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Bioengineering

Chip de glomérulo renal isogênico projetado a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

Published: November 4, 2022 doi: 10.3791/63821
Automatic Translation
1, 1,2,3,4
1Department of Biomedical Engineering, Pratt School of Engineering, Duke University, 2Department of Medicine, Division of Nephrology, Duke University School of Medicine, 3Department of Cell Biology, Duke University, 4Center for Biomolecular and Tissue Engineering, Duke University

Summary

Apresentamos aqui um protocolo para projetar um sistema personalizado de organ-on-a-chip que recapitula a estrutura e a função da barreira de filtração glomerular renal, integrando células endoteliais epiteliais e vasculares geneticamente combinadas diferenciadas de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos. Este sistema de bioengenharia pode avançar a medicina de precisão renal e aplicações relacionadas.

Abstract

A doença renal crônica (DRC) afeta 15% da população adulta dos EUA, mas o estabelecimento de terapias direcionadas tem sido limitado pela falta de modelos funcionais que possam prever com precisão as respostas biológicas humanas e a nefrotoxicidade. Os avanços na medicina de precisão renal podem ajudar a superar essas limitações. No entanto, modelos in vitro previamente estabelecidos do glomérulo renal humano - o local primário para a filtração do sangue e um alvo-chave de muitas doenças e toxicidades de drogas - normalmente empregam populações celulares heterogêneas com características funcionais limitadas e antecedentes genéticos incomparáveis. Essas características limitam significativamente sua aplicação para modelagem de doenças específicas do paciente e descoberta terapêutica.

Este trabalho apresenta um protocolo que integra o epitélio glomerular derivado de células-tronco pluripotente induzido por humanos (iPS) (podócitos) e endotélio vascular de um único paciente para projetar um chip de glomérulo renal microfluídico isogênico e vascularizado. O chip glomérulo resultante é composto de camadas de células endoteliais e epiteliais derivadas de células-tronco que expressam marcadores específicos de linhagem, produzem proteínas da membrana basal e formam uma interface tecido-tecido semelhante à barreira de filtração glomerular do rim. O chip de glomérulo modificado filtra seletivamente moléculas e recapitula a lesão renal induzida por drogas. A capacidade de reconstituir a estrutura e a função do glomérulo renal usando tipos de células isogênicas cria a oportunidade de modelar a doença renal com a especificidade do paciente e avançar a utilidade de órgãos em chips para medicina de precisão renal e aplicações relacionadas.

Introduction

Os dispositivos organ-on-a-chip são modelos dinâmicos 3D in vitro que empregam estimulação molecular e mecânica, bem como vascularização, para formar interfaces tecido-tecido que modelam a estrutura e a função de órgãos específicos. Dispositivos organ-on-a-chip previamente estabelecidos que visavam recapitular o glomérulo do rim (chips de glomérulo) consistiam em linhagens celulares animais1 ou linhagens celulares primárias e imortalizadas humanas de fontes heterogêneas 2,3. O uso de fontes celulares geneticamente heterogêneas apresenta variações que limitam significativamente os estudos de respostas específicas do paciente e genética ou mecanismos da doença 4,5. Enfrentar esse desafio depende da disponibilidade de linhagens celulares isogênicas originárias de indivíduos específicos com perfis moleculares e genéticos preservados para fornecer um microambiente mais preciso para a engenharia de modelos in vitro 2,3,6. Linhagens celulares isogênicas de origem humana agora podem ser facilmente geradas devido aos avanços na cultura de células iPS humanas. Como as células iPS humanas são tipicamente de origem não invasiva, podem se auto-renovar indefinidamente e se diferenciar em quase qualquer tipo de célula, elas servem como uma fonte atraente de células para o estabelecimento de modelos in vitro, como o chip glomérulo 7,8. A barreira de filtração glomerular é o principal local para a filtração do sangue. O sangue é primeiro filtrado através do endotélio vascular, da membrana basal glomerular e, finalmente, através do epitélio especializado chamado podócitos. Todos os três componentes da barreira de filtração contribuem para a filtração seletiva de moléculas. Apresentamos aqui um protocolo para estabelecer um dispositivo organ-on-a-chip em interface com endotélio vascular e epitélio glomerular a partir de uma única fonte de célula iPS humana. Embora este protocolo seja especialmente útil para projetar um chip isogênico e vascularizado para recapitular a barreira de filtração glomerular, ele também fornece um modelo para o desenvolvimento de outros tipos de órgãos personalizados em chips e plataformas multi-órgãos, como um sistema isogênico "corpo-em-um-chip".

O protocolo aqui descrito começa com a diferenciação divergente de células iPS humanas em duas linhagens separadas - mesoderma lateral e mesoderma, que são posteriormente diferenciadas em endotélio vascular e epitélio glomerular, respectivamente. Para gerar células mesodérmicas laterais, as células iPS humanas foram semeadas em placas revestidas de matriz de membrana basal 1 e cultivadas por 3 dias (sem troca de mídia) em meio N2B27 suplementado com o ativador Wnt, CHIR 99021, e o potente indutor mesodérmico, osso-morfogenético 4 (BMP4). As células mesodérmicas laterais resultantes foram previamente caracterizadas pela expressão de braquiúria (T), homeobox pareada mista (MIXL) e eomesodermina (EOMES)9. Posteriormente, as células mesodérmicas laterais foram cultivadas por 4 dias em meio suplementado com VEGF165 e Forskolin para induzir células endoteliais vasculares que foram classificadas com base na expressão de VE-Caderrina e/ou PECAM-1 usando classificação celular ativada por magnetismo (MACS). As células endoteliais vasculares resultantes (viEC) foram expandidas cultivando-as em frascos de matriz de membrana basal de 3 revestimentos até estarem prontas para semear no dispositivo microfluídico.

Para gerar células mesodérmicas, células iPS humanas foram semeadas em placas revestidas de 2 placas revestidas de matriz de membrana basal e cultivadas por 2 dias em meio contendo Activin A e CHIR99021. As células mesodérmicas resultantes foram caracterizadas pela expressão de HAND1, goosecoid e brachury (T), conforme descrito anteriormente 2,10,11. Para induzir a diferenciação celular do mesoderma intermediário (IM), as células mesodérmicas foram cultivadas por 14 dias em meio suplementado com BMP-7 e CHIR99021. As células IM resultantes expressam o Tumor de Wilm 1 (WT1), o gene caixa emparelhada 2 (PAX2) e a proteína relacionada 1 (OSR-1)2,10,11.

Um chip microfluídico à base de polidimetilsiloxano (PDMS) de dois canais foi projetado para recapitular a estrutura da barreira de filtração glomerular in vitro. O canal urinário é de 1.000 μm x 1.000 μm (a x h) e a dimensão do canal capilar é de 1.000 μm x 200 μm (a x h). Os ciclos cíclicos de alongamento e relaxamento foram facilitados pelas câmaras ocas presentes em cada lado dos canais fluídicos. As células foram semeadas em uma membrana PDMS flexível (50 μm de espessura) que separa os canais urinário e capilar. A membrana é equipada com poros hexagonais (7 μm de diâmetro, 40 μm de distância) para ajudar a promover a sinalização intercelular (Figura 1A)2,12. Dois dias antes da indução do MI ser concluída, os cavacos microfluídicos foram revestidos com matriz de membrana basal 2. viECs foram semeados no canal capilar do chip microfluídico usando meio de Manutenção Endotelial 1 dia antes da indução IM ser concluída, e o chip foi virado de cabeça para baixo para permitir a adesão celular no lado basal da membrana PDMS revestida de ECM. No dia em que a indução do IM foi concluída, as células foram semeadas no canal urinário do chip microfluídico usando um meio suplementado com BMP7, Activin A, CHIR99021, VEGF165 e todo o ácido retinóico trans para induzir a diferenciação de podócitos dentro do chip. No dia seguinte, os reservatórios do meio foram preenchidos com meio de Indução de Podócito e meio de Manutenção Endotelial, e 10% de deformação mecânica a 0,4 Hz e fluxo de fluido (60 μL/h) foram aplicados aos chips.

Os chips microfluídicos celularizados foram cultivados por mais 5 dias utilizando meio de Indução de Podócito (no canal urinário) e meio de Manutenção Endotelial (no canal vascular). Os chips de glomérulo renal resultantes foram cultivados por até 7 dias adicionais em meios de manutenção para as células podócitas e endoteliais. Os podócitos diferenciados expressaram positivamente proteínas específicas da linhagem, incluindo podocina e nefrina 13,14, enquanto os viECs expressaram positivamente as proteínas de identificação de linhagem PECAM-1 e VE-Caderina, todas moléculas essenciais para a manutenção da integridade da barreira de filtração glomerular 15,16 . Verificou-se que os podócitos e os viECs secretam a proteína da membrana basal glomerular mais abundante, o colágeno IV, que também é importante para a maturação e função do tecido.

Descobriu-se que o sistema de três componentes da barreira de filtração - endotélio, membrana basal e epitélio - nos chips de glomérulo filtrava seletivamente as moléculas e respondia a um tratamento medicamentoso nefrotóxico quimioterápico. Os resultados do tratamento medicamentoso indicaram que o chip de glomérulo pode ser usado para estudos de nefrotoxicidade e para modelagem de doenças. Este protocolo fornece a diretriz geral para a engenharia de um chip funcional de glomérulo renal microfluídico a partir de derivados isogênicos de células iPS. Análises a jusante do chip de engenharia podem ser realizadas conforme desejado pelo pesquisador. Para obter mais informações sobre o uso do chip glomérulo para modelar a lesão glomerular induzida por medicamentos, consulte publicações anteriores 2,12.

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Protocol

1. Preparar soluções de matriz de membrana basal e substratos revestidos

  1. Descongelar a matriz da membrana basal 1 durante a noite sobre gelo a 4 °C. Alíquota de acordo com a sugestão do fabricante para a razão de diluição. Usando um tubo cônico de 50 mL e pipeta, misture cuidadosamente uma quantidade apropriada de matriz de membrana basal 1 em 25 mL de DMEM/F12 frio até descongelar completamente e dissolver.
    1. Para dissolver uma alíquota congelada, tome ~200 μL dos 25 mL de DMEM/F12 frio e transfira-o para o tubo de alíquota congelado. Pipetar para cima e para baixo até que a matriz esteja completamente descongelada e dissolvida. Transfira todo o conteúdo do tubo da matriz de membrana basal 1 para o resto do DMEM/F12 frio.
  2. Pipetar 1 mL de matriz de membrana basal 1 solução para cada poço de uma placa de 6 poços. Para utilizar as placas revestidas no mesmo dia, incubar a 37 °C durante 2 h.
    1. Alternativamente, as placas revestidas podem ser embaladas com parafilme e armazenadas a 4 °C por até 2 semanas. Quando estiver pronta a utilizar a placa armazenada, incubar a 37 °C durante 30 min.
  3. Diluir a matriz da membrana basal 2 em 9 mL de água destilada estéril para atingir uma concentração final de 5 μg/mL. Pipetar 700 μL de solução de matriz de membrana basal 2 em cada poço de uma placa de 12 poços. Envolver as placas revestidas de 2 placas revestidas da matriz da membrana basal com parafilme e conservar a 4 °C durante um período máximo de 2 semanas.
  4. Reconstituir a matriz de membrana basal liofilizada 3 para atingir uma concentração final de 1 mg/mL em solução salina tamponada com fosfato (PBS, Ca+2 e Mg+2-livre), conforme sugerido pelo fabricante. Diluir uma alíquota de 250 μL até uma concentração final de 25 μg/mL em 9,75 mL de PBS (livre de Ca+2 e Mg+2). Utilizar 6 ml desta solução para revestir um balão de T75 (uma concentração final de 2 μg/cm2). Conservar os balões revestidos de matriz a 4 °C durante um período máximo de 1 semana.

2. Cultura de células iPS humanas

NOTA: A linha DU11 utilizada neste protocolo foi testada e mostrou-se livre de anormalidades de micoplasma e cariótipo.

  1. Incubar placas de 1 revestimento da matriz de membrana basal a 37°C por 1-2 h.
  2. Lave cada poço da placa de 6 poços 3x com 1 mL de DMEM/F12 morno (37 °C). Adicionar 2 mL de meio de cultura de células iPS humanas (MCC) (Tabela Suplementar S1) a cada poço da placa de 6 poços. Incubar as placas a 37 °C enquanto as células estão a ser preparadas para a semeadura, conforme descrito a seguir.
  3. Lave cada poço da placa de 6 poços contendo células iPS humanas com 1 mL de DMEM/F12 quente.
  4. Aspirar o DMEM/F12. Adicione 1 mL de tampão de descolamento de células quentes a cada poço da placa de 6 poços. Incubar a 37 °C durante 1 min.
  5. Inspecione visualmente cada poço sob um microscópio para dissociação ao redor das bordas da colônia celular. Aspirar cuidadosamente o tampão de descolamento celular das células. Lave suavemente cada poço com 1 mL de DMEM/F12 morno.
  6. Inspecione as placas sob o microscópio para garantir que as células não se separaram completamente da placa ou foram acidentalmente aspiradas.
  7. Adicione 3 mL de iPS CCM humano quente a cada poço da placa de 6 poços com células. Usando um elevador de células, raspe suavemente as colônias. Usando uma pipeta sorológica de 5 mL, misture suavemente a suspensão celular em cada poço para cima e para baixo uma vez.
  8. Retire a nova placa revestida de matriz de membrana basal 1 da incubadora. Transfira 0,5 mL da suspensão celular para cada poço da nova placa revestida de 1 matriz de membrana basal. Mova a placa em um movimento de figura de oito para distribuir as células uniformemente. Incubar a 37 °C numa incubadora de CO2 a 5%.
  9. Aspirar o meio gasto e substituir por 3 mL de iPS CCM humano todos os dias de cultura até que as células estejam 70% confluentes (aproximadamente 4 dias após a passagem).

3. Dias 0-16: diferenciação de iPSCs humanas em células mesodérmicas intermediárias

  1. Dias 0-2: indução mesodérmica
    1. Mover as placas revestidas de 2 revestimentos da matriz de membrana basal de 4 °C para a temperatura ambiente durante 2 h para se equilibrar após o armazenamento.
    2. Aspirar o meio gasto de cada poço da placa de 6 poços contendo aproximadamente 70% de células iPS humanas confluentes. Lave suavemente as células 3x com 1 mL de DMEM/F12 morno.
    3. Aspirar o DMEM/F12. Adicione 1 mL de tampão de descolamento celular a cada poço da placa de 6 poços de células iPS humanas. Incubar a 37 °C durante 5-7 min.
    4. Inspecione visualmente cada poço sob um microscópio para dissociação ao redor das bordas da colônia celular. Usando um elevador de células, raspe suavemente as colônias.
    5. Transfira as suspensões celulares de todos os poços da placa de 6 poços para um tubo cônico de 15 mL e use um P1000 para pipetar para cima e para baixo várias vezes para obter uma suspensão unicelular das células iPS.
    6. Encher a suspensão celular no tubo cônico até 14 mL com DMEM/F12. Centrífuga durante 5 min a 200 × g à temperatura ambiente.
    7. Aspirar o sobrenadante. Ressuscite o pellet celular em 14 mL de DMEM/F12 morno. Repetir a centrifugação durante 5 min a 200 × g à temperatura ambiente.
    8. Aspirar o sobrenadante. Ressuspender as células em 1 mL de meio de Indução Mesodérmica (Tabela Suplementar S1). Conte as células usando um hemocitômetro. Diluir em meio de indução mesoderma para atingir uma concentração final de 1 × 105 células/mL.
    9. Aspirar o revestimento da matriz de membrana basal 2-placa revestida. Enxaguar cada poço da matriz de membrana basal 2-placa revestida 2x com 1 mL de DMEM/F12 morno.
    10. Pipete suavemente a suspensão da célula para cima e para baixo 2x. Transfira 1 mL da suspensão celular para cada poço da matriz de membrana basal com placa revestida com 2 revestimentos. Mova suavemente a placa em um movimento de figura de oito para distribuir as células uniformemente.
    11. Incubar a placa a 37 °C durante a noite. No dia seguinte (dia 1), aspirar o meio gasto de cada poço da placa de 12 poços. Substitua por 1 mL de meio quente de indução mesodérmica. Incubar a 37 °C durante a noite.
  2. Dias 2-16: indução mesodérmica intermediária
    1. Aspirar o meio de indução mesodérmica gasto. Substitua por 1m L de meio de indução mesodérmica intermediário quente (Tabela Suplementar S1). Aspirar o meio gasto e substituir por 1 mL de meio quente de Indução Intermediária de Mesoderma todos os dias durante 14 dias.

4. Dias 0-15: diferenciação e expansão de iPSCs humanas em células endoteliais vasculares

  1. Dia 0: semeadura de células iPS humanas
    1. Preparar 15 mL de iPS CCM humano com inibidor de ROCK (Tabela Suplementar S1). Manter aquecido a 37 °C.
    2. Incubar uma matriz de membrana basal 1-placa revestida por 1-2 h a 37 °C. Aspirar a matriz da membrana basal 1. Lave 3x com 1 mL de DMEM/F12 morno.
    3. Aspirar o DMEM/F12. Adicione 2 mL de iPS CCM humano com inibidor de ROCK a cada poço da placa de 6 poços. Incubar as placas a 37 °C enquanto as células estão a ser preparadas para a semeadura, conforme descrito abaixo.
    4. Aspirar o meio gasto de cada poço da placa de 6 poços contendo aproximadamente 70% de células iPS humanas confluentes. Lave suavemente as células 3x com 1 mL de DMEM/F12 morno.
    5. Aspirar o DMEM/F12. Adicione 1 mL de tampão de descolamento celular a cada poço da placa de 6 poços de células iPS humanas. Incubar a 37 °C durante 5-7 min para dissociar as células em células únicas.
      NOTA: Devido às diferenças inerentes entre as linhas celulares iPS, o usuário precisará inspecionar visualmente as células após 5 minutos para determinar o tempo de incubação ideal.
    6. Transfira as células para um tubo cônico de 15 mL. Levar a suspensão celular até 14 ml com DMEM/F12 quente para neutralizar o tampão de descolamento. Centrífuga durante 5 min a 200× g à temperatura ambiente.
    7. Aspirar suavemente o sobrenadante. Ressuspender as células em 1 mL de CCM iPS humano com inibidor de ROCK. Conte o número total de células usando um hemocitômetro.
    8. Semeia as células entre 37.000 a 47.000 células/cm2 (355.200 a 451.200 células/poço de uma placa de 6 poços). Incubar a 37 °C durante a noite.
      NOTA: Devido às diferenças inerentes entre as linhas celulares iPS, o usuário precisará determinar a densidade de semeadura ideal.
  2. Dias 1-3: indução do mesoderma lateral
    1. No dia seguinte (dia 1), aspirar o meio gasto de cada poço da placa de 6 poços de células iPS humanas. Substitua cada poço da placa de 6 poços por 5 mL de meio de indução mesodérmica lateral (Tabela Suplementar S1). Ao aumentar a escala do vaso de cultura (por exemplo, frascos), geralmente, substitua por 3x o volume de trabalho no vaso de cultura.
    2. Não altere este meio por 3 dias.
      NOTA: O meio de indução lateral do mesoderma nos poços normalmente mudará de cor de vermelho para amarelo à medida que as células usam os nutrientes. No entanto, o meio turvo ou meio com crescimento bacteriano não é normal e deve ser descontaminado e descartado como tal.
  3. Dias 4-6: indução de células endoteliais
    1. Aspirar o meio gasto de cada poço da placa de 6 poços. Substitua cada poço da placa de 6 poços por 3 mL de meio de Indução Endotelial quente (Tabela Suplementar S1). Incubar a placa a 37 °C durante a noite.
    2. Para os 2 dias seguintes (dias 5 e 6), colete o meio gasto de todos os poços em um tubo cônico de 50 mL. Conservar o tubo cónico a 4 °C. Reabasteça as células com 3 mL de meio de Indução Endotelial quente. Incubar a placa a 37 °C.
  4. Dia 7: classificação das células endoteliais (viEC)
    1. Retire a matriz da membrana basal de 3 frascos e deixe à temperatura ambiente durante 1 h.
    2. Preparar 50 mL de tampão MACS (Tabela Suplementar S1).
    3. Coloque o tampão de descolamento celular, o tampão MACS, o CCM endotelial e o PBS (livre de Ca 2+ e Mg2 +) no gelo no exaustor de cultura de tecidos.
    4. Coloque o ímã no suporte MACS. Coloque dois tubos cônicos de 50 mL e um tubo cônico de 15 mL em um suporte de tubo cônico.
    5. Coloque o suporte MACS (com ímã ligado) e uma coluna LS no exaustor de cultura de tecidos. Configure o suporte do tubo cônico (com tubos cônicos dentro) no suporte MACS, abaixo do ímã (Figura suplementar S1A).
    6. Recolher o meio gasto de cada poço da placa de 6 poços para o tubo cónico de 50 ml a partir do passo 4.3.2. Lave cada poço da placa de 6 poços com PBS (Ca 2+ e Mg2+ livre).
    7. Aspirar o PBS. Adicionar 1 mL de tampão de descolamento celular. Incubar a 37 °C durante 5-7 min para dissociar totalmente as células.
    8. Transfira as células para um tubo cônico de 50 mL. Levar a suspensão celular a 15 ml com CCM endotelial frio. Centrífuga a 200 × g durante 5 min à temperatura ambiente.
    9. Aspirar o sobrenadante. Ressuspeite as células em 1 mL de tampão MACS frio. Conte as células com um hemocitômetro.
    10. Adicione 10 mL de tampão MACS à suspensão celular. Centrifugar durante 5 min a 200 × g à temperatura ambiente.
    11. Aspirar o sobrenadante. Ressuspenda as células em 80 μL de tampão MACS por 10 milhões de células. Adicione 20 μL por 10 milhões de células de Reagente Bloqueador FcR, microesferas CD31 e microesferas CD144. Incubar por 15 min no gelo.
    12. Enquanto a suspensão celular estiver incubando, centrifugar o meio coletado da indução endotelial (etapa 4.3.2) a 200 × g por 10 min.
    13. Recolher o sobrenadante num filtro de vácuo de 500 ml 0,22 μm. Preparar o meio Endotelial Condicionado (Tabela Suplementar S1). Filtrar o meio em condições estéreis e mantê-lo quente a 37 °C.
      NOTA: A taxa de proliferação de células endoteliais começará a diminuir após a passagem 3. Para alcançar o crescimento exponencial após a passagem 3, o meio endotelial condicionado e de manutenção pode ser suplementado com inibidor de TGF-Beta de 10 μM (SB431542) a partir da passagem 1.
    14. Após a incubação de 15 minutos na etapa 4.4.11, adicionar 10 mL de tampão MACS por 10 milhões de células (máximo de 30 mL de tampão MACS) à suspensão celular. Centrífuga a 200 × g durante 5 min.
    15. Aspirar o sobrenadante. Ressuspender em 1 mL de tampão MACS.
    16. Pegue a coluna LS e puxe o êmbolo para fora da seringa. Coloque o êmbolo de volta na manga de plástico. Coloque a coluna sobre o ímã.
    17. Posicione o primeiro tubo cônico de 50 mL sob a coluna. Adicione 1 mL de buffer MACS à coluna. Recolher no tubo cónico de 50 ml por baixo.
    18. Deixe o líquido fluir, embora não completamente para evitar que a coluna seque. Quando as gotas de líquido começarem a escorrer lentamente, adicione a suspensão celular à coluna. Recolher o caudal no mesmo tubo cónico de 50 ml.
    19. Quando as gotas de líquido começarem a escorrer lentamente, posicione o próximo tubo cônico de 50 mL sob a coluna. Adicione o fluxo inicial (etapa 4.4.18) à coluna. Recolher no tubo cónico de 50 ml por baixo.
    20. Quando as gotas de líquido começarem a escorrer lentamente, adicione 500 μL de tampão MACS 3x para lavar a coluna.
    21. Remova a coluna do ímã. Coloque a coluna no tubo cônico de 15 mL. Adicione 1 mL de PBS frio à coluna.
    22. Para coletar as células, pegue o êmbolo da manga de plástico e empurre-o firmemente para dentro da coluna.
    23. Conte as células usando um hemocitômetro. Levar a suspensão celular a 5 ml com PBS. Centrífuga por 5 min a 200 × g.
    24. Enquanto as células estão sendo submetidas à centrifugação, lave o frasco 3-revestido da matriz da membrana basal 3x com 5 mL de PBS para se preparar para a semeadura celular. Aspirar o PBS e adicionar 20 mL de meio condicionado endotelial ao frasco de 3 revestimentos da matriz da membrana basal.
    25. Remova as células da centrífuga e aspirar o sobrenadante. Resuspender as células em meio condicionado endotelial a semear a 26.000 células/cm2 (1,95 × 106 células/frasco T75). Semeie as células.
    26. Para calcular a eficiência de classificação e o rendimento de células, divida a contagem de células da etapa 4.4.23 pela contagem de células da etapa 4.4.9.
  5. Dias 8-15: expansão dos viECs
    1. No dia seguinte (dia 8), aspirar o meio gasto do frasco. Substitua por 10 mL de meio Endotelial Condicionado. Substitua o meio condicionado endotelial em dias alternados até que o balão esteja 90% confluente ou até que o frasco médio condicionado endotelial seja completamente utilizado.
    2. Aspirar o meio gasto e substituir por 10 mL de meio de Manutenção Endotelial (Tabela Suplementar S1) em dias alternados para expansão contínua.
    3. Para a passagem dos viECs, preparar dois frascos T75 de matriz de membrana basal com 3 revestimentos. Deixar os frascos à temperatura ambiente durante 1 h. Lavar bem os frascos acabados de preparar 3x com 5 ml de PBS.
    4. Aspirar o PBS. Adicionar 10 ml de meio quente de Manutenção Endotelial a cada balão acabado de preparar. Incubar as placas a 37 °C enquanto as células estão a ser preparadas para a semeadura, conforme descrito abaixo.
    5. Adicionar 5 ml de tampão de descolamento celular a um balão T75 90% confluente de viECs. Incubar a 37 °C durante 5-7 min. Transfira as células para um tubo cônico de 15 mL. Adicione 5 mL de DMEM/F12 morno. Centrífuga a 200 × g por 5 min.
    6. Aspirar o sobrenadante. Ressuspender em 1 mL de meio de Manutenção Endotelial quente. Adicionar 500 μL da suspensão celular a cada um dos balões T75 preparados na hora.
    7. No dia seguinte, aspirar o meio gasto. Substitua por 10 mL de meio de Manutenção Endotelial. Aspirar o meio gasto e substituir por 10 mL de meio de Manutenção Endotelial em dias alternados até que o balão esteja 90% confluente.

5. Dia 14: preparação de dispositivos de chip de órgão microfluídico para cultura de células

  1. Tratamento a plasma e revestimento de matriz de membrana basal 2
    1. Preparar a solução de matriz de membrana basal 2 (passo 1.3). Deixe-o de lado.
    2. Em um exaustor de cultura de tecidos estéril, desembale a placa de Petri redonda estéril de 100 mm x 15 mm. Coloque a placa de Petri no topo, virada para baixo, sob a parte inferior da placa de Petri (Figura suplementar S1B).
    3. Usando uma pinça, retire os chips microfluídicos da embalagem e coloque-os dentro da placa de Petri. Feche a placa de Petri usando a tampa por baixo do prato.
    4. No monitor de plasma, coloque a tampa da placa de Petri sob o prato, de cima para baixo, mantendo-os juntos como uma unidade. Coloque a unidade de placa de Petri na câmara de asher de plasma. Inicie o asher de plasma com oxigênio a 100 W, 15 SCCM, 30 s.
    5. Sensível ao tempo: Uma vez que o tratamento esteja completo, retire a unidade de placa de Petri do asher de plasma. Limpe rápida e levemente a tampa da placa de Petri com etanol a 70% pulverizado em uma toalha de laboratório. Cubra a placa de Petri com a tampa.
    6. Traga a placa de Petri para o capuz de cultura de tecidos estéreis. Adicione suavemente 25 μL de solução de matriz de membrana basal 2 no canal urinário (superior) do chip. Adicionar 20 μL de solução de matriz de membrana basal 2 no canal capilar (inferior) do chip.
    7. Pegue duas tampas de tubo cônico estéreis de 15 mL e encha-as com água destilada estéril (~500 μL). Coloque a tampa na placa de Petri para evitar que os canais de cavacos e a membrana sequem. Coloque a tampa no prato. Incubar a 37 °C durante a noite.

6. Semeadura de viECs e células mesodérmicas intermediárias nos dispositivos microfluídicos

  1. Dia 15: viECs
    1. Aspirar o meio a partir de frascos de T75 contendo viECs 90% confluentes. Adicionar 5 ml de tampão de descolamento celular e incubar a 37 °C durante 5-7 min.
    2. Transfira as células para um tubo cônico de 15 mL. Adicione 5 mL de DMEM/F12. Centrífuga a 200 × g durante 5 min.
      NOTA: Cada balão T75 com viECs aproximadamente 90% confluentes produzirá ~3 milhões de células.
    3. Aspirar o sobrenadante. Ressuspender as células em 300 μL de meio de Manutenção Endotelial para obter aproximadamente 2 milhões de células/300 μL. Conte as células com um hemocitômetro. Deixe a suspensão da célula de lado.
    4. Transfira a placa de Petri contendo os chips microfluídicos para o capuz de cultura de tecidos. Anexe uma ponta de barreira P200 à ponta de um aspirador.
    5. Lave os canais superior e inferior do chip microfluídico com 200 μL de DMEM/F12 enquanto aspira simultaneamente a periferia da saída.
    6. Segure o chip firmemente com a ponta de barreira P200 presa ao aspirador, longe da saída do canal inferior. Injete firmemente 20 μL da suspensão viEC com aproximadamente 134.000 células no canal capilar (inferior) do chip. Aspirar cuidadosamente o meio da periferia da tomada.
    7. Verifique sob o microscópio se há bolhas ou uma densidade de semeadura viEC desigual.
    8. Vire suavemente o chip para invertê-lo de modo que os viECs possam aderir ao lado basal da membrana PDMS flexível. Coloque o chip no cartucho do suporte. Adicione 3 mL de PBS no cartucho do suporte do chip para evitar que a membrana seque. Incubar o cavaco a 37 °C durante 3 h.
    9. Verifique o canal inferior sob o microscópio para uma camada confluente de viECs ligados à membrana PDMS flexível. Solte 200 μL de meio de Manutenção Endotelial na entrada do canal inferior e permita que ele flua através do canal para lavar o canal de células endoteliais desanexadas enquanto aspira cuidadosamente da periferia da saída do canal capilar (inferior).
    10. Substitua o chip de volta ao cartucho do suporte. Incubar a 37 °C durante a noite.
  2. Dia 16: células mesodérmicas intermediárias (IM)
    1. Lave suavemente o canal capilar (inferior) com 200 μL de meio de Manutenção Endotelial enquanto aspira cuidadosamente a periferia da porta de saída.
    2. Lave o canal urinário (superior) com 200 μL de DMEM/F12 enquanto aspira cuidadosamente a periferia da tomada. Solte ~50 μL de DMEM/F12 nas portas de entrada e saída.
    3. Aspirar o meio de Indução Mesodérmica Intermediária de cada poço da placa de 12 poços.
      NOTA: Cada poço no final da diferenciação dá aproximadamente 1,5 milhões de células IM.
    4. Adicionar 1 ml de tripsina-EDTA a cada alvéolo da placa de 12 poços e incubar a 37 °C durante 5 minutos.
    5. Raspe suavemente as células usando um elevador de células e pipete para cima e para baixo para dissociar as células usando um P1000. Adicione 2 mL de solução de neutralização de tripsina (Tabela Suplementar S1) a cada poço. Transfira as células para um tubo cônico de 50 mL. Levar o volume de suspensão celular para 50 mL com DMEM/F12 e centrifugar a 200 × g por 5 min.
    6. Aspirar o sobrenadante. Resuspender as células em 500 μL de meio de Indução Mesodérmica Intermediária para obter aproximadamente 3 milhões de células/500 μL. Conte as células com um hemocitômetro.
    7. Segure o chip firmemente com a ponta de barreira P200 presa ao aspirador, longe da saída do canal urinário (superior). Injete firmemente 25 μL de suspensão celular com aproximadamente 112.500 células IM no canal urinário (superior) do chip e aspirar cuidadosamente o meio da periferia da saída.
    8. Verifique sob o microscópio se há bolhas ou uma densidade de semeadura de células IM irregular. Adicione 3 mL de PBS no cartucho do suporte do chip. Incubar a 37 °C durante 3 h.
    9. Lave ambos os canais com 200 μL de seu respectivo meio de cultura celular enquanto aspira cuidadosamente a periferia das saídas de cavaco para ajudar a evitar o fluxo para trás do meio gasto e dos detritos celulares.
    10. Fixe as pontas de barreira P200 vazias em ambas as saídas dos canais urinário e capilar. Pipetar 200 μL de meio de Manutenção Endotelial e injetar metade dele na entrada do canal capilar. Solte a ponta da pipeta dentro da entrada de tal forma que tanto a entrada quanto a saída do canal estejam agora presas às pontas da pipeta cheias de meio.
    11. Pipetar 200 μL de meio de manutenção IM e injetar metade na entrada do canal urinário. Solte a ponta da pipeta dentro da entrada de tal forma que tanto a entrada quanto a saída do canal estejam agora presas às pontas da pipeta cheias de meio. Incubar os cavacos com pontas embutidas a 37 °C durante a noite.
  3. Conecte os chips ao Biorreator de Chip de Órgão para aplicar o fluxo de fluido e a tensão mecânica.
    1. Remova as pontas do P200 dos canais urinário e capilar. Adicione gotículas dos respectivos meios à entrada e saída dos canais urinário e capilar para evitar a secagem.
    2. Adicionar 3 mL de meio quente de indução de podócitos (Tabela Suplementar S1) ao reservatório de entrada urinária. Adicionar 3 mL de meio de Manutenção Endotelial quente ao reservatório de entrada capilar.
    3. Adicione 300 μL de meio quente de indução de podócitos ao reservatório de saída do canal urinário diretamente sobre a porta de saída. Adicione 300 μL de meio de Manutenção Endotelial quente ao reservatório de saída do canal capilar diretamente sobre a porta de saída.
    4. Deslize as cápsulas para a bandeja e para o Biorreator de Chip de Órgão.
    5. Use o mostrador rotativo no biorreator do chip de órgão para selecionar e iniciar o ciclo primário (2 min). Inspecione visualmente a parte inferior do pod em busca de pequenas gotículas em todas as quatro portas fluídicas.
    6. Para obter contato fluido-fluido entre a parte inferior do Pod e as portas do chip microfluídico, deslize suavemente o portador do chip para o Pod. Pressione suavemente a aba do portador do chip para dentro e para cima. Aspirar o excesso de meio da superfície do chip.
    7. Defina a vazão do Biorreator Organ Chip para 60 μL/h. Defina a deformação cíclica para 10% a 0,4 Hz. Use o Mostrador Rotativo no Biorreator do Chip de Órgão para selecionar o Ciclo de Regulação e funcionar por 2 h.
    8. Inspecione visualmente os reservatórios de saída para um aumento no nível do meio.
    9. Use o mostrador rotativo no Biorreator de Chip de Órgão para selecionar o ciclo Regular.

7. Dias 17-21 e além: indução de podócitos e manutenção de cavacos

  1. Aspirar o meio dos reservatórios de saída do canal urinário diagonalmente longe do porto, mas manter algum meio no reservatório todos os dias de cultura. Reabasteça o reservatório de entrada do canal urinário com até 3 mL de meio de indução de podócitos a cada 2 dias durante 5 dias.
    1. Após 5 dias, aspirar o meio do canal urinário, mas manter algum meio no reservatório. Reabasteça o reservatório de entrada do canal urinário diariamente com 3 mL de meio de Manutenção de Podocitos.
  2. Aspirar o meio dos reservatórios de saída do canal capilar diagonalmente longe do porto, mas manter algum meio no reservatório todos os dias de cultura. Reabastecer o reservatório de entrada do canal capilar diariamente com até 3 mL de meio de Manutenção Endotelial.

8. Ensaio funcional e imagem de imunofluorescência

NOTA: Consulte o Arquivo Suplementar 1 para obter detalhes sobre a análise de citometria de fluxo, ELISA para efluentes de chip e isolamento de mRNA.

  1. Ensaio funcional (filtração molecular) utilizando inulina e albumina
    1. Aspirar o meio do reservatório de saída do canal capilar diagonalmente longe do porto, mas manter algum meio no reservatório. Substitua por 3 mL de meio de Manutenção Endotelial suplementado com inulina e albumina (Tabela Suplementar S1) por 6 h.
    2. Usando uma pipeta sorológica de 5 mL, meça o volume (em mL) do meio do canal urinário e transfira para um tubo cônico de 15 mL. Envolva o tubo em papel alumínio para proteger da luz e minimizar o fotobranqueamento da inulina e albumina conjugadas com fluoróforos. Reabastecer o reservatório com 3 mL de meio de Manutenção de Podocitos.
    3. Preparar uma solução-mãe de inulina em meio de manutenção de podócitos. A partir de 25 μg/mL de Inulina, prepare oito padrões de inulina através de uma diluição seriada de 2x em meio de Manutenção de Podocitos.
    4. Da mesma forma, prepare uma solução de estoque de albumina em meio de manutenção de podócitos. A partir de 150 μg/mL de albumina, prepare oito padrões de albumina através de uma diluição seriada de 2x em meio de Manutenção de Podocitos.
    5. Pipetar em duplicado 100 μL de cada concentração padrão de inulina em cada poço de uma placa preta de 96 poços (ou 16 poços totais de inulina). Pipetar em duplicata 100 μL de cada concentração padrão de albumina em cada poço da mesma placa de 96 poços (16 poços totais de albumina). Pipeta em meio duplicado de Manutenção de Podócito de 100 μL para servir como o espaço em branco (ou dois poços totais de meio de Manutenção de Podocitos).
    6. Pipetar em duplicata 100 μL de meio efluente do canal urinário para cada poço da mesma placa de 96 poços. Pipeta em duplicata de 100 μL de meio efluente do canal capilar.
    7. Inserir a placa no leitor de placas e medir a fluorescência da albumina à excitação de 550 nm e à emissão de 615 nm. Medir a mesma placa para inulina na excitação 513 nm e emissão 577 nm.
    8. A partir dos dados gerados, a média das medições duplicadas (por chip). Subtraia o valor em branco correspondente a essa leitura da chapa do resto dos dados na folha.
    9. Plotar os valores correspondentes aos padrões de albumina para criar uma curva padrão com concentração [μg/mL] no eixo x e fluorescência no eixo y. Plotar os valores correspondentes aos padrões de inulina para criar uma curva padrão com concentração [μg/mL] no eixo x e fluorescência no eixo y.
    10. Utilizar um pacote de software de análise estatística e interpolação linear para determinar a concentração urinária de inulina e albumina, respectivamente, no meio efluente dos chips.
    11. Determinar a depuração urinária da inulina/albumina dos chips utilizando a equação (1)2:
      Depuração Urinária = ([U] × UV) / [P] (1)
      Onde [U] é a concentração urinária da etapa 8.1.10, UV é o volume de efluente do canal urinário coletado da etapa 8.1.2, e [P] é a concentração capilar de inulina ou albumina (10 μg/mL de inulina ou 100 μg/mL de albumina).
  2. Imagem de imunofluorescência
    1. Injete uma ponta P200 vazia nas portas de saída dos canais urinário e capilar. Para fixar as células, pipete 200 μL de formaldeído a 4% e injete metade dele na entrada do canal inferior. Solte a ponta da pipeta dentro da entrada.
    2. Pipetar 200 μL de formaldeído a 4% e injetar metade dele na entrada do canal urinário. Solte a ponta da pipeta dentro da entrada de tal forma que tanto a entrada quanto a saída do canal estejam agora presas às pontas da pipeta cheias de fixador.
    3. Incubar os cavacos à temperatura ambiente durante 20 min.
    4. Após 20 min, descarte todas as pontas da pipeta. Injete pontas P200 limpas e vazias nas portas de saída dos canais urinário e capilar. Para permeabilizar as células, pipetar 200 μL de Triton X-100/PBS a 0,125% e injetar metade dele na entrada do canal capilar. Solte a ponta da pipeta dentro da entrada.
    5. Pipeta 200 μL de 0,125% Triton X-100/PBS e injete metade dele na entrada do canal urinário. Solte a ponta da pipeta dentro da entrada. Incubar o chip à temperatura ambiente durante 5 min.
    6. Descarte todas as pontas da pipeta. Injete pontas P200 limpas e vazias nas portas de saída dos canais urinário e capilar. Para bloquear as células, pipetar 200 μL de albumina sérica bovina a 1% (BSA) em Triton X-100/PBS a 0,125% e injetar metade dela na entrada do canal capilar. Solte a ponta da pipeta dentro da entrada.
    7. Pipeta 200 μL de 1% BSA em 0,125% Triton X-100/PBS e injetar metade dele na entrada do canal urinário. Solte a ponta da pipeta dentro da entrada. Incubar à temperatura ambiente durante 30 min.
    8. Descarte todas as pontas da pipeta. Lave ambos os canais 3x pipetando 200 μL de 0,125% Triton X-100/PBS em cada canal e incubando à temperatura ambiente por 5 min.
    9. Preparar 100 μL de anticorpos primários por canal com a diluição recomendada pelo fabricante em Triton X-100/PBS a 0,125%. Injete pontas P200 limpas e vazias nas portas de saída dos canais urinário e capilar. Pipetar 100 μL de anticorpo primário e injetar metade nos respectivos canais. Solte a ponta da pipeta dentro da entrada.
    10. Incubar durante 1 h à temperatura ambiente ou, para melhores resultados, durante a noite a 4 °C.
      NOTA: Múltiplos anticorpos primários podem ser aplicados de uma só vez; no entanto, a solução primária de anticorpos deve ser diluída de acordo com as instruções do fabricante.
    11. Lave os canais 3 x 10 minutos conforme descrito na etapa 8.2.8.
    12. Preparar 100 μL de anticorpos secundários por canal com o fator de diluição recomendado pelo fabricante em Triton X-100/PBS a 0,125%. Injete pontas P200 limpas e vazias nas portas de saída dos canais urinário e capilar. Pipetar 100 μL de anticorpo secundário e injetar metade nos respectivos canais. Solte as pontas da pipeta dentro da entrada. Incubar durante 1 h à temperatura ambiente.
      NOTA: Cada anticorpo secundário deve ser aplicado separadamente. Lavar pelo menos 3 x 10 minutos entre cada aplicação, de acordo com a etapa 8.2.8.
    13. Lave os canais 3 x 10 minutos conforme descrito na etapa 8.2.8.
    14. Lave ambos os canais uma vez com 200 μL de água destilada enquanto aspira o fluido residual da periferia das portas de saída do chip.
    15. Injete P200 limpo e vazio nas portas de saída dos canais urinário e capilar. Para contra-manchar as células, pipetar 200 μL de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, diluição 1:1.000 em água destilada) e injetar metade do mesmo na entrada do canal capilar. Solte a ponta da pipeta dentro da entrada e pipete 200 μL de DAPI e injete metade dela na entrada do canal urinário. Solte a ponta da pipeta dentro da entrada e incube à temperatura ambiente por 5 min.
    16. Descarte todas as pontas da pipeta. Injete pontas P200 limpas e vazias nas portas de saída dos canais urinário e capilar. Para contracorar as células, pipetar 200 μL de faloidina (diluição de 1:1.000 em PBS sem Ca 2+ e Mg2+) e injetar metade dela na entrada do canal capilar e liberar a ponta da pipeta dentro da entrada. Pipetar 200 μL de faloidina (diluição de 1:1.000 em PBS sem Ca 2+ e Mg2+) e injetar metade dela na entrada do canal urinário e liberar a ponta da pipeta dentro da entrada. Incubar à temperatura ambiente durante 15 min.
    17. Lave os canais 3x com 200 μL de PBS sem Ca 2+ e Mg2+ e aspirar o excesso de fluido da periferia das portas de saída.
    18. Visualize os chips.

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Representative Results

Aqui mostramos que um modelo funcional 3D in vitro do glomérulo pode ser vascularizado e epitelizado a partir de uma fonte isogênica de células iPS humanas. Especificamente, este protocolo fornece instruções sobre como aplicar a tecnologia de células iPS humanas, particularmente sua capacidade de se diferenciar em tipos de células especializadas, para gerar epitélio glomerular renal (podócitos) e endotélio vascular (viECs) que podem ser integrados com dispositivos microfluídicos para modelar a estrutura e a função do rim humano no nível específico do paciente. Uma visão geral esquemática deste protocolo e linha do tempo (Figura 1A) descreve como cultivar células iPS humanas mitoticamente ativas (Figura 1B) e, em seguida, diferenciá-las (em paralelo) em linhagens celulares mesoderma e mesoderma lateral (Figura 1C,D). As células mesodérmicas resultantes expressaram braquiúria (T), enquanto as células mesodérmicas laterais expressaram braquiúria (T), MIDL e EOMES 2,9,10,11.

A diferenciação subsequente das células mesodérmicas produziu células mesodérmicas intermediárias (IM), enquanto a diferenciação das células mesodérmicas laterais produziu viECs (Figura 1D)2,10,11,17. A análise de citometria de fluxo foi usada para examinar a expressão de CD144 em viECs diferenciadas (antes e após a classificação MAC) em comparação com controles negativos (incluindo células iPS humanas indiferenciadas coradas e não coradas e endotélio não corado). Uma diferenciação endotelial otimizada resultará em 50% ou mais de células CD31/CD144-positivas antes da classificação MAC, o que melhorará significativamente após a classificação celular em comparação com os controles. Resultados representativos mostram eficiência de diferenciação de 59% para CD144 antes da classificação MAC, que aumentou para 77% ou mais células CD144-positivas (não incluindo células CD31-positivas) após a classificação MAC (Figura 1E).

No 14º dia deste protocolo (antes da conclusão da diferenciação IM e expansão viEC), os dispositivos organ-on-a-chip foram preparados para semeadura celular por plasma-tratamento e funcionalização com matriz de membrana basal 2. No dia seguinte (dia 15 do protocolo), os viECs foram semeados no canal capilar (inferior) do dispositivo microfluídico com meio viEC. No dia seguinte à semeadura da viEC (dia 16 do protocolo), as células IM foram semeadas no canal urinário (superior) do dispositivo microfluídico com meio de indução de podócitos. No dia seguinte à semeadura de células IM (dia 17 deste protocolo), a vazão de fluido de 60 μL/h e a deformação de 10% a 0,4 Hz foram aplicadas aos chips de glomérulo. Esses chips experimentam tensão de cisalhamento de 0,017dyn cm−2 e 0,0007dyn cm−2 nos canais capilar e urinário, respectivamente 2,12. Após até 5 dias de indução de podócitos e 6 dias de propagação do endotélio vascular no chip (dia 21 deste protocolo) (Figura 2A), as células resultantes dentro dos chips de glomérulo expressaram marcadores de identificação de linhagem.

Especificamente, os podócitos no canal urinário expressaram podocina e nefrina (Figura 2B, painel superior), e os viECs no canal capilar expressaram PECAM-1 (CD31) e VE-Caderrina (CD144) (Figura 2B, painel inferior). Além disso, as camadas de podócitos e viEC expressaram colágeno IV, a proteína GBM mais abundante (Figura 2B) no glomérulo renal. Mais colágeno IV é expresso no canal urinário porque os podócitos são os produtores predominantes de colágeno IV, incluindo a isoforma α3α4α5, que é a principal isoforma heterotrímera do colágeno no glomérulo maduro. Além disso, os podócitos propagados nos cavacos de glomérulo desenvolveram processos pedonais e secretaram VEGF165, ambos características de modelos funcionais do glomérulo renal 2,12. Este protocolo também fornece uma avaliação da função de filtração molecular seletiva do glomérulo renal usando inulina e albumina, a partir das quais os chips de glomérulo filtram seletivamente pequenas moléculas (inulina) do capilar para o canal urinário, evitando que grandes proteínas (albumina) saiam do canal capilar (Figura 2C)2,10,12.

Como cada linhagem celular iPS humana exibe diferenças inerentes no tempo de duplicação, é importante notar que as densidades ideais de semeadura celular para diferentes linhagens celulares podem variar e, portanto, devem ser otimizadas pelo pesquisador. Para a diferenciação de células endoteliais, se a densidade de semeadura de células iPS humanas for muito baixa, o pesquisador pode observar um menor rendimento de células endoteliais diferenciadas (eficiência de <30%). Se a densidade de semeadura de células iPS humanas for muito alta, o pesquisador pode observar rápido supercrescimento celular, descolamento ou pior adesão, aumento da morte celular e baixo rendimento (eficiência de <30%). Durante a indução endotelial (dias 4-7 de diferenciação), um aumento no número de células resultando em uma camada secundária de células é normal, mas deve ser mantido ao mínimo (Figura 3A). Para a diferenciação de MI e podócitos, a sobressemeadura de células iPS humanas (>100.000 células/poço de uma placa de 12 poços) pode resultar em células IM que crescem em grandes aglomerados ou formam agregados, o que pode impedir a diferenciação e resultar em podócitos com um fenótipo morfológico menos maduro de células agregadas e menos processos secundários e/ou terciáriosdo pé 10, 11.

Durante a cultura de cavacos microfluídicos, o fluxo cruzado inesperado de fluidos entre os canais urinário e capilar (Figura 3B) pode ser observado se houver ruptura ou ligação inadequada dos componentes do chip PDMS, ou se o caminho do fluxo de fluido estiver bloqueado. Esse fluxo cruzado de fluido indesejado também pode resultar de uma barreira de filtração comprometida, como modelos de tecido de semeadura celular inadequada (baixa) ou camadas celulares danificadas. Para evitar esse problema, recomenda-se que o pesquisador siga o protocolo recomendado e as densidades de semeadura celular, bem como inspecione visualmente os chips em busca de bolhas de ar nos canais em todas as etapas do processo. Se forem observadas bolhas de ar nos reservatórios de meios dos chips microfluídicos que estão sob fluxo de fluido, a bomba pode ser parada e o meio desgaseificado em condições estéreis.

Juntos, este protocolo e os resultados representativos descrevem a derivação do endotélio vascular (viECs) e do epitélio glomerular (podócitos) de uma linhagem celular iPS humana isogênica e sua reconstituição em um dispositivo microfluídico organ-on-a-chip para recapitular a estrutura e a função da barreira de filtração glomerular renal de maneira específica do paciente.

Figure 1
Figura 1: Derivação do epitélio glomerular isogênico e do endotélio vascular a partir de células iPS humanas. (A) Linha do tempo esquemática da indução intermediária de mesoderma e viEC, design de órgão em um chip e revestimento da matriz da membrana basal, semeadura celular no chip e indução de podócitos dentro do chip. (B) Imagens representativas de campos brilhantes de células iPS humanas PGP1 antes da dissociação no dia 0 do protocolo. (C) Imagens representativas de campo brilhante de células mesodérmicas PGP1 no dia 2 de diferenciação (esquerda) e células mesodérmicas intermediárias no dia 8 de diferenciação (direita). (D) Imagens representativas de campos brilhantes de células mesodérmicas laterais PGP1 no dia 3 de diferenciação (esquerda) e viECs PGP1 no dia 9 de diferenciação (2 dias de expansão) (direita). Barras de escala = 275 μm (B-D). (E) Quantificação da diferenciação viEC via análise de citometria de fluxo para células CD144-positivas no dia 7 de diferenciação de células endoteliais antes de MACS (azul) e no dia 9 de expansão de células endoteliais após MACS (rosa) em comparação com iPSCs humanas coradas com CD144 (preto) e células endoteliais não coradas (vermelho). Este número foi modificado de12. Abreviaturas: iPSCs = células-tronco pluripotentes induzidas; viEC = células endoteliais vasculares; BMP4/7 = proteína morfogenética óssea 4/7; AR = ácido retinóico; VEGF = fator de crescimento endotelial vascular; MACS = classificação de células ativadas por magnetismo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Imagens representativas do endotélio vascular e do epitélio glomerular (camada de podócitos) cultivados dentro do chip de glomérulo renal microfluídico. Imagens representativas de campo brilhante de viECs (esquerda) e epitélio glomerular (podócitos) (direita) propagadas no chip glomérulo. Barras de escala = 183 μm. (B) Imagens imunofluorescentes representativas do epitélio glomerular (podócitos) e viEC mostrando a expressão de marcadores específicos de linhagem. Barras de escala = 100 μm. (C) Dados representativos mostrando filtração molecular seletiva no chip glomérulo. As barras de erro representam SD. p < 0,0001. Este número foi reproduzido a partir de 12. Abreviaturas: viECs = células endoteliais vasculares; VE-caderina = CD144; PECAM-1 (= CD31) = molécula de adesão das células endoteliais plaquetárias. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Imagens de densidade de semeadura de endotélio subótima e fluxo de fluido irregular nos chips microfluídicos . (A) Imagens representativas de campos brilhantes de culturas de células ótimas (esquerda) e supersemeadas (direita) no dia 6 da diferenciação viEC. Barras de escala = 275 μm. (B) Imagens representativas de reservatórios de saída de cavacos microfluídicos com um fluxo de fluido uniforme e uma barreira funcional (esquerda). Imagem de um chip com fluxo de fluido irregular ou barreira disfuncional (à direita). As setas denotam os níveis de fluido nos reservatórios de saída para os canais capilares e urinários dos chips. Abreviação: viECs = células endoteliais vasculares. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo Suplementar 1: Citometria de fluxo, ELISA para efluente de cavaco e isolamento de mRNA. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar S1: Configurações de material de exaustor de cultura de tecidos. (A) Material do exaustor de cultura de tecidos configurado para MACS, incluindo balde de gelo com meio, ímã em suporte de ímã e tubos cônicos sob o ímã. (B) Configuração do material do exaustor de cultura de tecidos da placa de Petri para lascas, com a parte superior, voltada para baixo, sob a parte inferior da placa de Petri. Abreviação: MACS = classificação de células ativadas por magnetismo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar S1: Mídia e buffers usados neste protocolo. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

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Discussion

Neste relatório, delineamos um protocolo para derivar o endotélio vascular e o epitélio glomerular (podócitos) de uma linhagem celular iPS humana isogênica e o uso dessas células para projetar um sistema de órgão em um chip 3D que imita a estrutura, a interface tecido-tecido e a função de filtração molecular do glomérulo renal. Este chip de glomérulo é equipado com endotélio e epitélio glomerular que, juntos, fornecem uma barreira para filtrar seletivamente as moléculas.

Os pesquisadores interessados em adaptar este protocolo devem fazer as seguintes considerações: primeiro, a otimização pode ser necessária para a semeadura celular, dependendo das características inerentes de crescimento das linhagens de células-tronco que estão sendo usadas. A densidade de semeadura celular pode variar devido a diferenças intrínsecas nas taxas de proliferação de células iPS humanas. Recomenda-se que os pesquisadores comecem com a densidade de semeadura do mesoderma sugerida pelo protocolo e, em seguida, ajustem, se necessário. Da mesma forma, recomenda-se que a diferenciação do mesoderma lateral comece com a densidade de semeadura celular sugerida antes de ajustar conforme necessário para alcançar um rendimento de viEC e eficiência de classificação de 50% ou mais. Se células suficientes não forem diferenciadas após a classificação, o inibidor de TGF-Beta (SB431542) pode ser usado para prevenir a quiescência e ajudar a expandir exponencialmente os viECs (passagem passada 3). No entanto, vários processos celulares ou vias de sinalização são dependentes do TGF-Beta (por exemplo, patogênese de hiperglicemia/diabetes, homeostase imunológica); como tal, recomenda-se que os pesquisadores considerem os efeitos da inibição do TGF-Beta na análise a jusante ou garantam testes adequados para evitar resultados experimentais não intencionais.

Em segundo lugar, é importante observar possíveis variações na qualidade do reagente e nas especificações do fabricante, particularmente para componentes adquiridos de fornecedores diferentes dos especificados pelo protocolo. Assim, recomenda-se que o pesquisador teste reagentes de diferentes números de lotes, fornecedores e vendedores para garantir a reprodutibilidade de experimentos e resultados. Geralmente, o pesquisador deve evitar a exposição excessiva das células iPS humanas a enzimas de dissociação nos tampões de descolamento, pois isso pode levar à diminuição da viabilidade celular e à alteração do perfil molecular das células. Além disso, o meio de indução de podócitos deve ser protegido da luz para evitar a inativação de todo o ácido trans-retinóico. Em terceiro lugar, durante a cultura de células de órgão em um chip, é fundamental evitar bolhas de ar nos canais do dispositivo microfluídico ao perfundir os chips. O aparecimento de bolhas de ar pode ser minimizado ou prevenido inspecionando regularmente os cavacos durante a semeadura celular, mantendo o contato líquido-líquido em cada etapa que envolve perfusão de cavacos e não empurrando ou puxando o ar para os canais fluídicos ao usar pontas de pipeta e / ou aspiração.

Esforços anteriores para projetar chips de glomérulo renal com epitélio e endotélio geneticamente compatíveis dependeram do uso de células derivadas de animais1. Embora essas linhagens celulares derivadas de animais tenham sido tradicionalmente usadas para estudos pré-clínicos, muitas vezes não conseguem recapitular as respostas fisiológicas humanas, o que contribui para a alta taxa de falha (89,5%) dos ensaios clínicos em humanos18. Para ajudar a superar alguns desses problemas, modelos funcionais in vitro que recapitulem mais de perto a biologia humana são desejáveis. Progressos foram feitos para desenvolver modelos multicelulares do rim humano; no entanto, os chips de glomérulo empregaram células humanas de fontes heterogêneas e não isogênicas. Por exemplo, estabelecemos anteriormente um chip de glomérulo reconstituído a partir de podócitos derivados de células iPS humanas e endotélio derivado de tecido primário10. Estudos de outros grupos de pesquisa empregaram uma mistura de células primárias 4,9, células imortalizadas 3 ou células derivadas de líquido amniótico 3,6 que limitam seu uso para o estudo de respostas ou aplicações específicas do paciente em medicina personalizada.

O protocolo aqui descrito supera essas limitações, permitindo a derivação de endotélio vascular (viECs) e epitélio glomerular (podócitos) da mesma linhagem celular humana de iPS e integrando essas células em dispositivos compartimentados de órgão microfluídico em um chip para modelar a estrutura e a função da parede capilar glomerular renal in vitro . Dada a auto-renovação ilimitada das células iPS humanas, combinada com a sua capacidade de se diferenciar em quase qualquer tipo de célula, este protocolo também fornece uma avenida para o fornecimento contínuo de podócitos humanos e viECs para engenharia de tecidos e outras aplicações biomédicas. Esta abordagem para as derivações de podócitos e viECs tem sido reproduzida em múltiplas linhagens celulares de iPS humanas específicas do paciente, incluindo PGP1- e DU11 2,10,12,17,19, permitindo assim o estabelecimento de chips de glomérulo renal personalizados das populações de pacientes desejadas.

A estratégia de diferenciação de podócitos dentro dos chips microfluídicos permite o estudo mecanicista do glomérulo renal humano em desenvolvimento e a modelagem da doença. No entanto, o estudo do glomérulo renal humano em desenvolvimento é limitado pelos viECs que requerem classificação para enriquecer para a população desejada. Este trabalho poderia se beneficiar do estabelecimento de métodos para diferenciação de viECs sem a necessidade de seleção de subpopulações. Este estudo também é limitado pela espessa membrana PDMS que separa as camadas de endotélio vascular e células de podócitos. Trabalhos futuros poderiam integrar novos biomateriais para substituir o PDMS espesso para imitar melhor as propriedades moleculares e biofísicas da membrana basal glomerular. Por exemplo, uma membrana alternativa poderia ser projetada para possuir qualidades biodegradáveis com porosidade ajustável e ser mais fina (mais semelhante a GBM) do que a membrana PDMS de 50 μm de espessura usada neste protocolo.

No entanto, o chip glomérulo produzido por este protocolo pode ser aplicado para estudar os mecanismos de doenças renais debilitantes e servir como uma plataforma para testes de nefrotoxicidade e descoberta de medicamentos. Como as células iPS humanas mantêm o perfil genético do doador e o chip glomérulo é capaz de modelar a doença renal12, novos alvos terapêuticos podem ser descobertos no futuro para beneficiar aqueles que sofrem de formas hereditárias de doença renal. Além disso, as respostas biológicas específicas do paciente a drogas pós-transplante podem ser avaliadas com mais precisão usando um chip renal isogênico, como o descrito neste estudo. Finalmente, este chip de glomérulo está pronto para estudar os efeitos da dinâmica dos fluidos e da tensão mecânica diferencial - como as observadas em pacientes com doença renal com hipertensão ou síndrome cardiorrenal - dada a relativa facilidade de modular as taxas de fluxo de fluidos, alongamento tecidual ou tensão mecânica. É concebível que este protocolo possa avançar a compreensão atual do desenvolvimento renal humano e dos mecanismos de doença, bem como facilitar o desenvolvimento de terapias personalizadas no futuro.

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Disclosures

S.M. é um inventor de uma patente relacionada à diferenciação de podócitos a partir de células iPS humanas. O outro autor não tem nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pela Escola Pratt de Engenharia da Duke University, pela Divisão de Nefrologia do Departamento de Medicina de Duke, por uma Bolsa de Estudos Whitehead em Pesquisa Biomédica e por um Prêmio de Pesquisa Genentech para S. Musah. Y. Roye recebeu a Duke University-Alfred P. Sloan Foundation Scholarship e William M. "Monty" Reichert Graduate Fellowship do Departamento de Engenharia Biomédica da Duke University. A linhagem celular iPS DU11 (Duke University clone #11) foi gerada no Duke iPSC Core Facility e fornecida a nós pelo Bursac Lab da Duke University. Os autores agradecem a N. Abutaleb, J. Holmes, R. Bhattacharya e Y. Zhou pela assistência técnica e discussões úteis. Os autores também gostariam de agradecer aos membros do Musah Lab por comentários úteis sobre o manuscrito. Os autores agradecem ao Laboratório Segura pela doação de um citômetro de fluxo Acuri C6.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
Alexa Fluor 488- and Alexa Fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo/Life Technologies A32744; A32754; A-11076; A32790; A21203; A11015
Collagen IV Thermo/Life Technologies 14-9871-82
Nephrin Progen GP-N2
PECAM-1 R&D Systems AF806
Podocin Abcam ab50339
VE-Cadherin Santa Cruz sc-9989
Basement membrane matrices
Corning Fibronectin, Human Corning 356008 Basement membrane (3)
iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment Iwai North America N8922012 Basement membrane matrix (2)
Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial BD Biosciences 354277 Basement membrane matrix (1); may show lot-to-lot variation
Cells
DU11 human iPS cells The DU11 (Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. The line has been tested and found to be free of mycoplasma (last test in November 2021) and karyotype abnormalities (July 2019)
Culture medium growth factors and media supplements
0.5M EDTA, pH 8.0 Invitrogen 15575020
2-Mercaptoethanol Thermo/Life Technologies 21985023
Albumin from Bovine serum, Texas Red conjugate Thermo/Life Technologies A23017
All-trans retinoic acid (500 mg) Stem Cell Technologies 72262
B27 serum-free supplement Thermo/Life Technologies 17504044
B-27 supplement (50x) without Vitamin A Thermo/Life Technologies 12587010
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A9418
CHIR99021 Stemgent 04-0004 May show lot-to-lot variation
Complete medium kit with CultureBoost-R Cell Systems 4Z0-500-R Podocyte maintenance media
DMEM/F12 Thermo/Life Technologies 12634028
DMEM/F12 with GlutaMAX supplement Thermo/Life Technologies 10565042 DMEM/F12 with glutamine
Forskolin (Adenylyl cyclase activator) Abcam ab120058
GlutaMAX supplement Thermo/Life Technologies 35050061 glutamine supplement
Heat-inactivated FBS Thermo/Life Technologies 10082147
Heparin solution Stem Cell Technologies 7980
Human Activin A Thermo/Life Technologies PHC9544
Human BMP4 Preprotech 120-05ET
Human BMP7 Thermo/Life Technologies PHC9544
Human VEGF Thermo/Life Technologies PHC9394
Inulin-FITC Sigma-Aldrich F3272
mTeSR1 medium Stem Cell Technologies 05850 Human iPS cell culture media (CCM). Add 5x supplement according to the manufacturer. Human iPS CCM can be stored for up to 6 months at -20 °C.
N-2 Supplement (100x) Thermo/Life Technologies 17502048
Neurobasal media Thermo/Life Technologies 21103049 Lateral mesoderm basal media
PBS (Phosphate-buffered saline) Thermo/Life Technologies 14190-250
Penicillin-streptomycin, liquid (100x) Thermo/Life Technologies 15140-163
ROCK inhibitor (Y27632) Tocris 1254
StemPro-34 SFM Thermo/Life Technologies 10639011 Endothelial cell culture medium (CCM). Add supplement according to manufacturer. Endothelial CCM can be stored for up to two weeks at 4 °C or -20 °C for up to 6 months.
TGF-Beta inhibitor (SB431542) Stem Cell Technologies 72234
Enzymes and other reagents
Accutase Thermo/Life Technologies A1110501 Cell detachment buffer
Dimethyl Suloxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2438
Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade VWR 97065-058
Paraformaldehyde (PFA) Thermo/Life Technologies 28906
Sterile distilled water Thermo/Life Technologies 15230162
Triton X-100 VWR 97062-208
Equipment
Trypsin EDTA, 0.05% Thermo/Life Technologies 25300-120
(Orb) Hub module Emulate ORB-HM1
100mm x 15 mm round petri dish Fisherbrand FB087579B
120 x 120 mm square cell culture dish VWR 688161
Accuri C6 BD Biosciences
Aspirating pipettes, individually wrapped Corning 29442-462
Aspirating Unit SP Bel-Art F19917-0150
Avanti J-15R Centrifuge Beckman Coulter B99516
Conical centrifuge tube, 15 mL Corning 352097
Conical centrifuge tube, 50 mL Corning 352098
EVOS M7000 Thermo/Life Technologies AMF7000 Fluorescent microscope to take images of fixed and stained cells.
Hemocytometer VWR 100503-092
Heracell VIOS 160i CO2 incubator Thermo/Life Technologies 51030403
Inverted Zeiss Axio Observer equipeed with AxioCam 503 camera Carl Zeiss Micrscopy 491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera)
Kimberly-Clark nitrile gloves VWR 40101-346
Kimwipes, large VWR 21905-049
Leoca SP8 Upright Confocal Microscope
Media reservoir (POD Portable Module) Emulate POD-1
Microplate shaker VWR 12620-926
Organ-chip Emulate S-1 Chip
Organ-chip holder Emulate AK-CCR
P10 precision barrier pipette tips Denville Scientific P1096-FR
P100 barrier pipette tips Denville Scientific P1125
P1000 barrier pipette tips Denville Scientific P1121
P20 barrier pipette tips Denville Scientific P1122
P200 barrier pipette tips Denville Scientific P1122
Plasma Asher Quorum tech K1050X RF This Plasma Etcher/Asher/Cleaner was used as a part of Duke University's Shared Materials Instrumentation Facility (SMiF).
Round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap Corning 352235
Serological pipette, 10 mL, indivdually wrapped Corning 356551
Serological pipette, 25 mL, indivdually wrapped Corning 356525
Serological pipette, 5 mL, indivdually wrapped Corning 356543
Steriflip, 0.22 µm, PES EMD Millipore SCGP00525
Sterile Microcentrifuge tubes Thomas Scientific 1138W14
T75cm2 cell culture flask with vent cap Corning 430641U
Tissue culture-treated 12 well plates Corning 353043
Tissue culture-treated 6 well plates Corning 353046
Vacuum modulator and perstaltic pump (Zoe Culture Module) Emulate ZOE-CM1 Organ Chip Bioreactor
VE-Cadherin CD144 anti-human antibody - APC conjugated Miltenyi Biotec 130-126-010
Wide-beveled cell lifter Corning 3008
MACS
CD144 MicroBeads, human Miltenyi Biotec 130-097-857
CD31 MicroBead Kit, human Miltenyi Biotec 130-091-935
LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401

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References

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Bioengenharia Edição 189
Chip de glomérulo renal isogênico projetado a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos
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Roye, Y., Musah, S. Isogenic Kidney… More

Roye, Y., Musah, S. Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (189), e63821, doi:10.3791/63821 (2022).

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