Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Bedömning av cellulär bioenergetik i mus hematopoetisk stam och primitiva stamceller med hjälp av extracellulär flödesanalysator

Published: September 24, 2021 doi: 10.3791/63045
Automatic Translation
1, 2, 2,3,4, 1,4,5
1Department of Pathology, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Cellular and Developmental Biology, University of Michigan, Ann Arbor, 4Rogel Cancer Center, University of Michigan, Ann Arbor, 5Institute of Gerontology, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Metoden som presenteras här sammanfattar optimerade protokoll för bedömning av cellulär bioenergetik i icke-vidhäftande mushematopietiska stam- och primitiva stamceller (HSPC) med hjälp av den extracellulära flödesanalysatorn för att mäta extracellulär försurningshastighet (ECAR) och syreförbrukningshastighet (OCR) för HSPC i realtid.

Abstract

Under steady state förblir hematopoetiska stamceller (HSC) i stor utsträckning vilande och tros vara övervägande beroende av glykolys för att möta deras energiska behov. Men under stressförhållanden som infektion eller blodförlust blir HSC proliferativa och producerar snabbt nedströms stamceller, som i sin tur ytterligare differentierar och i slutändan producerar mogna blodkroppar. Under denna övergångs- och differentieringsprocess lämnar HSC från lugn och genomgår snabbt en metabolisk övergång från glykolys till oxidativ fosforylering (OxPHOS). Olika stressförhållanden, såsom åldrande, cancer, diabetes och fetma, kan negativt påverka mitokondriell funktion och kan därmed förändra den metaboliska omprogrammeringen och differentieringen av HSC och förfäder under hematopoies. Värdefulla insikter i glykolytiska och mitokondriella funktioner hos HSC och förfäder under normala och stressförhållanden kan erhållas genom bedömning av deras extracellulära försurningshastighet (ECAR) och syreförbrukningshastighet (OCR), som är indikatorer på cellulär glykolys respektive mitokondriell andning.

Här tillhandahålls ett detaljerat protokoll för att mäta ECAR och OCR i musbenmärgs-härledda härstamningsnegativa cellpopulationer, som inkluderar både hematopoetiska stam- och primitiva stamceller (HSPC), med användning av den extracellulära flödesanalysatorn. Detta protokoll beskriver metoder för att isolera härstamningsnegativa celler från musbenmärgen, förklarar optimering av cellsåddensitet och koncentrationer av 2-deoxi-D-glukos (2-DG, en glukosanalog som hämmar glykolys) och olika OxPHOS-riktade läkemedel (oligomycin, FCCP, rotenon och antimycin A) som används i dessa analyser och beskriver läkemedelsbehandlingsstrategier. Viktiga parametrar för glykolytiskt flöde, såsom glykolys, glykolytisk kapacitet och glykolytisk reserv, och OxPHOS-parametrar, såsom basal andning, maximal andning, protonläckage, ATP-produktion, ledig andningskapacitet och kopplingseffektivitet, kan mätas i dessa analyser. Detta protokoll tillåter ECAR- och OCR-mätningar på icke-vidhäftande HSPC och kan generaliseras för att optimera analysförhållandena för alla typer av suspensionsceller.

Introduction

Hematopoiesis är den process genom vilken olika typer av mogna blodkroppar med högspecialiserade funktioner bildas från HSC1. HSC kan självförnyelse och differentiering i olika multipotenta och härstamningsspecifika stampopulationer. Dessa förfäder producerar slutligen celler av lymfoida, myeloida, erytroida och megakaryocytlinjeer. För att upprätthålla sin självförnyelsekapacitet förblir HSC: er i stort sett vilande och, liksom andra vävnadsstamceller, tros vara beroende av glykolys snarare än mitokondriell OxPHOS för ATP-produktion 2,3. Inträde i cellcykeln leder till förbättrad andning och OxPHOS, vilket resulterar i förhöjda nivåer av reaktiva syrearter (ROS), som är skadliga för HSC-underhåll och funktion3. Upprepad celldelning kan således leda till minskad självförnyelseförmåga hos HSC och i slutändan till deras utmattning.

Vid vuxen hematopoies genomgår HSC främst asymmetrisk celldelning, under vilken en av dottercellerna behåller HSC-potentialen och fortsätter att förlita sig på glykolytisk metabolism. Den andra dottercellen blir en primitiv stamcell som förlorar självförnyelsekapacitet men förökar sig och så småningom ger upphov till differentierade funktionella hematopoetiska celler4. När HSC differentierar för att producera nedströms förfäder, antas en övergång från glykolys till mitokondriell metabolism ske för att leverera den energi och byggstenar som behövs för att stödja denna snabba övergång5, vilket föreslås av observationerna att HSC har inaktiv mitokondriell massa 6,7,8,9 . Däremot är mitokondriell aktivitet (indikerad av länkade ROS-nivåer) mycket högre i släktlinjeengagerade förfäder än i HSC 9,10,11. Metaboliska förändringar som uppstår under det tidigaste steget av hematopoies föreslår således en direkt och avgörande roll av mitokondrier för att reglera HSC-ödet.

Dysfunktionella mitokondrier som förekommer under olika stressförhållanden, såsom åldrande, cancer, diabetes och fetma12, kan störa HSC:s självförnyelsekapacitet, vilket skapar en obalans i HSC/stamfaderdifferentiering genom att producera alltför stora mängder ROS, försämra ATP-produktionen och/eller genom att förändra andra metaboliska processer 9,12,13 . Störningar i metabolisk homeostas vid HSC/stamfaderdifferentiering kan avsevärt påverka hematopoies, vilket kan bidra till utvecklingen av hematologiska avvikelser13. Med tanke på de kritiska influenserna av glykolys och mitokondriell oxfos på HSC-stamhet och differentiering är det av intresse att undersöka både metaboliska parametrar under normala och stressförhållanden. Värdefulla insikter i den glykolytiska och mitokondriella funktionen hos HSC och stamceller kan erhållas genom att bedöma deras ECAR och OCR, som är indikatorer på cellulär glykolys respektive mitokondriell andning.

Seahorse extracellulära flödesanalysator är en kraftfull apparat utrustad med två sonder per brunn för att samtidigt mäta ECAR och OCR i levande celler och kan därmed användas för att bedöma cellulär bioenergetik i realtid, som svar på olika substrat eller hämmare. Analyspatronen som används med analysatorn innehåller injektionsportar för att hålla upp till fyra läkemedel för automatiserad injektion under analysen. Ett schema för ett typiskt glykolysstresstest visas i figur 1A. Analysen börjar med mätning av ECAR av celler, inkuberade i glykolysstresstestmedium innehållande glutamin men inte glukos eller pyruvat. Detta representerar försurning som sker på grund av icke-glykolytiska aktiviteter hos cellerna och rapporteras som icke-glykolytisk försurning. Detta följs av injektion av glukos vid en mättande koncentration. Via glykolys omvandlas glukos i cellen till pyruvat, som metaboliseras ytterligare i cytoplasman för att producera laktat, eller i mitokondrier för att producera CO2 och vatten.

Omvandling av glukos till laktat orsakar nettoproduktion och efterföljande frisättning av protoner i det extracellulära mediet, vilket resulterar i en snabb ökning av ECAR 14,15,16. Denna glukosstimulerade förändring i ECAR rapporteras som glykolys under basala förhållanden. Den andra injektionen består av oligomycin (en hämmare av ATP-syntas, aka komplex V17), som hämmar mitokondriell ATP-produktion. Under oligomycinmedierad OxPHOS-hämning uppreglerar cellerna maximalt glykolys för att möta deras energiska krav. Detta orsakar en ytterligare ökning av ECAR, vilket avslöjar cellernas maximala glykolytiska kapacitet. Skillnaden mellan den maximala glykolytiska kapaciteten och basal glykolys kallas glykolytisk reserv. Slutligen injiceras 2-DG, vilket orsakar en signifikant minskning av ECAR, vanligtvis nära icke-glykolytiska försurningsnivåer. 2-DG är en glukosanalog som konkurrenskraftigt binder till hexokinas, vilket resulterar i hämning av glykolys18. Således bekräftar den 2-DG-inducerade minskningen av ECAR ytterligare att glykolys verkligen är källan till ECAR observerad efter glukos- och oligomycininjektioner.

Figur 1B visar schemat för ett typiskt mitokondriellt stresstest. Analysen börjar med baslinje OCR-mätning av cellerna, inkuberad i mitokondriellt stresstestmedium innehållande glukos, glutamin och pyruvat. Efter basala OCR-mätningar injiceras oligomycin i denna analys, vilket hämmar komplex V och därigenom minskar elektronflödet genom elektrontransportkedjan (ETC)17. Följaktligen reduceras OCR som svar på oligomycininjektion, och denna minskning av OCR är kopplad till mitokondriell ATP-produktion. Den andra injektionen består av karbonylcyanid-4 (trifluorometoxi) fenylhydrazon (FCCP), en protonofor och en frikoppling av mitokondriell OxPHOS17. FCCP kollapsar den mitokondriella protongradienten genom att tillåta flödet av protoner över det mitokondriella inre membranet. På grund av FCCP-injektionen avtrycks elektronflödet genom ETC och komplex IV förbrukar syre på maximal nivå. Skillnaden mellan maximal OCR och basal OCR kallas den extra andningskapaciteten, vilket är ett mått på cellens förmåga att reagera på ökat energibehov under stressförhållanden. Slutligen injiceras en blandning av två ETC-hämmare (rotenon, en komplex I-hämmare och antimycin A, en komplex III-hämmare17), som helt stänger av elektronflödet och OCR minskar till en låg nivå. OCR mätt efter rotenon och antimycin En injektion motsvarar icke-mitokondriell OCR som drivs av andra processer inuti cellerna. Icke-mitokondriell OCR möjliggör beräkning av basal andning, protonläckage och maximal andning.

Basal andning representerar skillnaden mellan baseline OCR och icke-mitokondriell OCR. Protonläckage avser skillnaden mellan OCR efter oligomycininjektion och icke-mitokondriell OCR. Maximal andning representerar skillnaden mellan OCR efter FCCP-injektion och icke-mitokondriell OCR. Kopplingseffektiviteten beräknas som procentandelen av ATP-produktionshastigheten till basal andningshastighet. Detta metoddokument ger ett detaljerat protokoll för att mäta ECAR och OCR i härstamningsnegativa HSPC med hjälp av Seahorse XFe96 extracellulär flödesanalysator. Detta protokoll beskriver metoder för att isolera muslinjenegativa HSPC, förklarar optimeringen av cellsåddensitet och koncentrationer av olika läkemedel som används i extracellulära flödesanalyser och beskriver läkemedelsbehandlingsstrategier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla försök med ryggradsdjur godkändes av och utfördes i enlighet med föreskrifterna från University of Michigan Committee on Use and Care of Animals.

1. Dag före analysen (Total tid: ~ 10 min)

  1. Hydrering av sensorpatronen (Stegtid: ~ 10 min)
    1. Öppna den extracellulära flödesanalyssatsen och ta bort sensorpatronen och verktygsplattan. Spara lastguidens lägenheter för användning nästa dag.
    2. Separera sensorpatronen manuellt (den övre gröna delen med lock) från verktygsplattan (nedre 96-brunns mikroplattan) och placera den upp och ner bredvid verktygsplattan.
    3. Fyll varje brunn på verktygsplattan med 200 μL calibrant med hjälp av en flerkanalig pipett, inkluderad med flödesanalyssats.
    4. Placera sensorpatronen tillbaka på verktygsplattan och se till att helt sänka sensorerna i bromsoken.
    5. Placera den monterade sensorpatronen och verktygsplattan med kaliber i enicke-CO2 37 ° C inkubator över natten. För att förhindra avdunstning av kalibränn, se till att inkubatorn är ordentligt fuktad. Om du använder en vanlig ugnsinkubator för inkubationer utan CO2 37 °C, placera en öppen bägare som innehåller vatten inuti inkubatorn för att befukta den. Använd en XF-förberedelsestation som inte är tillgänglig för alla inkubationer som inte ärCO2 37 °C.
      OBS: Alternativt kan sensorpatronen hydratiseras över natten med 200 μL per brunn sterilt ultrarent vatten i en icke-CO2 37 ° C inkubator. Byt ut vatten med 200 μL per brunn på 37 °C förvärmd kaliber, minst 45-60 minuter innan injektionsportarna laddas på analysdagen.

2. Analysdag (Total tid: ~ 9 h 30 min)

Obs: Den totala tiden som anges ovan inkluderar kumulativa varaktigheter för steg 2.1–2.4 utöver antingen steg 2.5 eller steg 2.6.

  1. Beredning av cellhäftande belagda mikroplattor (Stegtid: ~ 1 h 30 min)
    OBS: Utför alla steg i ett biosäkerhetsskåp.
    1. Förbered 2,5 ml av celllimlösningen (22,4 μg / ml, se materialförteckningen) per 96-brunns cellodlingsmikroplatta genom att lösa upp 56 μg av celllimet i en lämplig volym filtersteriliserad 0,1 M natriumbikarbonat (pH 8,0) och omedelbart tillsätta 1 N natriumhydroxid vid hälften av volymen av celllimstocken som används. Virvel eller pipett upp och ner för att blanda.
    2. Öppna mikroplattan med 96 brunnar (ingår i flödesanalyssatsen) och avge 25 μL av den beredda celllimlösningen i botten av varje brunn. Täck mikroplattan med locket och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur inuti huven.
    3. Efter inkubation, ta bort och kassera överflödig celllimlösning med en flerkanalig pipett eller aspirator och tvätta varje brunn två gånger med 200 μL sterilt ultrarent vatten. Lufttorka plattan, med locket borttaget, inuti huven i 30-45 min.
      OBS: Cellhäftande belagda cellodlingsmikroplattor kan förvaras i upp till en vecka vid 4 °C. Förbelagda mikroplattor som förvaras vid 4 °C måste värmas till rumstemperatur inuti huven innan cellerna såddas.
  2. Förberedelse av analysmedia (Stegtid: ~ 30 min)
    1. Framställning av glykolysstresstestanalysmedium
      1. Komplettera 100 ml basmedium (se materialförteckningen) med 1 ml 200 mM L-glutamin.
        OBS: Den slutliga L-glutaminkoncentrationen i analysmediet är 2 mM.
      2. Värm det L-glutamin-kompletterade mediet till 37 ° C i ett vattenbad.
      3. Justera pH-värdet för det varma mediet till 7,4 med 1 N NaOH.
      4. Filtrera sterilisera mediet med ett 0,2 μm filter och håll det vid 37 °C tills det är klart att användas.
    2. Beredning av analysmedium för mitokondriell stresstest
      1. Komplettera 100 ml av basmediet med 0,45 g glukos, 1 ml 200 mM L-glutamin och 1 ml 100 mM natriumpyruvat.
        OBS: Det slutliga analysmediet innehåller 25 mM glukos, 2 mM L-glutamin och 1 mM natriumpyruvat.
      2. Varm glukos, L-glutamin och natriumpyruvat-kompletterat medium till 37 ° C i ett vattenbad.
      3. Justera pH-värdet för det varma mediet till 7,4 med 1 N NaOH.
      4. Filtrera sterilisera medium med ett 0,2 μm filter och förvara vid 37 °C tills det är klart att användas.
  3. Skörda muslinjenegativa HSPC (Stegtid: ~ 3 h)
    1. Förbered analysbufferten genom att komplettera Hanks balanserade saltlösning med 4% fetalt bovint serum. Förbered 1x anrikningsbuffert genom att späda 5x beståndet med sterilt destillerat vatten. Håll båda buffertarna på is tills de används.
    2. Avliva möss humant med CO2 följt av cervikal dislokation och ta bort bakbenen med sax. Ta försiktigt bort alla vävnader från benen och skär ändarna från båda sidor av lårbenet och skenbenet med sax. Spola ut benmärgsceller från lårbenet och skenbenet med hjälp av analysbufferten. För de spolade cellerna genom ett sterilt 70 μm filter, centrifugera filtratet vid 200 × g i 5 min vid 4 °C och kassera supernatanten.
    3. Lysa de röda blodkropparna genom att återanvända cellpelleten i 500 μL ACK-buffert (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH 7,2). Efter lys i 1 min på is, tvätta proverna genom att tillsätta 1 ml analysbuffert och centrifug vid 200 × g i 5 min vid 4 °C. Kassera supernatanten.
    4. Efter tvättning, inkubera proverna med en cocktail av biotinylerade antikroppar riktade mot CD2 (1:200 utspädning), CD3 (1:200 utspädning), CD5 (1:200 utspädning), CD8 (1:200 utspädning), Ter-119 (1:200 utspädning), B220 (1:200 utspädning) och Gr-1 (1:800 utspädning) i 45 min på is i en total volym av 500 μL analysbuffert.
    5. Tvätta proverna med 1 ml analysbuffert med centrifugering enligt ovan.
    6. Tvätta proverna med 1 ml 1x anrikningsbuffert med centrifugering enligt ovan.
    7. Inkubera proverna med 20 μL streptavidin nanopärlor och 100 μL 1x anrikningsbuffert på is i 15 min.
    8. Tvätta proverna med 1 ml 1x anrikningsbuffert med centrifugering enligt ovan.
    9. Resuspendera proverna i 2,5 ml 1x anrikningsbuffert. Placera dem på en separationsmagnet i 5 minuter. Samla supernatanterna separat i 15 ml koniska rör.
    10. Resuspend magnetseparerade prover i ytterligare 2,5 ml 1x anrikningsbuffert och placera dem igen på separationsmagneten i 5 min. Samla in och kombinera supernatanter till tidigare samlingar i 15 ml koniska rör från steg 2.3.9.
      OBS: Supernatanterna innehåller de härstamningsnegativa cellfraktionerna.
    11. Centrifugera de 15 ml koniska rören som innehåller de negativt valda cellerna i 5 min vid 200 × g vid 4 °C.
    12. Resuspend cellpellets i 1 ml analysbuffert och räkna cellnumret med trypanblå manuellt eller via en automatiserad cellräknare som en grevinna 3.
      OBS: Enligt ovan beskrivna tillvägagångssätt bör ~ 6 × 106 härstamningsnegativa HSPC lätt renas från bakbenen på en enda mus. Om reagenser, såsom analysbuffert, 1x anrikningsbuffert och härstamningsspecifik antikroppscocktail, bereds dagen före experimentet tar det cirka 2,5-3 timmar att berika HSPC från 4 möss. Det skulle ta ytterligare 10 minuter för varje mus utöver detta nummer.
  4. Såddceller i cellhäftande belagda mikroplattor (Stegtid: ~ 1 timme)
    1. Centrifugceller från steg 2.3.12 vid 200 × g i 5 min vid rumstemperatur.
    2. Ta bort supernatanten och återsuspendera cellpelleten i lämpligt analysmedium (glykolysstresstestmedium eller mitokondriellt stresstestmedium). Centrifug vid 200 × g i 5 min vid rumstemperatur.
    3. Upprepa steg 2.4.2. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i lämpligt uppvärmt analysmedium till en koncentration av 2,5 × 105 celler per 50 μL eller 5 × 106 per ml.
    4. Pipett 50 μL av cellsuspensionen längs sidan av varje brunn i rumstemperaturcellens limbelagda 96-brunns cellodlingsmikroplatta. Pipettera 50 μL av analysmediet i hörnbakgrundsmätningsbrunnarna. Använd en flerkanalig pipett för cellplätering för att säkerställa konsistens.
    5. Skapa en centrifugbalansplatta genom att tillsätta 50 μL vatten per brunn av en icke-belagd 96-brunns cellodlingsmikroplatta.
    6. Centrifugera cellerna i plattan vid 200 × g i 1 min vid rumstemperatur. Antag inte broms. Överför plattan till en icke-CO2 37 ° C inkubator i 25-30 min för att säkerställa att cellerna har fäst helt. Visuellt bekräfta under ett mikroskop att cellerna är stabilt vidhäftade på mikroplattans yta.
      OBS: Eftersom ~ 6 × 106 härstamningsnegativa HSPC kan skördas från bakbenen på en enda mus, behövs HSPC isolerade från 4 möss (~ 2,4 × 107 celler) för att fylla en hel 96-brunnsplatta om målet är att screena flera interventioner ex vivo parallellt. Men om syftet är att undersöka effekterna av en genetisk förändring eller ett ingrepp på de metaboliska parametrarna för HSPC in vivo, kan HSPC isolerade från flera par kontroll- och testmöss analyseras i flera tekniska replikat parallellt med en enda platta.
  5. Utföra glykolysstresstest med hjälp av den extracellulära flödesanalysatorn (Stegtid: ~ 3 h 30 min)
    1. Laddar sensorpatron med injektionsföreningar
      1. Förbered 100 mM glukos, 20 μM oligomycin och 500 mM 2-DG-lösningar i förvärmt glykolysstresstestmedium (pH 7.4).
        OBS: Alla injicerande sammansatta lösningar tillverkas i 10x koncentration. De slutliga brunnskoncentrationerna är 10 mM för glukos, 2 μM för oligomycin och 50 mM för 2-DG (se tabell 1).
      2. Ta bort den hydratiserade sensorpatronen från inkubatorn för icke-CO2 37 °C från steg 1.1.5. Ta bort luftbubblor från bromsoket i verktygsplattan genom att lyfta sensorpatronen ur bromsoket och byta ut den på samma verktygsplatta med bromsoket.
      3. Placera A/D-laddningsstyrningen platt (ingår i det extracellulära flödesanalyssatsen) på toppen av sensorpatronen och orientera den så att bokstaven "A" är placerad i det övre vänstra hörnet för att säkerställa att endast portar A är tillgängliga för lastning. Använd en flerkanalig pipett och avge 20 μL 100 mM glukoslösning i portar A.
      4. Byt ut A/D-laststyrningen platt med B/C-laststyrningen platt, orientera så att bokstaven "B" är placerad i det övre vänstra hörnet för att säkerställa att endast portar B är tillgängliga för lastning. Använd en flerkanalig pipett och dispensera 22 μL 20 μM oligomycinlösning i portar B.
      5. Rikta om B/C-laststyrningen platt för att placera bokstaven "C" i det övre vänstra hörnet för lastportar C. Använd en flerkanalig pipett och avge 25 μL 500 mM 2-DG-lösning i portar C.
      6. Ta bort och kassera laststyrningsplattan.
        OBS: Det är viktigt att varje portserie av alla 96 brunnar, inklusive de i bakgrundsbrunnarna, laddas helt med samma volym av injektionsföreningen.
    2. Skapa, kalibrera och mäta mallar
      1. Skapa eller ladda mallen för glykolysstresstestet på regulatorn. Ange information om injektionsstrategier, behandlingsförhållanden och celltyper och tryck på generera grupper. Gå till plattkartan och tilldela brunnar till varje grupp som ska analyseras. Tilldela de fyra hörnbrunnarna för bakgrundsmätningar.
      2. Kontrollera att kalibrering och jämvikt kontrolleras i initieringssteget i protokollet.
      3. För baslinjemätning och mätningar efter varje injektion (glukos, oligomycin och 2-DG), ställ in antalet mätcykler till 3 och Mix - Vänta - Mät tider till 3 min - 0 min - 3 min (se tabell 2).
      4. Ta bort locket från föreningarna laddade och hydratiserade sensorpatronen, nedsänkt i kaliber i verktygsplattan. Placera den på arbetsfacket i den extracellulära flödesanalysatorn och börja körningen.
        OBS: Det första steget är kalibreringen, som vanligtvis tar ~ 20 minuter.
      5. Ta ut mikroplattan som innehåller cellerna från icke-CO2 37 ° C-inkubatorn från steg 2.4.6 efter att 25-30 minuters inkubation är över. Utan att störa cellerna, tillsätt långsamt 130 μL av det förvärmade glykolysstresstestmediet (pH 7,4) per brunn för att kompensera medelvolymen i varje brunn till 180 μL och återför plattan till icke-CO2 37 ° C-inkubatorn i ytterligare 15-20 min.
        OBS: En total inkubationstid på 45-60 min efter centrifugering är att föredra.
      6. När kalibreringen är över, byt ut verktygsplattan med analysmikroplattan (utan lock) som innehåller cellerna. Tryck på Ladda cellplattan för att starta mätningarna, vilket tar ~ 1,5 timmar för att slutföra analysen.
      7. När mätningarna är över, samla in analysmikroplattan som innehåller cellerna och ta bort analysmediet utan att störa cellerna. Tvätta en gång försiktigt med 250 μL 1x fosfatbuffrad saltlösning utan att lossa cellerna.
      8. Tillsätt 10 μL RIPA-lysbuffert (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% NP-40, 0,5 % Na-deoxikolat, 0,1% natriumdodecylsulfat, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF), kompletterat med 1x proteashämmarcocktail, till varje brunn och rör om plattan på en shaker i 10 min. Frys hela plattan vid -80 °C.
      9. Tina plattan och utför en proteinmätningsanalys för datanormalisering enligt tillverkarens instruktioner.
      10. Hämta och analysera data. Öppna datafilen med Wave Desktop Software. Klicka på Normalisera och klistra in normaliseringsvärdena för varje brunn. Klicka på Apply för att normalisera data. Klicka på Exportera och välj glykolys stresstestrapportgenerator för att exportera analyserade data till en rapportgenerator. Du kan också exportera data till ett externt program.
        OBS: Alternativt kan det totala kärn-DNA-innehållet i varje brunn användas för att normalisera data. Ett fluorescerande färgämne, såsom CyQuant som binder till nukleinsyra, kan användas för att bedöma det totala kärn-DNA-innehållet per brunn.
  6. Utföra ett mitokondriellt stresstest med hjälp av den extracellulära flödesanalysatorn (Stegtid: ~ 3 h 30 min)
    1. Laddar sensorpatron med injektionsföreningar
      1. Förbered 20 μM oligomycin, 20 μM FCCP och 5 μM rotenon + 5 μM antimycin A-lösningar i förvärmt mitokondriellt stresstestanalysmedium (pH 7.4).
        OBS: Alla injicerande sammansatta lösningar tillverkas i 10x koncentration. De slutliga brunnskoncentrationerna är 2 μM för oligomycin, 2 μM för FCCP och 0,5 μM vardera för rotenon och antimycin A (se tabell 3).
      2. Ta bort den hydratiserade sensorpatronen från inkubatorn på 37 °C från steg 1.1.5 och avlägsna luftbubblor enligt beskrivningen tidigare i steg 2.5.1.2.
      3. Genom att följa steg 2.5.1.3 till 2.5.1.6 doserar du 20 μL 20 μM oligomycin i portarna A, 22 μL 20 μM FCCP i portarna B och 25 μL av en blandning av 5 μM rotenon och 5 μM antimycin A i portarna C.
        OBS: Det är viktigt att varje portserie av alla 96 brunnar, inklusive de i bakgrundsbrunnarna, laddas helt med samma volym injektionsförening.
    2. Skapa, kalibrera och mäta mallar
      1. Skapa eller ladda mallen för mitokondriellt stresstest på styrenheten. Ange information om injektionsstrategier, behandlingsförhållanden och celltyper och tryck på generera grupper. Gå till plattkartan och tilldela brunnar till varje grupp som ska analyseras. Tilldela de fyra hörnbrunnarna för bakgrundsmätningar.
      2. Kontrollera att kalibrering och jämvikt kontrolleras i initieringssteget i protokollet.
      3. För baslinjemätning och mätningar efter varje injektion (oligomycin, FCCP och rotenon + antimycin A), ställ in antalet mätcykler till 3 och Mix - Vänta - Mät tider till 3 min - 0 min - 3 min (se tabell 4).
      4. Starta körningen för att utföra kalibreringen enligt steg 2.5.2.4.
      5. Tillsätt 130 μL av det förvärmade mitokondriella stresstestmediet (pH 7,4) samt i steg 2.5.2.5.
      6. Starta mätningarna; hämta och analysera data enligt steg 2.5.2.6 till 2.5.2.10. Exportera analyserade data till mitokondriell stressrapportgenerator eller en extern applikation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Med hjälp av detta protokoll optimerades cellantalet och koncentrationerna av olika OxPHOS-riktade läkemedel (som används i de extracellulära flödesanalyserna) för att mäta ECAR och OCR av HSPC isolerade från 24 veckor gamla kvinnliga C57BL/6-möss. Först utfördes glykolysstresstestet för att optimera cellantal och oligomycinkoncentration. Ett varierande antal HSPC per brunn från 5 × 104 till 2,5 × 105 användes i denna analys. Som visas i figur 2A och figur 2C stiger den icke-glykolytiska försurningshastigheten med ökat cellantal från 5 × 104 till 2,5 × 105 men ökar endast minimalt mellan 2 × 105 till 2,5 × 105 celler. Som förväntat stimulerar injektion av 10 mM glukos glykolys vid alla cellantal, med en maximal ökning av ECAR observerad vid 2,5 × 105 celler per brunn. Injektion av 2 μM oligomycin ökar dock inte ECAR ytterligare, vilket annars förväntas. Användningen av 1 μM oligomycin gav liknande resultat (visas inte). Dessa resultat kunde tolkas som att dessa oligomycinkoncentrationer inte var optimala i dessa analyser.

OCR-data som erhållits i samma uppsättning glykolysstresstester visar emellertid att båda testade oligomycinkoncentrationerna (1 μM och 2 μM) verkligen var effektiva, vilket antyds av den signifikanta minskningen av OCR efter oligomycininjektion på grund av komplex V-hämning (se figur 2B för 2 μM oligomycin; inte visat för 1 μM oligomycin). Vid båda testade oligomycinkoncentrationerna observerades maximala minskningar av OCR vid 2,5 × 105 celler per brunn. Slutligen resulterade injektion av 50 mM 2-DG i en signifikant minskning av ECAR, vilket innebär att glykolys är källan till ECAR som observerats i dessa experiment. Sammantaget kan man dra slutsatsen att HSPC uppnår maximal glykolys efter glukosinjektion i dessa analyser, och de har liten eller ingen glykolytisk reserv. Detta indikerar att, liksom renade HSC, är härstamningsnegativa HSPC, som inkluderar HSC-fraktionen som används i denna analys, också huvudsakligen beroende av glykolys för sin ATP-produktion. I celler med hög glykolytisk hastighet kan det inte finnas någon signifikant ökning av ATP-efterfrågan vid oligomycinmedierad hämning av mitokondriell ATP-produktion. Celler kan enkelt hantera förlusten av mitokondriell ATP utan ytterligare uppreglerande glykolys19. Glykolysstresstestparametrar - icke-glykolytisk försurning, glykolys, glykolytisk kapacitet och glykolytisk reserv som visas i figur 2C - beräknades enligt beskrivningen tidigare i introduktions- och protokollavsnitten. Baserat på dessa data valdes 2,5 × 105 celler per brunn och 2 μM oligomycin ut för vidare studier.

Det mitokondriella stresstestet användes för optimering av FCCP-koncentrationen. I denna analys användes 2,5 × 105 HSPC per brunn, vilket tidigare optimerats via glykolysstresstestet. Som visas i figur 3A börjar analysen med mätning av OCR vid baseline följt av 2 μM oligomycininjektion, vilket orsakar en signifikant minskning av OCR via hämning av komplex V. Efter OCR-mätningar efter oligomycininjektion injicerades FCCP i varierande koncentrationer: 0,5 μM, 1 μM, 1,5 μM och 2 μM. Som tidigare nämnts vänder FCCP det oligomycininducerade undertrycket av elektronflödet genom ETC genom att koppla bort protontransport från OxPHOS och tvingar komplex IV att konsumera syre maximalt. Som visas i figur 3A stimulerar FCCP OCR i HSPC på ett dosberoende sätt med en maximal ökning av OCR observerad vid 2 μM FCCP. Slutligen injicerades en blandning av 0,5 μM rotenon och 0,5 μM antimycin A, vilket helt stänger av elektronflödet genom ETC och OCR minskar till sin minimala nivå. OCR mätt efter rotenon och antimycin A-injektion motsvarar icke-mitokondriell syreförbrukning. Andra mitokondriella stresstestparametrar - basal andning, maximal andning, protonläckage, ATP-produktion, outnyttjad andningskapacitet och kopplingseffektivitet som visas i figur 3B - beräknades enligt beskrivningen tidigare i introduktions- och protokollavsnitten. Slutligen valdes 2 μM FCCP ut för vidare studier.

Figure 1
Figur 1: Schematisk representation av bedömning av glykolytisk funktion och mitokondriell andning med användning av den extracellulära flödesanalysatorn. Sekvenser och injektionstider för olika effektorföreningar som används i det glykolytiska stresstestet (A) och mitokondriellt stresstest (B) visas. (A) Glykolytiska parametrar, glykolys, glykolytisk kapacitet, glykolytisk reserv och icke-glykolytisk försurning, och (B) mitokondriella funktionsparametrar, basal andning, ATP-kopplad andning, maximal andning, icke-mitokondriell syreförbrukning, protonläckage och ledig andningskapacitet beskrivs. Förkortningar: ECAR = extracellulär försurningshastighet; 2-DG = 2-deoxi-D-glukos; OCR = syreförbrukningshastighet; FCCP = karbonylcyanid-4 (trifluormetoxi) fenylhydrazon; Ruttna. = rotenon; Anti. A = antimycin A. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Bedömning av den glykolytiska funktionen i mus-HSPC. Glykolysstresstestet utfördes för att mäta (A) de extracellulära försurningshastigheterna (ECAR, mpH / min) och (B) syreförbrukningshastigheterna (OCR, pmol / min) hos HSPC isolerade från 24 veckor gamla kvinnliga C57BL / 6-möss. Vid angivna tidpunkter injicerades glukos (10 mM), oligomycin (2 μM) och 2-DG (50 mM). (C) ECAR beräknas som icke-glykolytisk försurning, glykolys, glykolytisk kapacitet och glykolytisk reserv per 5 × 104, 1 × 105, 1,5 × 105, 2 × 105 och 2,5 × 105 HSPC /brunn. Data presenteras som medelvärde ± SEM, n = 4. Förkortningar: HSPC = hematopoetisk stam och primitiva stamceller; ECAR = extracellulär försurningshastighet; 2-DG = 2-deoxi-D-glukos; OCR = syreförbrukningshastighet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Bedömning av mitokondriell andning i mus-HSPC. Ett mitokondriellt stresstest utfördes för att mäta (A) syreförbrukningshastigheterna (pmol / min) hos HSPC isolerade från 24 veckor gamla kvinnliga C57BL / 6-möss. Vid angivna tidpunkter injicerades oligomycin (2 μM), FCCP (0,5 μM, 1 μM, 1,5 μM, 2 μM) och rotenon och antimycin A (Rot./AA, 0,5 μM vardera). (B) OCR beräknas som icke-mitokondriell syreförbrukning, basal andning, protonläckage, maximal andning (per 0,5 μM, 1 μM, 1,5 μM och 2 μM FCCP), ATP-produktion, outnyttjad andningskapacitet (per 0,5 μM, 1 μM, 1,5 μM och 2 μM FCCP) och kopplingseffektivitet per 2,5 × 105 HSPC /brunn. Data presenteras som medelvärde ± SEM, n = 4. Förkortningar: HSPC = hematopoetisk stam och primitiva stamceller; OCR = syreförbrukningshastighet; FCCP = karbonylcyanid-4 (trifluormetoxi) fenylhydrazon; Ruttna. = rotenon; AA = antimycin A. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Injektionsport Portvolym Injicerande förening (10x koncentrerad) Slutlig sammansatt koncentration i brunnen
A 20 μL Glukos (100 mM) 10 mM
B 22 μL Oligomycin (20 μM) 2 μM
C 25 μL 2-GD (500 mM) 50 mM

Tabell 1: Injektionsstrategi för glykolysstresstestet. Förkortning: 2-DG = 2-deoxi-D-glukos.

1 Kalibrering
2 Jämvikt
3 Injektioner och mätningar
Cykler Blanda Vänta Mått
Baslinje (icke-glykolytisk försurning) 3 gånger 3 minuter 0 minuter 3 minuter
Injicera port A: glukos 3 gånger 3 minuter 0 minuter 3 minuter
Injicera port B: Oligomycin 3 gånger 3 minuter 0 minuter 3 minuter
Injicera port C: 2-DG 3 gånger 3 minuter 0 minuter 3 minuter

Tabell 2: Extracellulärt flödesanalysatorprogram för glykolysstresstestet. Förkortning: 2-DG = 2-deoxi-D-glukos.

Injektionsport Portvolym Injicerande förening (10x koncentrerad) Slutlig sammansatt koncentration i brunnen
A 20 μL Oligomycin (20 μM) 2 μM
B 22 μL FCCP (20 μM) 2 μM
C 25 μL Rotenon (5 μM) + antimycin A (5 μM) 0,5 μM vardera

Tabell 3: Injektionsstrategi för mitokondriellt stresstest. Förkortning: FCCP = karbonylcyanid-4 (trifluormetoxi) fenylhydrazon.

1 Kalibrering
2 Jämvikt
3 Injektioner och mätningar
Cykler Blanda Vänta Mått
Baslinjemätningar 3 gånger 3 minuter 0 minuter 3 minuter
Injicera port A: Oligomycin 3 gånger 3 minuter 0 minuter 3 minuter
Injicera port B: FCCP 3 gånger 3 minuter 0 minuter 3 minuter
Injicera port C: Rotenon & Antimycin A 3 gånger 3 minuter 0 minuter 3 minuter

Tabell 4: Extracellulärt flödesanalysatorprogram för mitokondriellt stresstest. Förkortning: FCCP = karbonylcyanid-4 (trifluormetoxi) fenylhydrazon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta metoddokument beskriver ett optimerat protokoll för bedömning av cellulär bioenergetik (glykolys och OxPHOS) i mus-HSPC med hjälp av Seahorse extracellulära flödesanalysator. Denna enhet är ett kraftfullt verktyg som samtidigt mäter ECAR och OCR hos levande celler, vilka är mätvärden för glykolys respektive mitokondriell andning. Således kan den användas för att bedöma cellulär bioenergetik i realtid. Vidare erbjuder den 96-brunns mikroplattbaserade plattformen kvantifiering med hög genomströmning med hög känslighet, vilket möjliggör samtidig analys av flera prover med en enda platta, jämfört med en annan högupplöst respirometer, Oroboros O2k, som bara kan analysera 2 prover samtidigt, eller den klassiska Clark-elektroden20.

Den extracellulära flödesanalysatorn har främst använts för analys av vidhäftande celltyper, eftersom det kräver att celler finns i ett monolager, vilket gör det mer utmanande att analysera celler som odlas i suspension. Dessutom, efter läkemedelsinjektion från hamnen, uppstår turbulens under läkemedelsmedieblandningscykeln i brunnarna före mätningarna, vilket kan lossna cellerna. Därför måste cellerna vara ordentligt fastsatta på botten av brunnen. Protokollen som beskrivs här har använt en cellhäftande formulering av icke-immunogena polyfenolproteiner extraherade från den marina musslan, Mytilus edulis, för att framställa ett vidhäftande monolager av murina HSPC.

En annan begränsning av denna teknik är kostnaden per analys, som är mycket hög jämfört med Clark-typelektroden och Oroboros O2k. Patronerna är relativt dyra och kan inte återanvändas. Det uppskattas att kostnaden för den extracellulära flödesanalysatorn i sig är ~ 4 gånger högre än Oroboros O2k20. Men med tanke på halvautomatiseringen och kapaciteten med hög genomströmning hos den extracellulära flödesanalysatorn kan en mycket större mängd data samlas in per körning än med O2k.

Resultaten som erhålls här visar att 2,5 × 105 HSPC per brunn krävs för att erhålla tillförlitliga data med hjälp av en 96-brunnsbaserad extracellulär flödesanalysator. Detta lägger till ytterligare en utmaning när det gäller att utföra flödesanalyser med HSPC, som är svåra att få i stora mängder från en mus och kräver flödescytometrisk sortering för att få en ren population. Dessutom lägger flödessortering betydande tid till experimentet och kan förändra den metaboliska fenotypen hos stamcellerna. För att övervinna de begränsningar som är förknippade med flödescytometribaserad rening använde strategin som diskuterades här härstamningsspecifika antikroppar bundna till magnetiska pärlor för att tömma härstamningsengagerade förfäder, vilket berikar de härstamningsnegativa HSC: erna. För att ytterligare berika för mer primitiva HSPC:er kan ytterligare ett cKit-berikningssteg läggas till. Detta kommer dock med kostnaden för ytterligare ex vivo-tid (~ 1,5 timmar) och en minskning av cellnumret. Användningen av ett sådant protokoll skulle kräva optimering utanför detta protokolls räckvidd.

För att bibehålla sin pluripotens måste HSC förbli vilande och företrädesvis bo i den hypoxiska miljön inuti benmärgen 9,21. Quiescent HSC tros huvudsakligen förlita sig på glykolys för att uppfylla sina blygsamma energibehov, eftersom höga nivåer av ROS, en biprodukt av mitokondriell andning, är skadliga för deras stamhet 2,3. HSC har relativt hög, men till stor del inaktiv mitokondriell massa, vilket upprätthåller cellulär ROS vid låga nivåer för att möjliggöra underhåll av HSC pluripotens9. Under engagemang och differentiering blir mitokondrier emellertid den primära källan till ATP-produktion i HSC 5,9. Således spelar mitokondrier en nyckelfunktion vid övergång av HSC från lugn till det metaboliskt aktiva tillstånd som krävs för deras härstamningsåtagande och differentiering. Förutom att producera ATP via OxPHOS spelar mitokondrier många andra viktiga roller i hematopoetisk cellhomeostas, inklusive ROS-reglering, apoptos, kalciumsignalering och syntesen av hem och många andra kritiska metabolit intermediärer9. Förändringar i mitokondriella funktioner kan signifikant påverka HSC / stamfaderdifferentieringsvägar och kan bidra till olika hematologiska störningar, såsom hematopoetiska maligniteter, medfödd dyserytropoies och sideroblastiska anemier och myelodysplastiska syndrom13. I maligna hematopoetiska celler spelar dysfunktionella mitokondrier en avgörande roll för att ge resistens mot apoptos inducerad av olika cytotoxiska läkemedel13.

På grund av mitokondriernas centrala roll för att upprätthålla HSC/stamfaderhomeostas kan värdefulla insikter i dessa cellers fysiologiska status erhållas genom att bedöma deras mitokondriella OxPHOS under normala förhållanden och stressförhållanden. Identifieringen av nya modulatorer av mitokondriella aktiviteter kan identifiera nya terapeutiska mål för behandling av hematologiska avvikelser. Protokollet som beskrivs i detta dokument kan användas för att screena effekterna av kemiska föreningar eller metaboliska CRISPR-bibliotek på OCR och ECAR av HSC under normala och patologiska förhållanden, t.ex. HSC skördade från genetiskt konstruerade musmodeller av hematologiska störningar. Sådan screening kan också vara användbar för att belysa metaboliska vägar som upprätthåller HSC-styrkan i deras hypoxiska nisch, vilket skulle vara användbart vid utformningen av strategier för in vitro-expansion av HSC samtidigt som deras pluripotens bibehålls för terapeutiska ändamål. Med tanke på den höga genomströmningen av denna analys kan protokollet som beskrivs här enkelt anpassas för att screena ett stort antal bioenergetiska modulatorer i HSC, hematopoetiska förfäder och maligna hematopoetiska celler.

Sammanfattningsvis beskriver de metoder som presenteras här optimerade protokoll för mätning av ECAR och OCR i primära mus-HSPC med hjälp av den extracellulära flödesanalysatorn. Resultat erhållna från glykolysstresstestet har visat att 2,5 × 105 celler per brunn och 2 μM oligomycin är optimala för vidare analys. Med hjälp av 2,5 × 105 celler per brunn och 2 μM oligomycin utfördes mitokondriellt stresstest för att optimera FCCP-koncentrationen och 2 μM FCCP befanns inducera maximal OCR. Även om den aktuella studien huvudsakligen är inriktad på mus-HSPC, kan protokollet och detta tillvägagångssätt enkelt anpassas för att optimera analysförhållandena för alla typer av suspensionsceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att det inte finns någon intressekonflikt.

Acknowledgments

Arbetet i Lombard-laboratoriet stöds av NIH (NIGMS R01GM101171, NIEHS R21ES032305), DoD (CA190267, CA170628, NF170044 och ME200030) och Glenn Foundation for Medical Research. Arbetet i Li-laboratoriet stöds av NIH (NHLBI 5R01HL150707).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 μm filter Corning 430626 Used to filter-sterilize the assay media
100 mM sodium pyruvate Life Technologies 11360-070 Component of mitochondrial stress test assay medium
15 mL conical Falcon tubes Corning 352096 Used during HSPCs harvest and to prepare assay drug solutions
200 mM L-glutamine Life Technologies 25030-081 Component of glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media
2-Deoxy-D-glucose (2-DG) Sigma-Aldrich D8375 3rd drug injection during glycolysis stress test
5x Enrichment buffer (MojoSort) Biolegend 480017 Used for washings during HSPCs harvest
Ammonium chloride (NH4Cl) Fisher Scientific A661-3 Component of ACK lysis buffer
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674 3rd drug injection during mitochondrial stress test
Bio-Rad DC protein assay kit Bio-Rad 500-0112 Used as per manufacturer's instructions
Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) Sigma-Aldrich C2920 2nd drug injection during mitochondrial stress test
Cell-Tak Corning 354240 Cell adhesive. Used for coating cell microplates
Countes 3 Automated Cell Counter ThermoFisher Scientific For cell counting
EDTA Fisher Scientific O2793-500 Component of ACK lysis buffer and RIPA lysis buffer
Falcon 70 μm filter Fisher Scientific 08-771-2 Used as cells strainer during HSPCs harvest
Gibco Fetal bovine serum (FBS) Fisher Scientific 26400044 Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest
Gibco HBSS Fisher Scientific 14175095 Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest
Glucose Sigma-Aldrich G7528 Component of mitochondrial stress test assay medium and first injection of glycolysis stress test
Oligomycin Sigma-Aldrich O4876 2nd drug injection during glycolysis stress test and 1st drug injection during mitochondrial stress test
PBS Life Technologies 10010-049 Used to wash cells after assay for protein quantification
Potassium bicarbonate (KHCO3) Fisher Scientific P235-500 Component of ACK lysis buffer
Protease Inhibitor Cocktail (PIC) Roche 11836170001 Supplied as tablets. One tablet was dissolved in 10 mL of RIPA buffer to make 1x PIC.
Rat biotin antimouse-B220, Clone ID: RA3-6B2 Biolegend 103203 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD2, Clone ID: RM2-5 Biolegend 100103 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD3, Clone ID: 17A2 Biolegend 100243 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD5, Clone ID: 53-7.3 Biolegend 100603 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD8, Clone ID: 53-6.7 Biolegend 100703 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-Gr-1, Clone ID: RB6-8C5 Biolegend 108403 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-Ter-119, Clone ID: TER-119 Biolegend 116203 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rotenone Sigma-Aldrich R8875 3rd drug injection during mitochondrial stress test
Seahorse XFe96 extracellular flux analyzer Seahorse Biosciences now Agilent For ECAR and OCR measurments in real time.
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 Used to make Cell-adhesive solution for microplate coating
Sodium chloride (NaCl) Fisher BP358 Component of RIPA lysis buffer
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750 Component of RIPA lysis buffer
Sodium Fluoride (NaF) Sigma-Aldrich S7920 Component of RIPA lysis buffer
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S8045 Prepared 1 N solution. Used for pH normalization
Streptavidin Nanobeads (MojoSort) Biolegend 480015 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Tris-HCl Fisher BP153 Component of RIPA lysis buffer
XF base medium Agilent 102353-100 base medium used to prepare glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media
XF prep station Seahorse Biosciences Used for non-CO2 37 °C incubations
XFe96 extracellular FluxPak Agilent 102416-100 or 102601-100 Includes assay cartridges with utility plates, loading guide flats for loading
drugs onto the assay cartridge, XF calibrant solution, and XF cell culture microplate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rieger, M. A., Schroeder, T. Hematopoiesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008250 (2012).
  2. Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial role in stemness and differentiation of hematopoietic stem cells. Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).
  3. Snoeck, H. W. Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).
  4. Bujko, K., Kucia, M., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 49-77 (2019).
  5. Ito, K., Suda, T. Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).
  6. Norddahl, G. L., et al. Accumulating mitochondrial DNA mutations drive premature hematopoietic aging phenotypes distinct from physiological stem cell aging. Cell Stem Cell. 8 (5), 499-510 (2011).
  7. de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-independent methods reveal elevated mitochondrial mass in hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
  8. Kim, M., Cooper, D. D., Hayes, S. F., Spangrude, G. J. Rhodamine-123 staining in hematopoietic stem cells of young mice indicates mitochondrial activation rather than dye efflux. Blood. 91 (11), 4106-4117 (1998).
  9. Filippi, M. D., Ghaffari, S. Mitochondria in the maintenance of hematopoietic stem cells: new perspectives and opportunities. Blood. 133 (18), 1943-1952 (2019).
  10. Inoue, S., et al. Mitochondrial respiration defects modulate differentiation but not proliferation of hematopoietic stem and progenitor cells. FEBS Letters. 584 (15), 3402-3409 (2010).
  11. Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
  12. Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders - A step towards mitochondria based therapeutic strategies. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1863 (5), 1066-1077 (2017).
  13. Fontenay, M., Cathelin, S., Amiot, M., Gyan, E., Solary, E. Mitochondria in hematopoiesis and hematological diseases. Oncogene. 25 (34), 4757-4767 (2006).
  14. Nadanaciva, S., et al. Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (4), 421-437 (2012).
  15. Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2511 (2010).
  16. Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).
  17. Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics, Fourth Edition. Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. , Academic Press. Ch. 9 255-302 (2013).
  18. Aft, R. L., Zhang, F. W., Gius, D. Evaluation of 2-deoxy-D-glucose as a chemotherapeutic agent: mechanism of cell death. British Journal of Cancer. 87 (7), 805-812 (2002).
  19. Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54918 (2016).
  20. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. The Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  21. Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).

Tags

Biologi utgåva 175 hematopoetiska stamceller hematopoetiska stamceller glykolys mitokondriell andning oxidativ fosforylering extracellulär försurningshastighet syreförbrukningshastighet extracellulärt flöde icke-vidhäftande celler
Bedömning av cellulär bioenergetik i mus hematopoetisk stam och primitiva stamceller med hjälp av extracellulär flödesanalysator
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kumar, S., Jones, M., Li, Q.,… More

Kumar, S., Jones, M., Li, Q., Lombard, D. B. Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer. J. Vis. Exp. (175), e63045, doi:10.3791/63045 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter