Summary
O método aqui apresentado resume protocolos otimizados para avaliação de bioenergésicos celulares em haste hematopoiéticas não aderentes e células progenitoras primitivas (HSPCs) utilizando o analisador de fluxo extracelular para medir a taxa de acidificação extracelular (ECAR) e a taxa de consumo de oxigênio (OCR) dos HSPCs em tempo real.
Abstract
Sob estado estável, as células-tronco hematopoiéticas (HSCs) permanecem em grande parte quiescentes e acredita-se que são predominantemente dependentes da glicólise para atender às suas necessidades energéticas. No entanto, sob condições de estresse, como infecção ou perda de sangue, os HSCs tornam-se proliferativos e produzem rapidamente células progenitoras a jusante, que por sua vez diferenciam ainda mais, produzindo células sanguíneas maduras. Durante este processo de transição e diferenciação, os HSCs saem da quiescência e passam rapidamente por uma mudança metabólica da glicólise para a fosforilação oxidativa (OxPHOS). Várias condições de estresse, como envelhecimento, câncer, diabetes e obesidade, podem impactar negativamente a função mitocondrial e, assim, podem alterar a reprogramação metabólica e diferenciação de HSCs e progenitores durante a hematopoiese. Insights valiosos sobre funções glicolíticas e mitocondriais de HSCs e progenitores em condições normais e de estresse podem ser obtidos através da avaliação de sua taxa de acidificação extracelular (ECAR) e taxa de consumo de oxigênio (OCR), que são indicadores de glicolise celular e respiração mitocondrial, respectivamente.
Aqui, um protocolo detalhado é fornecido para medir o ECAR e o OCR em populações de células de linhagem derivada da medula óssea do rato, que incluem tronco hematopoiético e células progenitoras primitivas (HSPCs), usando o analisador de fluxo extracelular. Este protocolo descreve abordagens para isolar as células de linhagem negativas da medula óssea do rato, explica a otimização da densidade de semeadura celular e concentrações de 2-desoxi-D-glicose (2-DG, um análogo de glicose que inibe a glicólise) e várias drogas direcionadas ao OxPHOS (oligomicina, FCCP, rotenona e antimicina A) usadas nesses ensaios, e descreve estratégias de tratamento de drogas. Os principais parâmetros do fluxo glicóglitico, como glicólise, capacidade glicóltica e reserva glicóltica, e parâmetros oxphos, como respiração basal, respiração máxima, vazamento de prótons, produção de ATP, capacidade respiratória sobressalente e eficiência de acoplamento, podem ser medidos nestes ensaios. Este protocolo permite medições de ECAR e OCR em HSPCs não aderentes e pode ser generalizado para otimizar condições de análise para qualquer tipo de células de suspensão.
Introduction
Hematopoiese é o processo pelo qual vários tipos de células sanguíneas maduras com funções altamente especializadas são formadas a partir de HSCs1. Os HSCs são capazes de auto-renovação e diferenciação em várias populações progenitoras multipotentes e específicas da linhagem. Esses progenitores acabam produzindo células de linhagem linfoide, mieloide, eritróida e megacaito. Para manter sua capacidade de auto-renovação, acredita-se que os HSCs permaneçam em grande parte quiescentes e, como outras células-tronco tecerá-los, dependem da glicólise em vez de OxPHOS mitocondrial para a produção de ATP 2,3. A entrada no ciclo celular leva a uma respiração melhorada e oxphos, resultando em níveis elevados de espécies reativas de oxigênio (ROS), que são prejudiciais à manutenção e função do HSC3. A divisão celular repetida, portanto, pode levar à redução da capacidade de auto-renovação dos HSCs e, finalmente, à sua exaustão.
Em hematopoiese adulta, os HSCs são submetidos principalmente à divisão celular assimétrica, durante a qual uma das células filhas mantém o potencial de HSC e continua a depender do metabolismo glicóltico. A outra célula filha torna-se uma célula progenitora primitiva que perde a capacidade de auto-renovação, mas se prolifera e eventualmente dá origem a células hematopoiéticas funcionais diferenciadas4. Quando se pensa que os HSCs se diferenciam para produzir progenitores a jusante, acredita-se que uma mudança da glicolise para o metabolismo mitocondrial ocorra para fornecer a energia e os blocos de construção necessários para suportar essa transição rápida5, como sugerido pelas observações de que os HSCs possuem massa mitocondrial inativa 6,7,8,9 . Em contraste, a atividade mitocondrial (indicada pelos níveis de ROS vinculados) é muito maior em progenitores comprometidos com linhagem do que nos HSCs 9,10,11. Alterações metabólicas que ocorrem durante o primeiro passo da hematopoiese sugerem, assim, um papel direto e crucial das mitocôndrias na regulação do destino do HSC.
Mitocôndrias disfuncionais presentes sob várias condições de estresse, como envelhecimento, câncer, diabetes e obesidade12, podem interferir na capacidade de autoconstrução do HSC, induzindo um desequilíbrio na diferenciação do HSC/progenitor, produzindo quantidades excessivas de ROS, prejudicando a produção de ATP e/ou alterando outros processos metabólicos 9,12,13 . Perturbações na homeostase metabólica na diferenciação HSC/progenitor poderia impactar significativamente a hematopoiese, potencialmente contribuindo para o desenvolvimento de anormalidades hematológicas13. Dadas as influências críticas da glicólise e do OxPHOS mitocondrial sobre a haste e diferenciação do HSC, é de interesse investigar tanto parâmetros metabólicos em condições normais quanto de estresse. Insights valiosos sobre a função glicolítico e mitocondrial dos HSCs e células progenitoras podem ser obtidos avaliando seu ECAR e OCR, que são indicadores de glicolise celular e respiração mitocondrial, respectivamente.
O analisador de fluxo extracelular seahorse é um poderoso aparelho equipado com duas sondas por poço para medir simultaneamente eCAR e OCR em células vivas e, portanto, pode ser usado para avaliar bioenergésicos celulares em tempo real, em resposta a vários substratos ou inibidores. O cartucho de ensaio usado com o analisador contém portas de injeção para conter até quatro medicamentos para injeção automatizada durante o ensaio. Um esquema de um teste típico de estresse de glicolise é mostrado na Figura 1A. O ensaio começa com a medição do ECAR das células, incubado em meio de teste de estresse de glicolise contendo glutamina, mas não glicose ou piruvato. Isso representa acidificação ocorrida devido a atividades não glicolíticas das células e é relatada como acidificação não glicolítica. Isso é seguido pela injeção de glicose em uma concentração saturada. Via glicolise, a glicose na célula é convertida em piruvato, que é ainda mais metabolizado no citoplasma para produzir lactato, ou em mitocôndrias para produzir CO2 e água.
A conversão da glicose em lactato causa produção líquida e posterior liberação de prótons no meio extracelular, resultando em um rápido aumento no ECAR 14,15,16. Esta mudança estimulada pela glicose no ECAR é relatada como glicólise em condições basais. A segunda injeção consiste em oligomicina (um inibidor da synthase ATP, também conhecida como complexo V17), que inibe a produção de ATP mitocondrial. Durante a inibição oxphos mediada pela oligomicina, as células regulam a glicólise para atender às suas demandas energéticas. Isso causa um aumento adicional no ECAR, revelando a capacidade glicoglicítica máxima das células. A diferença entre a capacidade glicolítica máxima e a glicolise basal é referida como reserva glicolítica. Finalmente, 2-DG é injetado, o que causa uma queda significativa no ECAR, geralmente perto dos níveis de acidificação não glicolítico. 2-DG é um análogo de glicose que se liga competitivamente à hexokinase, resultando na inibição da glicólise18. Assim, a diminuição induzida por 2-DG no ECAR confirma ainda que a glicólise é de fato a fonte de ECAR observada após injeções de glicose e oligomicina.
A Figura 1B exibe o esquema para um típico teste de estresse mitocondrial. O ensaio começa com a medição de OCR de base das células, incubada em meio de teste de estresse mitocondrial contendo glicose, glutamina e piruvato. Após medições basais de OCR, a oligomicina é injetada neste ensaio, o que inibe o complexo V, reduzindo assim o fluxo de elétrons através da cadeia de transporte de elétrons (ETC)17. Consequentemente, o OCR é reduzido em resposta à injeção de oligomicina, e essa diminuição no OCR está ligada à produção de ATP mitocondrial. A segunda injeção consiste em cianeto carbonil-4 (trifluorometoxy) fenilhidrazone (FCCP), um prótonophore e um desacoplador de OxPHOSmitocondrial 17. FCCP colapsa o gradiente de próton mitocondrial permitindo o fluxo de prótons através da membrana interior mitocondrial. Devido à injeção de FCCP, o fluxo de elétrons através do ETC é desprimido, e o complexo IV consome oxigênio no nível máximo. A diferença entre OCR máximo e OCR basal é referida como a capacidade respiratória sobressal, que é uma medida da capacidade da célula de responder ao aumento da demanda de energia em condições de estresse. Finalmente, uma mistura de dois inibidores etc (rotenona, um inibidor complexo I, e antimicina A, um inibidor III complexo17) é injetada, o que desliga completamente o fluxo de elétrons, e o OCR diminui para um nível baixo. OCR medido após a injeção de rotenona e antimicina A corresponde ao OCR não mitocondrial impulsionado por outros processos dentro das células. O OCR não mitocondrial permite o cálculo da respiração basal, vazamento de prótons e respiração máxima.
A respiração basal representa a diferença entre OCR de linha de base e OCR não mitocondrial. O vazamento de prótons refere-se à diferença entre OCR após injeção de oligomicina e OCR não mitocondrial. A respiração máxima representa a diferença entre o OCR após a injeção de FCCP e o OCR não mitocondrial. A eficiência do acoplamento é calculada como a porcentagem da taxa de produção de ATP à taxa de respiração basal. Este documento de método fornece um protocolo detalhado para medir ECAR e OCR em HSPCs negativos de linhagem usando o analisador de fluxo extracelular Seahorse XFe96. Este protocolo descreve abordagens para isolar os HSPCs negativos da linhagem do rato, explica a otimização da densidade de semeadura celular e concentrações de várias drogas usadas em ensaios de fluxo extracelular, e descreve estratégias de tratamento de medicamentos.
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Protocol
Todos os experimentos com animais vertebrados foram aprovados e realizados de acordo com as normas do Comitê de Uso e Cuidado de Animais da Universidade de Michigan.
1. Um dia antes do ensaio (Tempo total: ~10 min)
- Hidratação do cartucho do sensor (Tempo de passo: ~10 min)
- Abra o kit de ensaio de fluxo extracelular e remova o cartucho do sensor e o conjunto da placa de utilidade. Guarde os planos de guia de carga para uso no dia seguinte.
- Separe manualmente o cartucho do sensor (a parte verde superior com tampa) da placa de utilidade (microplaque inferior de 96 poços) e coloque-o de cabeça para baixo ao lado da placa do utilitário.
- Utilizando uma pipeta multicanal, encha cada poço da placa de utilidade com 200 μL de calibrante, incluído com kit de ensaio de fluxo.
- Coloque o cartucho do sensor de volta na placa de utilidade, certificando-se de submergir completamente os sensores no calibrante.
- Coloque o cartucho do sensor montado e a placa de utilidade com calibrante em uma incubadora não CO2 37 °C durante a noite. Para evitar a evaporação do calibrador, certifique-se de que a incubadora esteja adequadamente umidificada. Se usar uma incubadora de forno regular para incubações não-CO2 37 °C, coloque um béquer aberto contendo água dentro da incubadora para umidificá-lo. Se disponível, use uma estação de preparação XF para todas as incubações não CO2 37 °C.
NOTA: Alternativamente, o cartucho do sensor pode ser hidratado durante a noite com 200 μL por poço de água ultrapura estéril em uma incubadora não-CO2 37 °C. Substitua a água por 200 μL por poço de calibrante pré-armado de 37 °C, pelo menos 45-60 min antes de carregar as portas de injeção no dia do ensaio.
2. Dia do ensaio (Tempo total: ~9 h 30 min)
NOTA: O tempo total indicado acima inclui durações cumulativas das etapas 2.1-2.4, além da etapa 2.5 ou da etapa 2.6.
- Preparação de microplacões revestidas de adesivo celular (Tempo de passo: ~1 h 30 min)
NOTA: Realize todas as etapas em um armário de biossegurança.- Prepare 2,5 mL da solução adesiva celular (22,4 μg/mL, ver a Tabela de Materiais) por microplacão de cultura celular de 96 poços dissolvendo 56 μg do adesivo celular em um volume apropriado de bicarbonato de sódio esterilizado por filtro 0,1 M (pH 8.0) e adicionando imediatamente 1 N de hidróxido de sódio à metade do volume de material adesivo celular utilizado. Vórtice ou pipeta para cima e para baixo para misturar.
- Abra a microplacar de cultura celular de 96 poços (incluído com o kit de ensaio de fluxo) e dispense 25 μL da solução de adesivo celular preparada na parte inferior de cada poço. Cubra a microplacão com a tampa e incubar por 30 minutos em temperatura ambiente dentro do capô.
- Após a incubação, remova e descarte a solução de adesivo de célula em excesso usando uma pipeta ou aspirador multicanal, e lave cada poço duas vezes com 200 μL de água ultrapura estéril. Seque a placa, com a tampa removida, dentro do capô por 30-45 min.
NOTA: As microplacões de cultura celular revestidas de células podem ser armazenadas por até uma semana a 4 °C. Microplacas pré-revestidas armazenadas a 4 °C devem ser permitidas a aquecer até a temperatura ambiente dentro do capô antes de semear células.
- Preparação de mídia de ensaio (Tempo de passo: ~30 min)
- Preparação do teste de glicólise teste de ensaio de ensaio
- Suplementar 100 mL de meio base (ver a Tabela de Materiais) com 1 mL de L-glutamina de 200 mM.
NOTA: A concentração final de L-glutamina no meio de ensaio é de 2 mM. - Aqueça o meio l-glutamina-suplementado a 37 °C em um banho de água.
- Ajuste o pH do meio quente para 7,4 com 1 N NaOH.
- Esterilize o meio com um filtro de 0,2 μm e mantenha-o a 37 °C até estar pronto para usar.
- Suplementar 100 mL de meio base (ver a Tabela de Materiais) com 1 mL de L-glutamina de 200 mM.
- Preparação do teste de estresse mitocondrial do teste de ensaio
- Suplementar 100 mL do meio base com 0,45 g de glicose, 1 mL de L-glutamina de 200 mM e 1 mL de piruvato de sódio de 100 mM.
NOTA: O médio de ensaio final contém glicose de 25 mM, 2 mM L-glutamina e 1 mM piruvanato de sódio. - Glicose quente, L-glutamina e o meio de piruvato de sódio a 37 °C em banho-maria.
- Ajuste o pH do meio quente para 7,4 com 1 N NaOH.
- O meio de esterilização do filtro com um filtro de 0,2 μm e mantenha a 37 °C até estar pronto para usar.
- Suplementar 100 mL do meio base com 0,45 g de glicose, 1 mL de L-glutamina de 200 mM e 1 mL de piruvato de sódio de 100 mM.
- Preparação do teste de glicólise teste de ensaio de ensaio
- HSPCs de linhagem de rato de colheita negativos (tempo de passo: ~3 h)
- Prepare o tampão de ensaio suplementando a solução de sal balanceada de Hank com 4% de soro bovino fetal. Prepare 1x tampão de enriquecimento diluindo o estoque de 5x com água destilada estéril. Mantenha os dois buffers no gelo até o uso.
- Camundongos humanamente eutanizam usando CO2 seguido de luxação cervical e removem as cascas com tesouras. Remova cuidadosamente todos os tecidos dos ossos e corte as extremidades de ambos os lados do fêmur e da tíbia usando uma tesoura. Limpe as células da medula óssea do fêmur e da tíbia usando o tampão de ensaio. Passe as células lavadas através de um filtro estéril de 70 μm, centrifule o filtrado a 200 × g por 5 min a 4 °C e descarte o supernante.
- Lyse os glóbulos vermelhos reutilizando a pelota celular em 500 μL de tampão ACK (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH 7.2). Seguindo a lise por 1 min no gelo, lave as amostras adicionando 1 mL de tampão de ensaio e centrífuga a 200 × g por 5 min a 4 °C. Descarte o supernatante.
- Após a lavagem, incubar as amostras com um coquetel de anticorpos biotiningados direcionados contra CD2 (diluição 1:200), CD3 (diluição 1:200), CD5 (diluição 1:200), CD8 (diluição 1:200), Ter-119 (diluição 1:200), B220 (diluição de 1:200) e Gr-1 (diluição de 1:800) por 45 min no gelo em um volume total de 500 μL de tampão de ensaio.
- Lave as amostras com 1 mL de tampão de ensaio com centrifugação conforme acima.
- Lave as amostras com 1 mL de 1x tampão de enriquecimento com centrifugação conforme acima.
- Incubar as amostras com 20 μL de nanoesferas streptavidinas e 100 μL de tampão de enriquecimento de 1x no gelo por 15 minutos.
- Lave as amostras com 1 mL de 1x tampão de enriquecimento com centrifugação conforme acima.
- Resuspenda as amostras em 2,5 mL de 1x tampão de enriquecimento. Coloque-os em um ímã de separação por 5 minutos. Colete os supernantes separadamente em tubos cônicos de 15 mL.
- Resuspend magnet-separated amostras em um adicional de 2,5 mL de tampão de enriquecimento 1x, e colocá-los novamente no ímã de separação por 5 minutos. Colete e combine supernantes às coleções anteriores em tubos cônicos de 15 mL a partir da etapa 2.3.9.
NOTA: Os supernantes contêm as frações celulares da linhagem negativa. - Centrifugar os tubos cônicos de 15 mL contendo as células negativamente selecionadas por 5 min a 200 × g a 4 °C.
- Resuspenda as pelotas de célula em 1 mL de tampão de ensaio e conte o número de célula usando o azul trypan manualmente ou através de um contador de células automatizado, como uma Condessa 3.
NOTA: Seguindo a abordagem acima descrita, ~6 × 106 HSPCs de linhagem negativa devem ser facilmente purificados a partir das linhas traseiras de um único mouse. Se os reagentes, como tampão de ensaio, tampão de enriquecimento 1x e coquetel de anticorpos específicos para linhagem, forem preparados no dia anterior ao experimento, é necessário aproximadamente 2,5-3 h para enriquecer HSPCs de 4 ratos. Seria preciso mais 10 minutos para cada mouse além deste número.
- Células de semeadura em microplacões revestidas de adesivo celular (Tempo de passo: ~1 h)
- Células centrífugas da etapa 2.3.12 a 200 × g por 5 min a temperatura ambiente.
- Remova o supernasce e resuspense a pelota celular no meio de ensaio apropriado (meio de teste de estresse glicólise ou meio de teste de estresse mitocondrial). Centrifugar a 200 × g por 5 min a temperatura ambiente.
- Repita o passo 2.4.2. Remova o supernaspetivo e resuspenque as células no médio de ensaio aquecido apropriado para a concentração de 2,5 × 105 células por 50 μL ou 5 × 106 por mL.
- Pipeta 50 μL da suspensão celular ao longo da lateral de cada poço da microplacão de cultura celular revestida de células revestida de células de 96 poços. Pipeta 50 μL do meio de ensaio nos poços de medição de fundo do canto. Use uma pipeta multicanal para chapeamento celular para garantir a consistência.
- Crie uma placa de equilíbrio de centrífugas adicionando 50 μL de água por poço de uma microplacão de cultura celular de 96 poços não revestido.
- Centrifugar as células da placa a 200 × g por 1 min a temperatura ambiente. Não aplique freio. Transfira a placa para uma incubadora não-CO2 37 °C por 25-30 min para garantir que as células tenham sido completamente anexadas. Confirme visualmente sob um microscópio que as células são aderidas à superfície da microplacão.
NOTA: Como ~6 × 106 HSPCs de linhagem negativa podem ser colhidos a partir dos blocos traseiros de um único mouse, HSPCs isolados de 4 ratos (~2,4 × 107 células) são necessários para preencher uma placa inteira de 96 poços se o objetivo é telar múltiplas intervenções ex vivo em paralelo. No entanto, se o objetivo é investigar o impacto de uma alteração genética ou uma intervenção nos parâmetros metabólicos dos HSPCs in vivo, então os HSPCs isolados de múltiplos pares de controle e ratos de teste podem ser analisados em múltiplas réplicas técnicas em paralelo usando uma única placa.
- Realizando o teste de estresse da glicolise usando o analisador de fluxo extracelular (Tempo de passo: ~3 h 30 min)
- Cartucho de sensor de carregamento com compostos injetáveis
- Prepare 100 mM de glicose, 20 μM de oligomicina e 500 mM 2-DG em teste de estresse de glicolise pré-armado (pH 7.4).
NOTA: Todas as soluções compostas de injeção são feitas na concentração de 10x. As concentrações finais do poço são de 10 mM para glicose, 2 μM para oligomicina e 50 mM para 2-DG (ver Tabela 1). - Remova o cartucho do sensor hidratado da incubadora não-CO2 37 °C da etapa 1.1.5. Remova as bolhas de ar do calibrante na placa do utilitário, levantando o cartucho do sensor para fora do calibrante e substituindo-o na mesma placa de utilidade com o calibrante.
- Coloque o guia de carregamento A/D plano (incluído no kit de ensaio de fluxo extracelular) na parte superior do cartucho do sensor, orientando-o para que a letra 'A' esteja localizada no canto superior esquerdo para garantir que apenas as portas A estejam disponíveis para carregamento. Utilizando uma pipeta multicanal, dispense 20 μL de solução de glicose de 100 mM nas portas A.
- Substitua o guia de carregamento A/D plano por plano de carga B/C, orientando para que a letra 'B' esteja localizada no canto superior esquerdo para garantir que apenas as portas B estejam disponíveis para carregamento. Utilizando uma pipeta multicanal, dispense 22 μL de solução de oligomicina de 20 μM nas portas B.
- Reorientar o guia de carregamento B/C plano para localizar a letra 'C' no canto superior esquerdo para carregar portas C. Usando uma pipeta multicanal, dispense 25 μL de solução 2-DG de 500 mM nas portas C.
- Remova e descarte os planos de guia de carga.
NOTA: É importante que cada série de portas de todos os 96 poços, incluindo os dos poços de fundo, sejam completamente carregados com o mesmo volume do composto de injeção.
- Prepare 100 mM de glicose, 20 μM de oligomicina e 500 mM 2-DG em teste de estresse de glicolise pré-armado (pH 7.4).
- Criação, calibração e medições de modelos
- Crie ou carregue o modelo para o teste de estresse da glicolise no controlador. Insira detalhes sobre estratégias de injeção, condições de tratamento e tipos de células, e pressione grupos de geração. Vá para o mapa da placa e atribua poços a cada grupo a ser analisado. Atribua os 4 poços de canto para medições de fundo.
- No protocolo, certifique-se de que a calibração e o equilíbrio sejam verificados na etapa de inicialização .
- Para medição e medidas da linha de base após cada injeção (glicose, oligomicina e 2-DG), defina o número de ciclos de medição para 3 e Misture - Espere - Meça os tempos para 3 min - 0 min - 3 min (ver Tabela 2).
- Remova a tampa dos compostos carregados e o cartucho do sensor hidratado, submerso no calibrante na placa de utilidade. Coloque-o na bandeja de trabalho do analisador de fluxo extracelular e comece a correr.
NOTA: O primeiro passo é a calibração, que geralmente leva ~20 min. - Retire a microplaca contendo as células da incubadora não-CO2 37 °C da etapa 2.4.6 após o fim de 25-30 min de incubação. Sem perturbar as células, adicione lentamente 130 μL do teste de ensaio de estresse de glicolise pré-caçada (pH 7,4) por poço para compor o volume médio em cada poço a 180 μL e devolva a placa à incubadora não-CO2 37 °C por 15-20 min adicionais.
NOTA: É preferível um tempo total de incubação de 45-60 minutos após a centrifugação. - Após o fim da calibração, substitua a placa de utilidade pela microplacão de ensaio (sem tampa) contendo as células. Pressione Carregar a placa celular para iniciar as medições, que levará ~1,5 h para a conclusão do ensaio.
- Após o fim das medições, colete a microplacão de ensaio contendo as células e remova o meio de ensaio sem perturbar as células. Lave uma vez suavemente com 250 μL de soro fisiológico tamponado de fosfato 1x sem desalojar as células.
- Adicione 10 μL de tampão de lise RIPA (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% NP-40, 0,5 % Na desoxicolato, 0,1% de dodecylsulfato de sódio, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF), complementado com coquetel inibidor de 1x protease, para cada poço e agitar a placa em um shaker por 10 min. Congele a placa inteira a -80 °C.
- Descongele a placa e realize um ensaio de medição de proteínas para normalização dos dados seguindo as instruções do fabricante.
- Recuperar e analisar os dados. Abra o arquivo de dados usando o Wave Desktop Software. Clique em Normalizar e cole os valores de normalização para cada poço. Clique em solicitar para normalizar os dados. Clique em Exportar e selecione gerador de relatório de teste de estresse de glicolise para exportar os dados analisados para um gerador de relatórios. Alternativamente, exporte os dados para uma aplicação externa.
NOTA: Alternativamente, o conteúdo total de DNA nuclear em cada poço pode ser usado para normalizar os dados. Um corante fluorescente, como o CyQuant que se liga ao ácido nucleico, pode ser usado para avaliar o conteúdo total do DNA nuclear por poço.
- Cartucho de sensor de carregamento com compostos injetáveis
- Realizando um teste de estresse mitocondrial usando o analisador de fluxo extracelular (Tempo de passo: ~3 h 30 min)
- Cartucho de sensor de carregamento com compostos injetáveis
- Prepare 20 soluções de oligomicina μM, 20 μM FCCP e 5 μM rotenone + 5 μM antimicina A em meio de ensaio de teste de estresse mitocondrial pré-armado (pH 7.4).
NOTA: Todas as soluções compostas de injeção são feitas na concentração de 10x. As concentrações finais do poço são de 2 μM para oligomicina, 2 μM para FCCP e 0,5 μM cada para rotenona e antimicina A (ver Tabela 3). - Remova o cartucho do sensor hidratado da incubadora de 37 °C da etapa 1.1.5 e remova as bolhas de ar como descrito anteriormente na etapa 2.5.1.2.
- Seguindo as etapas 2.5.1.3 a 2.5.1.6, dispense 20 μL de 20 μM de oligomicina nas portas A, 22 μL de 20 μM FCCP nas portas B e 25 μL de uma mistura de rotenone de 5 μM e 5 μM antimicina A nas portas C.
NOTA: É importante que cada série de portas de todos os 96 poços, incluindo os dos poços de fundo, sejam completamente carregados com o mesmo volume de composto de injeção.
- Prepare 20 soluções de oligomicina μM, 20 μM FCCP e 5 μM rotenone + 5 μM antimicina A em meio de ensaio de teste de estresse mitocondrial pré-armado (pH 7.4).
- Criação, calibração e medições de modelos
- Crie ou carregue o modelo para o teste de estresse mitocondrial no controlador. Insira detalhes sobre estratégias de injeção, condições de tratamento e tipos de células, e pressione grupos de geração. Vá para o mapa da placa e atribua poços a cada grupo a ser analisado. Atribua os 4 poços de canto para medições de fundo.
- No protocolo, certifique-se de que a calibração e o equilíbrio sejam verificados na etapa de inicialização.
- Para medição e medidas da linha de base após cada injeção (oligomicina, FCCP e rotenone + antimicina A), defina o número de ciclos de medição para 3 e Mix - Wait - Measure times to 3 min - 0 min - 3 min (ver Tabela 4).
- Inicie a corrida para realizar a calibração como na etapa 2.5.2.4.
- Adicione 130 μL do teste de estresse mitocondrial pré-armado médio (pH 7.4) por bem como na etapa 2.5.2.5.
- Iniciar as medições; recuperar e analisar os dados como nas etapas 2.5.2.6 a 2.5.2.10. Exporte os dados analisados para o gerador do relatório de teste de estresse mitocondrial ou para uma aplicação externa.
- Cartucho de sensor de carregamento com compostos injetáveis
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Representative Results
Utilizando este protocolo, o número celular e as concentrações de várias drogas direcionadas ao OxPHOS (usadas nos ensaios de fluxo extracelular) foram otimizadas para medir ecar e OCR de HSPCs isolados de camundongos C57BL/6 fêmeas de 24 semanas de idade. Primeiro, foi realizado o teste de estresse da glicolise para otimizar o número celular e a concentração de oligomicina. Um número variado de HSPCs por poço variando de 5 × 104 a 2,5 × 105 foram utilizados neste ensaio. Como mostrado na Figura 2A e Figura 2C, a taxa de acidificação não glicolítica sobe com o aumento do número celular de 5 × 104 para 2,5 × 105 , mas aumenta apenas minimamente entre 2 × 105 a 2,5 × 105 células. Como esperado, a injeção de glicose de 10 mM estimula a glicolise em todos os números celulares, com um aumento máximo no ECAR observado em 2,5 × 105 células por poço. No entanto, a injeção de 2 μM de oligomicina não aumenta ainda mais o ECAR, como de outra forma esperado. O uso de oligomicina de 1 μM produziu resultados semelhantes (não mostrados). Esses resultados poderiam ser interpretados para indicar que essas concentrações de oligomicina não eram ideais nesses ensaios.
No entanto, os dados do OCR obtidos no mesmo conjunto de testes de estresse de glicolise mostram que ambas as concentrações de oligomicina testadas (1 μM e 2 μM) foram de fato eficazes, como sugerido pela queda significativa do OCR após a injeção de oligomicina devido à inibição complexa v (ver Figura 2B para 2 μM oligomicina; não mostrada para 1 μM oligomicina). Em ambas as concentrações testadas de oligomicina, foram observadas reduções máximas no OCR em 2,5 × 105 células por poço. Finalmente, a injeção de 50 mM 2-DG resultou em uma redução significativa do ECAR, implicando que a glicólise é a fonte de ECAR observada nesses experimentos. Juntos, pode-se concluir que os HSPCs atingem a glicolise máxima após a injeção de glicose nestes ensaios, e possuem pouca ou nenhuma reserva glicolítica. Isso indica que, como HSCs purificados, os HSPCs negativos da linhagem, que incluem a fração HSC usada neste ensaio, também dependem predominantemente da glicólise para sua produção de ATP. Em células com alta taxa glicóltica, pode não haver um aumento significativo na demanda de ATP após a inibição mediada pela oligomicina da produção de ATP mitocondrial. As células poderiam facilmente gerenciar a perda de ATP mitocondrial sem aumentar ainda mais a glicólise19. Parâmetros do teste de glicolise-acidificação não glicolítico, glicolise, capacidade glicolírica e reserva glicolítico, conforme mostrado na Figura 2C- foram calculados como descrito anteriormente nas seções de introdução e protocolo. Com base nesses dados, foram selecionadas 2,5 × 105 células por poço e 2 μM de oligomicina para estudos posteriores.
O teste de estresse mitocondrial foi utilizado para a otimização da concentração de FCCP. Neste ensaio, foram utilizados 2,5 × 105 HSPCs por bem, otimizados anteriormente através do teste de estresse da glicolise. Como mostrado na Figura 3A, o ensaio começa com a medição do OCR de linha de base seguido de injeção de oligomicina de 2 μM, causando uma redução significativa do OCR através da inibição do complexo V. Após medições de OCR pós-injeção de oligomicina, a FCCP foi injetada em concentrações variadas: 0,5 μM, 1 μM, 1,5 μM e 2 μM. Como indicado anteriormente, FCCP inverte a repressão induzida pela oligomicina do fluxo de elétrons através etc, desacoplando o transporte de prótons de OxPHOS e força o complexo IV a consumir oxigênio máximamente. Como mostrado na Figura 3A, a FCCP estimula o OCR em HSPCs de forma dependente de doses com um aumento máximo no OCR observado em 2 μM de FCCP. Finalmente, uma mistura de rotenona de 0,5 μM e 0,5 μM de antimicina A foi injetada, o que desliga completamente o fluxo de elétrons através do ETC, e o OCR diminui para seu nível mínimo. OCR medido após a injeção de rotenona e antimicina A corresponde ao consumo de oxigênio não mitocondrial. Outros parâmetros de teste de estresse mitocondrial-respiração basal, respiração máxima, vazamento de prótons, produção de ATP, capacidade respiratória sobressalente e eficiência de acoplamento, como mostrado na Figura 3B- foram calculados como descrito anteriormente nas seções de introdução e protocolo. Finalmente, 2 μM de FCCP foram selecionados para estudos posteriores.
Figura 1: Representação esquemática da avaliação da função glicolítica e da respiração mitocondrial utilizando o analisador de fluxo extracelular. Sequências e tempos de injeção de vários compostos efeitos usados no teste de estresse glicolítico (A) e no teste de estresse mitocondrial (B) são mostrados. (A) Parâmetros glicolíticos, glicolise, capacidade glicolítico, reserva glicolítico e acidificação não glicolítico, e (B) parâmetros de função mitocondrial, respiração basal, respiração ligada ao ATP, respiração máxima, consumo de oxigênio não mitocondrial, vazamento de prótons e capacidade respiratória sobressalente. Abreviaturas: ECAR = taxa de acidificação extracelular; 2-DG = 2-desoxi-D-glicose; OCR = taxa de consumo de oxigênio; FCCP = cianeto de carbonil-4 (trifluorometoxy) fenilhidrazone; Apodrecer. = rotenona; Anti. A = antimicina A. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Avaliação da função glicolítico em HSPCs do mouse. O teste de estresse da glicólise foi realizado para medir (A) as taxas de acidificação extracelular (ECAR, mpH/min) e (B) as taxas de consumo de oxigênio (OCR, pmol/min) de HSPCs isolados de camundongos C57BL/6 fêmeas de 24 semanas de idade. Às vezes indicado, foram injetadas glicose (10 mM), oligomicina (2 μM) e 2-DG (50 mM). c O ECAR é calculado como acidificação não glicolítico, glicolise, capacidade glicoglicítica e reserva glicoglical por 5 × 104, 1 × 105, 1,5 × 105, 2 × 105 e 2,5 × 105 HSPCs/bem. Os dados são apresentados como média ± SEM, n = 4. Abreviaturas: HSPCs = haste hematopoiética e células progenitoras primitivas; ECAR = taxa de acidificação extracelular; 2-DG = 2-desoxi-D-glicose; OCR = taxa de consumo de oxigênio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Avaliação da respiração mitocondrial em HSPCs de camundongos. Foi realizado um teste de estresse mitocondrial para medir (A) as taxas de consumo de oxigênio (pmol/min) de HSPCs isolados de camundongos C57BL/6 femininos de 24 semanas de idade. Às vezes indicado, foram injetadas oligomicina (2 μM), FCCP (0,5 μM, 1 μM, 1,5 μM, 2 μM) e rotenona e antimicina A (Rot./AA, 0,5 μM cada) (B) Ocr é calculado como consumo de oxigênio não mitocondrial, respiração basal, vazamento de prótons, respiração máxima (por 0,5 μM, 1 μM, 1,5 μM e 2 μM FCCP), produção de ATP, capacidade respiratória sobressalente (por 0,5 μM, 1 μM, 1,5 μM e 2 μM FCCP), e eficiência de acoplamento por 2,5 × 105 HSPCs/bem. Os dados são apresentados como média ± SEM, n = 4. Abreviaturas: HSPCs = haste hematopoiética e células progenitoras primitivas; OCR = taxa de consumo de oxigênio; FCCP = cianeto de carbonil-4 (trifluorometoxy) fenilhidrazone; Apodrecer. = rotenona; AA = antimicina A. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Porta de injeção | Volume de portas | Composto de injeção (10x concentrado) | Concentração final de composto no poço |
| Um | 20 μL | Glicose (100 mM) | 10 mM |
| B | 22 μL | Oligomicina (20 μM) | 2 μM |
| C | 25 μL | 2-DG (500 mM) | 50 mM |
Tabela 1: Estratégia de injeção para o teste de estresse da glicolise. Abreviação: 2-DG = 2-desoxi-D-glicose.
| 1 | Calibração | ||||
| 2 | Equilibration | ||||
| 3 | Injeções e medidas | ||||
| Ciclos | Misturar | Esperar | Medir | ||
| Linha de base (acidificação não glicolítica) | 3 vezes | 3 min. | 0 min | 3 min. | |
| Porta de injeção A: Glicose | 3 vezes | 3 min. | 0 min | 3 min. | |
| Porta de injeção B: Oligomicina | 3 vezes | 3 min. | 0 min | 3 min. | |
| Porta de injeção C: 2-DG | 3 vezes | 3 min. | 0 min | 3 min. | |
Tabela 2: Programa de analisador de fluxo extracelular para o teste de estresse da glicolise. Abreviação: 2-DG = 2-desoxi-D-glicose.
| Porta de injeção | Volume de portas | Composto de injeção (10x concentrado) | Concentração final de composto no poço |
| Um | 20 μL | Oligomicina (20 μM) | 2 μM |
| B | 22 μL | FCCP (20 μM) | 2 μM |
| C | 25 μL | Rotenone (5 μM) + antimicina A (5 μM) | 0,5 μM cada |
Tabela 3: Estratégia de injeção para o teste de estresse mitocondrial. Abreviação: FCCP = cianeto carbonil-4 (trifluorometoxy) fenilhidrazone.
| 1 | Calibração | ||||
| 2 | Equilibration | ||||
| 3 | Injeções e medidas | ||||
| Ciclos | Misturar | Esperar | Medir | ||
| Medições de linha de base | 3 vezes | 3 min. | 0 min | 3 min. | |
| Porta de injeção A: Oligomicina | 3 vezes | 3 min. | 0 min | 3 min. | |
| Porta de injeção B: FCCP | 3 vezes | 3 min. | 0 min | 3 min. | |
| Inject Port C: Rotenone & Antimicina A | 3 vezes | 3 min. | 0 min | 3 min. | |
Tabela 4: Programa de analisador de fluxo extracelular para o teste de estresse mitocondrial. Abreviação: FCCP = cianeto carbonil-4 (trifluorometoxy) fenilhidrazone.
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Discussion
Este artigo de método descreve um protocolo otimizado para a avaliação de bioenergetics celulares (glicólise e OxPHOS) em HSPCs de camundongos usando o analisador de fluxo extracelular do Cavalo Marinho. Este dispositivo é uma ferramenta poderosa que mede simultaneamente o ECAR e o OCR de células vivas, que são métricas de glicolise e respiração mitocondrial, respectivamente. Assim, pode ser usado para avaliar a bioenergética celular em tempo real. Além disso, a plataforma baseada em microplaca de 96 poços oferece quantificação de alto rendimento com alta sensibilidade, permitindo a análise simultânea de múltiplas amostras usando uma única placa, em comparação com outro respirômetro de alta resolução, o Oroboros O2k, que só pode analisar 2 amostras simultaneamente, ou o eletrodo clássico de Clark20.
O analisador de fluxo extracelular tem sido usado principalmente para a análise de tipos de células aderentes, pois requer que as células estejam presentes em uma monocamada, tornando mais desafiador analisar células cultivadas em suspensão. Além disso, após a injeção de drogas da porta, a turbulência ocorre durante o ciclo de mistura de drogas-mídia nos poços antes das medições, que podem desalojar as células. Portanto, as células precisam estar firmemente presas à parte inferior do poço. Os protocolos aqui descritos utilizaram uma formulação adesiva celular de proteínas polifenóficas não imunogênicas extraídas do mexilhões marinhos, Mytilus edulis, para preparar uma monocamada aderente de HSPCs murinas.
Outra limitação dessa tecnologia é o custo por ensaio, que é muito alto em comparação com o eletrodo do tipo Clark e o Oroboros O2k. Os cartuchos são relativamente caros e não podem ser reutilizados. Estima-se que o custo do analisador de fluxo extracelular em si é ~4 vezes maior que o Oroboros O2k20. No entanto, dada a capacidade de semi-automação e alto throughput do analisador de fluxo extracelular, uma quantidade muito maior de dados pode ser coletada por execução do que com o O2k.
Os resultados obtidos aqui mostram que 2,5 × 105 HSPCs por poço são necessários para obter dados confiáveis usando um analisador de fluxo extracelular baseado em 96 bem baseados. Isso adiciona outro desafio na realização de ensaios de fluxo usando HSPCs, que são difíceis de obter em grandes quantidades de um rato e requerem classificação citométrica de fluxo para obter uma população pura. Além disso, a triagem de fluxo adiciona tempo substancial ao experimento e pode alterar o fenótipo metabólico das células progenitoras. Para superar as limitações associadas à purificação baseada em citometria de fluxo, a estratégia aqui discutida utilizou anticorpos específicos de linhagem ligados a contas magnéticas para esgotar progenitores comprometidos com linhagem, enriquecendo assim os HSPCs negativos da linhagem. Para enriquecer ainda mais para HSPCs mais primitivos, um passo adicional de enriquecimento de cKit pode ser adicionado; no entanto, isso vem com o custo de tempo ex vivo adicional (~1,5 h) e uma redução no número de células. A utilização de tal protocolo exigiria otimização fora do escopo deste protocolo.
Para manter sua pluripotência, os HSCs devem permanecer quiescentes e residir preferencialmente no ambiente hipóxico dentro da medulaóssea 9,21. Acredita-se que os HSCs quiescentes dependem predominantemente da glicólise para cumprir seus modestos requisitos energéticos, uma vez que altos níveis de ROS, um subproduto da respiração mitocondrial, são prejudiciais à sua origem 2,3. Os HSCs possuem massa mitocondrial relativamente alta, mas em grande parte inativa, mantendo ros celular em níveis baixos para permitir a manutenção de HSCs pluripotência9. No entanto, durante o compromisso e diferenciação, as mitocôndrias tornam-se a principal fonte de produção de ATP em HSCs 5,9. Assim, as mitocôndrias desempenham uma função fundamental na transição dos HSCs da quiescência para o estado metabolicamente ativo necessário para seu comprometimento e diferenciação de linhagem. Além de produzir ATP via OxPHOS, as mitocôndrias desempenham muitos outros papéis importantes na homeostase de células hematopoiéticas, incluindo regulação ros, apoptose, sinalização de cálcio e a síntese de heme e muitos outros intermediários metabolitas críticos9. Alterações nas funções mitocondriais podem impactar significativamente as vias de diferenciação do HSC/progenitor e podem contribuir para vários distúrbios hematológicos, como malignidades hematopoiéticas, distrotropoiese congênita e anemias sideroblasticas e síndromes mielodisplásicas13. Em células hematopoiéticas malignas, mitocôndrias disfuncionais desempenham um papel crítico na conferição da resistência à apoptose induzida por várias drogas citotóxicas13.
Devido ao papel central das mitocôndrias na manutenção da homeostase HSC/progenitora, insights valiosos sobre o estado fisiológico dessas células podem ser obtidos avaliando seus OxPHOS mitocondriais em condições normais e de estresse. A identificação de novos moduladores de atividades mitocondriais poderia identificar novos alvos terapêuticos para o tratamento de anormalidades hematológicas. O protocolo descrito neste artigo pode ser usado para rastrear os efeitos de compostos químicos ou bibliotecas metabólicas crispr no OCR e ECAR de HSCs em condições normais e patológicas, por exemplo, HSCs colhidos de modelos de camundongos geneticamente modificados de distúrbios hematológicos. Tal triagem também poderia ser útil na elucidação de vias metabólicas que sustentam a potência do HSC em seu nicho hipóxico, o que seria útil na elaboração de estratégias para a expansão in vitro de HSCs, mantendo sua pluripotência para fins terapêuticos. Dada a natureza de alto rendimento desta análise, o protocolo descrito aqui poderia ser facilmente adaptado para tela um grande número de moduladores bioenergénicos em HSCs, progenitores hematopoiéticos e células hematopoiéticas malignas.
Em resumo, os métodos aqui apresentados descrevem protocolos otimizados para medir ECAR e OCR em HSPCs de mouse primário usando o analisador de fluxo extracelular. Os resultados obtidos no teste de estresse da glicolise mostraram que 2,5 × 105 células por poço e oligomicina de 2 μM são ideais para análises posteriores. Utilizando 2,5 × 105 células por poço e 2 μM de oligomicina, o teste de estresse mitocondrial foi realizado para otimizar a concentração de FCCP, e 2 μM de FCCP foi encontrado para induzir OCR máximo. Embora o presente estudo seja focado principalmente em HSPCs do mouse, o protocolo e essa abordagem poderiam ser facilmente adaptados para otimizar condições de análise para qualquer tipo de células de suspensão.
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Disclosures
Os autores declaram que não há conflito de interesses.
Acknowledgments
O trabalho no laboratório lombardo é apoiado pelo NIH (NIGMS R01GM101171, NIEHS R21ES032305), DoD (CA190267, CA170628, NF170044 e ME200030) e Glenn Foundation for Medical Research. O trabalho no laboratório Li é apoiado pelo NIH (NHLBI 5R01HL150707).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm filter | Corning | 430626 | Used to filter-sterilize the assay media |
| 100 mM sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | Component of mitochondrial stress test assay medium |
| 15 mL conical Falcon tubes | Corning | 352096 | Used during HSPCs harvest and to prepare assay drug solutions |
| 200 mM L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Component of glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media |
| 2-Deoxy-D-glucose (2-DG) | Sigma-Aldrich | D8375 | 3rd drug injection during glycolysis stress test |
| 5x Enrichment buffer (MojoSort) | Biolegend | 480017 | Used for washings during HSPCs harvest |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-3 | Component of ACK lysis buffer |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | 3rd drug injection during mitochondrial stress test |
| Bio-Rad DC protein assay kit | Bio-Rad | 500-0112 | Used as per manufacturer's instructions |
| Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | 2nd drug injection during mitochondrial stress test |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell adhesive. Used for coating cell microplates |
| Countes 3 Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | For cell counting | |
| EDTA | Fisher Scientific | O2793-500 | Component of ACK lysis buffer and RIPA lysis buffer |
| Falcon 70 μm filter | Fisher Scientific | 08-771-2 | Used as cells strainer during HSPCs harvest |
| Gibco Fetal bovine serum (FBS) | Fisher Scientific | 26400044 | Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest |
| Gibco HBSS | Fisher Scientific | 14175095 | Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Component of mitochondrial stress test assay medium and first injection of glycolysis stress test |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | 2nd drug injection during glycolysis stress test and 1st drug injection during mitochondrial stress test |
| PBS | Life Technologies | 10010-049 | Used to wash cells after assay for protein quantification |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | Fisher Scientific | P235-500 | Component of ACK lysis buffer |
| Protease Inhibitor Cocktail (PIC) | Roche | 11836170001 | Supplied as tablets. One tablet was dissolved in 10 mL of RIPA buffer to make 1x PIC. |
| Rat biotin antimouse-B220, Clone ID: RA3-6B2 | Biolegend | 103203 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-CD2, Clone ID: RM2-5 | Biolegend | 100103 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-CD3, Clone ID: 17A2 | Biolegend | 100243 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-CD5, Clone ID: 53-7.3 | Biolegend | 100603 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-CD8, Clone ID: 53-6.7 | Biolegend | 100703 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-Gr-1, Clone ID: RB6-8C5 | Biolegend | 108403 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-Ter-119, Clone ID: TER-119 | Biolegend | 116203 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | 3rd drug injection during mitochondrial stress test |
| Seahorse XFe96 extracellular flux analyzer | Seahorse Biosciences now Agilent | For ECAR and OCR measurments in real time. | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Used to make Cell-adhesive solution for microplate coating |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher | BP358 | Component of RIPA lysis buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Component of RIPA lysis buffer |
| Sodium Fluoride (NaF) | Sigma-Aldrich | S7920 | Component of RIPA lysis buffer |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | Prepared 1 N solution. Used for pH normalization |
| Streptavidin Nanobeads (MojoSort) | Biolegend | 480015 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Tris-HCl | Fisher | BP153 | Component of RIPA lysis buffer |
| XF base medium | Agilent | 102353-100 | base medium used to prepare glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media |
| XF prep station | Seahorse Biosciences | Used for non-CO2 37 °C incubations | |
| XFe96 extracellular FluxPak | Agilent | 102416-100 or 102601-100 | Includes assay cartridges with utility plates, loading guide flats for loading drugs onto the assay cartridge, XF calibrant solution, and XF cell culture microplate |
References
- Rieger, M. A., Schroeder, T.
- Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial role in stemness and differentiation of hematopoietic stem cells. Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).
- Snoeck, H. W. Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).
- Bujko, K., Kucia, M., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 49-77 (2019).
- Ito, K., Suda, T. Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).
- Norddahl, G. L., et al. Accumulating mitochondrial DNA mutations drive premature hematopoietic aging phenotypes distinct from physiological stem cell aging. Cell Stem Cell. 8 (5), 499-510 (2011).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-independent methods reveal elevated mitochondrial mass in hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Kim, M., Cooper, D. D., Hayes, S. F., Spangrude, G. J. Rhodamine-123 staining in hematopoietic stem cells of young mice indicates mitochondrial activation rather than dye efflux. Blood. 91 (11), 4106-4117 (1998).
- Filippi, M. D., Ghaffari, S. Mitochondria in the maintenance of hematopoietic stem cells: new perspectives and opportunities. Blood. 133 (18), 1943-1952 (2019).
- Inoue, S., et al. Mitochondrial respiration defects modulate differentiation but not proliferation of hematopoietic stem and progenitor cells. FEBS Letters. 584 (15), 3402-3409 (2010).
- Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
- Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders - A step towards mitochondria based therapeutic strategies. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1863 (5), 1066-1077 (2017).
- Fontenay, M., Cathelin, S., Amiot, M., Gyan, E., Solary, E. Mitochondria in hematopoiesis and hematological diseases. Oncogene. 25 (34), 4757-4767 (2006).
- Nadanaciva, S., et al. Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (4), 421-437 (2012).
- Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2511 (2010).
- Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics, Fourth Edition. Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. , Academic Press. Ch. 9 255-302 (2013).
- Aft, R. L., Zhang, F. W., Gius, D. Evaluation of 2-deoxy-D-glucose as a chemotherapeutic agent: mechanism of cell death. British Journal of Cancer. 87 (7), 805-812 (2002).
- Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54918 (2016).
- Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. The Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
