Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Isogen nyre glomerulus chip konstrueret fra humaninducerede pluripotente stamceller

Published: November 4, 2022 doi: 10.3791/63821
Automatic Translation
1, 1,2,3,4
1Department of Biomedical Engineering, Pratt School of Engineering, Duke University, 2Department of Medicine, Division of Nephrology, Duke University School of Medicine, 3Department of Cell Biology, Duke University, 4Center for Biomolecular and Tissue Engineering, Duke University

Summary

Præsenteret her er en protokol til at konstruere et personligt organ-on-a-chip-system, der rekapitulerer strukturen og funktionen af den nyreglomerulære filtreringsbarriere ved at integrere genetisk matchede epitel- og vaskulære endotelceller differentieret fra humaninducerede pluripotente stamceller. Dette bioengineered system kan fremme nyrepræcisionsmedicin og relaterede applikationer.

Abstract

Kronisk nyresygdom (CKD) påvirker 15% af den amerikanske voksne befolkning, men etableringen af målrettede terapier har været begrænset af manglen på funktionelle modeller, der nøjagtigt kan forudsige menneskelige biologiske reaktioner og nefrotoksicitet. Fremskridt inden for nyrepræcisionsmedicin kan hjælpe med at overvinde disse begrænsninger. Tidligere etablerede in vitro-modeller af den humane nyreglomerulus - det primære sted for blodfiltrering og et centralt mål for mange sygdomme og lægemiddeltoksiciteter - anvender imidlertid typisk heterogene cellepopulationer med begrænsede funktionelle egenskaber og uovertruffen genetisk baggrund. Disse egenskaber begrænser deres anvendelse til patientspecifik sygdomsmodellering og terapeutisk opdagelse betydeligt.

Dette papir præsenterer en protokol, der integrerer humant induceret pluripotent stamme (iPS) celleafledt glomerulært epitel (podocytter) og vaskulært endotel fra en enkelt patient til at konstruere en isogen og vaskulariseret mikrofluidisk nyreglomeruluschip. Den resulterende glomeruluschip består af stamcelleafledte endotel- og epitelcellelag, der udtrykker afstamningsspecifikke markører, producerer kældermembranproteiner og danner en vævsvævsgrænseflade, der ligner nyrernes glomerulære filtreringsbarriere. Den konstruerede glomeruluschip filtrerer selektivt molekyler og rekapitulerer lægemiddelinduceret nyreskade. Evnen til at rekonstituere strukturen og funktionen af nyreglomerulus ved hjælp af isogene celletyper skaber mulighed for at modellere nyresygdom med patientspecificitet og fremme brugen af organer-på-chips til nyrepræcisionsmedicin og relaterede applikationer.

Introduction

Organ-on-a-chip-enheder er dynamiske 3D in vitro-modeller, der anvender molekylær og mekanisk stimulering samt vaskularisering til dannelse af vævsvævsgrænseflader, der modellerer strukturen og funktionen af specifikke organer. Tidligere etablerede organ-on-a-chip-enheder, der havde til formål at rekapitulere nyrernes glomerulus (glomeruluschips), bestod af dyrecellelinjer1 eller humane primære og udødeliggjorte cellelinjer af heterogene kilder 2,3. Anvendelsen af genetisk heterogene cellekilder frembyder variationer, der i væsentlig grad begrænser undersøgelserne af patientspecifikke reaktioner og genetik eller sygdomsmekanismer 4,5. Håndteringen af denne udfordring afhænger af tilgængeligheden af isogene cellelinjer, der stammer fra specifikke individer med bevarede molekylære og genetiske profiler, for at give et mere præcist mikromiljø til tekniske in vitro-modeller 2,3,6. Itogene cellelinjer af menneskelig oprindelse kan nu let genereres på grund af fremskridt inden for human iPS-cellekultur. Fordi humane iPS-celler typisk er ikke-invasivt fremskaffede, kan forny sig selv på ubestemt tid og differentiere sig til næsten enhver celletype, tjener de som en attraktiv kilde til celler til etablering af in vitro-modeller, såsom glomerulus-chippen 7,8. Den glomerulære filtreringsbarriere er det primære sted for blodfiltrering. Blod filtreres først gennem vaskulært endotel, den glomerulære kældermembran og endelig gennem specialiseret epitel ved navn podocytter. Alle tre komponenter i filtreringsbarrieren bidrager til selektiv filtrering af molekyler. Præsenteret her er en protokol til etablering af en organ-on-a-chip-enhed, der er forbundet med vaskulært endotel og glomerulært epitel fra en enkelt human iPS-cellekilde. Selvom denne protokol er særlig nyttig til at konstruere en isogen og vaskulariseret chip til at rekapitulere den glomerulære filtreringsbarriere, giver den også en plan for udvikling af andre typer personaliserede organer-på-chips og multiorganplatforme såsom et isogent 'body-on-a-chip' -system.

Protokollen beskrevet heri begynder med divergerende differentiering af humane iPS-celler i to separate linjer - laterale mesoderm- og mesodermceller, som efterfølgende differentieres til henholdsvis vaskulært endotel og glomerulært epitel. For at generere laterale mesodermceller blev humane iPS-celler podet på kældermembranmatrix 1-belagte plader og dyrket i 3 dage (uden medieudveksling) i N2B27-medium suppleret med Wnt-aktivatoren, CHIR 99021, og den potente mesoderminducer, knoglemorfogenetisk 4 (BMP4). De resulterende laterale mesodermceller var tidligere karakteriseret ved ekspression af brachyury (T), blandingsparet homøobox (MIXL) og eomesodermin (EOMES)9. Derefter blev de laterale mesodermceller dyrket i 4 dage i et medium suppleret med VEGF165 og Forskolin for at inducere vaskulære endotelceller, der blev sorteret ud baseret på VE-Cadherin og / eller PECAM-1-ekspression ved hjælp af magnetisk aktiveret cellesortering (MACS). De resulterende vaskulære endotelceller (viEC) blev udvidet ved at dyrke dem på kældermembranmatrix 3-belagte kolber, indtil de var klar til frø i den mikrofluidiske enhed.

For at generere mesodermceller blev humane iPS-celler podet på kældermembranmatrix 2-belagte plader og dyrket i 2 dage i et medium indeholdende Activin A og CHIR99021. De resulterende mesodermceller blev karakteriseret ved ekspression af HAND1, goosecoid og brachury (T) som beskrevet tidligere 2,10,11. For at inducere mellemliggende mesoderm (IM) celledifferentiering blev mesodermcellerne dyrket i 14 dage i et medium suppleret med BMP-7 og CHIR99021. De resulterende IM-celler udtrykker Wilms tumor 1 (WT1), parret boksgen 2 (PAX2) og ulige sprunget over relateret protein 1 (OSR-1) 2,10,11.

En tokanals polydimethylsiloxan (PDMS) -baseret mikrofluidisk chip blev designet til at rekapitulere strukturen af den glomerulære filtreringsbarriere in vitro. Urinkanalen er 1.000 μm x 1.000 μm (b x h) og kapillærkanaldimensionen er 1.000 μm x 200 μm (b x h). Cykliske stræknings- og afslapningscyklusser blev lettet af de hule kamre, der var til stede på hver side af de flydende kanaler. Celler blev podet på en fleksibel PDMS-membran (50 μm tyk), der adskiller urin- og kapillærkanalerne. Membranen er udstyret med sekskantede porer (7 μm diameter, 40 μm fra hinanden) for at hjælpe med at fremme intercellulær signalering (figur 1A) 2,12. To dage før IM-induktionen var afsluttet, blev de mikrofluidiske chips belagt med kældermembranmatrix 2. viEC'er blev podet i kapillærkanalen i den mikrofluidiske chip ved hjælp af endotelvedligeholdelsesmedium 1 dag før IM-induktion var afsluttet, og chippen blev vendt på hovedet for at muliggøre celleadhæsion på den basale side af den ECM-belagte PDMS-membran. Den dag, IM-induktionen blev afsluttet, blev cellerne podet i urinkanalen i den mikrofluidiske chip ved hjælp af et medium suppleret med BMP7, Activin A, CHIR99021, VEGF165 og alle trans retinsyre for at inducere podocytdifferentiering i chippen. Den følgende dag blev mediereservoirerne fyldt med Podocytinduktionsmedium og Endotelvedligeholdelsesmedium, og 10% mekanisk belastning ved 0,4 Hz og væskestrøm (60 μL / t) blev påført chipsene.

De cellulariserede mikrofluidiske chips blev dyrket i yderligere 5 dage ved hjælp af Podocytinduktionsmedium (i urinvejen) og endotelvedligeholdelsesmedium (i vaskulærkanalen). De resulterende nyreglomeruluschips blev dyrket i op til 7 yderligere dage i vedligeholdelsesmedier til både podocyt- og endotelcellerne. De differentierede podocytter udtrykte positivt afstamningsspecifikke proteiner, herunder podocin og nephrin 13,14, mens viEC'er positivt udtrykte afstamningsidentifikationsproteinerne PECAM-1 og VE-Cadherin, som alle er essentielle molekyler til opretholdelse af integriteten af den glomerulære filtreringsbarriere 15,16 . Podocytterne og viEC'erne viste sig begge at udskille det mest rigelige glomerulære kældermembranprotein, kollagen IV, hvilket også er vigtigt for vævsmodning og funktion.

Det trekomponentsystem af filtreringsbarrieren - endotel, kældermembran og epitel - i glomeruluschipsene viste sig selektivt at filtrere molekyler og reagere på en kemoterapeutisk, nefrotoksisk lægemiddelbehandling. Resultater fra lægemiddelbehandlingen viste, at glomeruluschippen kan bruges til nefrotoksicitetsundersøgelser og til sygdomsmodellering. Denne protokol giver den generelle retningslinje for konstruktion af en funktionel mikrofluidisk nyreglomeruluschip fra isogene iPS-cellederivater. Downstream-analyser af den konstruerede chip kan udføres efter ønske af forskeren. For mere information om brug af glomeruluschippen til at modellere lægemiddelinduceret glomerulær skade henvises til tidligere publikationer 2,12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forbered kældermembranmatrixopløsninger og belagte underlag

  1. Optøning af kældermembranmatrix 1 natten over på is ved 4 °C. Aliquot ifølge producentens forslag til fortyndingsforhold. Ved hjælp af et 50 ml konisk rør og pipette blandes grundigt en passende mængde kældermembranmatrix 1 til 25 ml kold DMEM / F12, indtil den er helt optøet og opløst.
    1. For at opløse en frossen aliquot skal du tage ~ 200 μL fra de 25 ml kold DMEM / F12 og overføre den til det frosne aliquotrør. Pipetter op og ned, indtil matrixen er grundigt optøet og opløst. Overfør det fulde rørindhold i kældermembranmatrix 1 til resten af den kolde DMEM/F12.
  2. Pipetter 1 ml kældermembranmatrix 1 opløsning i hver brønd af en 6-brønds plade. For at bruge de overtrukne plader samme dag inkuberes ved 37 °C i 2 timer.
    1. Alternativt kan de overtrukne plader pakkes med parafilm og opbevares ved 4 °C i op til 2 uger. Når den er klar til brug på den opbevarede plade, inkuberes ved 37 °C i 30 min.
  3. Fortynd kældermembranmatrix 2 i 9 ml sterilt destilleret vand for at opnå en endelig koncentration på 5 μg/ml. Pipetter 700 μL kældermembranmatrix 2-opløsning i hver brønd på en 12-brøndsplade. Pak kældermembranmatrixen 2-belagte plader med parafilm og opbevares ved 4 °C i op til 2 uger.
  4. Rekonstituere frysetørret kældermembranmatrix 3 for at opnå en endelig koncentration på 1 mg / ml i fosfatbufferet saltvand (PBS, Ca + 2- og Mg + 2-fri) som foreslået af producenten. Der fortyndes en 250 μL aliquot til en slutkoncentration på 25 μg/ml i 9,75 ml PBS (Ca+2 og Mg+2 fri). Brug 6 ml af denne opløsning til at belægge en T75-kolbe (en slutkoncentration på 2 μg/cm2). De matrixbelagte kolber opbevares ved 4 °C i op til 1 uge.

2. Human iPS-cellekultur

BEMÆRK: DU11-linjen, der anvendes i denne protokol, blev testet og viste sig at være fri for mycoplasma- og karyotypeabnormiteter.

  1. Inkuber kældermembranmatrix 1-belagte plader ved 37 ° C i 1-2 timer.
  2. Hver brønd på 6-brøndspladen vaskes 3x med 1 ml varm (37 °C) DMEM/F12. Der tilsættes 2 ml humant iPS-cellekulturmedium (CCM) (supplerende tabel S1) til hver brønd på 6-brøndspladen. Pladerne inkuberes ved 37 °C, mens cellerne forberedes til såning som beskrevet nedenfor.
  3. Hver brønd i 6-brøndspladen, der indeholder humane iPS-celler, vaskes med 1 ml varm DMEM/F12.
  4. Aspirere DMEM / F12. Tilsæt 1 ml varm celleløsningsbuffer til hver brønd på 6-brøndspladen. Inkuberes ved 37 °C i 1 min.
  5. Visuelt inspicere hver brønd under et mikroskop for dissociation omkring cellekolonikanterne. Opsæt forsigtigt celleløsningsbufferen fra cellerne. Vask forsigtigt hver brønd med 1 ml varm DMEM/F12.
  6. Undersøg pladerne under mikroskopet for at sikre, at cellerne ikke er helt løsnet fra pladen eller ved et uheld er blevet aspireret.
  7. Tilsæt 3 ml varm human iPS CCM til hver brønd på 6-brøndspladen med celler. Brug en celleløfter til forsigtigt at skrabe kolonierne. Brug en 5 ml serologisk pipette til forsigtigt at blande cellesuspensionen i hver brønd op og ned en gang.
  8. Tag den nye kældermembranmatrix 1-belagte plade ud af inkubatoren. Overfør 0,5 ml celleophæng til hver brønd i den nye kældermembranmatrix 1-belagte plade. Flyt pladen i en ottetalsbevægelse for at fordele cellerne jævnt. Der inkuberes ved 37 °C i en 5 % CO2 -inkubator.
  9. Aspirer det brugte medium og erstat med 3 ml human iPS CCM hver dag af dyrkning, indtil cellerne er 70% sammenflydende (ca. 4 dage efter passage).

3. Dag 0-16: differentiering af humane iPSC'er i mellemliggende mesodermceller

  1. Dag 0-2: mesoderm induktion
    1. Flyt kældermembranmatrix 2-belagte plader fra 4 °C til stuetemperatur i 2 timer for at ækvilibrere efter opbevaring.
    2. Aspirer det brugte medium fra hver brønd i 6-brøndspladen, der indeholder ca. 70% sammenflydende humane iPS-celler. Vask forsigtigt cellerne 3x med 1 ml varm DMEM / F12.
    3. Aspirere DMEM / F12. Der tilsættes 1 ml celleafmonteringsbuffer til hver brønd i 6-brøndspladen af humane iPS-celler. Inkuberes ved 37 °C i 5-7 min.
    4. Visuelt inspicere hver brønd under et mikroskop for dissociation omkring cellekolonikanterne. Brug en celleløfter til forsigtigt at skrabe kolonierne.
    5. Overfør cellesuspensionerne fra alle brøndene på 6-brøndspladen til et 15 ml konisk rør, og brug en P1000 til at pipettere op og ned flere gange for at opnå en encellet suspension af iPS-cellerne.
    6. Cellesuspensionen i det koniske rør fyldes til 14 ml med DMEM/F12. Centrifuge i 5 minutter ved 200 × g ved stuetemperatur.
    7. Aspirer supernatanten. Resuspender cellepelleten i 14 ml varm DMEM/F12. Gentag centrifugering i 5 minutter ved 200 × g ved stuetemperatur.
    8. Aspirer supernatanten. Resuspender cellerne i 1 ml Mesoderm Induktionsmedium (supplerende tabel S1). Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer. Fortynd i Mesoderm Induktionsmedium for at opnå en endelig koncentration på 1 × 105 celler / ml.
    9. Aspirer belægningen fra kældermembranmatrixen 2-belagt plade. Skyl hver brønd af kældermembranmatrixen 2-belagt plade 2x med 1 ml varm DMEM/F12.
    10. Pipetter forsigtigt cellesuspensionen op og ned 2x. Overfør 1 ml celleophæng til hver brønd i kældermembranmatrixen 2-belagt plade. Flyt forsigtigt pladen i en ottetalsbevægelse for at fordele cellerne jævnt.
    11. Inkuber pladen ved 37 °C natten over. Den næste dag (dag 1) skal du opsuge det brugte medium fra hver brønd på 12-brøndspladen. Udskift med 1 ml varmt Mesoderm Induktionsmedium. Inkuberes ved 37 °C natten over.
  2. Dag 2-16: mellemliggende mesoderm induktion
    1. Aspirere det brugte Mesoderm Induktionsmedium. Udskift med 1 m L varmt mellemliggende Mesoderm Induktionsmedium (supplerende tabel S1). Aspirer det brugte medium og udskift med 1 ml varmt mellemliggende mesoderm induktionsmedium hver dag i 14 dage.

4. Dag 0-15: differentiering og udvidelse af humane iPSC'er i vaskulære endotelceller

  1. Dag 0: human iPS-cellesåning
    1. Forbered 15 ml human iPS CCM med ROCK-hæmmer (supplerende tabel S1). Hold varmen ved 37 °C.
    2. Inkuber en kældermembranmatrix 1-belagt plade i 1-2 timer ved 37 °C. Aspirer kældermembranmatrixen 1. Vask 3x med 1 ml varm DMEM/F12.
    3. Aspirere DMEM / F12. Der tilsættes 2 ml human iPS CCM med ROCK-hæmmer til hver brønd på 6-brøndspladen. Pladerne inkuberes ved 37 °C, mens cellerne forberedes til såning som beskrevet nedenfor.
    4. Aspirer det brugte medium fra hver brønd i 6-brøndspladen, der indeholder ca. 70% sammenflydende humane iPS-celler. Vask forsigtigt cellerne 3x med 1 ml varm DMEM / F12.
    5. Aspirere DMEM / F12. Der tilsættes 1 ml celleafmonteringsbuffer til hver brønd i 6-brøndspladen af humane iPS-celler. Inkuberes ved 37 °C i 5-7 minutter for at adskille cellerne til enkeltceller.
      BEMÆRK: På grund af iboende forskelle mellem iPS-cellelinjer skal brugeren visuelt inspicere cellerne efter 5 minutter for at bestemme den optimale inkubationstid.
    6. Overfør cellerne til et 15 ml konisk rør. Cellesuspensionen bringes op til 14 ml med varm DMEM/F12 for at neutralisere løsrivelsesbufferen. Centrifuge i 5 minutter ved 200× g ved stuetemperatur.
    7. Opsæt forsigtigt supernatanten. Resuspender cellerne i 1 ml human iPS CCM med ROCK-hæmmer. Tæl det samlede antal celler ved hjælp af et hæmocytometer.
    8. Frø cellerne mellem 37.000 og 47.000 celler/cm2 (355.200 til 451.200 celler/brønd af en 6-brønds plade). Inkuberes ved 37 °C natten over.
      BEMÆRK: På grund af iboende forskelle mellem iPS-cellelinjer skal brugeren bestemme den optimale såtæthed.
  2. Dag 1-3: lateral mesoderm induktion
    1. Den næste dag (dag 1) skal du opsuge det brugte medium fra hver brønd i 6-brøndspladen af humane iPS-celler. Udskift hver brønd i 6-brøndspladen med 5 ml lateral mesoderm induktionsmedium (supplerende tabel S1). Ved opskalering af kulturbeholderen (f.eks. kolber) udskiftes generelt arbejdsvolumenet i kulturbeholderen med 3x.
    2. Skift ikke dette medium i 3 dage.
      BEMÆRK: Lateral Mesoderm Induktionsmedium i brøndene vil normalt ændre farve fra rød til gul, da cellerne bruger næringsstofferne. Imidlertid er overskyet medium eller medium med bakterievækst ikke normalt og bør dekontamineres og kasseres som sådan.
  3. Dag 4-6: endotelcelleinduktion
    1. Aspirer det brugte medium fra hver brønd på 6-brøndspladen. Udskift hver brønd på 6-brøndspladen med 3 ml varmt endotelinduktionsmedium (supplerende tabel S1). Inkuber pladen ved 37 °C natten over.
    2. I de følgende 2 dage (dag 5 og 6) samles det brugte medium fra alle brønde i et 50 ml konisk rør. Det koniske rør opbevares ved 4 °C. Genopfyld cellerne med 3 ml varmt endotelinduktionsmedium. Pladen inkuberes ved 37 °C.
  4. Dag 7: Sortering af endotelceller (viEC)
    1. Tag kældermembranmatrix 3 kolber ud og lad dem stå ved stuetemperatur i 1 time.
    2. Forbered 50 ml MACS-buffer (supplerende tabel S1).
    3. Placer celleløsningsbuffer, MAKS-buffer, endotel-CCM og PBS (Ca 2+ og Mg2+ fri) på is i vævskulturhætten.
    4. Placer magneten på MAKS-stativet. Placer to 50 ml koniske rør og et 15 ml konisk rør i en konisk rørholder.
    5. Placer MAKS-stativet (med magnet fastgjort) og en LS-søjle i vævskulturhætten. Opsæt den koniske rørholder (med koniske rør indeni) på MAKS-stativet under magneten (supplerende figur S1A).
    6. Det brugte medium opsamles fra hver brønd på 6-brøndspladen i det 50 ml koniske rør fra trin 4.3.2. Vask hvert hul på 6-brøndspladen med PBS (Ca 2+ og Mg2+ fri).
    7. Aspirere PBS. Tilsæt 1 ml celleløsningsbuffer. Inkuberes ved 37 °C i 5-7 minutter for at adskille cellerne fuldstændigt.
    8. Overfør cellerne til et 50 ml konisk rør. Cellesuspensionen bringes til 15 ml med kold endotel CCM. Centrifuge ved 200 × g i 5 minutter ved stuetemperatur.
    9. Aspirer supernatanten. Resuspender cellerne i 1 ml kold MACS-buffer. Tæl cellerne med et hæmocytometer.
    10. Tilsæt 10 ml MAKS-buffer til cellesuspensionen. Centrifuge i 5 minutter ved 200 × g ved stuetemperatur.
    11. Aspirer supernatanten. Resuspender cellerne i 80 μL MACS-buffer pr. 10 millioner celler. Tilsæt 20 μL pr. 10 millioner celler af FcR-blokerende reagens, CD31-mikroperler og CD144-mikroperler. Inkuberes i 15 minutter på is.
    12. Mens cellesuspensionen inkuberes, centrifugeres det medium, der opsamles fra endotelinduktion (trin 4.3.2) ved 200 × g i 10 min.
    13. Supernatanten samles i et vakuumfilter på 500 ml 0,22 μm. Forbered det endotelbetingede medium (supplerende tabel S1). Mediet filtreres under sterile forhold, og mediet holdes varmt ved 37 °C.
      BEMÆRK: Endotelcelleproliferationshastigheden begynder at falde efter passage 3. For at opnå eksponentiel vækst efter passage 3 kan endotelkonditioneret og vedligeholdelsesmedium suppleres med 10 μM TGF-Beta-hæmmer (SB431542) startende fra passage 1.
    14. Efter inkubationen på 15 minutter i trin 4.4.11 tilsættes 10 ml MACS-buffer pr. 10 millioner celler (maks. 30 ml MACS-buffer) til cellesuspensionen. Centrifuge ved 200 × g i 5 min.
    15. Aspirer supernatanten. Resuspender i 1 ml MACS-buffer.
    16. Tag LS-søjlen og træk stemplet ud af sprøjten. Sæt stemplet tilbage i plastikhylsteret. Placer søjlen på magneten.
    17. Placer det første 50 ml koniske rør under søjlen. Føj 1 ml MACS-buffer til kolonnen. Saml i det 50 ml koniske rør nedenunder.
    18. Lad væsken strømme igennem, men ikke helt for at forhindre søjlen i at tørre. Når væskedråberne begynder at sive langsomt, tilsættes cellesuspensionen til søjlen. Saml gennemstrømningen i det samme 50 ml koniske rør.
    19. Når væskedråberne begynder at sive langsomt, skal du placere det næste 50 ml koniske rør under søjlen. Føj den indledende gennemstrømning (trin 4.4.18) til kolonnen. Saml i det 50 ml koniske rør nedenunder.
    20. Når væskedråberne begynder at sive langsomt, tilsættes 500 μL MACS-buffer 3x for at vaske søjlen.
    21. Fjern søjlen fra magneten. Placer søjlen på det koniske rør på 15 ml. Tilføj 1 ml kold PBS til kolonnen.
    22. For at samle cellerne skal du tage stemplet fra plasthylsteret og skubbe det fast ind i søjlen.
    23. Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer. Cellesuspensionen bringes til 5 ml med PBS. Centrifuge i 5 minutter ved 200 × g.
    24. Mens cellerne gennemgår centrifugering, vaskes kældermembranmatrixen 3-belagt kolbe 3x med 5 ml PBS for at forberede cellesåning. Aspirer PBS og tilsæt 20 ml endotelkonditioneret medium til kældermembranmatrixen 3-belagt kolbe.
    25. Fjern cellerne fra centrifugen og opsæt supernatanten. Resuspender cellerne i endotelkonditioneret medium, der skal sås ved 26.000 celler / cm2 (1,95 × 106 celler / T75 kolbe). Frø cellerne.
    26. For at beregne sorteringseffektiviteten og celleudbyttet divideres celletallet fra trin 4.4.23 med celletællingen fra trin 4.4.9.
  5. Dag 8-15: udvidelse af viEC'er
    1. Den næste dag (dag 8) skal du opsuge det brugte medium fra kolben. Udskift med 10 ml endotelkonditioneret medium. Udskift det endotelkonditionerede medium hver anden dag, indtil kolben er 90% sammenflydende, eller indtil flasken med endotelkonditioneret medium er helt brugt.
    2. Aspirer det brugte medium og udskift med 10 ml endotelvedligeholdelsesmedium (supplerende tabel S1) hver anden dag for fortsat ekspansion.
    3. For at passere viEC'erne skal du forberede to kældermembranmatrix 3-belagte T75-kolber. Lad kolberne stå ved stuetemperatur i 1 time. Vask de frisklavede kolber grundigt 3x med 5 ml PBS.
    4. Aspirere PBS. Tilsæt 10 ml varmt endotelvedligeholdelsesmedium til hver frisklavet kolbe. Pladerne inkuberes ved 37 °C, mens cellerne forberedes til såning som beskrevet nedenfor.
    5. Der tilsættes 5 ml celleafmonteringsbuffer til en 90% sammenflydende T75-kolbe med viEC'er. Inkuberes ved 37 °C i 5-7 min. Overfør cellerne til et 15 ml konisk rør. Tilsæt 5 ml varm DMEM/F12. Centrifuge ved 200 × g i 5 min.
    6. Aspirer supernatanten. Resuspender i 1 ml varmt endotelvedligeholdelsesmedium. Der tilsættes 500 μL cellesuspension til hver af de frisklavede T75-kolber.
    7. Den næste dag skal du aspirere det brugte medium. Udskift med 10 ml endotelvedligeholdelsesmedium. Aspirer det brugte medium og udskift med 10 ml endotelvedligeholdelsesmedium hver anden dag, indtil kolben er 90% sammenflydende.

5. Dag 14: forberedelse af mikrofluidiske organchipanordninger til cellekultur

  1. Plasmabehandling og kældermembranmatrix 2 belægning
    1. Forbered kældermembranmatrix 2-opløsning (trin 1.3). Sæt det til side.
    2. I en steril vævskulturhætte pakkes den sterile 100 mm x 15 mm runde petriskål ud. Placer petriskålens top, der vender nedad, under petriskålens bund (supplerende figur S1B).
    3. Brug pincet til at tage de mikrofluidiske chips ud af pakken og læg dem inde i petriskålen. Luk petriskålen med låget under fadet.
    4. Ved plasma-asheren skal du placere petriskålens låg under skålen, øverst vendt nedad, og holde dem sammen som en enhed. Anbring petriskålenheden i plasmaaskekammeret. Start plasmaaskeren med ilt ved 100 W, 15 SCCM, 30 s.
    5. Tidsfølsom: Når behandlingen er afsluttet, skal du tage petriskålenheden ud af plasmaasheren. Tør hurtigt og let petriskålens låg af med 70% ethanol sprøjtet på en laboratorieserviet. Dæk petriskålen med låget.
    6. Bring petriskålen til den sterile vævskulturhætte. Tilsæt forsigtigt 25 μL kældermembranmatrix 2-opløsning i spånens urin (øverste) kanal. Tilsæt 20 μL kældermembranmatrix 2-opløsning i chippens kapillærkanal (nederst).
    7. Tag to sterile 15 ml koniske rørhætter og fyld dem med sterilt destilleret vand (~ 500 μL). Placer hætten i petriskålen for at forhindre, at chipkanalerne og membranen tørrer ud. Læg låget på fadet. Inkuberes ved 37 °C natten over.

6. Såning af viEC'er og mellemliggende mesodermceller i mikrofluidiske enheder

  1. Dag 15: viECs
    1. Medium aspireres fra T75-kolber, der indeholder 90% sammenflydende viEC'er. Tilsæt 5 ml celleløsningsbuffer og inkuberes ved 37 °C i 5-7 min.
    2. Overfør cellerne til et 15 ml konisk rør. Tilføj 5 ml DMEM/F12. Centrifuge ved 200 × g i 5 min.
      BEMÆRK: Hver T75-kolbe med ca. 90% sammenflydende viEC'er vil give ~ 3 millioner celler.
    3. Aspirer supernatanten. Resuspender cellerne i 300 μL endotelvedligeholdelsesmedium for at opnå ca. 2 millioner celler / 300 μL. Tæl cellerne med et hæmocytometer. Sæt cellesuspensionen til side.
    4. Overfør petriskålen indeholdende de mikrofluidiske chips til vævskulturhætten. Fastgør en P200 barrierespids til spidsen af en aspirator.
    5. Skyl både den øverste og nederste kanal af den mikrofluidiske chip med 200 μL DMEM / F12, samtidig med at udløbets periferi suges.
    6. Hold chippen fast med P200-barrierespidsen fastgjort til aspiratoren væk fra udløbet af den nederste kanal. Indsprøjt 20 μL af viEC-suspensionen med ca. 134.000 celler fast i chippens kapillærkanal (nederst). Opsæt forsigtigt medium fra udløbets periferi.
    7. Kontroller under mikroskopet for bobler eller en ujævn viEC såtæthed.
    8. Vend forsigtigt chippen om for at vende den om, så viEC'erne kan klæbe til den basale side af den fleksible PDMS-membran. Anbring chippen i holderpatronen. Tilsæt 3 ml PBS i chipholderpatronen for at forhindre membranen i at tørre. Chippen inkuberes ved 37 °C i 3 timer.
    9. Kontroller den nederste kanal under mikroskopet for et sammenflydende lag af viEC'er, der er fastgjort til den fleksible PDMS-membran. Slip 200 μL endotelvedligeholdelsesmedium på indløbet af den nederste kanal, og lad det strømme gennem kanalen for at vaske kanalen af ikke-vedhæftede endotelceller, mens den forsigtigt suges fra periferien af kapillærkanalen (nederst) kanaludløb.
    10. Sæt chippen tilbage i holderpatronen. Inkuberes ved 37 °C natten over.
  2. Dag 16: mellemliggende mesoderm (IM) celler
    1. Skyl forsigtigt kapillærkanalen (nederst) med 200 μL endotelvedligeholdelsesmedium, mens du forsigtigt opsuger udløbsportens periferi.
    2. Skyl urinkanalen (øverst) med 200 μL DMEM/F12, mens du forsigtigt opsuger udløbets periferi. Drop ~50 μL DMEM/F12 på indløbs- og udløbsportene.
    3. Aspirer det mellemliggende Mesoderm-induktionsmedium fra hver brønd i 12-brøndspladen.
      BEMÆRK: Hver brønd i slutningen af differentieringen giver ca. 1,5 millioner IM-celler.
    4. Der tilsættes 1 ml Trypsin-EDTA til hvert hul på 12-brøndspladen og inkuberes ved 37 °C i 5 min.
    5. Skrab forsigtigt cellerne ved hjælp af en celleløfter, og pipetter op og ned for at adskille cellerne ved hjælp af en P1000. Tilsæt 2 ml Trypsinneutraliseringsopløsning (supplerende tabel S1) til hver brønd. Overfør cellerne til et 50 ml konisk rør. Cellesuspensionsvolumenet bringes op på 50 ml med DMEM/F12, og centrifugeres ved 200 × g i 5 minutter.
    6. Aspirer supernatanten. Resuspender cellerne i 500 μL mellemliggende Mesoderm Induktionsmedium for at opnå ca. 3 millioner celler / 500 μL. Tæl cellerne med et hæmocytometer.
    7. Hold chippen fast med P200-barrierespidsen fastgjort til aspiratoren væk fra udløbet af urinkanalen (øverst). Injicer 25 μL cellesuspension med ca. 112.500 IM-celler fast i chippens urinkanal (øverste), og opsug forsigtigt mediet fra udløbets periferi.
    8. Kontroller under mikroskopet for bobler eller en ujævn IM-cellesåningstæthed. Tilsæt 3 ml PBS i chipholderpatronen. Inkuberes ved 37 °C i 3 timer.
    9. Skyl begge kanaler med 200 μL af deres respektive cellekulturmedium, mens du forsigtigt opsuger periferien af chipudløbene for at forhindre bagudgående strøm af det brugte medium og celleaffald.
    10. Fastgør tomme P200-barrierespidser i begge udløb af urin- og kapillærkanalerne. Pipetter 200 μL endotelvedligeholdelsesmedium og injicer halvdelen af det i kapillærkanalindløbet. Slip pipettespidsen inde i indløbet, således at både kanalens indløb og udløb nu er fastgjort til pipettespidser fyldt med medium.
    11. Der pipetteres 200 μL im-vedligeholdelsesmedium, og halvdelen injiceres i urinvejsindløbet. Slip pipettespidsen inde i indløbet, således at både kanalens indløb og udløb nu er fastgjort til pipettespidser fyldt med medium. Inkuber chipsene med spidser indlejret ved 37 °C natten over.
  3. Tilslut chips til Organ Chip Bioreactor for at anvende væskestrøm og mekanisk belastning.
    1. Fjern P200 spidser fra urin- og kapillærkanalerne. Tilsæt dråber af respektive medier til indløbet og udløbet af urin- og kapillærkanalerne for at forhindre tørring.
    2. Tilsæt 3 ml varmt podocytinduktionsmedium (supplerende tabel S1) til urinindløbsbeholderen. Tilsæt 3 ml varmt endotelvedligeholdelsesmedium til kapillærindløbsbeholderen.
    3. Der tilsættes 300 μL varmt podocytinduktionsmedium til urinkanaludløbsbeholderen direkte over udløbsporten. Der tilsættes 300 μL varmt endotelvedligeholdelsesmedium til kapillærkanalens udløbsreservoir direkte over udløbsporten.
    4. Skub bælgene på bakken og ind i Organ Chip Bioreactor.
    5. Brug drejeskiven på organchipbioreaktoren til at vælge og starte Prime Cycle (2 min). Undersøg visuelt undersiden af bælgen for små dråber ved alle fire fluidiske porte.
    6. For at opnå væske-væske-kontakt mellem Pod-undersiden og mikrofluidiske chipporte skal du forsigtigt skubbe chipholderen ind i Pod'en. Tryk forsigtigt chipholderfanen ind og op. Aspirer overskydende medium fra chipoverfladen.
    7. Indstil organchipbioreaktorens strømningshastighed til 60 μL / t. Indstil den cykliske belastning til 10% ved 0,4 Hz. Brug drejeskiven på organchipbioreaktoren til at vælge reguleringscyklussen og køre i 2 timer.
    8. Visuelt inspicere udløbsreservoirerne for en stigning i medieniveauet.
    9. Brug drejeskiven på Organ Chip Bioreactor til at vælge Regulate-cyklussen.

7. Dag 17-21 og derover: podocytinduktion og chipvedligeholdelse

  1. Aspirer mediet fra urinkanalens udløbsreservoirer diagonalt væk fra havnen, men hold noget medium i reservoiret hver kulturdag. Genopfyld urinkanalindløbsreservoiret med op til 3 ml podocytinduktionsmedium hver 2. dag i 5 dage.
    1. Efter 5 dage skal du aspirere mediet fra urinkanalen, men hold noget medium i reservoiret. Genopfyld urinkanalens indløbsreservoir dagligt med 3 ml podocytvedligeholdelsesmedium.
  2. Aspirer mediet fra kapillærkanalens udløbsreservoirer diagonalt væk fra havnen, men hold noget medium i reservoiret hver kulturdag. Genopfyld kapillærkanalens indløbsreservoir dagligt med op til 3 ml endotelvedligeholdelsesmedium.

8. Funktionel assay og immunfluorescensbilleddannelse

BEMÆRK: Se supplerende fil 1 for detaljer om flowcytometrianalyse, ELISA for chipudslip og mRNA-isolering.

  1. Funktionel assay (molekylær filtrering) ved anvendelse af inulin og albumin
    1. Aspirer mediet fra kapillærkanalens udløbsreservoir diagonalt væk fra havnen, men hold noget medium i reservoiret. Udskift med 3 ml endotelvedligeholdelsesmedium suppleret med inulin og albumin (supplerende tabel S1) i 6 timer.
    2. Ved hjælp af en 5 ml serologisk pipette måles volumenet (i ml) af medium fra urinkanalen og overføres til et 15 ml konisk rør. Pak røret ind i aluminiumsfolie for at beskytte mod lys og minimere fotoblegning af fluorophorekonjugeret inulin og albumin. Genopfyld reservoiret med 3 ml Podocyt Maintenance medium.
    3. Forbered en stamopløsning af inulin i Podocyt Maintenance medium. Fra 25 μg/ml Inulin fremstilles otte standarder for inulin via en 2x seriel fortynding i Podocytvedligeholdelsesmedium.
    4. På samme måde fremstilles en stamopløsning af albumin i Podocytvedligeholdelsesmedium. Fra 150 μg / ml albumin skal du forberede otte standarder for albumin via en 2x seriel fortynding i Podocytvedligeholdelsesmedium.
    5. Pipetter i to eksemplarer 100 μL af hver standard inulinkoncentration i hver brønd af en sort plade med 96 brønde (eller 16 inulinbrønde i alt). Pipette i to eksemplarer 100 μL af hver standard albuminkoncentration i hver brønd af den samme 96-brøndplade (16 samlede brønde af albumin). Pipette i to eksemplarer af 100 μL Podocytvedligeholdelsesmedium til at fungere som blindtarm (eller to samlede brønde i Podocytvedligeholdelsesmedium).
    6. Pipetter i to eksemplarer 100 μL spildevandsmedium fra urinkanalen ind i hver brønd af den samme 96-brøndsplade. Pipetter i to eksemplarer af 100 μL spildevandsmedium fra kapillærkanalen.
    7. Indsæt pladen i pladelæseren, og mål fluorescensen for albumin ved excitation 550 nm og emission 615 nm. Den samme plade for inulin måles ved excitation 513 nm og emission 577 nm.
    8. Fra de genererede data skal du gennemsnit de duplikerede målinger (pr. Chip). Træk den tomme værdi, der svarer til pladeaflæsningen, fra resten af dataene på arket.
    9. Afbild de værdier, der svarer til albuminstandarderne, for at skabe en standardkurve med koncentration [μg/ml] på x-aksen og fluorescens på y-aksen. Værdierne svarende til inulinstandarderne afbildes for at skabe en standardkurve med koncentration [μg/ml] på x-aksen og fluorescens på y-aksen.
    10. Brug en statistisk analysesoftwarepakke og lineær interpolation til at bestemme urinkoncentrationen af henholdsvis inulin og albumin i spildevandsmediet fra chipsene.
    11. Urinclearance af inulin/albumin bestemmes fra chipsene ved hjælp af ligning (1)2:
      Urinclearance = ([U] × UV) / [P] (1)
      Hvor [U] er urinkoncentrationen fra trin 8.1.10, er UV volumenet af opsamlet urinkanalspildevand fra trin 8.1.2, og [P] er kapillærkoncentrationen af inulin eller albumin (10 μg/ml inulin eller 100 μg/ml albumin).
  2. Immunofluorescens billeddannelse
    1. Injicer en tom P200-spids i udløbsportene i urin- og kapillærkanalerne. For at fiksere cellerne pipetteres 200 μL 4% formaldehyd og injiceres halvdelen af det i det nederste kanalindløb. Slip pipettespidsen inde i indløbet.
    2. Pipetter 200 μL 4% formaldehyd og injicer halvdelen af det i urinkanalindløbet. Slip pipettespidsen inde i indløbet, således at både kanalens indløb og udløb nu er fastgjort til pipettespidser fyldt med fikseringsmiddel.
    3. Inkuber chipsene ved stuetemperatur i 20 min.
    4. Efter 20 minutter kasseres alle pipettespidserne. Injicer rene, tomme P200-spidser i udløbsportene i urin- og kapillærkanalerne. For at gennemtrænge cellerne pipetteres 200 μL af 0,125% Triton X-100/PBS og injiceres halvdelen af det i kapillærkanalindløbet. Slip pipettespidsen inde i indløbet.
    5. Pipette 200 μL af 0,125% Triton X-100/PBS og injicere halvdelen af det i urinvejsindløbet. Slip pipettespidsen inde i indløbet. Inkuber chippen ved stuetemperatur i 5 min.
    6. Kassér alle pipettespidserne. Injicer rene, tomme P200-spidser i udløbsportene i urin- og kapillærkanalerne. For at blokere cellerne pipetteres 200 μL 1% bovin serumalbumin (BSA) i 0,125% Triton X-100/PBS og injiceres halvdelen af det i kapillærkanalindløbet. Slip pipettespidsen inde i indløbet.
    7. Pipetter 200 μL af 1% BSA i 0,125% Triton X-100/PBS og injicer halvdelen af det i urinvejsindløbet. Slip pipettespidsen inde i indløbet. Inkuberes ved stuetemperatur i 30 min.
    8. Kassér alle pipettespidserne. Begge kanaler vaskes 3x ved at pipettere 200 μL af 0,125% Triton X-100/PBS ind i hver kanal og inkubere ved stuetemperatur i 5 min.
    9. Der fremstilles 100 μL primært antistof pr. kanal med den fortynding, som fabrikanten anbefaler i 0,125 % Triton X-100/PBS. Injicer rene, tomme P200-spidser i udløbsportene i urin- og kapillærkanalerne. Pipetter 100 μL primært antistof og injicer halvdelen i de respektive kanaler. Slip pipettespidsen inde i indløbet.
    10. Der inkuberes i 1 time ved stuetemperatur eller, for bedre resultater, natten over ved 4 °C.
      BEMÆRK: Flere primære antistoffer kan påføres på én gang; Den primære antistofopløsning skal dog fortyndes i henhold til producentens anvisninger.
    11. Kanalerne vaskes 3 x 10 min som beskrevet i trin 8.2.8.
    12. Der fremstilles 100 μL sekundært antistof pr. kanal med den af producenten anbefalede fortyndingsfaktor i 0,125 % Triton X-100/PBS. Injicer rene, tomme P200-spidser i udløbsportene i urin- og kapillærkanalerne. Pipetter 100 μL sekundært antistof og injicer halvdelen i de respektive kanaler. Slip pipettespidserne inde i indløbet. Inkuberes i 1 time ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: Hvert sekundært antistof skal påføres separat. Der vaskes mindst 3 x 10 minutter mellem hver påføring i henhold til trin 8.2.8.
    13. Kanalerne vaskes 3 x 10 min som beskrevet i trin 8.2.8.
    14. Skyl begge kanaler én gang med 200 μL destilleret vand, mens restvæsken opsuges fra periferien af chipudløbsportene.
    15. Injicer ren, tom P200 i udløbsportene i urin- og kapillærkanalerne. For at modfarve cellerne pipetteres 200 μL 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI, 1:1.000 fortynding i destilleret vand) og injiceres halvdelen af det i kapillærkanalindløbet. Slip pipettespidsen inde i indløbet, og pipetter 200 μL DAPI, og injicer halvdelen af den i urinkanalindløbet. Slip pipettespidsen inde i indløbet, og inkuber ved stuetemperatur i 5 min.
    16. Kassér alle pipettespidserne. Injicer rene, tomme P200-spidser i udløbsportene i urin- og kapillærkanalerne. For at modvirke cellerne pipetteres 200 μL phalloidin (1:1.000 fortynding i PBS uden Ca 2+ og Mg2+) og injiceres halvdelen af det i kapillærkanalindløbet og frigiver pipettespidsen inde i indløbet. Pipetter 200 μL phalloidin (1:1.000 fortynding i PBS uden Ca 2+ og Mg2+) og injicer halvdelen af det i urinkanalindløbet og slip pipettespidsen inde i indløbet. Inkuberes ved stuetemperatur i 15 min.
    17. Skyl kanalerne 3x med 200 μL PBS uden Ca 2+ og Mg2+, og opsæt overskydende væske fra periferien af udløbsportene.
    18. Visualiser chipsene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her viser vi, at en funktionel 3D in vitro-model af glomerulus kan vaskulariseres og epithelialiseres fra en isogen kilde til humane iPS-celler. Specifikt giver denne protokol instruktioner om, hvordan man anvender human iPS-celleteknologi, især deres evne til at differentiere sig til specialiserede celletyper, til at generere nyreglomerulært epitel (podocytter) og vaskulært endotel (viEC'er), der kan integreres med mikrofluidiske enheder til at modellere strukturen og funktionen af den menneskelige nyre på patientspecifikt niveau. En skematisk oversigt over denne protokol og tidslinje (figur 1A) beskriver, hvordan man dyrker mitotisk aktive humane iPS-celler (figur 1B) og derefter differentierer dem (parallelt) til mesoderm og laterale mesodermcellelinjer (figur 1C, D). De resulterende mesodermceller viste sig at udtrykke brachyury (T), mens de laterale mesodermceller udtrykte brachyury (T), MIXL og EOMES 2,9,10,11.

Efterfølgende differentiering af mesodermcellerne producerede mellemliggende mesoderm (IM) celler, mens differentiering af de laterale mesodermceller producerede viEC'er (figur 1D) 2,10,11,17. Flowcytometrianalyse blev brugt til at undersøge ekspressionen af CD144 i differentierede viEC'er (før og efter MAC-sortering) sammenlignet med negative kontroller (herunder farvede og ufarvede udifferentierede humane iPS-celler og ufarvet endotel). En optimeret endoteldifferentiering vil resultere i 50% eller større CD31 / CD144-positive celler før MAC-sortering, hvilket vil forbedre sig betydeligt efter cellesortering sammenlignet med kontroller. Repræsentative resultater viser 59% differentieringseffektivitet for CD144 før MAC-sortering, som steg til 77% eller flere CD144-positive celler (eksklusive CD31-positive celler) efter MAC-sortering (figur 1E).

På dag 14 i denne protokol (før afslutningen af IM-differentiering og viEC-ekspansion) blev organ-on-a-chip-enhederne forberedt til cellesåning ved plasmabehandling og funktionalisering med kældermembranmatrix 2. Den følgende dag (dag 15 i protokollen) blev viEC'er podet i kapillærkanalen (nederst) på den mikrofluidiske enhed med viEC-medium. Dagen efter viEC-såning (dag 16 i protokollen) blev IM-celler podet i urinkanalen (øverste) i den mikrofluidiske enhed med podocytinduktionsmedium. Dagen efter IM-cellesåning (dag 17 i denne protokol) blev 60 μL/h væskestrømningshastighed og 10% belastning ved 0,4 Hz påført glomeruluschipsene. Disse chips oplever forskydningsspænding på 0,017 cm-2 og 0,0007 cm-2 i kapillær- og urinkanalerne, henholdsvis 2,12. Efter op til 5 dages podocytinduktion og 6 dages vaskulær endotelformering i chippen (dag 21 i denne protokol) (figur 2A) udtrykte de resulterende celler inden for glomeruluschips afstamningsidentifikationsmarkører.

Specifikt podocytterne i urinkanalen udtrykte podocin og nefrin (figur 2B, øverste panel) og viEC'erne i kapillærkanalen PECAM-1 (CD31) og VE-Cadherin (CD144) (figur 2B, nederste panel). Derudover udtrykte både podocyt- og viEC-lagene kollagen IV, det mest rigelige GBM-protein (figur 2B) i nyreglomerulus. Mere kollagen IV udtrykkes i urinkanalen, fordi podocytter er de dominerende producenter af kollagen IV, herunder α3α4α5 isoformen, som er den vigtigste heterotrimer isoform af kollagen i den modne glomerulus. Derudover udviklede podocytterne, der blev forplantet i glomeruluschipsene, fodprocesser og udskilte VEGF165, som begge er karakteristiske træk ved funktionelle modeller af nyreglomerulus 2,12. Denne protokol giver også en vurdering af den selektive molekylære filtreringsfunktion af nyreglomerulus ved anvendelse af inulin og albumin, hvorfra glomeruluschipsene selektivt filtrerer små molekyler (inulin) fra kapillæren ind i urinkanalen, samtidig med at store proteiner (albumin) forhindres i at forlade kapillærkanalen (figur 2C)2,10,12.

Da hver menneskelig iPS-cellelinje udviser iboende forskelle i fordoblingstiden, er det vigtigt at bemærke, at optimale cellesåtætheder for forskellige cellelinjer kan variere og derfor skal optimeres af forskeren. For endotelcelledifferentiering, hvis såtætheden af humane iPS-celler er for lav, kan forskeren observere et lavere udbytte af differentierede endotelceller (<30% effektivitet). Hvis såtætheden af humane iPS-celler er for høj, kan forskeren observere hurtig cellevækst, løsrivelse eller dårligere vedhæftning, øget celledød og lavt udbytte (<30% effektivitet). Under endotelinduktion (dag 4-7 af differentiering) er en stigning i cellenummeret, der resulterer i et sekundært lag af celler, normalt, men bør holdes på et minimum (figur 3A). For IM- og podocytdifferentiering kan overovervågning af humane iPS-celler (>100.000 celler / brønd af en 12-brøndsplade) resultere i IM-celler, der vokser i store klynger eller danner aggregater, hvilket kan hindre differentiering og resultere i podocytter med en mindre moden morfologisk fænotype af aggregerede celler og mindre sekundære og / eller tertiære fodprocesser10, 11.

Under mikrofluidisk chipkultur kan uventet væskekrydsning mellem urin- og kapillærkanalerne (figur 3B) observeres, hvis der er bristet eller utilstrækkelig binding af PDMS-chipkomponenterne, eller hvis væskestrømningsvejen er blokeret. Denne uønskede væskekrydsning kan også skyldes en kompromitteret filtreringsbarriere, såsom vævsmodeller fra utilstrækkelig (lav) cellesåning eller beskadigede cellelag. For at forhindre dette problem anbefales det, at forskeren følger den anbefalede protokol og cellesåningstætheder samt visuelt inspicerer chipsene for luftbobler i kanalerne på hvert trin i processen. Hvis der observeres luftbobler i mediereservoirerne for de mikrofluidiske chips, der er under væskestrøm, kan pumpen stoppes og mediet afgasses under sterile forhold.

Sammen beskriver denne protokol og repræsentative resultater afledningen af vaskulært endotel (viEC'er) og glomerulært epitel (podocytter) fra en isogen human iPS-cellelinje og deres rekonstitution i en mikrofluidisk organ-on-a-chip-enhed for at rekapitulere strukturen og funktionen af den nyreglomerulære filtreringsbarriere på en patientspecifik måde.

Figure 1
Figur 1: Afledning af isogent glomerulært epitel og vaskulært endotel fra humane iPS-celler. (A) Skematisk tidslinje for mellemliggende mesoderm og viEC induktion, organ-on-a-chip design og kældermembranmatrixbelægning, cellesåning i chippen og podocytinduktion i chippen. (B) Repræsentative brightfield-billeder af PGP1 humane iPS-celler før dissociation på dag 0 i protokollen. (C) Repræsentative brightfield-billeder af PGP1-mesodermceller på dag 2 af differentiering (venstre) og mellemliggende mesodermceller på dag 8 af differentiering (højre). (D) Repræsentative brightfield-billeder af PGP1 laterale mesodermceller på dag 3 af differentiering (venstre) og PGP1 viEC'er på dag 9 af differentiering (2 dages ekspansion) (højre). Skalabjælker = 275 μm (B-D). (E) Kvantificering af viEC-differentiering via flowcytometrianalyse for CD144-positive celler på dag 7 af endotelcelledifferentiering før MACS (blå) og på dag 9 af endotelcelleudvidelse efter MACS (pink) sammenlignet med CD144-farvede humane iPSC'er (sorte) og ufarvede endotelceller (rød). Dette tal er ændret fra12. Forkortelser: iPSC'er = inducerede pluripotente stamceller; viEC = vaskulære endotelceller; BMP4/7 = knoglemorfogenetisk protein 4/7; RA = retinsyre; VEGF = vaskulær endotel vækstfaktor; MACS = magnetisk aktiveret cellesortering. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Repræsentative billeder af vaskulært endotel og glomerulært epitel (podocytlag) dyrket i den mikrofluidiske nyreglomeruluschip. Repræsentative brightfield-billeder af viEC'er (venstre) og glomerulært epitel (podocytter) (højre) formeret i glomerulus-chippen. Skalabjælker = 183 μm. (B) Repræsentative immunfluorescerende billeder af glomerulært epitel (podocytter) og viEC, der viser ekspressionen af afstamningsspecifikke markører. Skalabjælker = 100 μm. (C) Repræsentative data, der viser selektiv molekylær filtrering i glomeruluschippen. Fejllinjer repræsenterer SD. p < 0,0001. Dette tal er gengivet fra 12. Forkortelser: viEC'er = vaskulære endotelceller; VE-cadherin = CD144; PECAM-1 (= CD31) = blodpladeendotelcelleadhæsionsmolekyle. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Billeder af suboptimal endotelsåtæthed og ujævn væskestrøm i de mikrofluidiske chips . (A) Repræsentative lysfeltbilleder af optimale (venstre) og overvågede (højre) cellekulturer på dag 6 af viEC-differentiering. Skalastænger = 275 μm. (B) Repræsentative billeder af udløbsreservoirer fra mikrofluidiske chips med en jævn væskestrøm og en funktionel barriere (til venstre). Billede fra en chip med ujævn væskestrøm eller dysfunktionel barriere (højre). Pile angiver væskeniveauer i udløbsreservoirer til chipsens kapillær- og urinkanaler. Forkortelse: viECs = vaskulære endotelceller. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende fil 1: Flowcytometri, ELISA til chipudslip og mRNA-isolering. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S1: Opsætninger af emhættemateriale i vævskultur. (A) Emhættemateriale til kultur, der er sat op til MACS, herunder isspand med medier, magnet på magnetstativ og koniske rør under magneten. (B) In-tissue kultur hætte materiale opsætning af petriskål til chips, med toppen, vender nedad, under petriskålens bund. Forkortelse: MACS = magnetisk aktiveret cellesortering. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel S1: Medier og buffere, der anvendes i denne protokol. Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne rapport skitserer vi en protokol til at udlede vaskulært endotel og glomerulært epitel (podocytter) fra en isogen human iPS-cellelinje og brugen af disse celler til at konstruere et 3D-organ-on-a-chip-system, der efterligner strukturen, vævsvævsgrænsefladen og molekylær filtreringsfunktion af nyreglomerulus. Denne glomeruluschip er udstyret med endotel og glomerulært epitel, der sammen giver en barriere for selektivt filtrerende molekyler.

Forskere, der er interesseret i at tilpasse denne protokol, bør gøre følgende overvejelser: For det første kan optimering være nødvendig for cellesåning afhængigt af de iboende vækstegenskaber ved de stamcellelinjer, der anvendes. Cellesåtætheden kan variere på grund af iboende forskelle i humane iPS-celleproliferationshastigheder. Det anbefales, at forskere begynder med den mesoderm såtæthed, der foreslås af protokollen, og derefter justerer om nødvendigt. Tilsvarende anbefales det, at den laterale mesodermdifferentiering starter med den foreslåede cellesåningstæthed, før den justeres efter behov for at opnå et viEC-udbytte og sorteringseffektivitet på 50% eller mere. Hvis tilstrækkelige celler ikke differentieres efter sortering, kan TGF-Beta-hæmmer (SB431542) bruges til at forhindre hvile og hjælpe eksponentielt med at udvide viEC'er (tidligere passage 3). Imidlertid er flere cellulære processer eller signalveje afhængige af TGF-Beta (f.eks. Patogenese af hyperglykæmi / diabetes, immunhomeostase); som sådan anbefales det, at forskere overvejer virkningerne af TGF-Beta-hæmning på downstream-analyse eller sikrer tilstrækkelig test for at undgå utilsigtede eksperimentelle resultater.

For det andet er det vigtigt at bemærke mulige variationer i reagenskvalitet og producentspecifikationer, især for komponenter erhvervet fra andre leverandører end dem, der er specificeret i protokollen. Det anbefales således, at forskeren tester reagenser fra forskellige partinumre, leverandører og leverandører for at sikre reproducerbarhed af eksperimenter og resultater. Generelt bør forskeren undgå overdreven eksponering af de humane iPS-celler for dissociationsenzymer i løsrivelsesbufferne, da dette kan føre til nedsat cellelevedygtighed og ændret molekylær profil af cellerne. Derudover skal podocytinduktionsmediet beskyttes mod lys for at forhindre inaktivering af al trans retinsyre. For det tredje er det under organ-on-a-chip cellekultur afgørende at undgå luftbobler i kanalerne i den mikrofluidiske enhed, når man gennemgår chipsene. Udseendet af luftbobler kan minimeres eller forhindres ved regelmæssigt at inspicere chipsene under cellesåning, ved at opretholde væske-væske-kontakt ved hvert trin, der involverer chipperfusion, og ved ikke at skubbe eller trække luft ind i de flydende kanaler, når der anvendes pipettespidser og / eller aspiration.

Tidligere bestræbelser på at konstruere nyreglomeruluschips med genetisk matchet epitel og endotel har været afhængige af brugen af dyreafledte celler1. Mens disse dyreafledte cellelinjer traditionelt er blevet brugt til prækliniske undersøgelser, undlader de ofte at rekapitulere humane fysiologiske reaktioner, hvilket bidrager til den høje fejlrate (89,5%) af kliniske forsøg hos mennesker18. For at hjælpe med at overvinde nogle af disse problemer er funktionelle in vitro-modeller, der nærmere rekapitulerer menneskelig biologi, ønskelige. Der er gjort fremskridt med at udvikle flercellede modeller af den menneskelige nyre; Glomeruluschipsene anvendte imidlertid humane celler fra heterogene, ikke-isogene kilder. For eksempel har vi tidligere etableret en glomeruluschip rekonstitueret fra humane iPS-celleafledte podocytter og primært vævsafledt endotel10. Undersøgelser fra andre forskningsgrupper anvendte en blanding af primære celler4,9, udødeliggjorte celler 3 eller fostervandsafledte celler 3,6, der begrænser deres anvendelse til at studere patientspecifikke reaktioner eller applikationer i personlig medicin.

Protokollen, der er beskrevet heri, overvinder disse begrænsninger ved at muliggøre afledning af både vaskulært endotel (viEC'er) og glomerulært epitel (podocytter) fra den samme humane iPS-cellelinje og integrere disse celler i opdelte mikrofluidiske organ-on-a-chip-enheder for at modellere strukturen og funktionen af den nyreglomerulære kapillærvæg in vitro . I betragtning af den ubegrænsede selvfornyelse af humane iPS-celler kombineret med deres evne til at differentiere sig til næsten enhver celletype giver denne protokol også en mulighed for kontinuerlig sourcing af humane podocytter og viEC'er til vævsteknik og andre biomedicinske applikationer. Denne tilgang til afledninger af podocytter og viEC'er er blevet reproduceret i flere patientspecifikke humane iPS-cellelinjer, herunder PGP1- og DU11 2,10,12,17,19, hvilket muliggør etablering af personlige nyreglomeruluschips fra de ønskede patientpopulationer.

Strategien for differentiering af podocytter inden for de mikrofluidiske chips muliggør mekanistisk undersøgelse af udviklingen af human nyreglomerulus og sygdomsmodellering. Undersøgelsen af udviklingen af human nyreglomerulus er imidlertid begrænset af de viEC'er, der kræver sortering for at berige den ønskede population. Dette arbejde kunne drage fordel af etableringen af metoder til differentiering af viEC'er uden behov for udvælgelse af subpopulationer. Denne undersøgelse er også begrænset af den tykke PDMS-membran, der adskiller de vaskulære endotel og podocytcellelag. Fremtidigt arbejde kunne integrere nye biomaterialer til erstatning for den tykke PDMS for bedre at efterligne de molekylære og biofysiske egenskaber ved den glomerulære kældermembran. For eksempel kan en alternativ membran konstrueres til at besidde bionedbrydelige kvaliteter med indstillelig porøsitet og være tyndere (mere GBM-lignende) end den 50 μm tykke PDMS-membran, der anvendes i denne protokol.

Ikke desto mindre kan glomeruluschippen produceret af denne protokol anvendes til at studere mekanismerne for svækkende nyresygdomme og tjene som en platform for nefrotoksicitetstest og lægemiddelopdagelse. Fordi humane iPS-celler opretholder donorens genetiske profil, og glomeruluschippen er i stand til at modellere nyresygdom12, kan nye terapeutiske mål opdages i fremtiden til gavn for dem, der lider af arvelige former for nyresygdom. Derudover kan patientspecifikke biologiske reaktioner på lægemidler efter transplantation evalueres mere nøjagtigt ved hjælp af en isogen nyrechip som den, der er beskrevet i denne undersøgelse. Endelig er denne glomeruluschip klar til at studere virkningerne af væskedynamik og differentiel mekanisk belastning - som dem, der observeres hos nyresygdomspatienter med hypertension eller kardio-renalt syndrom - givet den relative lethed at modulere hastigheden af væskestrøm, vævsstrækning eller mekanisk belastning. Det er tænkeligt, at denne protokol kan fremme den nuværende forståelse af menneskelig nyreudvikling og sygdomsmekanismer samt lette udviklingen af personlig terapi i fremtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

S.M. er opfinder på et patent relateret til podocytdifferentiering fra humane iPS-celler. Den anden forfatter har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Pratt School of Engineering ved Duke University, Division of Nephrology ved Duke Department of Medicine, et Whitehead Scholarship i biomedicinsk forskning og en Genentech Research Award for S. Musah. Y. Roye er modtager af Duke University-Alfred P. Sloan Foundation Scholarship og William M. "Monty" Reichert Graduate Fellowship fra Duke University's Department of Biomedical Engineering. DU11 (Duke University klon #11) iPS-cellelinjen blev genereret på Duke iPSC Core Facility og leveret til os af Bursac Lab ved Duke University. Forfatterne takker N. Abutaleb, J. Holmes, R. Bhattacharya og Y. Zhou for teknisk bistand og nyttige diskussioner. Forfatterne vil også gerne takke medlemmer af Musah Lab for nyttige kommentarer til manuskriptet. Forfatterne takker Segura Lab for gaven af et Acuri C6 flowcytometer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
Alexa Fluor 488- and Alexa Fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo/Life Technologies A32744; A32754; A-11076; A32790; A21203; A11015
Collagen IV Thermo/Life Technologies 14-9871-82
Nephrin Progen GP-N2
PECAM-1 R&D Systems AF806
Podocin Abcam ab50339
VE-Cadherin Santa Cruz sc-9989
Basement membrane matrices
Corning Fibronectin, Human Corning 356008 Basement membrane (3)
iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment Iwai North America N8922012 Basement membrane matrix (2)
Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial BD Biosciences 354277 Basement membrane matrix (1); may show lot-to-lot variation
Cells
DU11 human iPS cells The DU11 (Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. The line has been tested and found to be free of mycoplasma (last test in November 2021) and karyotype abnormalities (July 2019)
Culture medium growth factors and media supplements
0.5M EDTA, pH 8.0 Invitrogen 15575020
2-Mercaptoethanol Thermo/Life Technologies 21985023
Albumin from Bovine serum, Texas Red conjugate Thermo/Life Technologies A23017
All-trans retinoic acid (500 mg) Stem Cell Technologies 72262
B27 serum-free supplement Thermo/Life Technologies 17504044
B-27 supplement (50x) without Vitamin A Thermo/Life Technologies 12587010
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A9418
CHIR99021 Stemgent 04-0004 May show lot-to-lot variation
Complete medium kit with CultureBoost-R Cell Systems 4Z0-500-R Podocyte maintenance media
DMEM/F12 Thermo/Life Technologies 12634028
DMEM/F12 with GlutaMAX supplement Thermo/Life Technologies 10565042 DMEM/F12 with glutamine
Forskolin (Adenylyl cyclase activator) Abcam ab120058
GlutaMAX supplement Thermo/Life Technologies 35050061 glutamine supplement
Heat-inactivated FBS Thermo/Life Technologies 10082147
Heparin solution Stem Cell Technologies 7980
Human Activin A Thermo/Life Technologies PHC9544
Human BMP4 Preprotech 120-05ET
Human BMP7 Thermo/Life Technologies PHC9544
Human VEGF Thermo/Life Technologies PHC9394
Inulin-FITC Sigma-Aldrich F3272
mTeSR1 medium Stem Cell Technologies 05850 Human iPS cell culture media (CCM). Add 5x supplement according to the manufacturer. Human iPS CCM can be stored for up to 6 months at -20 °C.
N-2 Supplement (100x) Thermo/Life Technologies 17502048
Neurobasal media Thermo/Life Technologies 21103049 Lateral mesoderm basal media
PBS (Phosphate-buffered saline) Thermo/Life Technologies 14190-250
Penicillin-streptomycin, liquid (100x) Thermo/Life Technologies 15140-163
ROCK inhibitor (Y27632) Tocris 1254
StemPro-34 SFM Thermo/Life Technologies 10639011 Endothelial cell culture medium (CCM). Add supplement according to manufacturer. Endothelial CCM can be stored for up to two weeks at 4 °C or -20 °C for up to 6 months.
TGF-Beta inhibitor (SB431542) Stem Cell Technologies 72234
Enzymes and other reagents
Accutase Thermo/Life Technologies A1110501 Cell detachment buffer
Dimethyl Suloxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2438
Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade VWR 97065-058
Paraformaldehyde (PFA) Thermo/Life Technologies 28906
Sterile distilled water Thermo/Life Technologies 15230162
Triton X-100 VWR 97062-208
Equipment
Trypsin EDTA, 0.05% Thermo/Life Technologies 25300-120
(Orb) Hub module Emulate ORB-HM1
100mm x 15 mm round petri dish Fisherbrand FB087579B
120 x 120 mm square cell culture dish VWR 688161
Accuri C6 BD Biosciences
Aspirating pipettes, individually wrapped Corning 29442-462
Aspirating Unit SP Bel-Art F19917-0150
Avanti J-15R Centrifuge Beckman Coulter B99516
Conical centrifuge tube, 15 mL Corning 352097
Conical centrifuge tube, 50 mL Corning 352098
EVOS M7000 Thermo/Life Technologies AMF7000 Fluorescent microscope to take images of fixed and stained cells.
Hemocytometer VWR 100503-092
Heracell VIOS 160i CO2 incubator Thermo/Life Technologies 51030403
Inverted Zeiss Axio Observer equipeed with AxioCam 503 camera Carl Zeiss Micrscopy 491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera)
Kimberly-Clark nitrile gloves VWR 40101-346
Kimwipes, large VWR 21905-049
Leoca SP8 Upright Confocal Microscope
Media reservoir (POD Portable Module) Emulate POD-1
Microplate shaker VWR 12620-926
Organ-chip Emulate S-1 Chip
Organ-chip holder Emulate AK-CCR
P10 precision barrier pipette tips Denville Scientific P1096-FR
P100 barrier pipette tips Denville Scientific P1125
P1000 barrier pipette tips Denville Scientific P1121
P20 barrier pipette tips Denville Scientific P1122
P200 barrier pipette tips Denville Scientific P1122
Plasma Asher Quorum tech K1050X RF This Plasma Etcher/Asher/Cleaner was used as a part of Duke University's Shared Materials Instrumentation Facility (SMiF).
Round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap Corning 352235
Serological pipette, 10 mL, indivdually wrapped Corning 356551
Serological pipette, 25 mL, indivdually wrapped Corning 356525
Serological pipette, 5 mL, indivdually wrapped Corning 356543
Steriflip, 0.22 µm, PES EMD Millipore SCGP00525
Sterile Microcentrifuge tubes Thomas Scientific 1138W14
T75cm2 cell culture flask with vent cap Corning 430641U
Tissue culture-treated 12 well plates Corning 353043
Tissue culture-treated 6 well plates Corning 353046
Vacuum modulator and perstaltic pump (Zoe Culture Module) Emulate ZOE-CM1 Organ Chip Bioreactor
VE-Cadherin CD144 anti-human antibody - APC conjugated Miltenyi Biotec 130-126-010
Wide-beveled cell lifter Corning 3008
MACS
CD144 MicroBeads, human Miltenyi Biotec 130-097-857
CD31 MicroBead Kit, human Miltenyi Biotec 130-091-935
LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, L., et al. A disease model of diabetic nephropathy in a glomerulus-on-a-chip microdevice. Lab on a Chip. 17 (10), 1749-1760 (2017).
  2. Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (5), 1-12 (2017).
  3. Petrosyan, A., et al. A glomerulus-on-a-chip to recapitulate the human glomerular filtration barrier. Nature Communications. 10 (1), 3656 (2019).
  4. Hass, R., Kasper, C., Böhm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Communication and Signaling. 9, 12 (2011).
  5. Altschuler, S. J., Wu, L. F. Cellular heterogeneity: when do differences make a difference. Cell. 141 (4), 559-563 (2010).
  6. Da Sacco, S., et al. A novel source of cultured podocytes. PloS One. 8 (12), 81812 (2013).
  7. Singh, V. K., Kalsan, M., Kumar, N., Saini, A., Chandra, R. Induced pluripotent stem cells: applications in regenerative medicine, disease modeling, and drug discovery. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 2 (2015).
  8. Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of cardiovascular pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  9. Patsch, C., et al. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).
  10. Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13 (7), 1662-1685 (2018).
  11. Burt, M., Bhattachaya, R., Okafor, A. E., Musah, S. Guided differentiation of mature kidney podocytes from human induced pluripotent stem cells under chemically defined conditions. Journal of Visualized Experiments. (161), e61299 (2020).
  12. Roye, Y. A personalized glomerulus chip engineered from stem cell-derived epithelium and vascular endothelium. Micromachines. 12 (8), 967 (2021).
  13. Roselli, S., et al. Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area. The American Journal of Pathology. 160 (1), 131-139 (2002).
  14. Ruotsalainen, V., et al. Nephrin is specifically located at the slit diaphragm of glomerular podocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 7962-7967 (1999).
  15. Privratsky, J. R., Newman, P. J. PECAM-1: regulator of endothelial junctional integrity. Cell and Tissue Research. 355 (3), 607-619 (2014).
  16. Menon, M. C., Chuang, P. Y., He, C. J. The glomerular filtration barrier: components and crosstalk. International Journal of Nephrology. 2012, 749010 (2012).
  17. Abutaleb, N. O., Truskey, G. A. Differentiation and characterization of human iPSC-derived vascular endothelial cells under physiological shear stress. STAR Protocols. 2 (2), 100394 (2021).
  18. Pammolli, F., Magazzini, L., Riccaboni, M. The productivity crisis in pharmaceutical R&D. Nature Reviews. Drug Discovery. 10 (6), 428-438 (2011).
  19. Atchison, L., et al. iPSC-derived endothelial cells affect vascular function in a tissue-engineered blood vessel model of Hutchinson-Gilford progeria syndrome. Stem Cell Reports. 14 (2), 325-337 (2020).

Tags

Bioengineering udgave 189
Isogen nyre glomerulus chip konstrueret fra humaninducerede pluripotente stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Roye, Y., Musah, S. Isogenic Kidney… More

Roye, Y., Musah, S. Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (189), e63821, doi:10.3791/63821 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter