट लोड करें। इंजेक्शन रणनीतियों, उपचार की स्थिति, और सेल प्रकारों के बारे में विवरण दर्ज करें, और समूह उत्पन्न करें दबाएँ। प्लेट मानचित्र पर जाएं और विश्लेषण करने के लिए प्रत्येक समूह को कुओं को असाइन करें। पृष्ठभूमि माप के लिए 4 कोने कुओं असाइन करें।
      2. प्रोटोकॉल में, सुनिश्चित करें कि अंशांकन और संतुलन प्रारंभ चरण में चेक किए गए हैं।
      3. प्रत्येक इंजेक्शन (oligomycin, FCCP, और rotenone + antimycin A) के बाद बेसलाइन माप और माप के लिए, माप चक्रों की संख्या को 3 पर सेट करें और मिक्स - प्रतीक्षा करें - 3 मिनट - 0 मिनट - 3 मिनट तक मापें ( तालिका 4 देखें)।
      4. चरण 2.5.2.4 के रूप में अंशांकन करने के लिए चलाएँ प्रारंभ करें।
      5. Prewarmed माइटोकॉन्ड्रियल तनाव परीक्षण परख माध्यम (पीएच 7.4) प्रति के रूप में अच्छी तरह से चरण 2.5.2.5 में 130 μL जोड़ें.
      6. माप शुरू करें; पुनः प्राप्त करें और चरण 2.5.2.6 से 2.5.2.10 के रूप में डेटा का विश्लेषण करें। माइटोकॉन्ड्रियल तनाव परीक्षण रिपोर्ट जनरेटर या किसी बाहरी अनुप्रयोग के लिए विश्लेषण किए गए डेटा को निर्यात करें।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, सेल संख्या और विभिन्न OxPHOS-लक्ष्यीकरण दवाओं की सांद्रता (बाह्य कोशिकीय फ्लक्स assays में उपयोग किया जाता है) को 24-सप्ताह की महिला C57BL / 6 चूहों से अलग किए गए HSPCs के ECAR और OCR को मापने के लिए अनुकूलित किया गया था। सबसे पहले, ग्लाइकोलाइसिस तनाव परीक्षण सेल संख्या और ओलिगोमाइसिन एकाग्रता को अनुकूलित करने के लिए किया गया था। 5 से लेकर 104 से 2.5 × × 10 5 तक की अच्छी तरह से HSPCs की एक अलग संख्या इस परख में इस्तेमालकिया गया था . जैसा कि चित्र 2A और चित्रा 2C में दिखाया गया है, गैर-ग्लाइकोलाइटिक अम्लीकरण दर 5 से 104 से 2.5 × × 10 5 तक बढ़ी हुई सेल संख्या के साथ बढ़तीहै, लेकिन केवल 2 × 10 5 से2.5 × 105 कोशिकाओं के बीच न्यूनतम रूप से बढ़ जाती है। जैसा कि अपेक्षित था, 10 एमएम ग्लूकोज का इंजेक्शन सभी सेल नंबरों पर ग्लाइकोलाइसिस को उत्तेजित करता है, जिसमें ईसीएआर में अधिकतम वृद्धि 2.5 × 105 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से देखी गई। हालांकि, ओलिगोमाइसिन के 2 μM का इंजेक्शन ECAR को और अधिक नहीं बढ़ाता है, जैसा कि अन्यथा अपेक्षित है। 1 μM oligomycin के उपयोग ने समान परिणाम दिए (नहीं दिखाए गए)। इन परिणामों की व्याख्या यह इंगित करने के लिए की जा सकती है कि ये ओलिगोमाइसिन सांद्रता इन assays में इष्टतम नहीं थे।

हालांकि, ग्लाइकोलाइसिस तनाव परीक्षणों के एक ही सेट में प्राप्त ओसीआर डेटा से पता चलता है कि दोनों परीक्षण किए गए ओलिगोमाइसिन सांद्रता (1 μM और 2 μM) वास्तव में प्रभावी थे, जैसा कि जटिल वी निषेध के कारण ओलिगोमाइसिन इंजेक्शन के बाद ओसीआर में महत्वपूर्ण गिरावट द्वारा सुझाया गया था (2 μM ओलिगोमाइसिन के लिए चित्रा 2B देखें; 1 μM ओलिगोमाइसिन के लिए नहीं दिखाया गया है)। दोनों परीक्षण किए गए ओलिगोमाइसिन सांद्रता में, ओसीआर में अधिकतम कमी 2.5 × 105 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से देखी गई थी। अंत में, 50 mM 2-DG के इंजेक्शन के परिणामस्वरूप ECAR की एक महत्वपूर्ण कमी आई, जिसका अर्थ है कि ग्लाइकोलाइसिस इन प्रयोगों में देखे गए ECAR का स्रोत है। एक साथ लिया गया, यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि एचएसपीसी इन assays में ग्लूकोज इंजेक्शन के बाद अधिकतम ग्लाइकोलाइसिस प्राप्त करते हैं, और उनके पास थोड़ा-से-कोई ग्लाइकोलाइटिक रिजर्व नहीं है। यह इंगित करता है कि, शुद्ध एचएससी की तरह, वंश-नकारात्मक एचएसपीसी, जिसमें इस परख में उपयोग किए जाने वाले एचएससी अंश शामिल हैं, उनके एटीपी उत्पादन के लिए मुख्य रूप से ग्लाइकोलाइसिस पर भी भरोसा करते हैं। उच्च ग्लाइकोलाइटिक दर वाली कोशिकाओं में, माइटोकॉन्ड्रियल एटीपी उत्पादन के ओलिगोमाइसिन-मध्यस्थता निषेध पर एटीपी की मांग में महत्वपूर्ण वृद्धि नहीं हो सकती है। कोशिकाएं आसानी से ग्लाइकोलाइसिस19 को आगे बढ़ाने के बिना माइटोकॉन्ड्रियल एटीपी के नुकसान का प्रबंधन कर सकती हैं। ग्लाइकोलाइसिस तनाव परीक्षण पैरामीटर-गैर-ग्लाइकोलाइटिक अम्लीकरण, ग्लाइकोलाइसिस, ग्लाइकोलाइटिक क्षमता, और ग्लाइकोलाइटिक रिजर्व जैसा कि चित्रा 2 सी में दिखाया गया है- की गणना की गई थी जैसा कि पहले परिचय और प्रोटोकॉल वर्गों में वर्णित किया गया था। इन आंकड़ों के आधार पर, 2.5 × प्रति अच्छी तरह से 105 कोशिकाओं और ओलिगोमाइसिन के 2 μM को आगे के अध्ययन के लिए चुना गया था।

माइटोकॉन्ड्रियल तनाव परीक्षण का उपयोग एफसीसीपी एकाग्रता के अनुकूलन के लिए किया गया था। इस परख में, 2.5 × 105 HSPCs प्रति अच्छी तरह से इस्तेमाल किया गया था, के रूप में ग्लाइकोलिसिस तनाव परीक्षण के माध्यम से पहले अनुकूलित. जैसा कि चित्रा 3 ए में दिखाया गया है, परख बेसलाइन ओसीआर के माप के साथ शुरू होती है, जिसके बाद 2 μM ओलिगोमाइसिन इंजेक्शन होता है, जिससे जटिल वी के निषेध के माध्यम से ओसीआर में महत्वपूर्ण कमी आती है। पोस्ट-ओलिगोमाइसिन इंजेक्शन ओसीआर माप के बाद, एफसीसीपी को अलग-अलग सांद्रता में इंजेक्ट किया गया था: 0.5 μM, 1 μM, 1.5 μM, और 2 μM। जैसा कि पहले संकेत दिया गया है, FCCP OxPHOS से प्रोटॉन परिवहन को अनकपल करके ईटीसी के माध्यम से इलेक्ट्रॉन प्रवाह के ओलिगोमाइसिन-प्रेरित दमन को उलट देता है और जटिल IV को अधिकतम ऑक्सीजन का उपभोग करने के लिए मजबूर करता है। जैसा कि चित्र 3A में दिखाया गया है, FCCP FCCP के 2 μM पर देखे गए OCR में अधिकतम वृद्धि के साथ एक खुराक-निर्भर तरीके से HSPCs में OCR को उत्तेजित करता है। अंत में, 0.5 μM रोटेनोन और 0.5 μM एंटीमाइसिन ए का मिश्रण इंजेक्ट किया गया था, जो ईटीसी के माध्यम से इलेक्ट्रॉन प्रवाह को पूरी तरह से बंद कर देता है, और ओसीआर अपने न्यूनतम स्तर तक कम हो जाता है। रोटेनोन और एंटीमाइसिन के बाद मापा गया ओसीआर एक इंजेक्शन गैर-माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन की खपत से मेल खाता है। अन्य माइटोकॉन्ड्रियल तनाव परीक्षण पैरामीटर-बेसल श्वसन, अधिकतम श्वसन, प्रोटॉन रिसाव, एटीपी उत्पादन, अतिरिक्त श्वसन क्षमता, और युग्मन दक्षता जैसा कि चित्रा 3 बी में दिखाया गया है- की गणना की गई थी जैसा कि पहले परिचय और प्रोटोकॉल वर्गों में वर्णित है। अंत में, FCCP के 2 μM को आगे के अध्ययन के लिए चुना गया था।

Figure 1
चित्रा 1: ग्लाइकोलाइटिक फ़ंक्शन और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के मूल्यांकन का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व बाह्य कोशिकीय फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग करके। ग्लाइकोलाइटिक तनाव परीक्षण (ए) और माइटोकॉन्ड्रियल तनाव परीक्षण (बी) में उपयोग किए जाने वाले विभिन्न प्रभावकारी यौगिकों के अनुक्रम और इंजेक्शन समय दिखाए गए हैं। (ए) ग्लाइकोलाइटिक पैरामीटर, ग्लाइकोलाइसिस, ग्लाइकोलाइटिक क्षमता, ग्लाइकोलाइटिक रिजर्व, और गैर-ग्लाइकोलाइटिक अम्लीकरण, और (बी) माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन पैरामीटर, बेसल श्वसन, एटीपी-लिंक्ड श्वसन, अधिकतम श्वसन, गैर-माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन खपत, प्रोटॉन रिसाव और अतिरिक्त श्वसन क्षमता को रेखांकित किया गया है। संक्षेप: ECAR = extracellular अम्लीकरण दर; 2-डीजी = 2-डीऑक्सी-डी-ग्लूकोज; OCR = ऑक्सीजन की खपत दर; FCCP = कार्बोनिल साइनाइड -4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone; सड़ना। = रोटेनोन; विरोधी। A = antimycin A. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: माउस HSPCs में ग्लाइकोलाइटिक समारोह का आकलन। ग्लाइकोलाइसिस तनाव परीक्षण (ए) बाह्य कोशिकीय अम्लीकरण दरों (ईसीएआर, एमपीएच / मिनट) और (बी) को मापने के लिए किया गया था एचएसपीसी की ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर, पीएमओएल / मिनट) 24 सप्ताह पुरानी मादा C57BL / 6 चूहों से अलग। कई बार संकेत दिया गया, ग्लूकोज (10 एमएम), ओलिगोमाइसिन (2 μM), और 2-डीजी (50 एमएम) को इंजेक्ट किया गया था। (ग) ईसीएआर की गणना गैर-ग्लाइकोलाइटिक अम्लीकरण, ग्लाइकोलाइसिस, ग्लाइकोलाइटिक क्षमता और ग्लाइकोलाइटिक रिजर्व प्रति 5 × 104, 1 × 10 5,1.5 × 105, 2 × 105, और 2.5 × 105 एचएसपीसी / अच्छी तरह से के रूप में की जाती है। डेटा को माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है ± SEM, n = 4। संक्षेप: HSPCs = हेमटोपोइएटिक स्टेम और आदिम पूर्वज कोशिकाएं; ECAR = extracellular अम्लीकरण दर; 2-डीजी = 2-डीऑक्सी-डी-ग्लूकोज; OCR = ऑक्सीजन की खपत दर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: माउस HSPCs में माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन का आकलन। 24 सप्ताह की मादा C57BL/6 चूहों से अलग किए गए HSPCs की ऑक्सीजन खपत दर (pmol/min) को मापने के लिए एक माइटोकॉन्ड्रियल तनाव परीक्षण किया गया था। कई बार इंगित किया गया है, ओलिगोमाइसिन (2 μM), FCCP (0.5 μM, 1 μM, 1.5 μM, 2 μM), और रोटेनोन और एंटीमाइसिन ए (Rot./AA, 0.5 μM प्रत्येक) को इंजेक्ट किया गया था। (बी) ओसीआर की गणना गैर-माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन खपत, बेसल श्वसन, प्रोटॉन रिसाव, अधिकतम श्वसन (प्रति 0.5 μM, 1 μM, 1.5 μM, और 2 μM FCCP), एटीपी उत्पादन, अतिरिक्त श्वसन क्षमता (प्रति 0.5 μM, 1 μM, 1.5 μM, और 2 μM FCCP) के रूप में की जाती है, और प्रति 2.5 × 105 HSPCs / अच्छी तरह से युग्मन दक्षता। डेटा को माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है ± SEM, n = 4। संक्षेप: HSPCs = हेमटोपोइएटिक स्टेम और आदिम पूर्वज कोशिकाएं; OCR = ऑक्सीजन की खपत दर; FCCP = कार्बोनिल साइनाइड -4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone; सड़ना। = रोटेनोन; AA = antimycin A. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इंजेक्शन पोर्ट पोर्ट वॉल्यूम इंजेक्शन यौगिक (10x केंद्रित) कुएं में अंतिम यौगिक सांद्रता
एक 20 μL ग्लूकोज (100 mM) 10 mM
B 22 μL Oligomycin (20 μM) 2 μM
C 25 μL 2-डीजी (500 mM) 50 mM

तालिका 1: ग्लाइकोलाइसिस तनाव परीक्षण के लिए इंजेक्शन रणनीति। संक्षिप्त रूप: 2-DG = 2-deoxy-D-glucose।

1 अंशांकन
2 संतुलन
3 इंजेक्शन और माप
चक्र मिलाना ज़रा रुको माप
आधार रेखा (Non-glycolytic acidification) 3 बार 3 मिनट 0 मिनट 3 मिनट
इंजेक्ट पोर्ट ए: ग्लूकोज 3 बार 3 मिनट 0 मिनट 3 मिनट
इंजेक्ट पोर्ट बी: Oligomycin 3 बार 3 मिनट 0 मिनट 3 मिनट
इंजेक्ट पोर्ट सी: 2-डीजी 3 बार 3 मिनट 0 मिनट 3 मिनट

तालिका 2: ग्लाइकोलाइसिस तनाव परीक्षण के लिए बाह्य कोशिकीय फ्लक्स विश्लेषक कार्यक्रम। संक्षिप्त रूप: 2-DG = 2-deoxy-D-glucose।

इंजेक्शन पोर्ट पोर्ट वॉल्यूम इंजेक्शन यौगिक (10x केंद्रित) कुएं में अंतिम यौगिक सांद्रता
एक 20 μL Oligomycin (20 μM) 2 μM
B 22 μL FCCP (20 μM) 2 μM
C 25 μL रोटेनोन (5 μM) + एंटीमाइसिन A (5 μM) 0.5 μM प्रत्येक

तालिका 3: माइटोकॉन्ड्रियल तनाव परीक्षण के लिए इंजेक्शन रणनीति। संक्षिप्त नाम: FCCP = कार्बोनिल साइनाइड -4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone।

1 अंशांकन
2 संतुलन
3 इंजेक्शन और माप
चक्र मिलाना ज़रा रुको माप
आधार रेखा माप 3 बार 3 मिनट 0 मिनट 3 मिनट
इंजेक्ट पोर्ट ए: Oligomycin 3 बार 3 मिनट 0 मिनट 3 मिनट
इंजेक्ट पोर्ट बी: FCCP 3 बार 3 मिनट 0 मिनट 3 मिनट
इंजेक्ट पोर्ट सी: रोटेनोन और एंटीमाइसिन ए 3 बार 3 मिनट 0 मिनट 3 मिनट

तालिका 4: माइटोकॉन्ड्रियल तनाव परीक्षण के लिए बाह्य कोशिकीय फ्लक्स विश्लेषक कार्यक्रम। संक्षिप्त नाम: FCCP = कार्बोनिल साइनाइड -4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone।

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Discussion

यह विधि पत्र सीहोर्स एक्स्ट्रासेल्युलर फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग करके माउस एचएसपीसी में सेलुलर बायोएनर्जेटिक्स (ग्लाइकोलाइसिस और ऑक्सएफओएस) के मूल्यांकन के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। यह उपकरण एक शक्तिशाली उपकरण है जो एक साथ जीवित कोशिकाओं के ईसीएआर और ओसीआर को मापता है, जो क्रमशः ग्लाइकोलाइसिस और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के मीट्रिक हैं। इस प्रकार, इसका उपयोग वास्तविक समय में सेलुलर बायोएनर्जेटिक्स का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट-आधारित प्लेटफ़ॉर्म उच्च संवेदनशीलता के साथ उच्च-थ्रूपुट परिमाणीकरण प्रदान करता है, जो एक ही प्लेट का उपयोग करके कई नमूनों के एक साथ विश्लेषण की अनुमति देता है, एक और उच्च-रिज़ॉल्यूशन रेस्पिरोमीटर, ओरोबोरोस ओ 2 के की तुलना में, जो केवल एक साथ 2 नमूनों का विश्लेषण कर सकता है, या शास्त्रीय क्लार्क इलेक्ट्रोड20।

बाह्य कोशिकीय फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग मुख्य रूप से अनुयायी सेल प्रकारों के विश्लेषण के लिए किया गया है, क्योंकि इसके लिए कोशिकाओं को मोनोलेयर में मौजूद होने की आवश्यकता होती है, जिससे निलंबन में उगाई गई कोशिकाओं का विश्लेषण करना अधिक चुनौतीपूर्ण हो जाता है। इसके अलावा, बंदरगाह से दवा इंजेक्शन के बाद, माप से पहले कुओं में दवा-मीडिया मिश्रण चक्र के दौरान अशांति होती है, जो कोशिकाओं को हटा सकती है। इसलिए, कोशिकाओं को कुएं के नीचे से दृढ़ता से जुड़ा होना चाहिए। यहां वर्णित प्रोटोकॉल ने समुद्री मूसल, माइटिलस एडुलिस से निकाले गए गैर-इम्युनोजेनिक पॉलीफेनोलिक प्रोटीन के सेल-चिपकने वाले सूत्रीकरण का उपयोग किया है, ताकि मुरीन एचएसपीसी के अनुयायी मोनोलेयर को तैयार किया जा सके।

इस तकनीक की एक और सीमा प्रति परख लागत है, जो क्लार्क-प्रकार इलेक्ट्रोड और Oroboros O2k की तुलना में बहुत अधिक है। कारतूस अपेक्षाकृत महंगे हैं और उनका पुन: उपयोग नहीं किया जा सकता है। यह अनुमान लगाया गया है कि बाह्य कोशिकीय फ्लक्स विश्लेषक की लागत Oroboros O2k20 की तुलना में ~ 4 गुना अधिक है। हालांकि, बाह्य कोशिकीय फ्लक्स विश्लेषक की अर्ध-स्वचालन और उच्च-थ्रूपुट क्षमता को देखते हुए, O2k की तुलना में प्रति रन बहुत अधिक मात्रा में डेटा एकत्र किया जा सकता है।

यहां प्राप्त परिणामों से पता चलता है कि 2.5 × 105 एचएसपीसी प्रति अच्छी तरह से 96-अच्छी तरह से आधारित बाह्य कोशिकीय फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग करके विश्वसनीय डेटा प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं। यह एचएसपीसी का उपयोग करके फ्लक्स एसेस करने में एक और चुनौती जोड़ता है, जो माउस से बड़ी मात्रा में प्राप्त करना मुश्किल है और शुद्ध आबादी प्राप्त करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्रिक सॉर्टिंग की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, प्रवाह-छँटाई प्रयोग में पर्याप्त समय जोड़ती है और पूर्वज कोशिकाओं के चयापचय फेनोटाइप को बदल सकती है। प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित शुद्धिकरण से जुड़ी सीमाओं को दूर करने के लिए, यहां चर्चा की गई रणनीति ने वंश-प्रतिबद्ध पूर्वजों को कम करने के लिए चुंबकीय मोतियों से बंधे वंश-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग किया, इस प्रकार वंश-नकारात्मक एचएसपीसी को समृद्ध किया। अधिक आदिम एचएसपीसी के लिए और अधिक समृद्ध करने के लिए, एक अतिरिक्त सीकिट संवर्धन कदम जोड़ा जा सकता है; हालांकि, यह अतिरिक्त पूर्व विवो समय (~ 1.5 ज) की लागत और सेल संख्या में कमी के साथ आता है। इस तरह के प्रोटोकॉल के उपयोग के लिए इस प्रोटोकॉल के दायरे के बाहर अनुकूलन की आवश्यकता होगी।

अपनी प्लूटोरेसी को बनाए रखने के लिए, एचएससी को अस्थि मज्जा 9,21 के अंदर हाइपोक्सिक वातावरण में रहना चाहिए और अधिमानतः रहना चाहिए। माना जाता है कि Quiescent HSC अपनी मामूली ऊर्जा आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए मुख्य रूप से ग्लाइकोलाइसिस पर भरोसा करते हैं, क्योंकि आरओएस के उच्च स्तर, माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन का एक उपोत्पाद, उनके स्टेमनेस 2,3 के लिए हानिकारक हैं। एचएससी के पास अपेक्षाकृत उच्च, लेकिन काफी हद तक निष्क्रिय माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमानहोता है, जो एचएससी के रखरखाव की अनुमति देने के लिए कम स्तर पर सेलुलर आरओएस को बनाए रखता है। हालांकि, प्रतिबद्धता और भेदभाव के दौरान, माइटोकॉन्ड्रिया एचएससी 5,9 में एटीपी उत्पादन का प्राथमिक स्रोत बन जाता है। इस प्रकार, माइटोकॉन्ड्रिया एचएससी को उनके वंश प्रतिबद्धता और भेदभाव के लिए आवश्यक चयापचय रूप से सक्रिय स्थिति में क्विसेंस से संक्रमण करने में एक महत्वपूर्ण कार्य निभाते हैं। OxPHOS के माध्यम से एटीपी का उत्पादन करने के अलावा, माइटोकॉन्ड्रिया हेमटोपोइएटिक सेल होमियोस्टैसिस में कई अन्य महत्वपूर्ण भूमिकाएं निभाते हैं, जिसमें आरओएस विनियमन, एपोप्टोसिस, कैल्शियम सिग्नलिंग और हीम और कई अन्य महत्वपूर्ण मेटाबोलाइट मध्यवर्तीका संश्लेषण शामिल है। माइटोकॉन्ड्रियल कार्यों में परिवर्तन एचएससी / पूर्वज भेदभाव मार्गों को काफी प्रभावित कर सकते हैं और विभिन्न हेमेटोलॉजिकल विकारों में योगदान कर सकते हैं, जैसे कि हेमटोपोइएटिक दुर्दमता, जन्मजात डिस्रिथ्रोपोइसिस और साइडरोब्लास्टिक एनीमिया, और मायलोडिसप्लास्टिक सिंड्रोम13। घातक हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं में, बेकार माइटोकॉन्ड्रिया विभिन्न साइटोटॉक्सिक दवाओं द्वारा प्रेरित एपोप्टोसिस के प्रतिरोध को प्रदान करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभातेहैं।

एचएससी / पूर्वज होमियोस्टैसिस को बनाए रखने में माइटोकॉन्ड्रिया की केंद्रीय भूमिका के कारण, इन कोशिकाओं की शारीरिक स्थिति में मूल्यवान अंतर्दृष्टि सामान्य और तनाव की स्थिति के तहत उनके माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सएफओओएस का आकलन करके प्राप्त की जा सकती है। माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधियों के उपन्यास मॉड्यूलेटर की पहचान हेमेटोलॉजिकल असामान्यताओं के इलाज के लिए उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान कर सकती है। इस पेपर में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग सामान्य और रोग संबंधी परिस्थितियों में एचएससी के ओसीआर और ईसीएआर पर रासायनिक यौगिकों या चयापचय CRISPR पुस्तकालयों के प्रभावों को स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, एचएससी हेमेटोलॉजिकल विकारों के आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल से काटा जाता है। इस तरह की स्क्रीनिंग चयापचय मार्गों को स्पष्ट करने में भी उपयोगी हो सकती है जो एचएससी शक्ति को अपने हाइपोक्सिक आला में बनाए रखते हैं, जो चिकित्सीय उद्देश्यों के लिए उनकी बहुलता को बनाए रखते हुए एचएससी के इन विट्रो विस्तार के लिए रणनीतियों को तैयार करने में उपयोगी होगा। इस विश्लेषण की उच्च-थ्रूपुट प्रकृति को देखते हुए, यहां वर्णित प्रोटोकॉल को एचएससी, हेमटोपोइएटिक पूर्वजों और घातक हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं में बड़ी संख्या में बायोएनर्जेटिक मॉड्यूलेटर्स की जांच करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

संक्षेप में, यहां प्रस्तुत विधियां बाह्य कोशिकीय फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग करके प्राथमिक माउस एचएसपीसी में ईसीएआर और ओसीआर को मापने के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन करती हैं। ग्लाइकोलाइसिस तनाव परीक्षण से प्राप्त परिणामों से पता चला है कि 2.5 × प्रति अच्छी तरह से 105 कोशिकाएं और 2 μM ओलिगोमाइसिन आगे के विश्लेषण के लिए इष्टतम हैं। 2.5 × 105 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से और 2 μM oligomycin का उपयोग करते हुए, माइटोकॉन्ड्रियल तनाव परीक्षण FCCP एकाग्रता को अनुकूलित करने के लिए किया गया था, और FCCP के 2 μM को अधिकतम OCR को प्रेरित करने के लिए पाया गया था। यद्यपि वर्तमान अध्ययन मुख्य रूप से माउस एचएसपीसी पर केंद्रित है, प्रोटोकॉल और इस दृष्टिकोण को आसानी से किसी भी प्रकार के निलंबन कोशिकाओं के लिए विश्लेषण स्थितियों को अनुकूलित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की है कि हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लोम्बार्ड प्रयोगशाला में काम एनआईएच (NIGMS R01GM101171, NIEHS R21ES032305), DoD (CA190267, CA170628, NF170044, और ME200030) और चिकित्सा अनुसंधान के लिए ग्लेन फाउंडेशन द्वारा समर्थित है। ली प्रयोगशाला में काम एनआईएच (NHLBI 5R01HL150707) द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 μm filter Corning 430626 Used to filter-sterilize the assay media
100 mM sodium pyruvate Life Technologies 11360-070 Component of mitochondrial stress test assay medium
15 mL conical Falcon tubes Corning 352096 Used during HSPCs harvest and to prepare assay drug solutions
200 mM L-glutamine Life Technologies 25030-081 Component of glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media
2-Deoxy-D-glucose (2-DG) Sigma-Aldrich D8375 3rd drug injection during glycolysis stress test
5x Enrichment buffer (MojoSort) Biolegend 480017 Used for washings during HSPCs harvest
Ammonium chloride (NH4Cl) Fisher Scientific A661-3 Component of ACK lysis buffer
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674 3rd drug injection during mitochondrial stress test
Bio-Rad DC protein assay kit Bio-Rad 500-0112 Used as per manufacturer's instructions
Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) Sigma-Aldrich C2920 2nd drug injection during mitochondrial stress test
Cell-Tak Corning 354240 Cell adhesive. Used for coating cell microplates
Countes 3 Automated Cell Counter ThermoFisher Scientific For cell counting
EDTA Fisher Scientific O2793-500 Component of ACK lysis buffer and RIPA lysis buffer
Falcon 70 μm filter Fisher Scientific 08-771-2 Used as cells strainer during HSPCs harvest
Gibco Fetal bovine serum (FBS) Fisher Scientific 26400044 Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest
Gibco HBSS Fisher Scientific 14175095 Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest
Glucose Sigma-Aldrich G7528 Component of mitochondrial stress test assay medium and first injection of glycolysis stress test
Oligomycin Sigma-Aldrich O4876 2nd drug injection during glycolysis stress test and 1st drug injection during mitochondrial stress test
PBS Life Technologies 10010-049 Used to wash cells after assay for protein quantification
Potassium bicarbonate (KHCO3) Fisher Scientific P235-500 Component of ACK lysis buffer
Protease Inhibitor Cocktail (PIC) Roche 11836170001 Supplied as tablets. One tablet was dissolved in 10 mL of RIPA buffer to make 1x PIC.
Rat biotin antimouse-B220, Clone ID: RA3-6B2 Biolegend 103203 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD2, Clone ID: RM2-5 Biolegend 100103 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD3, Clone ID: 17A2 Biolegend 100243 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD5, Clone ID: 53-7.3 Biolegend 100603 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD8, Clone ID: 53-6.7 Biolegend 100703 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-Gr-1, Clone ID: RB6-8C5 Biolegend 108403 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-Ter-119, Clone ID: TER-119 Biolegend 116203 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rotenone Sigma-Aldrich R8875 3rd drug injection during mitochondrial stress test
Seahorse XFe96 extracellular flux analyzer Seahorse Biosciences now Agilent For ECAR and OCR measurments in real time.
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 Used to make Cell-adhesive solution for microplate coating
Sodium chloride (NaCl) Fisher BP358 Component of RIPA lysis buffer
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750 Component of RIPA lysis buffer
Sodium Fluoride (NaF) Sigma-Aldrich S7920 Component of RIPA lysis buffer
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S8045 Prepared 1 N solution. Used for pH normalization
Streptavidin Nanobeads (MojoSort) Biolegend 480015 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Tris-HCl Fisher BP153 Component of RIPA lysis buffer
XF base medium Agilent 102353-100 base medium used to prepare glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media
XF prep station Seahorse Biosciences Used for non-CO2 37 °C incubations
XFe96 extracellular FluxPak Agilent 102416-100 or 102601-100 Includes assay cartridges with utility plates, loading guide flats for loading
drugs onto the assay cartridge, XF calibrant solution, and XF cell culture microplate

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References

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जीवविज्ञान अंक 175 हेमटोपोइएटिक स्टेम कोशिकाएं हेमटोपोइएटिक पूर्वज कोशिकाएं ग्लाइकोलाइसिस माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन बाह्य कोशिकीय अम्लीकरण दर ऑक्सीजन की खपत दर बाह्य कोशिकीय फ्लक्स गैर-अनुयायी कोशिकाएं
माउस हेमटोपोइएटिक स्टेम और आदिम पूर्वज कोशिकाओं में सेलुलर बायोएनर्जेटिक्स का मूल्यांकन बाह्य कोशिकीय फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग करके
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Kumar, S., Jones, M., Li, Q., Lombard, D. B. Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer. J. Vis. Exp. (175), e63045, doi:10.3791/63045 (2021).

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