Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Isogen njure glomerulus chip konstruerad från humaninducerade pluripotenta stamceller

Published: November 4, 2022 doi: 10.3791/63821
Automatic Translation
1, 1,2,3,4
1Department of Biomedical Engineering, Pratt School of Engineering, Duke University, 2Department of Medicine, Division of Nephrology, Duke University School of Medicine, 3Department of Cell Biology, Duke University, 4Center for Biomolecular and Tissue Engineering, Duke University

Summary

Här presenteras ett protokoll för att konstruera ett personligt organ-på-ett-chip-system som rekapitulerar strukturen och funktionen hos njurglomerulär filtreringsbarriär genom att integrera genetiskt matchade epitel- och vaskulära endotelceller differentierade från humaninducerade pluripotenta stamceller. Detta biotekniska system kan främja njurprecisionsmedicin och relaterade applikationer.

Abstract

Kronisk njursjukdom (CKD) drabbar 15% av den amerikanska vuxna befolkningen, men etableringen av riktade terapier har begränsats av bristen på funktionella modeller som exakt kan förutsäga mänskliga biologiska svar och nefrotoxicitet. Framsteg inom njurprecisionsmedicin kan hjälpa till att övervinna dessa begränsningar. Tidigare etablerade in vitro-modeller av den mänskliga njurglomerulusen - den primära platsen för blodfiltrering och ett viktigt mål för många sjukdomar och läkemedelstoxiciteter - använder emellertid vanligtvis heterogena cellpopulationer med begränsade funktionella egenskaper och oöverträffad genetisk bakgrund. Dessa egenskaper begränsar signifikant deras tillämpning för patientspecifik sjukdomsmodellering och terapeutisk upptäckt.

Detta papper presenterar ett protokoll som integrerar humant inducerat pluripotent stam (iPS) cell-härledd glomerulärt epitel (podocyter) och vaskulärt endotel från en enda patient för att konstruera ett isogent och vaskulariserat mikrofluidiskt njurglomeruluschip. Det resulterande glomeruluschipet består av stamcellsderiverade endotel- och epitelcellskikt som uttrycker härstamningsspecifika markörer, producerar källarmembranproteiner och bildar ett vävnads-vävnadsgränssnitt som liknar njurens glomerulära filtreringsbarriär. Det konstruerade glomeruluschipet filtrerar selektivt molekyler och rekapitulerar läkemedelsinducerad njurskada. Förmågan att rekonstituera strukturen och funktionen hos njurglomerulus med hjälp av isogena celltyper skapar möjlighet att modellera njursjukdom med patientspecificitet och främja nyttan av organ-on-chips för njurprecisionsmedicin och relaterade applikationer.

Introduction

Organ-on-a-chip-enheter är dynamiska 3D-in vitro-modeller som använder molekylär och mekanisk stimulering, såväl som vaskularisering, för att bilda vävnads-vävnadsgränssnitt som modellerar strukturen och funktionen hos specifika organ. Tidigare etablerade organ-on-a-chip-enheter som syftade till att rekapitulera njurens glomerulus (glomeruluschips) bestod av djurcellinjer1 eller mänskliga primära och odödliga cellinjer av heterogena källor 2,3. Användningen av genetiskt heterogena cellkällor uppvisar variationer som avsevärt begränsar studierna av patientspecifika svar och genetik eller sjukdomsmekanismer 4,5. Att ta itu med denna utmaning beror på tillgången på isogena cellinjer från specifika individer med bevarade molekylära och genetiska profiler för att ge en mer exakt mikromiljö för konstruktion av in vitro-modeller 2,3,6. Isogena cellinjer av mänskligt ursprung kan nu enkelt genereras på grund av framsteg inom human iPS-cellodling. Eftersom mänskliga iPS-celler vanligtvis är icke-invasivt anskaffade, kan förnya sig själv på obestämd tid och differentieras till nästan vilken celltyp som helst, fungerar de som en attraktiv källa till celler för etablering av in vitro-modeller, såsom glomerulus-chipet 7,8. Den glomerulära filtreringsbarriären är den primära platsen för blodfiltrering. Blod filtreras först genom vaskulärt endotel, det glomerulära källarmembranet och slutligen genom specialiserade epitel som heter podocyter. Alla tre komponenterna i filtreringsbarriären bidrar till selektiv filtrering av molekyler. Här presenteras ett protokoll för att upprätta en organ-på-ett-chip-enhet som är gränssnitt med vaskulärt endotel och glomerulärt epitel från en enda mänsklig iPS-cellkälla. Även om detta protokoll är särskilt användbart för att konstruera ett isogent och vaskulärt chip för att rekapitulera den glomerulära filtreringsbarriären, ger det också en plan för att utveckla andra typer av personliga organ-på-chips och plattformar med flera organ, såsom ett isogent "kropp-på-ett-chip" -system.

Protokollet som beskrivs häri börjar med divergerande differentiering av humana iPS-celler i två separata linjer - laterala mesoderm- och mesodermceller, som därefter differentieras till vaskulärt endotel respektive glomerulärt epitel. För att generera laterala mesodermceller såddes humana iPS-celler på källarmembranmatris 1-belagda plattor och odlades i 3 dagar (utan medieutbyte) i N2B27-medium kompletterat med Wnt-aktivatorn, CHIR 99021, och den potenta mesoderminduceraren, benmorfogenetisk 4 (BMP4). De resulterande laterala mesodermcellerna kännetecknades tidigare av uttrycket av brachyury (T), mixparad som homeobox (MIXL) och eomesodermin (EOMES)9. Därefter odlades de laterala mesodermcellerna i 4 dagar i ett medium kompletterat med VEGF165 och Forskolin för att inducera vaskulära endotelceller som sorterades ut baserat på VE-Cadherin och / eller PECAM-1-uttryck med hjälp av magnetaktiverad cellsortering (MACS). De resulterande vaskulära endotelcellerna (viEC) expanderades genom att odla dem på källarmembranmatris 3-belagda kolvar tills de var redo att fröas i den mikrofluidiska anordningen.

För att generera mesodermceller såddes humana iPS-celler på källarmembranmatris 2-belagda plattor och odlades i 2 dagar i ett medium innehållande Activin A och CHIR99021. De resulterande mesodermcellerna kännetecknades av uttrycket av HAND1, goosecoid och brachury (T) som beskrivits tidigare 2,10,11. För att inducera mellanliggande mesoderm (IM) celldifferentiering odlades mesodermcellerna i 14 dagar i ett medium kompletterat med BMP-7 och CHIR99021. De resulterande IM-cellerna uttrycker Wilms tumör 1 (WT1), parad boxgen 2 (PAX2) och udda överhoppat relaterat protein 1 (OSR-1)2,10,11.

Ett tvåkanaligt polydimetylsiloxan (PDMS) -baserat mikrofluidiskt chip utformades för att rekapitulera strukturen hos den glomerulära filtreringsbarriären in vitro. Urinkanalen är 1 000 μm x 1 000 μm (b x h) och kapillärkanaldimensionen är 1 000 μm x 200 μm (w x h). Cykliska sträcknings- och avslappningscykler underlättades av de ihåliga kamrarna som finns på varje sida av de fluidiska kanalerna. Cellerna såddes på ett flexibelt PDMS-membran (50 μm tjockt) som separerar urin- och kapillärkanalerna. Membranet är utrustat med sexkantiga porer (7 μm diameter, 40 μm från varandra) för att främja intercellulär signalering (figur 1A)2,12. Två dagar innan IM-induktionen var klar belades de mikrofluidiska chipsen med källarmembranmatris 2. viECs såddes in i kapillärkanalen i det mikrofluidiska chipet med hjälp av endotelunderhållsmedium 1 dag innan IM-induktionen var klar och chipet vändes upp och ner för att möjliggöra celladhesion på basalsidan av det ECM-belagda PDMS-membranet. Samma dag som IM-induktionen slutfördes såddes cellerna in i urinkanalen i det mikrofluidiska chipet med hjälp av ett medium kompletterat med BMP7, Activin A, CHIR99021, VEGF165 och all trans retinsyra för att inducera podocytdifferentiering i chipet. Följande dag fylldes mediebehållarna med Podocyte Induction medium och Endothelial Maintenance medium, och 10% mekanisk belastning vid 0,4 Hz och vätskeflöde (60 μL / h) applicerades på chipsen.

De cellulariserade mikrofluidiska chipsen odlades i ytterligare 5 dagar med användning av Podocyte Induction medium (i urinkanalen) och endotelunderhållsmedium (i kärlkanalen). De resulterande njurglomeruluschipsen odlades i upp till 7 ytterligare dagar i underhållsmedier för både podocyt- och endotelcellerna. De differentierade podocyterna uttryckte positivt härstamningsspecifika proteiner, inklusive podocin och nefrin 13,14, medan viECs positivt uttryckte härstamningsidentifieringsproteinerna PECAM-1 och VE-Cadherin, som alla är väsentliga molekyler för att upprätthålla integriteten hos den glomerulära filtreringsbarriären 15,16 . Podocyterna och viECs visade sig båda utsöndra det vanligaste glomerulära källarmembranproteinet, kollagen IV, vilket också är viktigt för vävnadsmognad och funktion.

Trekomponentsystemet i filtreringsbarriären - endotel, källarmembran och epitel - i glomeruluschipsen befanns selektivt filtrera molekyler och svara på en kemoterapeutisk, nefrotoxisk läkemedelsbehandling. Resultat från läkemedelsbehandlingen indikerade att glomeruluschipet kan användas för nefrotoxicitetsstudier och för sjukdomsmodellering. Detta protokoll ger den allmänna riktlinjen för konstruktion av ett funktionellt mikrofluidiskt njurglomeruluschip från isogena iPS-cellderivat. Nedströmsanalyser av det konstruerade chipet kan utföras enligt forskarens önskemål. För mer information om hur du använder glomeruluschipet för att modellera läkemedelsinducerad glomerulär skada, se tidigare publikationer 2,12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Förbered källarmembranmatrislösningar och belagda substrat

  1. Tina källarmembranmatris 1 över natten på is vid 4 °C. Alikvot enligt tillverkarens förslag till utspädningsgrad. Blanda noggrant en lämplig mängd källarmembranmatris 1 till 25 ml kall DMEM/F12 med ett 50 ml koniskt rör och pipett tills den är helt tinad och upplöst.
    1. För att lösa upp en fryst alikvot, ta ~ 200 μL från 25 ml kall DMEM / F12 och överför den till det frysta alikvotröret. Pipett upp och ner tills matrisen är ordentligt tinad och upplöst. Överför hela rörinnehållet i källarmembranmatris 1 till resten av den kalla DMEM/F12.
  2. Pipettera 1 ml källarmembranmatris 1-lösning i varje brunn på en 6-brunnsplatta. För att använda de belagda plattorna samma dag, inkubera vid 37 °C i 2 timmar.
    1. Alternativt kan de belagda plattorna förpackas med parafilm och förvaras vid 4 °C i upp till 2 veckor. När den förvarade plattan är klar att användas, inkubera vid 37 °C i 30 minuter.
  3. Späd källarmembranmatris 2 i 9 ml sterilt destillerat vatten för att uppnå en slutlig koncentration på 5 μg/ml. Pipettera 700 μL källarmembranmatris 2-lösning i varje brunn i en 12-brunnsplatta. Vik in källarmembranmatrisen 2-belagda plattor med parafilm och förvara vid 4 °C i upp till 2 veckor.
  4. Rekonstituera frystorkad källarmembranmatris 3 för att uppnå en slutlig koncentration av 1 mg / ml i fosfatbuffrad saltlösning (PBS, Ca + 2- och Mg + 2-fri) enligt tillverkarens förslag. Späd en alikvot på 250 μl till en slutlig koncentration på 25 μg/ml i 9,75 ml PBS (Ca+2 och Mg+2 fritt). Använd 6 ml av denna lösning för att belägga en T75-kolv (en slutlig koncentration på 2 μg/cm2). Förvara de matrisbelagda kolvarna vid 4 °C i upp till 1 vecka.

2. Mänsklig iPS-cellodling

OBS: DU11-linjen som används i detta protokoll testades och befanns vara fri från mykoplasma- och karyotypavvikelser.

  1. Inkubera källarmembranmatris 1-belagda plattor vid 37 °C i 1-2 timmar.
  2. Tvätta varje brunn på 6-brunnsplattan 3x med 1 ml varm (37 °C) DMEM/F12. Tillsätt 2 ml humant iPS-cellodlingsmedium (CCM) (kompletterande tabell S1) till varje brunn på 6-brunnsplattan. Inkubera plattorna vid 37 °C medan cellerna förbereds för sådd enligt beskrivningen nedan.
  3. Tvätta varje brunn på 6-brunnsplattan som innehåller humana iPS-celler med 1 ml varm DMEM/F12.
  4. Aspirera DMEM/F12. Tillsätt 1 ml varm cellavskiljningsbuffert till varje brunn på 6-brunnsplattan. Inkubera vid 37 °C i 1 min.
  5. Inspektera varje brunn visuellt under ett mikroskop för dissociation runt cellkolonikanterna. Aspirera försiktigt cellavskiljningsbufferten från cellerna. Tvätta försiktigt varje brunn med 1 ml varm DMEM/F12.
  6. Inspektera plattorna under mikroskopet för att säkerställa att cellerna inte har lossnat helt från plattan eller oavsiktligt sugits upp.
  7. Tillsätt 3 ml varm human iPS CCM till varje brunn på 6-brunnsplattan med celler. Skrapa försiktigt kolonierna med en celllyftare. Använd en 5 ml serologisk pipett och blanda försiktigt cellsuspensionen i varje brunn upp och ner en gång.
  8. Ta ut den nya källarmembranmatrisen 1-belagd platta från inkubatorn. Överför 0,5 ml av cellsuspensionen till varje brunn i den nya källarmembranmatrisen 1-belagd platta. Flytta plattan i en figur-av-åtta-rörelse för att fördela cellerna jämnt. Inkubera vid 37 °C i en 5%CO2-inkubator .
  9. Aspirera det förbrukade mediet och ersätt med 3 ml humant iPS CCM varje odlingsdag tills cellerna är 70% sammanflytande (cirka 4 dagar efter passage).

3. Dagar 0-16: differentiering av humana iPSC till mellanliggande mesodermceller

  1. Dag 0-2: mesoderm induktion
    1. Flytta källarmembranmatris 2-belagda plattor från 4 °C till rumstemperatur i 2 timmar för att balansera efter förvaring.
    2. Aspirera det förbrukade mediet från varje brunn i 6-brunnsplattan som innehåller cirka 70% sammanflytande humana iPS-celler. Tvätta försiktigt cellerna 3x med 1 ml varm DMEM/F12.
    3. Aspirera DMEM/F12. Tillsätt 1 ml cellavskiljningsbuffert till varje brunn i 6-brunnsplattan med humana iPS-celler. Inkubera vid 37 °C i 5–7 minuter.
    4. Inspektera varje brunn visuellt under ett mikroskop för dissociation runt cellkolonikanterna. Skrapa försiktigt kolonierna med en celllyftare.
    5. Överför cellsuspensionerna från alla brunnar i 6-brunnsplattan till ett 15 ml koniskt rör och använd en P1000 för att pipettera upp och ner flera gånger för att erhålla en encellssuspension av iPS-cellerna.
    6. Fyll cellsuspensionen i det koniska röret till 14 ml med DMEM/F12. Centrifugera i 5 minuter vid 200 × g vid rumstemperatur.
    7. Aspirera supernatanten. Återsuspendera cellpelleten i 14 ml varm DMEM/F12. Upprepa centrifugeringen i 5 minuter vid 200 × g vid rumstemperatur.
    8. Aspirera supernatanten. Återsuspendera cellerna i 1 ml mesoderminduktionsmedium (kompletterande tabell S1). Räkna cellerna med en hemocytometer. Späd i Mesoderm Induction medium för att uppnå en slutlig koncentration av 1 × 105 celler/ml.
    9. Aspirera beläggningen från källarmembranmatrisen 2-belagd platta. Skölj varje brunn i källarmembranmatrisen 2-belagd platta 2x med 1 ml varm DMEM / F12.
    10. Pipettera försiktigt cellupphängningen upp och ner 2x. Överför 1 ml av cellsuspensionen till varje brunn i källarmembranmatrisen 2-belagd platta. Flytta försiktigt plattan i en figur-av-åtta-rörelse för att fördela cellerna jämnt.
    11. Inkubera plattan vid 37 °C över natten. Nästa dag (dag 1), aspirera det förbrukade mediet från varje brunn på 12-brunnsplattan. Byt ut med 1 ml varmt Mesoderm Induction medium. Inkubera vid 37 °C över natten.
  2. Dag 2-16: intermediär mesoderminduktion
    1. Aspirera det förbrukade Mesoderm Induction-mediet. Ersätt med 1m L varmt mellanliggande mesoderminduktionsmedium (kompletterande tabell S1). Aspirera det förbrukade mediet och ersätt med 1 ml varmt Intermediate Mesoderm Induction medium varje dag i 14 dagar.

4. Dagar 0-15: differentiering och expansion av humana iPSC till vaskulära endotelceller

  1. Dag 0: human iPS-cellsådd
    1. Förbered 15 ml humant iPS CCM med ROCK-hämmare (kompletterande tabell S1). Förvaras varmt vid 37 °C.
    2. Inkubera en källarmembranmatris 1-belagd platta i 1-2 timmar vid 37 °C. Aspirera källarmembranmatrisen 1. Tvätta 3x med 1 ml varm DMEM/F12.
    3. Aspirera DMEM/F12. Tillsätt 2 ml human iPS CCM med ROCK-hämmare till varje brunn på 6-brunnsplattan. Inkubera plattorna vid 37 °C medan cellerna förbereds för sådd enligt beskrivningen nedan.
    4. Aspirera det förbrukade mediet från varje brunn i 6-brunnsplattan som innehåller cirka 70% sammanflytande humana iPS-celler. Tvätta försiktigt cellerna 3x med 1 ml varm DMEM/F12.
    5. Aspirera DMEM/F12. Tillsätt 1 ml cellavskiljningsbuffert till varje brunn i 6-brunnsplattan med humana iPS-celler. Inkubera vid 37 °C i 5–7 minuter för att dissociera cellerna till enstaka celler.
      OBS: På grund av inneboende skillnader mellan iPS-cellinjer måste användaren visuellt inspektera cellerna efter 5 minuter för att bestämma den optimala inkubationstiden.
    6. Överför cellerna till ett 15 ml koniskt rör. Bring cellsuspensionen upp till 14 ml med varm DMEM/F12 för att neutralisera lossningsbufferten. Centrifugera i 5 min vid 200× g vid rumstemperatur.
    7. Aspirera försiktigt supernatanten. Återsuspendera cellerna i 1 ml humant iPS CCM med ROCK-hämmare. Räkna det totala antalet celler som använder en hemocytometer.
    8. Frö cellerna mellan 37 000 och 47 000 celler/cm2 (355 200 till 451 200 celler/brunn på en 6-brunnsplatta). Inkubera vid 37 °C över natten.
      På grund av inneboende skillnader mellan iPS-cellinjer måste användaren bestämma den optimala sådddensiteten.
  2. Dag 1-3: lateral mesoderminduktion
    1. Nästa dag (dag 1) aspirerar du det förbrukade mediet från varje brunn i 6-brunnsplattan av mänskliga iPS-celler. Byt ut varje brunn på 6-brunnsplattan med 5 ml lateralt mesoderminduktionsmedium (kompletterande tabell S1). När du skalar upp odlingskärlet (t.ex. kolvar), ersätt i allmänhet med 3x arbetsvolymen i odlingskärlet.
    2. Byt inte detta medium i 3 dagar.
      OBS: Lateral Mesoderm Induction Medium i brunnarna kommer normalt att ändra färg från rött till gult när cellerna använder upp näringsämnena. Grumligt medium eller medium med bakterietillväxt är dock inte normalt och bör dekontamineras och kasseras som sådant.
  3. Dag 4-6: endotelcellsinduktion
    1. Aspirera det förbrukade mediet från varje brunn på 6-brunnsplattan. Byt ut varje brunn på 6-brunnsplattan med 3 ml varmt endotelinduktionsmedium (tilläggstabell S1). Inkubera plattan vid 37 °C över natten.
    2. Under de följande 2 dagarna (dag 5 och 6), samla det förbrukade mediet från alla brunnar i ett 50 ml koniskt rör. Förvara det koniska röret vid 4 °C. Fyll på cellerna med 3 ml varmt endotelinduktionsmedium. Inkubera plattan vid 37 °C.
  4. Dag 7: sortering av endotelceller (viEC)
    1. Ta ut källarmembranmatris 3 kolvar och låt stå vid rumstemperatur i 1 h.
    2. Förbered 50 ml MACS-buffert (kompletterande tabell S1).
    3. Placera cellavskiljningsbuffert, MACS-buffert, endotel-CCM och PBS (Ca 2+ och Mg2+ gratis) på is i vävnadsodlingshuven.
    4. Placera magneten på MACS-stativet. Placera två 50 ml koniska rör och ett 15 ml koniskt rör i en konisk rörhållare.
    5. Placera MACS-stativet (med magneten fäst) och en LS-kolonn i vävnadsodlingshuven. Ställ in den koniska rörhållaren (med koniska rör inuti) på MACS-stativet, under magneten (kompletterande figur S1A).
    6. Samla upp det förbrukade mediet från varje brunn på 6-brunnsplattan i det 50 ml koniska röret från steg 4.3.2. Tvätta varje brunn på 6-brunnsplattan med PBS (Ca 2+ och Mg2+ gratis).
    7. Aspirera PBS. Tillsätt 1 ml cellavskiljningsbuffert. Inkubera vid 37 °C i 5–7 minuter för att helt dissociera cellerna.
    8. Överför cellerna till ett 50 ml koniskt rör. Bringa cellsuspensionen till 15 ml med kall endotel CCM. Centrifugera vid 200 × g i 5 min vid rumstemperatur.
    9. Aspirera supernatanten. Återsuspendera cellerna i 1 ml kall MACS-buffert. Räkna cellerna med en hemocytometer.
    10. Lägg till 10 ml MACS-buffert i cellsuspensionen. Centrifugera i 5 min vid 200 × g vid rumstemperatur.
    11. Aspirera supernatanten. Återsuspendera cellerna i 80 μl MACS-buffert per 10 miljoner celler. Tillsätt 20 μL per 10 miljoner celler av FcR-blockerande reagens, CD31-mikrober och CD144-mikrober. Inkubera i 15 min på is.
    12. Medan cellsuspensionen ruvar, centrifugera mediet som samlats upp från endotelinduktion (steg 4.3.2) vid 200 × g i 10 minuter.
    13. Samla supernatanten i ett 500 ml 0,22 μm vakuumfilter. Förbered endotelkonditionerat medium (kompletterande tabell S1). Filtrera mediet under sterila förhållanden och håll mediet varmt vid 37 °C.
      OBS: Endotelcellsproliferationshastigheten börjar minska efter passage 3. För att uppnå exponentiell tillväxt efter passage 3 kan endotelkonditionerat och underhållsmedium kompletteras med 10 μM TGF-Beta-hämmare (SB431542) från och med passage 1.
    14. Efter inkubationen på 15 minuter i steg 4.4.11, tillsätt 10 ml MACS-buffert per 10 miljoner celler (högst 30 ml MACS-buffert) till cellsuspensionen. Centrifugera vid 200 × g i 5 min.
    15. Aspirera supernatanten. Stäng av igen i 1 ml MACS-buffert.
    16. Ta LS-kolonnen och dra ut kolven ur sprutan. Placera kolven tillbaka i plasthylsan. Placera kolonnen på magneten.
    17. Placera det första 50 ml koniska röret under kolonnen. Lägg till 1 ml MACS-buffert i kolumnen. Samla i 50 ml koniskt rör under.
    18. Låt vätskan strömma igenom, men inte helt för att förhindra att kolonnen torkar. När vätskedropparna börjar sippra långsamt, lägg till cellsuspensionen i kolonnen. Samla genomströmningen i samma 50 ml koniska rör.
    19. När vätskedropparna börjar sippra långsamt, placera nästa 50 ml koniska rör under kolonnen. Lägg till den första genomströmningen (steg 4.4.18) i kolumnen. Samla i 50 ml koniskt rör under.
    20. När vätskedropparna börjar sippra långsamt, tillsätt 500 μL MACS-buffert 3x för att tvätta kolonnen.
    21. Ta bort kolonnen från magneten. Placera kolonnen på det koniska röret på 15 ml. Lägg till 1 ml kall PBS i kolumnen.
    22. För att samla cellerna, ta kolven från plasthylsan och tryck den ordentligt i kolonnen.
    23. Räkna cellerna med en hemocytometer. Bringa cellsuspensionen till 5 ml med PBS. Centrifugera i 5 min vid 200 × g.
    24. Medan cellerna genomgår centrifugering, tvätta källarmembranmatrisen 3-belagd kolv 3x med 5 ml PBS för att förbereda för cellsådd. Aspirera PBS och tillsätt 20 ml endotelkonditionerat medium till källarmembranmatrisen 3-belagd kolv.
    25. Ta bort cellerna från centrifugen och aspirera supernatanten. Återsuspendera cellerna i endotelkonditionerat medium för sådd med 26 000 celler/cm2 (1,95 × 106 celler/T75-kolv). Frö cellerna.
    26. För att beräkna sorteringseffektiviteten och cellutbytet, dela cellantalet från steg 4.4.23 med cellantalet från steg 4.4.9.
  5. Dag 8-15: utbyggnad av viECs
    1. Nästa dag (dag 8), aspirera det förbrukade mediet från kolven. Ersätt med 10 ml endotelkonditionerat medium. Byt ut det endotelkonditionerade mediet varannan dag tills kolven är 90% sammanflytande eller tills Endothelial Conditioned mediumflaskan är helt använd.
    2. Aspirera det förbrukade mediet och ersätt med 10 ml endotelunderhållsmedium (kompletterande tabell S1) varannan dag för fortsatt expansion.
    3. För att passera viECs, förbered två källarmembranmatris 3-belagda T75-kolvar. Låt kolvarna stå i rumstemperatur i 1 h. Tvätta noggrant de nyberedda kolvarna 3x med 5 ml PBS.
    4. Aspirera PBS. Tillsätt 10 ml varmt endotelunderhållsmedium till varje nyberedd kolv. Inkubera plattorna vid 37 °C medan cellerna förbereds för sådd enligt beskrivningen nedan.
    5. Tillsätt 5 ml cellavskiljningsbuffert till en 90 % sammanflytande T75-kolv med viECs. Inkubera vid 37 °C i 5–7 minuter. Överför cellerna till ett 15 ml koniskt rör. Tillsätt 5 ml varm DMEM/F12. Centrifugera vid 200 × g i 5 min.
    6. Aspirera supernatanten. Återsuspendera i 1 ml varmt endotelunderhållsmedium. Tillsätt 500 μl av cellsuspensionen till var och en av de nyberedda T75-kolvarna.
    7. Nästa dag, aspirera det förbrukade mediet. Byt ut med 10 ml endotelunderhållsmedium. Aspirera det förbrukade mediet och ersätt med 10 ml endotelunderhållsmedium varannan dag tills kolven är 90% sammanflytande.

5. Dag 14: beredning av mikrofluidiska organchipanordningar för cellodling

  1. Plasmabehandling och källarmembranmatris 2-beläggning
    1. Förbered källarmembranmatris 2-lösning (steg 1.3). Lägg den åt sidan.
    2. I en steril vävnadsodlingshuv, packa upp den sterila 100 mm x 15 mm runda petriskålen. Placera petriskålens ovansida, vänd nedåt, under petriskålens botten (kompletterande figur S1B).
    3. Ta ut mikrofluidiska chips från förpackningen med pincett och placera dem i petriskålen. Stäng petriskålen med locket under skålen.
    4. Vid plasmaasher, placera petriskålens lock under skålen, överst nedåt och håll dem ihop som en enhet. Placera petriskålenheten i plasmaasherkammaren. Starta plasmaasher med syre vid 100 W, 15 SCCM, 30 s.
    5. Tidskänslig: När behandlingen är klar, ta ut petriskålenheten från plasmaasher. Torka snabbt och lätt av petriskålslocket med 70% etanol sprayad på en laboratorieservett. Täck petriskålen med locket.
    6. Ta med petriskålen till den sterila vävnadsodlingshuven. Tillsätt försiktigt 25 μL källarmembranmatris 2-lösning i chipets urinkanal (översta). Tillsätt 20 μL källarmembranmatris 2-lösning i chipets kapillärkanal (botten).
    7. Ta två sterila 15 ml koniska rörlock och fyll dem med sterilt destillerat vatten (~ 500 μL). Placera locket i petriskålen för att förhindra att spånkanalerna och membranet torkar ut. Placera locket på skålen. Inkubera vid 37 °C över natten.

6. Sådd av viECs och mellanliggande mesodermceller i mikrofluidiska anordningar

  1. Dag 15: viECs
    1. Aspirera mediet från T75-kolvar som innehåller 90% konfluenta viEC. Tillsätt 5 ml cellavskiljningsbuffert och inkubera vid 37 °C i 5–7 minuter.
    2. Överför cellerna till ett 15 ml koniskt rör. Tillsätt 5 ml DMEM/F12. Centrifugera vid 200 × g i 5 min.
      OBS: Varje T75-kolv med cirka 90% sammanflytande viECs ger ~ 3 miljoner celler.
    3. Aspirera supernatanten. Återsuspendera cellerna i 300 μL endotelunderhållsmedium för att erhålla cirka 2 miljoner celler / 300 μl. Räkna cellerna med en hemocytometer. Ställ cellsuspensionen åt sidan.
    4. Överför petriskålen som innehåller de mikrofluidiska chipsen till vävnadsodlingshuven. Fäst en P200 barriärspets på spetsen av en aspirator.
    5. Spola både de övre och nedre kanalerna i det mikrofluidiska chipet med 200 μL DMEM / F12 samtidigt som du suger i utloppets periferi.
    6. Håll chipet ordentligt med P200-barriärspetsen fäst vid aspiratorn, bort från utloppet på bottenkanalen. Injicera 20 μL av viEC-suspensionen ordentligt med cirka 134 000 celler i chipets kapillärkanal (nedre). Försiktigt aspirera medium från utloppets periferi.
    7. Kontrollera under mikroskopet för bubblor eller en ojämn viEC-sådddensitet.
    8. Vänd försiktigt chipet för att invertera det så att viECs kan fästa vid basalsidan av det flexibla PDMS-membranet. Placera chipet i hållarpatronen. Tillsätt 3 ml PBS i spånhållarpatronen för att förhindra att membranet torkar. Inkubera chipet vid 37 °C i 3 timmar.
    9. Kontrollera bottenkanalen under mikroskopet för ett sammanflytande lager av viECs fästa vid det flexibla PDMS-membranet. Släpp 200 μL endotelunderhållsmedium på inloppet till bottenkanalen och låt det strömma genom kanalen för att tvätta kanalen av obundna endotelceller medan du försiktigt suger från periferin av kapillärkanalens (botten) kanalutlopp.
    10. Byt tillbaka chipet i hållarpatronen. Inkubera vid 37 °C över natten.
  2. Dag 16: mellanliggande mesodermceller (IM)
    1. Spola försiktigt kapillärkanalen (botten) med 200 μL endotelunderhållsmedium medan du försiktigt suger i utloppsportens periferi.
    2. Spola urinkanalen (överst) med 200 μL DMEM/F12 medan du försiktigt suger ut utloppets periferi. Släpp ~ 50 μL DMEM / F12 på inlopps- och utloppsportarna.
    3. Aspirera det mellanliggande mesoderminduktionsmediet från varje brunn på 12-brunnsplattan.
      OBS: Varje brunn i slutet av differentieringen ger cirka 1,5 miljoner IM-celler.
    4. Tillsätt 1 ml trypsin-EDTA till varje brunn på 12-brunnsplattan och inkubera vid 37 °C i 5 minuter.
    5. Skrapa försiktigt cellerna med en celllyftare och pipettera upp och ner för att dissociera cellerna med hjälp av en P1000. Tillsätt 2 ml trypsinneutraliseringslösning (kompletterande tabell S1) till varje brunn. Överför cellerna till ett 50 ml koniskt rör. Bringa cellsuspensionsvolymen till 50 ml med DMEM/F12 och centrifugera vid 200 × g i 5 minuter.
    6. Aspirera supernatanten. Återsuspendera cellerna i 500 μL intermediärt mesoderminduktionsmedium för att erhålla cirka 3 miljoner celler/500 μl. Räkna cellerna med en hemocytometer.
    7. Håll chipet ordentligt med P200-barriärspetsen fäst vid aspiratorn, bort från urinkanalens utlopp. Injicera 25 μL cellsuspension med cirka 112 500 IM-celler ordentligt i chipets urinkanal (översta) och aspirera försiktigt mediet från utloppets periferi.
    8. Kontrollera under mikroskopet för bubblor eller en ojämn im-cellsåddstäthet. Tillsätt 3 ml PBS i spånhållarpatronen. Inkubera vid 37 °C i 3 timmar.
    9. Spola båda kanalerna med 200 μL av deras respektive cellodlingsmedium medan du försiktigt aspirerar periferin på chiputloppen för att förhindra bakåtflöde av det förbrukade mediet och cellskräp.
    10. Fäst tomma P200-barriärspetsar i båda utloppen i urin- och kapillärkanalerna. Pipettera 200 μL endotelunderhållsmedium och injicera hälften av det i kapillärkanalinloppet. Släpp pipettspetsen inuti inloppet så att både kanalens inlopp och utlopp nu är fästa vid pipettspetsar fyllda med medium.
    11. Pipettera över 200 μl underhållsmedium för snabbmeddelanden och injicera hälften i urinvägsinloppet. Släpp pipettspetsen inuti inloppet så att både kanalens inlopp och utlopp nu är fästa vid pipettspetsar fyllda med medium. Inkubera chipsen med spetsar inbäddade vid 37 °C över natten.
  3. Anslut chips till Organ Chip Bioreactor för att applicera vätskeflöde och mekanisk belastning.
    1. Ta bort P200-spetsar från urin- och kapillärkanalerna. Tillsätt droppar av respektive media till inloppet och utloppet av urin- och kapillärkanalerna för att förhindra torkning.
    2. Tillsätt 3 ml varmt Podocytinduktionsmedium (kompletterande tabell S1) till urininloppsbehållaren. Tillsätt 3 ml varmt endotelunderhållsmedium till kapillärinloppsbehållaren.
    3. Tillsätt 300 μl varmt Podocytinduktionsmedium till urinkanalens utloppsbehållare direkt över utloppsporten. Tillsätt 300 μl varmt endotelunderhållsmedium till kapillärkanalens utloppsbehållare direkt över utloppsporten.
    4. Skjut baljorna på brickan och in i organchipbioreaktorn.
    5. Använd vridratten på organchipbioreaktorn för att välja och starta Prime Cycle (2 min). Inspektera podens undersida visuellt för små droppar vid alla fyra fluidiska portarna.
    6. För att uppnå vätske-vätskekontakt mellan Pod-undersidan och mikrofluidiska chipportar, skjut försiktigt in chipbäraren i podden. Tryck försiktigt in och upp chipbärarfliken. Aspirera överflödigt medium från chipytan.
    7. Ställ in organchipbioreaktorns flödeshastighet på 60 μl / h. Ställ in den cykliska stammen på 10% vid 0,4 Hz. Använd vridratten på organchipbioreaktorn för att välja regleringscykeln och kör i 2 timmar.
    8. Visuellt inspektera utloppsbehållarna för en ökning av medienivån.
    9. Använd vridratten på organchipbioreaktorn för att välja regleringscykeln.

7. Dag 17-21 och därefter: podocytinduktion och chipunderhåll

  1. Aspirera mediet från urinkanalens utloppsreservoarer diagonalt bort från hamnen men håll något medium i behållaren varje kulturdag. Fyll på urinkanalens inloppsbehållare med upp till 3 ml Podocyte Induction medium var 2: e dag i 5 dagar.
    1. Efter 5 dagar, aspirera mediet från urinkanalen men håll lite medium i behållaren. Fyll på urinkanalens inloppsbehållare dagligen med 3 ml Podocyte Maintenance medium.
  2. Aspirera mediet från kapillärkanalens utloppsreservoarer diagonalt bort från hamnen men håll lite medium i behållaren varje kulturdag. Fyll på kapillärkanalens inloppsbehållare dagligen med upp till 3 ml endotelunderhållsmedium.

8. Funktionell analys och immunofluorescensavbildning

OBS: Se kompletterande fil 1 för detaljer om flödescytometrianalys, ELISA för chipavlopp och mRNA-isolering.

  1. Funktionell analys (molekylär filtrering) med användning av inulin och albumin
    1. Aspirera mediet från kapillärkanalens utloppsreservoar diagonalt bort från hamnen men håll lite medium i behållaren. Ersätt med 3 ml endotelunderhållsmedium kompletterat med inulin och albumin (kompletterande tabell S1) i 6 timmar.
    2. Använd en 5 ml serologisk pipett och mät volymen (i ml) medium från urinkanalen och överför till ett 15 ml koniskt rör. Vik in röret i aluminiumfolie för att skydda mot ljus och minimera fotoblekning av fluoroforkonjugerat inulin och albumin. Fyll på behållaren med 3 ml Podocyte Maintenance medium.
    3. Förbered en stamlösning av inulin i Podocyte Maintenance medium. Från 25 μg / ml Inulin, förbered åtta standarder av inulin via en 2x seriell utspädning i Podocyte Maintenance medium.
    4. På samma sätt bereder du en stamlösning av albumin i Podocyte Maintenance-mediet. Från och med 150 μg / ml albumin, förbered åtta standarder albumin via en 2x seriell utspädning i Podocyte Maintenance-medium.
    5. Pipettera i två exemplar 100 μL av varje standardinulinkoncentration i varje brunn på en svart 96-brunnsplatta (eller totalt 16 brunnar inulin). Pipettera i två exemplar 100 μL av varje standardalbuminkoncentration i varje brunn av samma 96-brunnsplatta (totalt 16 brunnar albumin). Pipett i duplikat 100 μL Podocytunderhållsmedium för att fungera som blankett (eller två totala brunnar i Podocyte Maintenance medium).
    6. Pipettera i två exemplar 100 μL avloppsmedium från urinkanalen till varje brunn på samma 96-brunnsplatta. Pipett i duplikat 100 μL avloppsmedium från kapillärkanalen.
    7. Sätt i plattan i plattläsaren och mät fluorescensen för albumin vid excitation 550 nm och emission 615 nm. Mät samma platta för inulin vid excitation 513 nm och emission 577 nm.
    8. Från de genererade data, genomsnitt de dubbla mätningarna (per chip). Subtrahera det tomma värdet som motsvarar den plåtavläsningen från resten av data på arket.
    9. Plotta de värden som motsvarar albuminstandarderna för att skapa en standardkurva med koncentration [μg/ml] på x-axeln och fluorescens på y-axeln. Plotta de värden som motsvarar inulinstandarderna för att skapa en standardkurva med koncentration [μg/ml] på x-axeln och fluorescens på y-axeln.
    10. Använd ett programpaket för statistisk analys och linjär interpolering för att bestämma urinkoncentrationen av inulin respektive albumin i avloppsmediet från chipsen.
    11. Bestäm urinclearance av inulin/albumin från chipsen med hjälp av ekvation (1)2:
      Urinclearance = ([U] × UV) / [P] (1)
      Där [U] är urinkoncentrationen från steg 8.1.10 är UV volymen av uppsamlat urinkanalutflöde från steg 8.1.2 och [P] är kapillärkoncentrationen av inulin eller albumin (10 μg / ml inulin eller 100 μg / ml albumin).
  2. Immunofluorescensavbildning
    1. Injicera en tom P200-spets i utloppsportarna i urin- och kapillärkanalerna. För att fixera cellerna, pipettera 200 μL 4% formaldehyd och injicera hälften av det i bottenkanalinloppet. Släpp pipettspetsen inuti inloppet.
    2. Pipettera 200 μl 4% formaldehyd och injicera hälften av det i urinvägsinloppet. Släpp pipettspetsen inuti inloppet så att både kanalens inlopp och utlopp nu är fästa vid pipettspetsar fyllda med fixeringsmedel.
    3. Inkubera chipsen vid rumstemperatur i 20 minuter.
    4. Efter 20 min, kassera alla pipettspetsar. Injicera rena, tomma P200-spetsar i utloppsportarna i urin- och kapillärkanalerna. För att permeabilisera cellerna, pipettera 200 μL av 0,125% Triton X-100 / PBS och injicera hälften av det i kapillärkanalinloppet. Släpp pipettspetsen inuti inloppet.
    5. Pipettera 200 μl 0,125% Triton X-100/PBS och injicera hälften av det i urinvägsinloppet. Släpp pipettspetsen inuti inloppet. Inkubera chipet vid rumstemperatur i 5 minuter.
    6. Kassera alla pipettspetsar. Injicera rena, tomma P200-spetsar i utloppsportarna i urin- och kapillärkanalerna. För att blockera cellerna, pipettera 200 μL 1% bovint serumalbumin (BSA) i 0,125% Triton X-100 / PBS och injicera hälften av det i kapillärkanalinloppet. Släpp pipettspetsen inuti inloppet.
    7. Pipettera 200 μl 1% BSA i 0,125% Triton X-100/PBS och injicera hälften av det i urinvägsinloppet. Släpp pipettspetsen inuti inloppet. Inkubera vid rumstemperatur i 30 min.
    8. Kassera alla pipettspetsar. Tvätta båda kanalerna 3x genom att pipettera 200 μL 0,125% Triton X-100/PBS i varje kanal och inkubera vid rumstemperatur i 5 min.
    9. Förbered 100 μl primär antikropp per kanal med den utspädning som rekommenderas av tillverkaren i 0,125% Triton X-100/PBS. Injicera rena, tomma P200-spetsar i utloppsportarna i urin- och kapillärkanalerna. Pipettera över 100 μl primär antikropp och injicera hälften i respektive kanal. Släpp pipettspetsen inuti inloppet.
    10. Inkubera i 1 timme vid rumstemperatur eller, för bättre resultat, över natten vid 4 °C.
      OBS: Flera primära antikroppar kan appliceras samtidigt; Den primära antikroppslösningen måste dock spädas enligt tillverkarens instruktioner.
    11. Tvätta kanalerna 3 x 10 min enligt beskrivningen i steg 8.2.8.
    12. Förbered 100 μl sekundär antikropp per kanal med den utspädningsfaktor som rekommenderas av tillverkaren i 0,125% Triton X-100/PBS. Injicera rena, tomma P200-spetsar i utloppsportarna i urin- och kapillärkanalerna. Pipettera över 100 μl sekundär antikropp och injicera hälften i respektive kanal. Släpp pipettspetsarna inuti inloppet. Inkubera i 1 h vid rumstemperatur.
      OBS: Varje sekundär antikropp måste appliceras separat. Tvätta minst 3 x 10 min mellan varje applicering enligt steg 8.2.8.
    13. Tvätta kanalerna 3 x 10 min enligt beskrivningen i steg 8.2.8.
    14. Spola båda kanalerna en gång med 200 μL destillerat vatten medan du suger restvätskan från periferin av chiputloppsportarna.
    15. Injicera ren, tom P200 i utloppsportarna i urin- och kapillärkanalerna. För att motverka cellerna, pipettera 200 μl 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, 1:1 000 utspädning i destillerat vatten) och injicera hälften av det i kapillärkanalinloppet. Släpp pipettspetsen inuti inloppet och pipettera 200 μL DAPI och injicera hälften av den i urinvägsinloppet. Släpp pipettspetsen inuti inloppet och inkubera vid rumstemperatur i 5 minuter.
    16. Kassera alla pipettspetsar. Injicera rena, tomma P200-spetsar i utloppsportarna i urin- och kapillärkanalerna. För att motverka cellerna, pipettera 200 μL falloidin (1:1 000 utspädning i PBS utan Ca 2+ och Mg2+) och injicera hälften av det i kapillärkanalens inlopp och släpp pipettspetsen inuti inloppet. Pipettera över 200 μl falloidin (1:1 000 spädning i PBS utan Ca 2+ och Mg2+) och injicera hälften av det i urinvägsinloppet och släpp pipettspetsen inuti inloppet. Inkubera vid rumstemperatur i 15 min.
    17. Spola kanalerna 3x med 200 μL PBS utan Ca 2+ och Mg2+ och sug överskottsvätska från utloppsportarnas periferi.
    18. Visualisera chipsen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Här visar vi att en funktionell 3D in vitro-modell av glomerulus kan vaskulariseras och epiteliseras från en isogen källa till humana iPS-celler. Specifikt ger detta protokoll instruktioner om hur man tillämpar mänsklig iPS-cellteknik, särskilt deras förmåga att differentiera till specialiserade celltyper, för att generera njurglomerulärt epitel (podocyter) och vaskulärt endotel (viECs) som kan integreras med mikrofluidiska enheter för att modellera strukturen och funktionen hos den mänskliga njuren på patientspecifik nivå. En schematisk översikt över detta protokoll och tidslinje (figur 1A) beskriver hur man odlar mitotiskt aktiva humana iPS-celler (figur 1B) och sedan differentierar dem (parallellt) i mesoderm- och laterala mesodermcellinjer (figur 1C, D). De resulterande mesodermcellerna visade sig uttrycka brachyury (T), medan de laterala mesodermcellerna uttryckte brachyury (T), MIXL och EOMES 2,9,10,11.

Efterföljande differentiering av mesodermcellerna producerade mellanliggande mesodermceller (IM), medan differentiering av laterala mesodermceller producerade viECs (Figur 1D)2,10,11,17. Flödescytometrianalys användes för att undersöka uttrycket av CD144 i differentierade viECs (före och efter MAC-sortering) jämfört med negativa kontroller (inklusive färgade och ofärgade odifferentierade humana iPS-celler och ofärgat endotel). En optimerad endoteldifferentiering kommer att resultera i 50% eller större CD31 / CD144-positiva celler före MAC-sortering, vilket kommer att förbättras avsevärt efter cellsortering jämfört med kontroller. Representativa resultat visar 59% differentieringseffektivitet för CD144 före MAC-sortering, vilket ökade till 77% eller mer CD144-positiva celler (exklusive CD31-positiva celler) efter MAC-sortering (figur 1E).

På dag 14 i detta protokoll (före slutförandet av IM-differentiering och viEC-expansion) förbereddes organ-på-ett-chip-enheterna för cellsådd genom plasmabehandling och funktionalisering med källarmembranmatris 2. Följande dag (dag 15 i protokollet) såddes viECs in i kapillärkanalen (botten) i mikrofluidikanordningen med viEC-medium. Dagen efter viEC-sådd (dag 16 i protokollet) såddes IM-celler in i urinkanalen (överst) i den mikrofluidiska enheten med podocytinduktionsmedium. Dagen efter IM-cellsådd (dag 17 i detta protokoll) applicerades 60 μL / h vätskeflödeshastighet och 10% töjning vid 0,4 Hz på glomeruluschipsen. Dessa chips upplever skjuvspänning på 0,017dyn cm−2 och 0,0007dyn cm−2 i kapillär- respektiveurinvägarna 2,12. Efter upp till 5 dagars podocytinduktion och 6 dagars vaskulär endotelutbredning i chipet (dag 21 i detta protokoll) (figur 2A) uttryckte de resulterande cellerna i glomeruluschipsen härstamningsidentifieringsmarkörer.

Specifikt uttryckte podocyterna i urinkanalen podocin och nefrin (figur 2B, övre panelen) och viECs i kapillärkanalen PECAM-1 (CD31) och VE-Cadherin (CD144) (figur 2B, nedre panelen). Dessutom uttryckte både podocyt- och viEC-skikten kollagen IV, det vanligaste GBM-proteinet (figur 2B) i njurglomerulus. Mer kollagen IV uttrycks i urinkanalen eftersom podocyter är de dominerande producenterna av kollagen IV, inklusive isoformen α3α4α5, som är den huvudsakliga heterotrimerisoformen av kollagen i den mogna glomerulusen. Dessutom utvecklade podocyterna som förökades i glomeruluschipsen fotprocesser och utsöndrade VEGF165, som båda är karakteristiska egenskaper hos funktionella modeller av njurglomerulus 2,12. Detta protokoll ger också en bedömning av den selektiva molekylära filtreringsfunktionen hos njurglomerulus med användning av inulin och albumin, från vilket glomeruluschipsen selektivt filtrerar små molekyler (inulin) från kapillären till urinkanalen, samtidigt som stora proteiner (albumin) förhindras från att lämna kapillärkanalen (figur 2C)2,10,12.

Eftersom varje mänsklig iPS-cellinje uppvisar inneboende skillnader i fördubblingstiden är det viktigt att notera att optimala cellsåddstätheter för olika cellinjer kan variera och därför måste optimeras av forskaren. För endotelcellsdifferentiering, om sådddensiteten hos humana iPS-celler är för låg, kan forskaren observera ett lägre utbyte av differentierade endotelceller (<30% effektivitet). Om sådddensiteten hos humana iPS-celler är för hög kan forskaren observera snabb cellöverväxt, lossning eller sämre vidhäftning, ökad celldöd och lågt utbyte (<30% effektivitet). Under endotelinduktion (dag 4-7 av differentiering) är en ökning av cellantalet som resulterar i ett sekundärt skikt av celler normalt men bör hållas till ett minimum (figur 3A). För im- och podocytdifferentiering kan övervakning av humana iPS-celler (>100 000 celler/brunn i en 12-brunnsplatta) resultera i im-celler som växer i stora kluster eller bildar aggregat, vilket kan hindra differentiering och resultera i podocyter med en mindre mogen morfologisk fenotyp av aggregerade celler och mindre sekundära och/eller tertiära fotprocesser10. 11.

Under mikrofluidisk spånkultur kan oväntat vätskekorsflöde mellan urin- och kapillärkanalerna (figur 3B) observeras om det finns brusten eller otillräcklig bindning av PDMS-chipkomponenterna, eller om vätskeflödesvägen blockeras. Detta oönskade vätskekorsflöde kan också bero på en komprometterad filtreringsbarriär, såsom vävnadsmodeller från otillräcklig (låg) cellsådd eller skadade cellskikt. För att förhindra detta problem rekommenderas att forskaren följer det rekommenderade protokollet och cellsådddensiteterna, samt visuellt inspekterar chipsen för luftbubblor i kanalerna i varje steg i processen. Om luftbubblor observeras i mediebehållarna i de mikrofluidiska chipsen som är under vätskeflöde, kan pumpen stoppas och mediet avgasas under sterila förhållanden.

Tillsammans beskriver detta protokoll och representativa resultat härledningen av vaskulärt endotel (viEC) och glomerulärt epitel (podocyter) från en isogen human iPS-cellinje och deras rekonstitution i en mikrofluidisk organ-på-ett-chip-enhet för att rekapitulera strukturen och funktionen hos njurglomerulär filtreringsbarriär på ett patientspecifikt sätt.

Figure 1
Figur 1: Härledning av isogent glomerulärt epitel och vaskulärt endotel från humana iPS-celler. (A) Schematisk tidslinje för mellanliggande mesoderm- och viEC-induktion, organ-på-en-chip-design och källarmembranmatrisbeläggning, cellsådd i chipet och podocytinduktion i chipet. (B) Representativa ljusfältsbilder av PGP1 humana iPS-celler före dissociation vid dag 0 i protokollet. (C) Representativa ljusfältsbilder av PGP1-mesodermceller på dag 2 av differentiering (vänster) och mellanliggande mesodermceller på dag 8 av differentiering (höger). (D) Representativa ljusfältsbilder av PGP1 laterala mesodermceller på dag 3 av differentiering (vänster) och PGP1 viECs på dag 9 av differentiering (2 dagars expansion) (höger). Skalstänger = 275 μm (B-D). (E) Kvantifiering av viEC-differentiering via flödescytometrianalys för CD144-positiva celler på dag 7 av endotelcellsdifferentiering före MACS (blå) och på dag 9 av endotelcellsutvidgning efter MACS (rosa) jämfört med CD144-färgade humana iPSC (svarta) och ofärgade endotelceller (röda). Denna siffra har modifierats från12. Förkortningar: iPSCs = inducerade pluripotenta stamceller; viEC = vaskulära endotelceller; BMP4/7 = benmorfogenetiskt protein 4/7; RA = retinsyra; VEGF = vaskulär endoteltillväxtfaktor; MACS = magnetaktiverad cellsortering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Representativa bilder av vaskulärt endotel och glomerulärt epitel (podocytskikt) odlat i det mikrofluidiska njurglomeruluschipet. Representativa ljusfältbilder av viECs (vänster) och glomerulärt epitel (podocyter) (höger) förökade i glomeruluschipet. Skalstänger = 183 μm. (B) Representativa immunofluorescerande bilder av glomerulärt epitel (podocyter) och viEC som visar uttrycket av härstamningsspecifika markörer. Skalstänger = 100 μm. (C) Representativa data som visar selektiv molekylär filtrering i glomeruluschipet. Felstaplar representerar SD. p < 0,0001. Denna siffra har återgetts från 12. Förkortningar: viECs = vaskulära endotelceller; VE-cadherin = CD144; PECAM-1 (= CD31) = trombocytendotelcellsadhesionsmolekyl. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Bilder av suboptimal endotelsåddstäthet och ojämnt vätskeflöde i mikrofluidiska chips. (A) Representativa ljusfältsbilder av optimala (vänster) och övervakade (högra) cellkulturer på dag 6 av viEC-differentiering. Skalstänger = 275 μm. (B) Representativa bilder av utloppsreservoarer från mikrofluidiska chips med ett jämnt vätskeflöde och en funktionell barriär (vänster). Bild från ett chip med ojämnt vätskeflöde eller dysfunktionell barriär (höger). Pilar betecknar vätskenivåer i utloppsreservoarer för flisens kapillär- och urinkanaler. Förkortning: viECs = vaskulära endotelceller. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande fil 1: Flödescytometri, ELISA för chipavlopp och mRNA-isolering. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur S1: Inställningar för huvmaterial i vävnadsodling. (A) Odlingsmaterial i vävnadskulturen som ställts in för MACS, inklusive ishink med media, magnet på magnetstativ och koniska rör under magneten. (B) Inställning av petriskål för chips i vävnadsodlingshuven, med toppen, nedåt, under petriskålens botten. Förkortning: MACS = magnetaktiverad cellsortering. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande tabell S1: Media och buffertar som används i detta protokoll. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denna rapport beskriver vi ett protokoll för att härleda vaskulärt endotel och glomerulärt epitel (podocyter) från en isogen human iPS-cellinje och användningen av dessa celler för att konstruera ett 3D-organ-på-ett-chip-system som efterliknar strukturen, vävnadsgränssnittet och molekylär filtreringsfunktion hos njurglomerulus. Detta glomeruluschip är utrustat med endotel och glomerulärt epitel som tillsammans ger en barriär för selektivt filtrerande molekyler.

Forskare som är intresserade av att anpassa detta protokoll bör göra följande överväganden: För det första kan optimering vara nödvändig för cellsådd beroende på de inneboende tillväxtegenskaperna hos stamcellslinjerna som används. Cellsåddstätheten kan variera på grund av inneboende skillnader i mänskliga iPS-cellproliferationshastigheter. Det rekommenderas att forskare börjar med mesodermsåddstätheten som föreslås av protokollet och sedan justerar vid behov. På samma sätt rekommenderas att den laterala mesodermdifferentieringen börjar med den föreslagna cellsåddstätheten innan den justeras efter behov för att uppnå ett viEC-utbyte och sorteringseffektivitet på 50% eller mer. Om tillräckligt många celler inte differentieras efter sortering kan TGF-Beta-hämmare (SB431542) användas för att förhindra quiescence och hjälpa exponentiellt att expandera viECs (tidigare passage 3). Emellertid, flera cellulära processer eller signalvägar är beroende av TGF-Beta (t.ex. patogenes av hyperglykemi / diabetes, immun homeostas); som sådan, Det rekommenderas att forskare överväga effekterna av TGF-Beta-hämning på nedströms analys eller säkerställa adekvat testning för att undvika oavsiktliga experimentella resultat.

För det andra är det viktigt att notera eventuella variationer i reagenskvalitet och tillverkarens specifikationer, särskilt för komponenter som förvärvats från andra leverantörer än de som anges i protokollet. Således rekommenderas att forskaren testar reagenser från olika partinummer, leverantörer och leverantörer för att säkerställa reproducerbarhet av experiment och resultat. I allmänhet bör forskaren undvika överdriven exponering av de humana iPS-cellerna för dissociationsenzymer i lossningsbuffertarna eftersom detta kan leda till minskad cellviabilitet och förändrad molekylär profil hos cellerna. Dessutom måste podocytinduktionsmediet skyddas mot ljus för att förhindra inaktivering av all transretinsyra . För det tredje, under organ-on-a-chip-cellodling, är det viktigt att undvika luftbubblor i kanalerna i den mikrofluidiska anordningen när man perfuserar chipsen. Uppkomsten av luftbubblor kan minimeras eller förhindras genom att regelbundet inspektera flisen under cellsådd, genom att upprätthålla vätske-vätskekontakt vid varje steg som involverar spånperfusion och genom att inte trycka eller dra luft in i fluidkanalerna när man använder pipettspetsar och / eller aspiration.

Tidigare ansträngningar för att konstruera njurglomeruluschips med genetiskt matchat epitel och endotel har förlitat sig på användningen av djur-härledda celler1. Även om dessa animaliska cellinjer traditionellt har använts för prekliniska studier, misslyckas de ofta med att rekapitulera humana fysiologiska svar, vilket bidrar till den höga felfrekvensen (89.5%) av kliniska prövningar på människa18. För att hjälpa till att övervinna några av dessa problem är funktionella in vitro-modeller som närmare rekapitulerar mänsklig biologi önskvärda. Framsteg har gjorts för att utveckla flercelliga modeller av den mänskliga njuren; Glomeruluschipsen använde emellertid mänskliga celler från heterogena, icke-isogena källor. Till exempel etablerade vi tidigare ett glomeruluschip rekonstituerat från humana iPS-cell-härledda podocyter och primärvävnadsderiverat endotel10. Studier från andra forskargrupper använde en blandning av primära celler4,9, förevigade celler 3 eller fostervatten-härledda celler 3,6 som begränsar deras användning för att studera patientspecifika svar eller applikationer inom personlig medicin.

Protokollet som beskrivs häri övervinner dessa begränsningar genom att möjliggöra härledning av både vaskulärt endotel (viEC) och glomerulärt epitel (podocyter) från samma humana iPS-cellinje och integrera dessa celler i uppdelade mikrofluidiska organ-on-a-chip-enheter för att modellera strukturen och funktionen hos njurglomerulär kapillärvägg in vitro . Med tanke på den obegränsade självförnyelsen av mänskliga iPS-celler, i kombination med deras förmåga att differentiera sig till nästan vilken celltyp som helst, ger detta protokoll också en väg för kontinuerlig inköp av mänskliga podocyter och viECs för vävnadsteknik och andra biomedicinska applikationer. Detta tillvägagångssätt för härledningar av podocyter och viECs har reproducerats i flera patientspecifika humana iPS-cellinjer, inklusive PGP1- och DU11 2,10,12,17,19, vilket möjliggör etablering av personliga njurglomeruluschips från de önskade patientpopulationerna.

Strategin för att differentiera podocyter inom mikrofluidiska chips möjliggör mekanistisk studie av den utvecklande mänskliga njurglomerulus och sjukdomsmodellering. Studien av den utvecklande mänskliga njurglomerulus begränsas dock av viECs som kräver sortering för att berika för den önskade befolkningen. Detta arbete skulle kunna dra nytta av inrättandet av metoder för differentiering av viECs utan behov av val av delpopulation. Denna studie begränsas också av det tjocka PDMS-membranet som separerar de vaskulära endotel- och podocytcellskikten. Framtida arbete kan integrera nya biomaterial för att ersätta det tjocka PDMS för att bättre efterlikna de molekylära och biofysiska egenskaperna hos det glomerulära källarmembranet. Till exempel kan ett alternativt membran konstrueras för att ha biologiskt nedbrytbara egenskaper med avstämbar porositet och vara tunnare (mer GBM-liknande) än det 50 μm tjocka PDMS-membranet som används i detta protokoll.

Ändå kan glomeruluschipet som produceras av detta protokoll tillämpas för att studera mekanismerna för försvagande njursjukdomar och fungera som en plattform för nefrotoxicitetstestning och läkemedelsupptäckt. Eftersom mänskliga iPS-celler upprätthåller givarens genetiska profil och glomeruluschipet kan modellera njursjukdom12, kan nya terapeutiska mål upptäckas i framtiden för att gynna dem som lider av ärftliga former av njursjukdom. Dessutom kan patientspecifika biologiska svar på läkemedel efter transplantation utvärderas mer exakt med hjälp av ett isogent njurchip som det som beskrivs i denna studie. Slutligen är detta glomeruluschip redo att studera effekterna av vätskedynamik och differentiell mekanisk stam - såsom de som observerats hos njursjukdomspatienter med högt blodtryck eller hjärt-njursyndrom - med tanke på den relativa lättheten att modulera vätskeflödeshastigheterna, vävnadssträckningen eller mekanisk belastning. Det är tänkbart att detta protokoll kan främja den nuvarande förståelsen av mänsklig njurutveckling och sjukdomsmekanismer, samt underlätta utvecklingen av personliga terapier i framtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

S.M. är uppfinnare på ett patent relaterat till podocytdifferentiering från humana iPS-celler. Den andra författaren har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Pratt school of Engineering vid Duke University, avdelningen för nefrologi vid Duke Department of Medicine, ett Whitehead-stipendium i biomedicinsk forskning och ett Genentech Research Award för S. Musah. Y. Roye är mottagare av Duke University-Alfred P. Sloan Foundation Scholarship och William M. "Monty" Reichert Graduate Fellowship från Duke University's Department of Biomedical Engineering. DU11 (Duke University klon #11) iPS-cellinjen genererades vid Duke iPSC Core Facility och tillhandahölls oss av Bursac Lab vid Duke University. Författarna tackar N. Abutaleb, J. Holmes, R. Bhattacharya och Y. Zhou för tekniskt bistånd och hjälpsamma diskussioner. Författarna vill också tacka medlemmarna i Musah Lab för hjälpsamma kommentarer om manuskriptet. Författarna tackar Segura Lab för gåvan av en Acuri C6 flödescytometer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
Alexa Fluor 488- and Alexa Fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo/Life Technologies A32744; A32754; A-11076; A32790; A21203; A11015
Collagen IV Thermo/Life Technologies 14-9871-82
Nephrin Progen GP-N2
PECAM-1 R&D Systems AF806
Podocin Abcam ab50339
VE-Cadherin Santa Cruz sc-9989
Basement membrane matrices
Corning Fibronectin, Human Corning 356008 Basement membrane (3)
iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment Iwai North America N8922012 Basement membrane matrix (2)
Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial BD Biosciences 354277 Basement membrane matrix (1); may show lot-to-lot variation
Cells
DU11 human iPS cells The DU11 (Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. The line has been tested and found to be free of mycoplasma (last test in November 2021) and karyotype abnormalities (July 2019)
Culture medium growth factors and media supplements
0.5M EDTA, pH 8.0 Invitrogen 15575020
2-Mercaptoethanol Thermo/Life Technologies 21985023
Albumin from Bovine serum, Texas Red conjugate Thermo/Life Technologies A23017
All-trans retinoic acid (500 mg) Stem Cell Technologies 72262
B27 serum-free supplement Thermo/Life Technologies 17504044
B-27 supplement (50x) without Vitamin A Thermo/Life Technologies 12587010
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A9418
CHIR99021 Stemgent 04-0004 May show lot-to-lot variation
Complete medium kit with CultureBoost-R Cell Systems 4Z0-500-R Podocyte maintenance media
DMEM/F12 Thermo/Life Technologies 12634028
DMEM/F12 with GlutaMAX supplement Thermo/Life Technologies 10565042 DMEM/F12 with glutamine
Forskolin (Adenylyl cyclase activator) Abcam ab120058
GlutaMAX supplement Thermo/Life Technologies 35050061 glutamine supplement
Heat-inactivated FBS Thermo/Life Technologies 10082147
Heparin solution Stem Cell Technologies 7980
Human Activin A Thermo/Life Technologies PHC9544
Human BMP4 Preprotech 120-05ET
Human BMP7 Thermo/Life Technologies PHC9544
Human VEGF Thermo/Life Technologies PHC9394
Inulin-FITC Sigma-Aldrich F3272
mTeSR1 medium Stem Cell Technologies 05850 Human iPS cell culture media (CCM). Add 5x supplement according to the manufacturer. Human iPS CCM can be stored for up to 6 months at -20 °C.
N-2 Supplement (100x) Thermo/Life Technologies 17502048
Neurobasal media Thermo/Life Technologies 21103049 Lateral mesoderm basal media
PBS (Phosphate-buffered saline) Thermo/Life Technologies 14190-250
Penicillin-streptomycin, liquid (100x) Thermo/Life Technologies 15140-163
ROCK inhibitor (Y27632) Tocris 1254
StemPro-34 SFM Thermo/Life Technologies 10639011 Endothelial cell culture medium (CCM). Add supplement according to manufacturer. Endothelial CCM can be stored for up to two weeks at 4 °C or -20 °C for up to 6 months.
TGF-Beta inhibitor (SB431542) Stem Cell Technologies 72234
Enzymes and other reagents
Accutase Thermo/Life Technologies A1110501 Cell detachment buffer
Dimethyl Suloxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2438
Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade VWR 97065-058
Paraformaldehyde (PFA) Thermo/Life Technologies 28906
Sterile distilled water Thermo/Life Technologies 15230162
Triton X-100 VWR 97062-208
Equipment
Trypsin EDTA, 0.05% Thermo/Life Technologies 25300-120
(Orb) Hub module Emulate ORB-HM1
100mm x 15 mm round petri dish Fisherbrand FB087579B
120 x 120 mm square cell culture dish VWR 688161
Accuri C6 BD Biosciences
Aspirating pipettes, individually wrapped Corning 29442-462
Aspirating Unit SP Bel-Art F19917-0150
Avanti J-15R Centrifuge Beckman Coulter B99516
Conical centrifuge tube, 15 mL Corning 352097
Conical centrifuge tube, 50 mL Corning 352098
EVOS M7000 Thermo/Life Technologies AMF7000 Fluorescent microscope to take images of fixed and stained cells.
Hemocytometer VWR 100503-092
Heracell VIOS 160i CO2 incubator Thermo/Life Technologies 51030403
Inverted Zeiss Axio Observer equipeed with AxioCam 503 camera Carl Zeiss Micrscopy 491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera)
Kimberly-Clark nitrile gloves VWR 40101-346
Kimwipes, large VWR 21905-049
Leoca SP8 Upright Confocal Microscope
Media reservoir (POD Portable Module) Emulate POD-1
Microplate shaker VWR 12620-926
Organ-chip Emulate S-1 Chip
Organ-chip holder Emulate AK-CCR
P10 precision barrier pipette tips Denville Scientific P1096-FR
P100 barrier pipette tips Denville Scientific P1125
P1000 barrier pipette tips Denville Scientific P1121
P20 barrier pipette tips Denville Scientific P1122
P200 barrier pipette tips Denville Scientific P1122
Plasma Asher Quorum tech K1050X RF This Plasma Etcher/Asher/Cleaner was used as a part of Duke University's Shared Materials Instrumentation Facility (SMiF).
Round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap Corning 352235
Serological pipette, 10 mL, indivdually wrapped Corning 356551
Serological pipette, 25 mL, indivdually wrapped Corning 356525
Serological pipette, 5 mL, indivdually wrapped Corning 356543
Steriflip, 0.22 µm, PES EMD Millipore SCGP00525
Sterile Microcentrifuge tubes Thomas Scientific 1138W14
T75cm2 cell culture flask with vent cap Corning 430641U
Tissue culture-treated 12 well plates Corning 353043
Tissue culture-treated 6 well plates Corning 353046
Vacuum modulator and perstaltic pump (Zoe Culture Module) Emulate ZOE-CM1 Organ Chip Bioreactor
VE-Cadherin CD144 anti-human antibody - APC conjugated Miltenyi Biotec 130-126-010
Wide-beveled cell lifter Corning 3008
MACS
CD144 MicroBeads, human Miltenyi Biotec 130-097-857
CD31 MicroBead Kit, human Miltenyi Biotec 130-091-935
LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, L., et al. A disease model of diabetic nephropathy in a glomerulus-on-a-chip microdevice. Lab on a Chip. 17 (10), 1749-1760 (2017).
  2. Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (5), 1-12 (2017).
  3. Petrosyan, A., et al. A glomerulus-on-a-chip to recapitulate the human glomerular filtration barrier. Nature Communications. 10 (1), 3656 (2019).
  4. Hass, R., Kasper, C., Böhm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Communication and Signaling. 9, 12 (2011).
  5. Altschuler, S. J., Wu, L. F. Cellular heterogeneity: when do differences make a difference. Cell. 141 (4), 559-563 (2010).
  6. Da Sacco, S., et al. A novel source of cultured podocytes. PloS One. 8 (12), 81812 (2013).
  7. Singh, V. K., Kalsan, M., Kumar, N., Saini, A., Chandra, R. Induced pluripotent stem cells: applications in regenerative medicine, disease modeling, and drug discovery. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 2 (2015).
  8. Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of cardiovascular pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  9. Patsch, C., et al. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).
  10. Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13 (7), 1662-1685 (2018).
  11. Burt, M., Bhattachaya, R., Okafor, A. E., Musah, S. Guided differentiation of mature kidney podocytes from human induced pluripotent stem cells under chemically defined conditions. Journal of Visualized Experiments. (161), e61299 (2020).
  12. Roye, Y. A personalized glomerulus chip engineered from stem cell-derived epithelium and vascular endothelium. Micromachines. 12 (8), 967 (2021).
  13. Roselli, S., et al. Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area. The American Journal of Pathology. 160 (1), 131-139 (2002).
  14. Ruotsalainen, V., et al. Nephrin is specifically located at the slit diaphragm of glomerular podocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 7962-7967 (1999).
  15. Privratsky, J. R., Newman, P. J. PECAM-1: regulator of endothelial junctional integrity. Cell and Tissue Research. 355 (3), 607-619 (2014).
  16. Menon, M. C., Chuang, P. Y., He, C. J. The glomerular filtration barrier: components and crosstalk. International Journal of Nephrology. 2012, 749010 (2012).
  17. Abutaleb, N. O., Truskey, G. A. Differentiation and characterization of human iPSC-derived vascular endothelial cells under physiological shear stress. STAR Protocols. 2 (2), 100394 (2021).
  18. Pammolli, F., Magazzini, L., Riccaboni, M. The productivity crisis in pharmaceutical R&D. Nature Reviews. Drug Discovery. 10 (6), 428-438 (2011).
  19. Atchison, L., et al. iPSC-derived endothelial cells affect vascular function in a tissue-engineered blood vessel model of Hutchinson-Gilford progeria syndrome. Stem Cell Reports. 14 (2), 325-337 (2020).

Tags

Bioengineering utgåva 189
Isogen njure glomerulus chip konstruerad från humaninducerade pluripotenta stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Roye, Y., Musah, S. Isogenic Kidney… More

Roye, Y., Musah, S. Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (189), e63821, doi:10.3791/63821 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter