Summary
Near-UV-lithografie en tractiekrachtmicroscopie worden gecombineerd om cellulaire krachten op microgepatterde hydrogels te meten. De gerichte licht-geïnduceerde afgifte van enkele cellen maakt een groot aantal metingen op hetzelfde monster mogelijk.
Abstract
Tractiekrachtmicroscopie (TFM) is de belangrijkste methode die in de mechanobiologie wordt gebruikt om celkrachten te meten. Gewoonlijk wordt dit gebruikt voor cellen die zich hechten aan platte zachte substraten die vervormen onder celtractie (2D-TFM). TFM vertrouwt op het gebruik van lineair elastische materialen, zoals polydimethylsiloxaan (PDMS) of polyacrylamide (PA). Voor 2D-TFM op PA is de moeilijkheid om een hoge doorvoer te bereiken voornamelijk het gevolg van de grote variabiliteit van celvormen en tracties, wat standaardisatie vereist. We presenteren een protocol om snel en efficiënt microgepatterde PA-hydrogels te fabriceren voor 2D-TFM-studies. De micropatronen worden eerst gemaakt door maskerloze fotolithografie met behulp van bijna UV-licht waarbij extracellulaire matrixeiwitten alleen binden aan de microgepatterde gebieden, terwijl de rest van het oppervlak niet-klevend blijft voor cellen. De micropatterning van extracellulaire matrixeiwitten is te wijten aan de aanwezigheid van actieve aldehydegroepen, wat resulteert in kleefgebieden van verschillende vormen om afzonderlijke cellen of groepen cellen te huisvesten. Voor TFM-metingen gebruiken we PA-hydrogels met verschillende elasticiteit door de hoeveelheden acrylamide en bis-acrylamide te variëren en de verplaatsing van ingebedde fluorescerende kralen te volgen om celtractievelden te reconstrueren met geregulariseerde Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC).
Om verder te komen tot nauwkeurige registratie van celkrachten, beschrijven we het gebruik van een gecontroleerde dosis patroonlicht om celtractie vrij te maken in gedefinieerde gebieden voor afzonderlijke cellen of groepen cellen. We noemen deze methode lokale UV-verlichting tractiekrachtmicroscopie (LUVI-TFM). Bij enzymatische behandeling worden alle cellen tegelijkertijd van het monster losgemaakt, terwijl met LUVI-TFM tractiekrachten van cellen in verschillende regio's van het monster in volgorde kunnen worden geregistreerd. We tonen de toepasbaarheid van dit protocol aan (i) om celtractiekrachten te bestuderen als een functie van gecontroleerde adhesie aan het substraat, en (ii) om een groter aantal experimentele waarnemingen van hetzelfde monster te bereiken.
Introduction
Bij interactie met hun extracellulaire omgeving oefenen aanhangende cellen krachten uit die voornamelijk worden gemedieerd door op integrine gebaseerde focale verklevingen die de extracellulaire matrix (ECM) verbinden met het actinecytoskelet. Focale verklevingen zijn multiproteïneassemblages die zijn gecentreerd rond de binding van integrines aan ECM-eiwitten zoals fibronectine en collageen. Integrineclustering en groei van focale verklevingen is niet alleen cruciaal voor het tot stand brengen van een mechanisch stabiele verbinding, maar ook voor de rekrutering van andere focale adhesie-eiwitten, waaronder die welke de RhoA-route activeren voor de regulatie van cellulaire contractiliteit1. De RhoA-afhankelijke contractiliteit van het actinecytoskelet stelt cellen in staat zich te verspreiden en te migreren op de onderliggende ECM, en ook om de stijfheid ervan te voelen2. De verdeling van tractiekrachten hangt sterk af van het verspreidingsgebied en de vorm van cellen, die beide afhankelijk zijn van matrixeigenschappen en daarom de cytoskeletale organisatie beïnvloeden, waardoor uiteindelijk een gesloten feedbacklus wordt gevormd tussen matrixmechanica en cytoskeletorganisatie3,4.
Oppervlaktemicropatterningtechnieken maken een gedefinieerde controle van de celvorm mogelijk door micron-sized gebieden te creëren die ECM-kleefeiwitten presenteren; volgens de grootte van deze gebieden, enkele cellen of groepen cellen die zich hechten aan de micropattern5. ECM-eiwitten kunnen op verschillende manieren op glazen substraten worden gemodelleerd, zoals microcontactprinten, fotopatronen of laserpatronen6. Het gebruik van UV-licht (λ = 185 of 375 nm) in combinatie met oppervlakte-aangroeistrategieën biedt de flexibiliteit voor het ontwerpen van verschillende vormen en maten en immobilisatie van meerdere eiwittypen met een hoge precisie in de buurt van oppervlakteranden7,8. De regio's bedekt met eiwitafstotende chemicaliën zoals polyethyleenglycol (PEG) worden beschermd met een chroomfotomasker of een op digitaal spiegelapparaat (DMD) gebaseerd maskerloos lithografiesysteem. De patronen in de maskers maken de blootstelling aan UV-licht mogelijk van regio's die vervolgens worden gemodelleerd met ECM-eiwitten. Het patroon van hydrogeloppervlakken met ECM-eiwitten vereist een overdrachtsstap om eiwitten van het glasoppervlak te verwijderen en ze te verknopen met de patronen. Als alternatief kunnen patronen op zachte materialen worden bereikt door het fotomasker eerst te coaten met een afstotend eiwit, gevolgd door de ontmaskerde gebieden te verbranden met behulp van diepe UV-verlichting. Omdat diepe UV ozon genereert en het oppervlak reactief maakt voor eiwitbinding, worden de ontmaskerde gebieden bedekt met ECM-eiwitten en ten slotte wordt de gel direct bovenop de ontmaskerde gebieden gepolymeriseerd9,10.
De hydrogels met patroon kunnen worden gebruikt om TFM uit te voeren, een techniek die celkrachten meet op het cel-materiaalinterface11. In 2D-TFM gebruikt men het platte oppervlak van een dikke polymeerfilm, waarin markerkralen zijn ingebed om vervormingen te volgen12,13,14,15. Om verplaatsingsvectoren te extraheren, is het essentieel om twee afbeeldingen te combineren, een van de vervormde toestand en een referentiebeeld zonder vervormingen. De twee afbeeldingen worden vervolgens met beeldverwerking op elkaar in kaart gebracht. Bij hoge markerdichtheid gebeurt dit meestal met Particle Image Velocimetry (PIV), een gevestigde methode om hydrodynamische stroming te reconstrueren. Bij lage markerdichtheid en in 3D-TFM gebeurt dit meestal met Particle Tracking Velocimetry (PTV), die specifieke kenmerken van de experimentele dataset bevat. Een voorbeeld van een rekenkundig goedkoper alternatief is optische flow, zoals het Kanade-Lucas-Tomasi (KLT) algoritme16. In het geval van hydrogelsubstraten worden fluorescerende kralen meestal ingebed met een hoge dichtheid tijdens de materiaalpolymerisatie en worden beelden opgenomen voor en na celafgifte bij enzymatische loslating. Enzymatische loslating van aanhangende cellen, bijvoorbeeld door trypsinisatie, leidt tot gelijktijdige afgifte van cellulaire tracties van alle cellen op de hydrogels, waardoor het moeilijk is om een gedetailleerde analyse van een groot aantal cellen te verkrijgen.
Hier presenteren we een protocol om microgepatterde hydrogels te bereiden om de celvorm en lokalisatie te regelen en een methode om tractiekrachten efficiënt achter elkaar te meten met behulp van UV om individuele cellen van het substraat los te maken. Voor tractiekrachtmetingen presenteren we een techniek om tweelaagse PA-hydrogels te produceren, waarbij fluorescerende kralen alleen in de bovenste laag zijn ingebed, wat hun dichtheid verhoogt en hun verticale verspreiding vermindert. Het combineren van UV-gemedieerde afgifte van cellulaire tractiekrachten met micropatterning maakt het mogelijk om ruimtelijke controle te verkrijgen over celloslating (bijvoorbeeld van afzonderlijke cellen zonder de hechting van andere cellen in het betreffende gebied te beïnvloeden), op voorwaarde dat er voldoende afstand is tussen cellen met patronen. Cellulaire tractie wordt vervolgens gereconstrueerd met behulp van de meest efficiënte en betrouwbare methode voor 2D-TFM, namelijk Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC) met regularisatie17,18.
Protocol
1. Bereiding van methacrylaatdeksels
OPMERKING: Glazen coverslips worden methacrylaat om PA-hydrogels covalent te verbinden en daarom hun loslating tijdens de incubatie met cellen te voorkomen. Microscoopglas coverslips worden gebruikt om een hoge beeldkwaliteit te bereiken.
- Om een oplossing van 300 ml te bereiden, neemt u een schoon glazen bekerglas van 400 ml en plaatst u het in een zuurkast.
- Voeg 10 ml dubbel gedestilleerd water (ddH2O) toe aan het bekerglas. Voeg 18,75 ml azijnzuur (≥99,8% pro-analyse, p.a.), 18,75 ml 3-(trimethoxysilyl)propylmethacrylaat en 252,5 ml ethanol (≥99,8% p.a.) toe met behulp van een serologische pipet. Giet de oplossing in een kristalliserende schaal.
- Reinig 24 mm ronde glazen dekplaten met precisiedoekjes. Plaats de coverslips in een op maat gemaakt polytetrafluorethyleenrek.
- Dompel het rek onder in de oplossing en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Neem het rek en spoel alle coverslips af met ethanol (99,8% per jaar). Droog de dekenslips onder luchtstroom.
OPMERKING: Methacrylated coverslips kunnen tot 1 maand worden bewaard bij RT.
2. Micropatterning van extracellulaire matrixeiwitten op glazen coverslips
OPMERKING: Glazen coverslips worden eerst bedekt met een laag moleculen, bestaande uit eiwit- en celafstotend middel. Deze laag wordt vervolgens verwijderd met behulp van een fotopatterning-techniek, om de daaropvolgende afzetting van extracellulaire matrixeiwitten in microgepatterde gebieden mogelijk te maken.
- Neem een 15 mm ronde glazen afdekplaat en leg deze op een petrischaaltje. Gebruik een diamantpen om de bovenzijde van de coverslip te markeren. Ga vervolgens verder met reinigen via zuurstofplasmabehandeling bij 0,4 mbar en 200 W gedurende 2 minuten.
- Pipetteer 100 μL 0,01% poly-L-lysine-oplossing op het oppervlak van elke coverslip. Incubeer gedurende 30 min bij RT. Was de coverslips met 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonzuur (HEPES) pH 8,5. Verwijder overtollige vloeistof, maar houd het oppervlak nat.
- Pipetteer 100 μL van 50 mg/ml poly(ethyleenglycol) methylether succinimidylvaleraatzuur (mPEG-SVA) in 10 mM HEPES pH 8,5 op het oppervlak van elke coverslip. Incubeer gedurende 1 uur bij RT. Spoel de afdekplaten af met 10 mM HEPES pH 8,5 en droog af onder luchtstroom.
- Voeg 2 μL UV-gevoelige foto-initiator (bijv. PLPP-gel) gevolgd door 40 μL ethanol (≥99,8% per jaar) toe aan het oppervlak. Om een homogene verdeling van de gel en ethanol over het oppervlak te verkrijgen, kantelt u de petrischaal voorzichtig heen en weer. Wacht 5 minuten tot de oplossing polymeriseert.
- Plaats een enkele afdekplaat in een petrischaaltje van 35 mm met een gat van 20 mm aan de onderkant. Hierdoor kan de laserstraal die van onderaf komt direct het glasoppervlak bereiken.
- Zet de microscoop en een lichtpatroonmodule aan (werken met dit apparaat is alleen toegestaan na een veiligheidsinleiding van de laserveiligheidsfunctionarissen). Kalibreer de UV-A laser op het 20x lucht objectief. Zet het monster met de foto-initiator op het podium. Pas de focus aan op het oppervlak van het glas en schakel de scherpstelregeling in. Laad en vergrendel het vooraf getekende patroon.
- Bereid het patroon voor met behulp van grafische software zoals Inkscape. Zorg ervoor dat het patroonbestand de DMD-afmetingen niet overschrijdt (1824 x 1140 px, wat overeenkomt met 552 x 325 μm op 20 x lens (0,28 μm /px)).
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de DMD-grootte (1824 x 1140 pixels) te gebruiken als de grootte van het patroonbestand, omdat dit ervoor zorgt dat er geen fouten optreden tijdens het patroon. Maak bijvoorbeeld geen patroonbestand met een dimensie van 1830 x 1130 pixels. - Met het oog op patroonoverdracht naar polyacrylamide, moet u ervoor zorgen dat het patroon slechts tot 60% -70% van de straal van het midden van het glas tot de rand wordt uitgevoerd.
- Gebruik voor het patroon van een enkele cel een diameter van 50-100 μm met de afstand van 100 μm tussen patronen en een diameter van 150-300 μm voor een celgroep. De juiste patroongrootte hangt sterk af van de typische celgrootte en moet voldoende groot zijn om cellen te laten hechten.
- Bereid het patroon voor met behulp van grafische software zoals Inkscape. Zorg ervoor dat het patroonbestand de DMD-afmetingen niet overschrijdt (1824 x 1140 px, wat overeenkomt met 552 x 325 μm op 20 x lens (0,28 μm /px)).
- Start de patroonvorming met een UV-dosis van 30 mJ/mm2. De patroonduur is afhankelijk van het aantal patronen. Het maken van een enkel patroon duurt ongeveer 1 s.
- Spoel na het voltooien van de patroonstap het oppervlak drie keer af met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Incubeer het monster met 100 μL 25 μg/ml fibronectine opgelost in 1x PBS en 25 μg/ml fibrinogeen Alexa488 conjugaat in PBS gedurende 1 uur bij RT. Zoek voor andere ECM-eiwitten de optimale concentraties die de patroongebieden volledig bedekken.
- Spoel het oppervlak drie keer af met 1x PBS. Zorg ervoor dat het patroonglas onmiddellijk wordt gebruikt voor glas-PA-overdracht. Bewaar het patroonglas in PBS bij RT tijdens de hydrogelbereiding.
3. Vervaardiging van polyacrylamide hydrogels met patroon
OPMERKING: Polyacrylamide hydrogels worden bereid, inclusief geoxideerd N-hydroxyethyl acrylamide (HEA) om reactieve aldehydegroepen te presenteren voor de covalente binding van matrixeiwitten op het oppervlak. Bovendien wordt een tweelaagse benadering om fluorescerende kralen alleen op de bovenste laag van de hydrogel in te bedden gebruikt om de registratie van kraalverplaatsing tijdens tractiekrachtmicroscopie-experimenten te verbeteren.
- Doe de methacrylaatglazen dekplaten in een petrischaaltje.
- Om verse geoxideerde HEA-oplossing te bereiden, voegt u 9,55 ml dubbel gedestilleerd water toe aan een centrifugebuis van 15 ml. Voeg vervolgens 0,5 ml HEA en 42 mg natrium(meta)periodaat toe om 10 ml van de oplossing te krijgen. Roer de oplossing continu in het donker gedurende 4 uur.
- Meng acrylamide, bis-acrylamide en dubbel gedestilleerd water volgens tabel 1 om 10 ml hydrogel met stamoplossing te krijgen (doe het onder de zuurkast, monomeren zijn neurotoxisch). Ontgas en sluit het deksel tot een luchtdichte afdichting.
OPMERKING: De stamoplossing kan tot 1 jaar in aliquots bij 4 °C worden bewaard. Karakteriseer altijd de Young's modulus van de hydrogel voorafgaand aan gebruik. - Bereid een dubbellaagse PA-hydrogel voor (doe het onder de zuurkast, monomeren zijn neurotoxisch).
- Begin met de onderste laag door voorzichtig 99,3 μL stockoplossing, 0,5 μL 1% ammoniumperssulfaat (APS) en 0,2 μL tetramethylethyleendiamine (TEMED) in een buis van 1,5 ml te mengen. Neem 10 μL uit de oplossing en pipetteer het druppelsgewijs op het midden van de methacrylaatdeksel.
- Plaats voorzichtig een ronde afdekplaat van 15 mm op de druppel en wacht 45 minuten op polymerisatie. Maak de bovenste coverslip voorzichtig los met een scalpel.
- Meng voor de bovenste laag voorzichtig 93,3 μLof-stamoplossing met 1 μL vers geoxideerde HEA-oplossing, 5 μL fluorescerende kralen (overeenkomend met drie kralen per vierkante micron voor kralen van 200 nm), 0,5 μL van 1% APS en 0,2 μL TEMED in een buis van 1,5 ml. Neem 5 μL uit de oplossing en pipetteer het druppelsgewijs op het midden van de reeds gepolymeriseerde onderlaag.
- Plaats de microgepatterde dekplaat voorzichtig op de druppel. Wacht 45 minuten bij RT tot de druppel is gepolymeriseerd. Zorg ervoor dat de zijkant met patroon de druppel raakt. Maak de coverslip voorzichtig los met een scalpel.
- Lijm de 24 mm coverslips op de bodem van op maat geboorde 6-well platen met behulp van tweecomponenten siliconenlijm. Voeg na 5 minuten PBS toe aan de putten.
- Karakteriseer de Young's modulus van de polyacrylamide hydrogel monsters door atomaire kracht microscopie (AFM).
- Monteer een bolvormige puntkraan op de AFM-houder.
- Kalibreer elke cantilever door een krachtafstandscurve (3-4 V instelpunt) op een hard substraat (bijv. Glas of mica) te verkrijgen, extrapoleer de vrijdragende gevoeligheid, trek je terug van het oppervlak en voer een thermische tune uit om hun veerconstante te krijgen.
- Plaats de gekalibreerde cantilevers over het hydrogelmonster en verkrijg krachtcurven in PBS-buffer, met behulp van de volgende parameters: 20-30 nN krachtinstelpunt, 5 of 10 μm / s nadering en retractiesnelheid, 5 μm rampgrootte.
OPMERKING: Een omgekeerde optische microscoop, uitgerust met een lucht 40x objectief en een groen fluorescerend eiwit (GFP) filter werd gebruikt om ECM-micropatterned gebieden in de PA hydrogel monsters te visualiseren en te targeten. - Plot de verworven kracht versus afstand curven met de AFM analyse software.
- Zoek het contactpunt en zet kracht versus afstandscurven om in kracht versus inspringingscurven.
- Monteer het inkepingsgedeelte van de curve met het Hertz-model (of een geschikt mechanicamodel in functie van de tipgeometrie), met behulp van een Poisson-verhouding tussen 0,2 en 0,5.
4. Lokale afgifte van celtractiekrachten door UV-A-laserverlichting (LUVI-TFM)
OPMERKING: UV-A-laser wordt toegepast om tractiekrachten vrij te maken in cellen die gelokaliseerd zijn in gedefinieerde gebieden van de hydrogels. De UV-A laser (d.w.z. λ = 375 nm solid-state laser, <15 mW) is een klasse 3B laser. De niet-afgeschermde laserstraal is gevaarlijk voor de ogen en vaak voor de huid. Gereflecteerd en verstrooid licht en straling kunnen gevaarlijk zijn. Bovendien kan UV-straling huidkanker veroorzaken. Het werken met apparaten is alleen toegestaan na veiligheidsinleiding van de laserveiligheidsfunctionarissen.
- Aspirateer de PBS uit de putten.
- Zaad 3 x 106 cellen per 6-well plaat in groeimedium. Gebruik voor fibroblasten hoge glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met L-glutamine en aangevuld met 10% Foetal Bovine Serum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine. Incubeer de cellen een nacht bij 37 °C/5% CO2. Was monsters om zwevende cellen te verwijderen voordat u met microscopie begint.
- Schakel de microscoop incubatiekamer en gastoevoer in om een temperatuur van 37 °C en 5% CO2-atmosfeer te verkrijgen.
- Schakel de microscoop en de laserpatroonmodule in. Kalibreer indien nodig de UV-A-laser opnieuw op het 20x luchtobjectief met behulp van de Leonardo-software. Leg de op maat gemaakte 6-well plaat met de samples op het podium. Pas de focus aan op het oppervlak van de PA.
- Stel het verlichtingspatroon in en markeer de cellen van belang. Focus opnieuw op het oppervlak van de hydrogel. Verkrijg het beeld van de cellen in het brightfield-kanaal. Schakel over naar het Cy5-kanaal (verroodfilter, 650 nm excitatie, 670 nm emissie) en maak een foto van kralen in de vervormde toestand.
- Ga naar het laserkanaal. Zet de laser gedurende 3 minuten aan. In onze specifieke opstelling kwam dit overeen met een lichte dosis van 6.000 mJ/mm2.
- Schakel over naar het Cy5-kanaal en krijg een afbeelding van de kralen in de ongevormde toestand.
OPMERKING: Voor experimenten met embryonale fibroblasten van muizen wacht u tot 15 minuten na blootstelling om de referentie/ongevormde afbeelding vast te leggen (zie de sectie Representatieve resultaten ). Het kan anders zijn voor andere type cellen. Herhaal stap 4.5-4.7 nogmaals voor een andere cel(len) die van belang zijn. - Om de verhoogde oxidatieve spanning na UV-A-verlichting te meten, gebruikt u het in de handel verkrijgbare reagens (CellRox). CellRox is niet-fluorescerend in verminderde toestand en, wanneer geoxideerd door reactieve zuurstofsoorten, fluoresceert met een emissiemaximum van ~ 665 nm.
- Voeg volgens het meegeleverde protocol 5 μM-reagens toe aan de beeldvormende media en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C/5% CO2. Was vervolgens de cellen 3x met warme 1x PBS en vervang de beeldvormende media. Neem het Cy5-signaal op door fluorescentiebeeldvorming voor en na UV-A-verlichting met een vergelijkbare lichtblootstelling.
5. Beeldverwerking, deeltjesbeeld velocimetrie en berekening van tractiekrachten
OPMERKING: Celtractiekrachten worden geregistreerd door de verplaatsing van fluorescerende kralen te analyseren en berekend met behulp van beeldanalysetools op basis van deeltjesbeeld velocimetrie.
- Open fluorescerende kralenafbeeldingen, vóór (d.w.z. vervormd) en na laser (d.w.z. ongedeformeerd) met Fiji. Twee afbeeldingen samenvoegen als één stapel (Afbeelding | Stapels | Afbeeldingen om te stapelen).
- Corrigeer laterale drift tussen de twee afbeeldingen met behulp van stackreg plugin (P. Thévenaz, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne). Afbeeldingen wijzigen in 8-bits (Afbeelding | Soort | 8 bit) en opnieuw schalen naar 1024 x 1024 pix (Afbeelding | Schaal). Opslaan als een afbeeldingsreeks (TIFF-indeling) met de referentieafbeelding altijd aan het begin.
- Verkrijg het verplaatsingsvectorveld met behulp van een kruiscorrelatietechniek19 uit het PIV-veld zoals geïmplementeerd in het OpenPIV-project.
- Zorg ervoor dat de ontspannen (niet-vervormde) afbeelding en de vervormde afbeelding zijn bedekt met zoekvensters van grootte wR en wD in pixels. Definieer voor elk zoekvenster een kruiscorrelatiefunctie met behulp van de volgende formule:
Hier beschrijven R(i,j) en D(i,j) de intensiteitsvelden van de twee afbeeldingen die zijn afgekapt naar het geselecteerde zoekvenster en vervolgens worden gespiegeld.
en 
beschrijf hun gemiddelde waarde. De venstergroottes worden gekozen als wR = 32 en wD = 32 en er wordt een overlap van 70% gebruikt tussen de aangrenzende zoekvensters. - Bepaal voor elk zoekvenster een verplaatsingsvector
die de kruiscorrelatiefunctie optimaliseert en wijs toe aan de middelste positie van het zoekvenster. Subpixelnauwkeurigheid wordt verkregen met behulp van een Gaussiaanse fit rond het maximagebied zoals beschreven20. - Zoek en verwijder dubbelzinnige verplaatsingsvectoren. Verplaatsingsvectoren die overeenkomen met zoekvensters waarbij de verhouding tussen twee hoogste lokale maxima van de kruiscorrelatiefunctie onder een drempel van 1,5 als dubbelzinnig wordt beschouwd21.
- Verwijder verplaatsingsvectoren die niet slagen voor de genormaliseerde mediaantest voor een restdrempel van 1,522.
- (Optioneel) Corrigeer de resterende laterale drift door een vaste vector
af te trekken van alle verplaatsingen. Dit wordt gedaan omdat de verplaatsing in een geselecteerd gebied ver weg van de cel verdwijnt. - Interpoleer het resulterende verplaatsingsvectorveld naar een regulier raster met een afstand van 4 px van de invoerafbeeldingen met behulp van een kubische polynomiale interpolatie. Ontbrekende datapunten worden opgevuld met behulp van een vloeiende bivariate spline extrapolatie. Een verplaatsingsvector in pixels is gerelateerd aan een lokale vervorming door de pixelverhouding van de afbeelding (0,33 μm /px voor 20x luchtlens).
- (Optioneel) Spiegel het beeld om rinkelende artefacten in de daaropvolgende analyse te verminderen.
- Vermenigvuldig het vervormingsveld met een Tukey-vensterfunctie om het randeffect als gevolg van de driftcorrectie te elimineren, met een parameter van 0,2-0,3. In dit experiment is het microgepatterde gebied in het centrum van FOV van belang.
- Zorg ervoor dat de ontspannen (niet-vervormde) afbeelding en de vervormde afbeelding zijn bedekt met zoekvensters van grootte wR en wD in pixels. Definieer voor elk zoekvenster een kruiscorrelatiefunctie met behulp van de volgende formule:
- Reconstrueer de tractie met behulp van geregulariseerde Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC)18. Als regularisatie gebruiken we de eenvoudigste redelijke keuze, namelijk 0e orde Tikhonov (L2) regularisatie23,24,25. Een optimale regularisatieparameter λ wordt zodanig gekozen dat deze de GCV-functie (Generalized Cross Validation) minimaliseert, gedefinieerd door26:
Hier is τλ een gestapelde vector die de x- en y-componenten van het gereconstrueerde tractieveld bevat voor de gegeven waarde van λ voor alle Fourier-bemonsteringsmodi en G is de lineaire operator die tractievelden in kaart brengt met hun overeenkomstige verplaatsingsveld, zoals gedefinieerd voor FTTC. De som loopt over vectorcomponenten. ui zijn de x- en y-componenten van het verplaatsingsveld voor alle Fourier-bemonsteringsmodi. GCV wordt veel gebruikt op het gebied van slecht gestelde inverse problemen en is een goed alternatief voor het L-curve criterium dat vaak wordt gebruikt in TFM. Een Lanzcos-filter wordt gebruikt om artefacten te verminderen vanwege de beperkte frequentieruimte en de upsampling van het verplaatsingsveld. De tractieberekening is afhankelijk van de Young-modulus van de PA (bijv. 11,3 kPa) en de Poisson-verhouding (bijvoorbeeld voor PA in het bereik tussen 0,2 en 0,5, afhankelijk van de crosslinkerconcentratie).
en 
beschrijf hun gemiddelde waarde. De venstergroottes worden gekozen als wR = 32 en wD = 32 en er wordt een overlap van 70% gebruikt tussen de aangrenzende zoekvensters.
die de kruiscorrelatiefunctie optimaliseert en wijs toe aan de middelste positie van het zoekvenster. Subpixelnauwkeurigheid wordt verkregen met behulp van een Gaussiaanse fit rond het maximagebied zoals beschreven20.
af te trekken van alle verplaatsingen. Dit wordt gedaan omdat de verplaatsing in een geselecteerd gebied ver weg van de cel verdwijnt.
Representative Results
De PA-hydrogels werden gepolymeriseerd op methacrylaatglazen coverslips, die reactieve groepen presenteren voor de covalente koppeling van de PA. Op deze manier werd bij het plaatsen van de hydrogels in een waterige oplossing hun loslating van het substraat voorkomen (figuur 1A-D). Om een hoge dichtheid van fiduciale markers in de buurt van het hydrogeloppervlak te verkrijgen, ontwikkelden we de voorbereiding van een dubbellaagse PA-hydrogel. De onderste laag, zonder fluorescerende kralen, werd gepolymeriseerd op de methacrylaatdeksel. Vervolgens werd een andere laag met kralen bovenop de onderste laag gepolymeriseerd (figuur 1E-H), ter vervanging van de behoefte aan sedimentatie, die vaak wordt gebruikt om parelverdeling in een enkel brandpuntsvlak te bereiken en de kraaldichtheid te verhogen. Om controle te krijgen over de celvorm tijdens TFM-metingen, produceerden we microgepatterde PA-hydrogels via directe overdracht van microstructuren met fibronectinepatroon van een glazen afdekplaat naar de voorgepolymeriseerde PA (figuur 1F-F '). De toevoeging van 1% niet-conventionele crosslinker (geoxideerde HEA) in de bovenste hydrogellaagoplossing biedt aldehydegroepen die covalent binden aan aminegroepen van fibronectine.
We bereidden PA-hydrogels, die ongeveer 60 μm dik zijn en beperkte fluorescerende kralen in de bovenste laag dicht bij het hydrogeloppervlak. Dit type hydrogel is een geschikt substraat voor het afbeelden van cellulaire tractie met omgekeerde microscopen en dik genoeg (minimale dikte om TFM uit te voeren is gemeld 20-30 μm)18 om elke impact van het glassubstraat te voorkomen. Lokalisatie van de fluorescerende kralen werd in beeld gebracht door confocale microscopie (figuur 1I). Om de eiwitoverdracht op de hydrogel te visualiseren, gebruikten we fluorescerend gelabelde ECM-eiwitten en brachten ze in beeld door epifluorescentiemicroscopie (figuur 1J). We bereidden microgepatterde cirkels van fibronectine met een diameter van 100 μm (linkerkant) en 50 μm (rechterkant) om hechting van groepen cellen of enkele cellen mogelijk te maken, zoals te zien is in de overlay van heldere veldafbeeldingen van aanhangende cellen, en fluorescerend gelabelde fiduciale kralen en fibronectine micropatronen. Op een ander monster werd de adhesierespons van afzonderlijke cellen op microgepatterd fibronectine gevalideerd door indirecte immunofluorescentiemicroscopie om de lokalisatie van focale adhesie-eiwitten zoals paxilline in beeld te brengen (figuur 1K).
Zowel ECM-eiwitcoating als hydrogelstijfheid zijn cruciale parameters voor celadhesie26. Om de mechanische eigenschappen van onze PA-hydrogels te karakteriseren, hebben we nano-indentatie-experimenten uitgevoerd door AFM27, gekoppeld aan een epifluorescentiemicroscoop. Hydrogel substraten van drie verschillende stijfheid werden voorbereid en getest met onze opstelling (figuur 2 en tabel 1). Bolvormige AFM-cantilevers werden cyclisch benaderd en teruggetrokken uit ongepatterde PA-hydrogels en fibrinogeen geconjugeerd aan Alexa488-microgepatterde gebieden, terwijl kracht-afstandscurven werden geregistreerd. Vervolgens stelden de evaluatie van het contactpunt en de toepassing van het Hertz-model ons in staat om de Young-modulus (E) van elk monster te schatten. ECM-micropatterning veranderde niets aan de modulus van de Young, die vergelijkbaar bleef met elk van de ongepatterde PA-hydrogels.
Om de tractiekrachten te meten die worden uitgeoefend door aanhangende cellen op het substraat, hebben we een experimentele opstelling ontwikkeld voor referentiegebaseerde TFM, uitgevoerd op een widefield-epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een bijna UV-lasermodule (UV-A 6000 mJ / mm2) om celtractie vrij te maken (figuur 3A). Omdat de laserstraalverlichting spatio-temporeel kan worden geregeld, is het niet alleen mogelijk om selectief een enkele cel of een celcluster met een hoge laserdosis bloot te stellen, maar ook en nog belangrijker, de verstorende tussenstap van celverwijdering uit het hele monster met behulp van een spijsverteringsenzym zoals trypsine is niet langer nodig. Het verlichten van cellen met zo'n hoge laserdosis veroorzaakte een verhoogde oxidatieve stress die leidde tot celdood (figuur 3B). Celdood leverde de afgifte van tractie uit het substraat op, zoals aangegeven door de kraalverplaatsing (geïllustreerd in figuur 3A). We combineerden de UV-A-verlichting met een lichtpatroonmodule om selectief micron-groottegebieden van de PA-hydrogels te verlichten (figuur 3B-C). Op deze manier is het mogelijk om de tractie van microgepatterde celclusters (figuur 3C,F) of enkele cellen (figuur 3B) vrij te geven. Belangrijk is dat op onze tijdschalen de mechanische eigenschappen van de ECM-patroonhydrogels niet significant werden beïnvloed door UV-blootstelling (figuur 2C). Toename van oxidatieve stress is weergegeven in figuur 3D,E. De tractiekrachten werden gereconstrueerd met behulp van geregulariseerde FTTC met een regularisatieparameter gekozen door Generalized Cross Validation (Figuur 3B,F). De afgifte van krachten voor afzonderlijke cellen vond plaats over een periode van 15 minuten en het resultaat van de LUVI-TFM is vergelijkbaar met de op trypsine gebaseerde TFM (figuur 3G-H).
Figuur 1: Schema van patroon fibronectine-substraatpreparaat voor TFM. (A) De oplossing voor de onderste laag wordt gepipetteerd op een methacrylaat oppervlak. (B) Een kleinere schone dekplaat wordt voorzichtig op de druppel geplaatst. (C) De gelation tijd is 45 min. (D) De bovenste coverslip is losgemaakt. De onderste laag is klaar. (E) De oplossing voor de toplaag wordt op de hydrogel gepipetteerd. (F) De patroondeksellip wordt zorgvuldig op de druppel geplaatst. (F') De micropatterning van kleefeiwitten op glas wordt geproduceerd door maskerloze near UV-lithografie en vervolgens overgebracht van glas naar PA-hydrogel. De vrije aminegroepen van kleefeiwitten, bijvoorbeeld fibronectine, binden covalent aan aldehydegroepen op het PA-oppervlak. (G) De gelation tijd is 45 min. (H) De bovenste coverslip is losgemaakt. De PA hydrogel met patroon is klaar. (I) Een 3D-weergave van een confocale xyz-micrograaf die een hoge dichtheid van fiduciale kralen in de buurt van het oppervlak laat zien. (J) Een micrograaf van fluorescerend gelabeld fibronectine (magenta) op het oppervlak van PA met ingebedde fluorescerende kralen (groen), bedekt met een helder veldbeeld van cellen. (K) Indirecte immunofluorescentiemicroscopie beeldvorming van een enkele cel die zich hecht aan een cirkelvormig fibronectinemicropattern (100 μm). Nucleus (blauw), paxilline (rood). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Karakterisering van de mechanische eigenschappen van het monster door AFM. (A) AFM nano-dentatie experimentele opstelling. Een bolvormige cantilever wordt gebruikt om ECM-micropatronen voor of na UV-behandeling te onderzoeken, en de niet-patroonachtige gebieden van dubbellaagse PA (5% acrylamide, 0,3% Bis-acrylamide) gebieden. (B) Representatieve kracht versus indrukcurve voor ECM-micropattern (zwart). Hertz fit (rood) wordt gebruikt om de Young's modulus (E) van het monster te berekenen. (C) Mechanische metingen voor niet-patroonige dubbellaagse PA-gebieden (geen ECM), ECM-micropattern en ECM-micropattern na blootstelling aan UV-A. De balken tonen gemiddelde ± S.E.M. (Brown-Forsythe en Welch ANOVA test). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Lokale UV-A verlichting TFM (LUVI-TFM) maakt lokale tractiekrachtmetingen binnen een groot gezichtsveld mogelijk. (A) Schema van lokale UV-A-verlichting TFM. Cellen worden behandeld met een hoge dosis UV-A laser om het ongevormde (referentie)beeld te krijgen. (B) Het heldere beeld van een enkele cel vóór UV-A laserverlichting. Midden: Het heldere beeld van een enkele cel na UV-A laserverlichting. Rechts: Trekkracht van een enkele MEF die zich hecht aan een met fibronectine gecoate PA-hydrogel (E = 5,74 kPa) verlicht met een UV-lichtbundel met een diameter van 50 μm (rode stippellijn). (C) Links: Registratie van de tractiekrachten van een cluster van embryonale fibroblasten van muizen (MEF) die zich hechten aan microgepatterd fibronectine (cirkel, diameter 100 μm). De cluster werd verlicht met een UV-lichtbundel met een diameter van 200 μm (rode stippellijn). Rechts: Registratie van de trekkrachten van een cluster van embryonale fibroblasten van muizen (MEF) die zich hechten aan microgepatterd fibronectine (cirkel, diameter 300 μm). De cluster werd verlicht met een UV-lichtbundel met een diameter van 300 μm (rode stippellijn). Schaalbalk = 200 μm. (D,E) Een toename van oxidatieve stress in cellen die wordt aangegeven door de verhoogde Cy5-signaalintensiteit na een hoge UV-A-laserdosis wordt gedetecteerd door fluorescentiemicroscopie. De oxidatieve stress leidt tot celdood. Schaalbalk = 200 μm. (F) Links: De stress heat map van een cluster van muis embryonale fibroblasten (MEF) die zich hechten aan microgepatterde fibronectine (cirkel, 100 μm diameter). Rechts: De stress heat map van een cluster van muis embryonale fibroblasten (MEF) die zich hechten aan microgepatterde fibronectine (cirkel, 300 μm diameter). (G) MEF-cellen die zich hechten aan 100 μm fibronectine micropatronen geven langzaam hun tractie af na blootstelling aan UV-A. Volledige release wordt bereikt na 15 minuten (de referentiefoto is vervolgens 15 minuten na belichting gemaakt). (H) Een vergelijking met de conventionele op trypsine gebaseerde TFM voor MEF-cellen met een diameter van 300 μm met een patroon-fibronectine. Het resultaat van UV-A-verlichting (6.000 mJ/mm2) gevolgd door 15 minuten wachten verschilt niet significant van de conventionele trypsinebehandeling (d.w.z. 0,05% gedurende 20 minuten). De balken tonen het gemiddelde S.E.M. (two-tailed Student's t-test, ****P < 0,0001, * P < 0,05, ns P ≤0,5). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Acrylamide (%) | Bis-acrylamide (%) | Acrylamide uit 40 % stamoplossing (ml) | Bisacrylamide uit 2 % stamoplossing (ml) | Water (ml) | Young's modulus (kPa) |
| 4 | 0.1 | 1 | 0.5 | 8.5 | 5,74 ± 0,53 |
| 5 | 0.15 | 1.25 | 0.75 | 8 | 9,69 ± 0,68 |
| 5 | 0.3 | 1.25 | 1.5 | 7.25 | 11,33 ± 1,06 |
Tabel 1: Mengsels van hydrogel-stamoplossing en resulterende elasticiteit
Alle gegevens worden gedeponeerd in de Open Access Data Repository van The Max Planck Society (Edmond) en zijn toegankelijk via het volgende adres: https://edmond.mpdl.mpg.de/imeji/collection/JTu8PlWqpbymN9Qf
Discussion
In dit protocol beschrijven we de bereiding van microgepatterde PA-hydrogels met fluorescerende kralen, die worden gebruikt als fiduciale markers voor TFM-studies. Onze aanpak is gebaseerd op drie stappen: 1) bereiding van dubbellaagse PA-hydrogels; 2) micropatterning van ECM-eiwitten en hun overdracht op het hydrogeloppervlak; 3) gebruik van patroon bijna-UV-licht voor TFM. De experimentele opstelling om celtractie naar het substraat te analyseren, vereist het gebruik van lineaire elastische materialen met bekende stijfheidswaarden om de krachten te berekenen die verband houden met verplaatsing van de fluorescerende kralen26. PA-hydrogels zijn gemakkelijk te bereiden, de stijfheid kan gemakkelijk worden afgestemd en ze worden vaak gebruikt voor stijfheidsdetectie en TFM18,28. Om echter reproduceerbare polymerisatietijden en homogene polymerisatie van de gehele hydrogel te verkrijgen, moet aandacht worden besteed aan de opslagomstandigheden en de tijd voor de reagentia, bijvoorbeeld APS moet in een exsiccator worden bewaard om te voorkomen dat het zijn activiteit verliest; TEMED moet worden beschermd tegen direct licht. Het gebruik van geoxideerde HEA maakt de covalente binding van matrixeiwitten op het hydrogeloppervlak mogelijk, wat voordelig kan zijn om de vorming van een volledige en stabiele eiwitlaag te bereiken. De geoxideerde HEA-oplossing moet vers worden bereid telkens wanneer PA-hydrogels worden vervaardigd. De dubbellaagse PA-hydrogel biedt drie belangrijke voordelen: 1) het biedt een alternatieve manier om reproduceerbaar een homogene verdeling van fiduciale kralen in de buurt van het hydrogeloppervlak te krijgen, zonder dat de gel extreem dun hoeft te worden (d.w.z. <20 μm). Controle over de dikte van de hydrogel is cruciaal voor het verkrijgen van nauwkeurige metingen met TFM. Wanneer het elastische substraat te dun is, kunnen sterk hechtende cellen zoals fibroblasten het onderliggende stijve glassubstraat detecteren en mechanisch erop reageren29,30. Dikke hydrogels maken de beeldverwerving voor de krachtreconstructie uitdagender. Bovendien zullen veel microscopen niet voldoende ruimte hebben om ze te huisvesten, gezien de extra dikte van het glazen substraat dat wordt gebruikt om de hydrogel te bevestigen, tenzij ultradunne microscopieglaasjes worden gebruikt. 2) In de tweelaagse PA-hydrogel wordt de homogene verdeling van fiduciale kralen nabij het oppervlak van de PA-hydrogel bereikt zonder een centrifuge te gebruiken, maar eerder met een eenvoudige incubatie van precieze hoeveelheden hydrogeloplossingen en fluorescerende kralen. Een hoge pareldichtheid is van groot voordeel bij het uitvoeren van de PIV-analyse omdat het de resolutie van de trekkrachten en de signaal-ruisverhouding verhoogt zonder de noodzaak van confocale microscopie. 3) Het insluiten van kralen in een dunne laag dicht bij de cel-materiaalinterface maakt beeldvorming van tractiekrachten mogelijk met epifluorescentiemicroscopen en confocale microscopen. Bij het voorbereiden van de hydrogel moet de gebruiker ervoor zorgen dat deze stevig aan het onderste glas hecht voordat hij doorgaat met de volgende stappen van het protocol. We raden aan om de incubatietijd te volgen die is aangegeven voor de polymerisatie van de hydrogellagen, omdat het moeilijk kan zijn om het glas bovenop het oppervlak te verwijderen zonder het hydrogeloppervlak te beschadigen.
De meest bekende technieken om elastische eigenschappen te meten zijn AFM, nano-dedentatie, trekproeven en rheometrie. Nano-aantasting veroorzaakt echter zeer hoge spanningen op de materialen die de bepaling van elastische eigenschappen kunnen beïnvloeden. Trekproeven en rheometrie daarentegen zijn macroscopische meettechnieken, terwijl cellen interageren op microscopische schaal31,32. AFM maakt metingen op microschaal mogelijk met verminderde spanningen onder fysiologische omstandigheden. De betrouwbaarheid van AFM-metingen kan nadelig worden beïnvloed als experimentele details ontbreken (bijv. inkepingskracht en snelheid) of als er onvoldoende gegevens worden geregistreerd27. Huth et al. beschrijven een algoritme om de moduli van Young uit AFM-gegevens te halen, waarbij de nadruk wordt gelegd op het constant houden van meetgegevens27. Dit algoritme biedt een nauwkeurige en betrouwbare bepaling van Young's moduli en werd gebruikt voor onze experimenten. Bovendien hebben we veel curven gemeten op monsters die op verschillende dagen zijn vervaardigd en zeer vergelijkbare resultaten behaald (variatie van gemiddelde waarden van ca. 1-2 kPa). Dit toont aan dat de stijfheid van onze gels betrouwbaar kan worden voorspeld.
In dit protocol gebruiken we een fotopatterningmodule om microgepatterde gebieden op glas te creëren, die vervolgens worden overgebracht naar de hydrogeloppervlakken. De micropatterning die in dit protocol wordt getoond, is gebaseerd op DMD (digital micro-mirror device)-gebaseerde maskerloze near-UV-lithografie (λ = 375 nm)7. Een DMD bestaat uit een groot aantal microspiegels op een chip. Een enkele pixel komt overeen met een enkele microspiegel. Het gepixelde patroonafbeeldingsbestand van een computer wordt geprojecteerd via DMD en op het oppervlak gericht met behulp van een objectieve lens. Voor micropatterning van eiwitten wordt het gerichte laserlicht gebruikt om afstotende polymeerborstels te splitsen met behulp van een foto-initiator. Daarna worden de blootgestelde gebieden gevuld met ECM-eiwitten. Deze maskerloze ablatiemethode biedt grote flexibiliteit bij het ontwerpen van nieuwe patronen, omdat deze niet afhankelijk is van het gebruik van een fotomasker. Het ontwerpen en toepassen van een patroon is heel eenvoudig omdat het slechts enkele minuten duurt met behulp van een freeware zoals Inkscape. Het aantal patronen en monsters dat in korte tijd wordt geproduceerd, is echter een groot nadeel, omdat deze methode slechts kan worden gebruikt om elke keer een enkel substraat te modelleren. De fotopatterning module maakt gebruik van een near UV solid-state laserbron die meerdere milliwatts uitzendt. De onbeschermde laserstraal is gevaarlijk voor de ogen en de huid. Gereflecteerd en verstrooid licht en straling kunnen ook gevaarlijk zijn. De hantering moet gepaard gaan met een veiligheidsinstructie van laserofficieren. De meest kritische stap in het protocol bij het gebruik van een fotopatterning module is ervoor te zorgen dat tijdens de micropatterning en de ablatie de laser goed op het oppervlak wordt gericht. Een consistente verlichtingsdosis (intensiteit vermenigvuldigd met tijd) van UV-licht tijdens het patroonvorming is afhankelijk van hoe de laser op het oppervlak wordt gericht. Een zwakke intensiteit op het oppervlak als gevolg van slechte focus kan resulteren in het falen van ECM-overdracht naar het hydrogeloppervlak, waardoor er geen cellen aan de hydrogel vast komen te zitten.
In TFM-experimenten, na de eerste beeldvorming van adherente cellen en de fiduciale markers, worden cellen vrijgegeven uit de PA-hydrogel door trypsinebehandeling om hun ontspannen toestand vast te leggen. Een nadeel bij het uitvoeren van deze stap is het verwerken van het monster in de microscopiefase. Zonder een perfusiekamer vormen het openen van het deksel van de schaal, het aanzuigen van het medium, het spoelen en pipetteren van trypsine-oplossing een uitdaging voor beginners en ervaren gebruikers. In feite zijn deze procedures een belangrijke bron van de drift in xyz-assen , wat resulteert in verlies van positie en focus. Ons lokale UV-verlichtingsprotocol maakt TFM een meer toegankelijke techniek voor beginners. Opgemerkt moet worden dat we een in de handel verkrijgbare op microscopie gebaseerde maskerloze fotopatterningmodule hebben gebruikt, maar in principe kan elk UV-A-verlichtingssysteem worden gebruikt, uiteindelijk in combinatie met een masker om delen van de substraten te beschermen, waar celtractiekrachten niet mogen worden geregistreerd. Het blootstellen van cellen met een aanzienlijke dosis zichtbaar licht met een lage golflengte (bijvoorbeeld het violette licht dat DAPI-emissie prikkelt) zal leiden tot toenemende oxidatieve stress, wat kan leiden tot fototoxiciteit en celdood. Daarom kan deze techniek zelfs in een epifluorescentiemicroscoop zonder UV-lasermodule worden toegepast. Omdat de intensiteit echter veel zwakker is, zal het in dit geval veel gemakkelijker zijn om TFM te bereiken met de enzymatische behandeling.
Met LUVI-TFM is het mogelijk om hetzelfde monster voor meerdere metingen te gebruiken vanwege de lokale loslating van afzonderlijke cellen of kleine groepen cellen. Er moet echter aandacht worden besteed aan de selectie van cellen om los te maken, om te voorkomen dat krachten van naburige cellen worden geregistreerd. Voor eencellige metingen in afwezigheid van micropatronen moeten dus drukke gebieden worden vermeden; voor metingen aan afzonderlijke cellen met micropatronen moeten de patronen zodanig zijn ontworpen dat de afstand tussen afzonderlijke structuren ten minste tweemaal de diameter van het patroongebied bedraagt. We raden ook aan om geen cellen uit aangrenzende patronen achter elkaar te gebruiken, maar ze eerder te bemonsteren uit verre gebieden op het substraat. Onze meting wordt goed uitgevoerd op een epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een focus control functie en een 40 x lucht NA = 0,9 lens, waarbij de werkafstand van de lens voldoende lang is en de snelle beweging van de ene put naar de andere zeer afstembaar is. Het gericht loskoppelen van cellen voor TFM-toepassingen is effectief voor het meten van de cellulaire kracht van een enkele cel of van een hele kleine celcluster (bijvoorbeeld tot 300 μm in diameter). Met behulp van onze opstelling observeerden we celafronding en ontkoppeling voor UV-behandeling van afzonderlijke cellen (figuur 3A), terwijl loslating zelden voorkwam voor kleine celclusters. Dit kan leiden tot een onderschatting van de celtractiekrachten. Voor grotere celclusters wordt enzymatische ontkoppeling aanbevolen, omdat de gebruikers een 20x luchtdoel moeten gebruiken om het hele cluster in beeld te brengen en een focuscontrolefunctie nodig is. Omdat de scherptediepte van de 20x luchtlens veel langer is, zal de handling niet zo kritisch zijn als het hogere vergrotingsobjectief. De gebruiker moet ervoor zorgen dat de focus correct is ingesteld voor de ablatie van cellen, omdat de verlichtingsdosis afhankelijk is van de laserfocus op het oppervlak. Hoewel we ons bewust zijn van de mogelijke beperkingen bij het gebruik van LUVI-TFM in celcollectieven vanwege mogelijke mechanische interacties met naburige onbehandelde cellen, zou dit aspect eigenlijk nuttig kunnen blijken te zijn voor studies naar de mechanica van gerichte celextrusie, bijvoorbeeld van epitheliale monolagen.
Kortom, met onze TFM-aanpak in combinatie met licht geïnduceerde afgifte van microgepatterde cellen, bieden we een robuust en high-throughput protocol om celadhesiekrachten te meten. De veelzijdigheid van deze methode kan verder worden benut met behulp van microscopie en beeldvormingsopstelling gericht op het verbeteren van resolutie en gevoeligheid.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We danken mevrouw Rebecca Alvarado voor de steun in de videoproductie van het protocol en de heer Stephen Casale voor de opbouwende kritiek op het manuscript. We danken de collega's van de afdeling Cellulaire Biofysica, Max Planck Instituut voor Medisch Onderzoek voor de nuttige discussies. De financiële steun van de Max-Planck-Gesellschaft aan E.A.C.-A. en de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB1129, Projektnummer 240245660, P15 tot E.A.C.-A. en P4 tot U.S.S.; DFG EXC 2082/1-390761711 naar de VS) wordt ook zeer erkend. J.B. bedankt de Carl Zeiss Foundation voor de financiële steun. E.A.C.-A., C.S. en U.S.S. erkennen financiering via de Max Planck School Matter to Life ondersteund door het Duitse federale ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF). C.S. wordt ondersteund door de European Research Council (Consolidator Grant PHOTOMECH, no.101001797).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | #440159 | Sigma Aldrich | |
| Acetic acid | #33209 | Honeywell | |
| Acrylamide 40 % | #1610140 | Bio-Rad | CAUTION : toxic, work under a fume hood |
| AFM cantilever | #CP-CONT-BSG-A-G | NanoAndMore | 5 μm spherical tip |
| AFM system | #NanoWizard3 | JPK | Coupled to optical microscope equipped with 40x air objective and GFP filter |
| Ammonium persulfate | #A3678 | Sigma | |
| Bis-acrylamide 2 % | #1610142 | Bio-Rad | CAUTION : toxic, work under a fume hood |
| Camera sCMOS | #C11440-42U30 | Hamamatsu | |
| Camera sCMOS | #ANDORZYLA4.2 | Oxford Instrument | |
| CellRox | #C10422 | Thermo Fisher | |
| Custom incubator chamber | EMBLEM | ||
| Dental glue | #1300 100 | Picodent | |
| DMEM | #41965 | Thermo Fisher | |
| Epifluorescence microscope | #Eclipse Ti2E | Nikon | |
| Epifluorescence microscope | #Axiovert200 | Zeiss | |
| Ethanol | #9065.3 | Carl Roth | |
| FBS South America | #S181T | Thermo Fisher | |
| Fibrinogen | #F13191 | Invitrogen | Alexa488 conjugate |
| Fibronectin | #F1141 | Sigma | |
| Fluorescent beads 200 nm | #F8805 | Invitrogen | Carboxylated (365/415) |
| Fluorescent beads 200 nm | #F8848 | Invitrogen | Carboxylated (505/515) |
| Fluorescent beads 200 nm | #F8810 | Invitrogen | Carboxylated (580/605) |
| Fluorescent beads 200 nm | #F8807 | Invitrogen | Carboxylated (660/680) |
| Glass coverslip 15 mm round | #41001115 | Assistent | |
| Glass coverslip 24 mm round | #41001124 | Assistent | |
| Microscope Objective | #MRH08230 | Nikon | 20x air NA 0.45 |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | #CRL-2991 | ATCC | |
| mPEG-SVA | #MPEG-SVA-5000 | Laysan Bio | |
| N-Hydroxyethyl acrylamide | #697931 | Aldrich | |
| Plasma cleaner | #100-E | TePla | |
| PLPP gel | #PLPPgel | Alveole | |
| Poly-L-lysine | #P4823 | Sigma Aldrich | |
| Poly(L-lysine)-graft-poly(ethylene glycol) | #PLL(20-g[3.5]-PEG(2) | SuSoS | |
| Sodium(meta) periodate | #S1878 | Sigma Aldrich | |
| TEMED | #17919 | Thermo Scientific | |
| UV Patterning module | #PRIMO | Alveole | |
| UVO cleaner | #342-220 | Jelight |
References
- Geiger, B., Bershadsky, A. Exploring the neighborhood: adhesion-coupled cell mechanosensors. Cell. 110 (2), 139-142 (2002).
- Beningo, K. A., Hamao, K., Dembo, M., Wang, Y. -l, Hosoya, H. Traction forces of fibroblasts are regulated by the Rho-dependent kinase but not by the myosin light chain kinase. Archives of Biochemistry and Biophysics. 456 (2), 7 (2006).
- Rape, A. D., Guo, W. H., Wang, Y. L. The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions. Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2011).
- Kumar, R., Saha, S., Sinha, B. Cell spread area and traction forces determine myosin-II-based cortex thickness regulation. Biochimica Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1866 (12), 118516 (2019).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
- Thery, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123, 4201-4213 (2010).
- Strale, P. O., et al. Multiprotein printing by light-induced molecular adsorption. Advanced Materials. 28 (10), 2024-2029 (2016).
- Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. Microtubules: in vivo Methods in Cell Biology. , 133-146 (2010).
- Tseng, Q., et al. A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
- Vignaud, T., Ennomani, H., Thery, M. Polyacrylamide hydrogel micropatterning. Methods Cell Biology. 120, 93-116 (2014).
- Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).
- Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
- Polacheck, W. J., Chen, C. S. Measuring cell-generated forces: a guide to the available tools. Nature Methods. 13 (5), 415-423 (2016).
- Schwarz, U. S., Soine, J. R. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica Biophysica Acta. 1853, 3095-3104 (2015).
- Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. Quantifying forces in cell biology. Nature Cell Biology. 19 (7), 742-751 (2017).
- Hanke, J., Probst, D., Zemel, A., Schwarz, U. S., Koster, S. Dynamics of force generation by spreading platelets. Soft Matter. 14 (31), 6571-6581 (2018).
- Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
- Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances. Biophysical Journal. 94 (1), 207-220 (2008).
- Willert, C. E., Gharib, M. Digital particle image velocimetry. Experiments in Fluids. 10, 181-193 (1991).
- Lourenco, L., Krothapalli, A. On the accuracy of velocity and corticity measurements with PIV. Experiments in Fluids. 18, 421-428 (1995).
- Adrian, R. J., Westerweel, J. Particle Image Velocimetry. , Cambridge University Press. (2011).
- Westerweel, J., Scarano, F. Universal outlier detection for PIV data. Experiments in Fluids. 39 (6), 1096-1100 (2005).
- Dembo, M., Wang, Y. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Schwarz, U. S., et al. Calculation of forces at focal adhesions from elastic substrate data: the effect of localized force and the need for regularization. Biophysical Journal. 83 (3), 1380-1394 (2002).
- Huang, Y., Gompper, G., Sabass, B. A Bayesian traction force microscopy method with automated denoising in a user-friendly software package. Computer Physics Communications. 256, 107313 (2020).
- Vedadghavami, A., et al. Manufacturing of hydrogel biomaterials with controlled mechanical properties for tissue engineering applications. Acta Biomaterialia. 62, 42-63 (2017).
- Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young's modulus. PLoS One. 14 (8), 0220281 (2019).
- Oria, R., et al. Force loading explains spatial sensing of ligands by cells. Nature. 552 (7684), 219-224 (2017).
- Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics. Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).
- Sen, S., Engler, A. J., Discher, D. E. Matrix strains induced by cells: Computing how far cells can feel. Cell and Molecular Bioengineering. 2 (1), 39-48 (2009).
- Arnold, M., et al. Induction of cell polarization and migration by a gradient of nanoscale variations in adhesive ligand spacing. Nano Letters. 8 (7), 2063-2069 (2008).
- Galluzzi, M., et al. Atomic force microscopy methodology and AFMech Suite software for nanomechanics on heterogeneous soft materials. Nat Communications. 9 (1), 3584 (2018).
