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Bioengineering

इसोजेनिक किडनी ग्लोमेरुलस चिप मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से इंजीनियर

Published: November 4, 2022 doi: 10.3791/63821
Automatic Translation
1, 1,2,3,4
1Department of Biomedical Engineering, Pratt School of Engineering, Duke University, 2Department of Medicine, Division of Nephrology, Duke University School of Medicine, 3Department of Cell Biology, Duke University, 4Center for Biomolecular and Tissue Engineering, Duke University

Summary

यहां प्रस्तुत एक व्यक्तिगत अंग-ऑन-ए-चिप प्रणाली को इंजीनियर करने के लिए एक प्रोटोकॉल है जो मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से विभेदित आनुवंशिक रूप से मिलान किए गए उपकला और संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाओं को एकीकृत करके गुर्दे ग्लोमेरुलर निस्पंदन बाधा की संरचना और कार्य को पुन: उत्पन्न करता है। यह बायोइंजीनियर्ड सिस्टम किडनी परिशुद्धता दवा और संबंधित अनुप्रयोगों को आगे बढ़ा सकता है।

Abstract

क्रोनिक किडनी रोग (सीकेडी) अमेरिकी वयस्क आबादी के 15% को प्रभावित करता है, लेकिन लक्षित उपचारों की स्थापना कार्यात्मक मॉडल की कमी से सीमित हो गई है जो मानव जैविक प्रतिक्रियाओं और नेफ्रोटॉक्सिसिटी की सटीक भविष्यवाणी कर सकती है। गुर्दे की सटीक चिकित्सा में प्रगति इन सीमाओं को दूर करने में मदद कर सकती है। हालांकि, मानव किडनी ग्लोमेरुलस के पहले से स्थापित इन विट्रो मॉडल - रक्त निस्पंदन के लिए प्राथमिक साइट और कई बीमारियों और दवा विषाक्तताओं का एक प्रमुख लक्ष्य - आमतौर पर सीमित कार्यात्मक विशेषताओं और बेजोड़ आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ विषम सेल आबादी को नियोजित करते हैं। ये विशेषताएं रोगी-विशिष्ट रोग मॉडलिंग और चिकित्सीय खोज के लिए उनके आवेदन को काफी सीमित करती हैं।

यह पेपर एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम (आईपीएस) सेल-व्युत्पन्न ग्लोमेरुलर एपिथेलियम (पोडोसाइट्स) और संवहनी एंडोथेलियम को एक एकल रोगी से एकीकृत करता है ताकि एक आइसोजेनिक और संवहनी माइक्रोफ्लुइडिक किडनी ग्लोमेरुलस चिप को इंजीनियर किया जा सके। परिणामस्वरूप ग्लोमेरुलस चिप में स्टेम सेल-व्युत्पन्न एंडोथेलियल और उपकला कोशिका परतें शामिल होती हैं जो वंश-विशिष्ट मार्करों को व्यक्त करती हैं, तहखाने झिल्ली प्रोटीन का उत्पादन करती हैं, और गुर्दे के ग्लोमेरुलर निस्पंदन बाधा के समान एक ऊतक-ऊतक इंटरफ़ेस बनाती हैं। इंजीनियर ग्लोमेरुलस चिप चुनिंदा अणुओं को फ़िल्टर करती है और दवा से प्रेरित गुर्दे की चोट को पुन: उत्पन्न करती है। इसोजेनिक सेल प्रकारों का उपयोग करके किडनी ग्लोमेरुलस की संरचना और कार्य को पुनर्गठित करने की क्षमता रोगी विशिष्टता के साथ गुर्दे की बीमारी को मॉडल करने और गुर्दे की सटीक दवा और संबंधित अनुप्रयोगों के लिए अंगों-ऑन-चिप्स की उपयोगिता को आगे बढ़ाने का अवसर पैदा करती है।

Introduction

ऑर्गन-ऑन-ए-चिप डिवाइस गतिशील 3 डी इन विट्रो मॉडल हैं जो आणविक और यांत्रिक उत्तेजना, साथ ही वैस्कुलराइजेशन को नियोजित करते हैं, ऊतक-ऊतक इंटरफेस बनाने के लिए जो विशिष्ट अंगों की संरचना और कार्य को मॉडल करते हैं। पहले से स्थापित अंग-पर-चिप उपकरण जिनका उद्देश्य गुर्दे के ग्लोमेरुलस (ग्लोमेरुलस चिप्स) को पुन: प्राप्त करना था, उनमें पशु सेल लाइनें1 या मानव प्राथमिक और विषम स्रोतों की अमर सेल लाइनें शामिलथीं। आनुवंशिक रूप से विषम कोशिका स्रोतों का उपयोग विविधताएं प्रस्तुत करता है जो रोगी-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं और आनुवंशिकी या रोगके तंत्र के अध्ययन को काफी सीमित करते हैं। इस चुनौती को संबोधित करना इन विट्रो मॉडल 2,3,6 में इंजीनियरिंग के लिए अधिक सटीक माइक्रोएन्वायरमेंट प्रदान करने के लिए संरक्षित आणविक और आनुवंशिक प्रोफाइल वाले विशिष्ट व्यक्तियों से उत्पन्न होने वाली इसोजेनिक सेल लाइनों की उपलब्धता पर टिका है। मानव मूल की इसोजेनिक सेल लाइनें अब मानव आईपीएस सेल संस्कृति में प्रगति के कारण आसानी से उत्पन्न की जा सकती हैं। क्योंकि मानव आईपीएस कोशिकाएं आम तौर पर गैर-प्रमुख रूप से सोर्स की जाती हैं, अनिश्चित काल तक स्व-नवीनीकरण कर सकती हैं, और लगभग किसी भी सेल प्रकार में अंतर कर सकती हैं, वे इन विट्रो मॉडल की स्थापना के लिए कोशिकाओं के एक आकर्षक स्रोत के रूप में काम करती हैं, जैसे ग्लोमेरुलस चिप 7,8। ग्लोमेरुलर निस्पंदन बाधा रक्त निस्पंदन के लिए प्राथमिक साइट है। रक्त को पहले संवहनी एंडोथेलियम, ग्लोमेरुलर तहखाने झिल्ली के माध्यम से फ़िल्टर किया जाता है, और अंत में पोडोसाइट्स नामक विशेष उपकला के माध्यम से। निस्पंदन बाधा के सभी तीन घटक अणुओं के चयनात्मक निस्पंदन में योगदान करते हैं। यहां प्रस्तुत एक एकल मानव आईपीएस सेल स्रोत से संवहनी एंडोथेलियम और ग्लोमेरुलर एपिथेलियम के साथ इंटरफेस किए गए एक अंग-ऑन-ए-चिप डिवाइस को स्थापित करने के लिए एक प्रोटोकॉल है। जबकि यह प्रोटोकॉल ग्लोमेरुलर निस्पंदन बाधा को पुन: उत्पन्न करने के लिए एक इसोजेनिक और संवहनी चिप को इंजीनियर करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है, यह अन्य प्रकार के व्यक्तिगत अंगों-ऑन-चिप्स और बहु-अंग प्लेटफार्मों जैसे कि इसोजेनिक 'बॉडी-ऑन-ए-चिप' प्रणाली को विकसित करने के लिए एक खाका भी प्रदान करता है।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल मानव आईपीएस कोशिकाओं के दो अलग-अलग वंशों में भिन्न विभेदन से शुरू होता है - पार्श्व मेसोडर्म और मेसोडर्म कोशिकाएं, जिन्हें बाद में क्रमशः संवहनी एंडोथेलियम और ग्लोमेरुलर एपिथेलियम में विभेदित किया जाता है। पार्श्व मेसोडर्म कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए, मानव आईपीएस कोशिकाओं को तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स 1-लेपित प्लेटों पर बीज दिया गया था और एन 2 बी 27 माध्यम में 3 दिनों (मीडिया विनिमय के बिना) के लिए सुसंस्कृत किया गया था, जो डब्ल्यूएनटी एक्टिवेटर, सीएचआईआर 99021, और शक्तिशाली मेसोडर्म इंड्यूसर, बोन-मोर्फोजेनेटिक 4 (बीएमपी 4) के साथ पूरक था। परिणामस्वरूप पार्श्व मेसोडर्म कोशिकाओं को पहले ब्रैकियूरी (टी), मिश्रण युग्मित होमोबॉक्स (मिक्सएल), और ईओमेसोडर्मिन (ईओएमईएस) 9 की अभिव्यक्ति की विशेषता थी। इसके बाद, पार्श्व मेसोडर्म कोशिकाओं को वीईजीएफ 165 और फोर्स्कोलिन के साथ पूरक माध्यम में 4 दिनों के लिए संवर्धित किया गया था ताकि संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाओं को प्रेरित किया जा सके, जिन्हें चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमएसीएस) का उपयोग करके वीई-कैडरिन और / या पीईसीएएम -1 अभिव्यक्ति के आधार पर क्रमबद्ध किया गया था। परिणामस्वरूप संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाओं (वीआईईसी) को बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स 3-लेपित फ्लास्क पर संवर्धन करके विस्तारित किया गया था जब तक कि माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में बीज के लिए तैयार न हो जाए।

मेसोडर्म कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए, मानव आईपीएस कोशिकाओं को बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स 2-लेपित प्लेटों पर बीज दिया गया और एक्टिविन ए और सीएचआईआर 99021 युक्त माध्यम में 2 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया गया। परिणामस्वरूप मेसोडर्म कोशिकाओं को हैंड 1, गूज़कोइड और ब्राचुरी (टी) की अभिव्यक्ति की विशेषता थी जैसा कि पहले 2,10,11 वर्णित है। मध्यवर्ती मेसोडर्म (आईएम) सेल भेदभाव को प्रेरित करने के लिए, मेसोडर्म कोशिकाओं को बीएमपी -7 और सीएचआईआर 99021 के साथ पूरक माध्यम में 14 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया गया था। परिणामस्वरूप आईएम कोशिकाएं विल्म ट्यूमर 1 (डब्ल्यूटी 1), युग्मित बॉक्स जीन 2 (पैक्स 2), और विषम-स्किप किए गए संबंधित प्रोटीन 1 (ओएसआर -1)2,10,11 को व्यक्त करती हैं।

एक दो-चैनल पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) आधारित माइक्रोफ्लुइडिक चिप को विट्रो में ग्लोमेरुलर निस्पंदन बाधा की संरचना को पुन: उत्पन्न करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। मूत्र चैनल 1,000 μm x 1,000 μm (w x h) है और केशिका चैनल आयाम 1,000 μm x 200 μm (w x h) है। द्रविक चैनलों के प्रत्येक तरफ मौजूद खोखले कक्षों द्वारा चक्रीय खिंचाव और विश्राम चक्रों को सुविधाजनक बनाया गया था। कोशिकाओं को एक लचीली, पीडीएमएस झिल्ली (50 μm मोटी) पर बीज दिया गया था जो मूत्र और केशिका चैनलों को अलग करता है। अंतरकोशिकीय सिग्नलिंग (चित्रा 1 ए) 2,12 को बढ़ावा देने में मदद करने के लिए झिल्ली को हेक्सागोनल छिद्रों (7 μm व्यास, 40 μm अलग) के साथ तैयार किया जाता है। आईएम प्रेरण पूरा होने से दो दिन पहले, माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स को बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स 2 के साथ लेपित किया गया था। आईएम प्रेरण पूरा होने से 1 दिन पहले एंडोथेलियल रखरखाव माध्यम का उपयोग करके माइक्रोफ्लुइडिक चिप के केशिका चैनल में वीआईईसी को बीज दिया गया था, और चिप को ईसीएम-लेपित पीडीएमएस झिल्ली के बेसल साइड पर सेल आसंजन को सक्षम करने के लिए उल्टा फ्लिप किया गया था। जिस दिन आईएम प्रेरण पूरा हो गया था, कोशिकाओं को बीएमपी 7, एक्टिविन ए, सीएचआईआर 99021, वीईजीएफ 165 और चिप के भीतर पोडोसाइट्स भेदभाव को प्रेरित करने के लिए सभी ट्रांस रेटिनोइक एसिड के साथ पूरक माध्यम का उपयोग करके माइक्रोफ्लुइडिक चिप के मूत्र चैनल में बीज दिया गया था। अगले दिन, मीडिया जलाशयों को पोडोसाइट्स प्रेरण माध्यम और एंडोथेलियल रखरखाव माध्यम से भर दिया गया था, और 0.4 हर्ट्ज पर 10% यांत्रिक तनाव और तरल प्रवाह (60 μL / h) चिप्स पर लागू किया गया था।

सेलुलर माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स को पोडोसाइट्स इंडक्शन माध्यम (मूत्र चैनल में) और एंडोथेलियल रखरखाव माध्यम (संवहनी चैनल में) का उपयोग करके 5 अतिरिक्त दिनों के लिए संवर्धित किया गया था। परिणामस्वरूप किडनी ग्लोमेरुलस चिप्स को पोडोसाइट्स और एंडोथेलियल कोशिकाओं दोनों के लिए रखरखाव मीडिया में 7 अतिरिक्त दिनों तक सुसंस्कृत किया गया था। विभेदित पोडोसाइट्स ने सकारात्मक रूप से वंश-विशिष्ट प्रोटीन व्यक्त किए, जिसमें पोडोसिन और नेफ्रिन13,14 शामिल हैं, जबकि वीईसी ने सकारात्मक रूप से वंश पहचान प्रोटीन पीईसीएएम -1 और वीई-कैडरिन को व्यक्त किया, जिनमें से सभी ग्लोमेरुलर निस्पंदन बाधा15,16 की अखंडता को बनाए रखने के लिए आवश्यक अणु हैं। . पोडोसाइट्स और वीआईईसी दोनों को सबसे प्रचुर मात्रा में ग्लोमेरुलर बेसमेंट झिल्ली प्रोटीन, कोलेजन IV का स्राव करने के लिए पाया गया था, जो ऊतक परिपक्वता और कार्य के लिए भी महत्वपूर्ण है।

ग्लोमेरुलस चिप्स में निस्पंदन बाधा की तीन-घटक प्रणाली - एंडोथेलियम, तहखाने झिल्ली और उपकला - चुनिंदा अणुओं को फ़िल्टर करने और कीमोथेरेपी, नेफ्रोटॉक्सिक दवा उपचार का जवाब देने के लिए पाई गई थी। दवा उपचार के परिणामों ने संकेत दिया कि ग्लोमेरुलस चिप का उपयोग नेफ्रोटॉक्सिसिटी अध्ययन और रोग मॉडलिंग के लिए किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल इसोजेनिक आईपीएस सेल डेरिवेटिव से एक कार्यात्मक माइक्रोफ्लुइडिक किडनी ग्लोमेरुलस चिप इंजीनियरिंग के लिए सामान्य दिशानिर्देश प्रदान करता है। इंजीनियर चिप का डाउनस्ट्रीम विश्लेषण शोधकर्ता द्वारा वांछित रूप से किया जा सकता है। दवा-प्रेरित ग्लोमेरुलर चोट को मॉडल करने के लिए ग्लोमेरुलस चिप का उपयोग करने के बारे में अधिक जानकारी के लिए, पिछलेप्रकाशनों 2,12 को देखें।

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Protocol

1. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स समाधान और लेपित सब्सट्रेट तैयार करें

  1. बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स 1 को 4 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ पर रात भर पिघलाएं। कमजोर पड़ने के अनुपात के लिए निर्माता के सुझाव के अनुसार एलिकोट। 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब और पिपेट का उपयोग करके, पूरी तरह से पिघलने और घुलने तक 25 एमएल ठंडे डीएमईएम / एफ 12 में बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स 1 की उचित मात्रा मिलाएं।
    1. जमे हुए एलिकोट को भंग करने के लिए, ठंडे डीएमईएम / एफ 12 के 25 एमएल से ~ 200 μL लें और इसे जमे हुए एलिकोट ट्यूब में स्थानांतरित करें। जब तक मैट्रिक्स पूरी तरह से पिघल और घुल नहीं जाता, तब तक पिपेट ऊपर और नीचे। बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स 1 की पूर्ण ट्यूब सामग्री को ठंडे डीएमईएम / एफ 12 के बाकी हिस्सों में स्थानांतरित करें।
  2. पिपेट 1 एमएल बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स 1 समाधान को 6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में स्थापित करता है। उसी दिन लेपित प्लेटों का उपयोग करने के लिए, 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    1. वैकल्पिक रूप से, लेपित प्लेटों को पैराफिल्म के साथ लपेटा जा सकता है और 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। संग्रहीत प्लेट का उपयोग करने के लिए तैयार होने पर, 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. 5 μg/ mL की अंतिम सांद्रता प्राप्त करने के लिए बाँझ आसुत जल के 9 एमएल में पतला बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स 2। पिपेट 700 μL बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स 2 समाधान को 12-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में डालता है। बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स 2-लेपित प्लेटों को पैराफिल्म के साथ लपेटें और 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. निर्माता द्वारा सुझाए गए फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस, सीए + 2-, और एमजी + 2-मुक्त) में 1 मिलीग्राम / एमएल की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए लियोफिलाइज्ड बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स 3 का पुनर्गठन करें। पीबीएस के 9.75 एमएल (सीए + 2 और एमजी + 2 फ्री) में 25 μg / mL की अंतिम सांद्रता के लिए एक 250 μL एलिकोट को पतला करें। एक T75 फ्लास्क (2 μg/ cm2 की अंतिम सांद्रता) को कोट करने के लिए इस घोल के 6 एमएल का उपयोग करें। मैट्रिक्स-लेपित फ्लास्क को 1 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. मानव आईपीएस सेल संस्कृति

नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली डीयू 11 लाइन का परीक्षण किया गया था और माइकोप्लाज्मा और कैरियोटाइप असामान्यताओं से मुक्त पाया गया था।

  1. बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स 1-लेपित प्लेटों को 1-2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. 6-वेल प्लेट 3x के प्रत्येक कुएं को 1 एमएल गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) डीएमईएम / एफ 12 के साथ धोएं। 6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में मानव आईपीएस सेल कल्चर माध्यम (सीसीएम) (पूरक तालिका एस 1) के 2 एमएल जोड़ें। प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, जबकि कोशिकाओं को नीचे वर्णित बीज के लिए तैयार किया जा रहा है।
  3. मानव आईपीएस कोशिकाओं वाले 6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं को 1 एमएल गर्म डीएमईएम / एफ 12 के साथ धोएं।
  4. DMEM/F12 को प्रेरित करें। 6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 1 एमएल गर्म सेल डिटेचमेंट बफर जोड़ें। 1 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  5. सेल कॉलोनी किनारों के चारों ओर पृथक्करण के लिए माइक्रोस्कोप के तहत प्रत्येक कुएं का निरीक्षण करें। कोशिकाओं से सेल डिटेचमेंट बफर को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें। धीरे से प्रत्येक अच्छी तरह से 1 एमएल गर्म डीएमईएम / एफ 12 के साथ धो लें।
  6. माइक्रोस्कोप के नीचे प्लेटों का निरीक्षण करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि कोशिकाएं प्लेट से पूरी तरह से अलग नहीं हुई हैं या गलती से एस्पिरेटेड हो गई हैं।
  7. कोशिकाओं के साथ 6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 3 एमएल गर्म मानव आईपीएस सीसीएम जोड़ें। एक सेल लिफ्टर का उपयोग करके, धीरे से कॉलोनियों को खुरचें। 5 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके, धीरे से प्रत्येक अच्छी तरह से सेल निलंबन को एक बार ऊपर और नीचे मिलाएं।
  8. इनक्यूबेटर से नए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स 1-लेपित प्लेट को बाहर निकालें। सेल निलंबन के 0.5 एमएल को नए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स 1-लेपित प्लेट के प्रत्येक कुएं में स्थानांतरित करें। कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करने के लिए प्लेट को आठ के आंकड़े में स्थानांतरित करें। 5% CO2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  9. खर्च किए गए माध्यम को एस्पिरेट करें और संस्कृति के हर दिन 3 एमएल मानव आईपीएस सीसीएम के साथ प्रतिस्थापित करें जब तक कि कोशिकाएं 70% कॉन्फ्लुएंट (पारित होने के लगभग 4 दिन बाद) न हों।

3. दिन 0-16: मध्यवर्ती मेसोडर्म कोशिकाओं में मानव आईपीएससी का भेदभाव

  1. दिन 0-2: मेसोडर्म प्रेरण
    1. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स 2-लेपित प्लेटों को 4 डिग्री सेल्सियस से कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए स्थानांतरित करें ताकि भंडारण के बाद संतुलन बनाया जा सके।
    2. 6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं से खर्च किए गए माध्यम को एस्पिरेट करें जिसमें लगभग 70% मानव आईपीएस कोशिकाएं होती हैं। धीरे से गर्म डीएमईएम / एफ 12 के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को 3 गुना धोएं।
    3. DMEM/F12 को प्रेरित करें। मानव आईपीएस कोशिकाओं की 6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 1 एमएल सेल डिटेचमेंट बफर जोड़ें। 5-7 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    4. सेल कॉलोनी किनारों के चारों ओर पृथक्करण के लिए माइक्रोस्कोप के तहत प्रत्येक कुएं का निरीक्षण करें। एक सेल लिफ्टर का उपयोग करके, धीरे से कॉलोनियों को खुरचें।
    5. 6-वेल प्लेट के सभी कुओं से सेल सस्पेंशन को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें और आईपीएस कोशिकाओं के एकल-सेल निलंबन को प्राप्त करने के लिए कई बार ऊपर और नीचे पाइप करने के लिए पी 1000 का उपयोग करें।
    6. शंक्वाकार ट्यूब में सेल निलंबन को डीएमईएम / एफ 12 के साथ 14 एमएल तक भरें। कमरे के तापमान पर 200 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
    7. सतह पर तैरने वाले को उत्तेजित करें। सेल पेलेट को 14 एमएल गर्म डीएमईएम / एफ 12 में पुन: निलंबित करें। कमरे के तापमान पर 200 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन दोहराएं।
    8. सतह पर तैरने वाले को उत्तेजित करें। मेसोडर्म प्रेरण माध्यम (पूरक तालिका एस 1) के 1 एमएल में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। 1 × 105 कोशिकाओं / एमएल की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए मेसोडर्म प्रेरण माध्यम में पतला।
    9. बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स 2-लेपित प्लेट से कोटिंग को एस्पिरेट करें। बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स 2-लेपित प्लेट 2x के प्रत्येक कुएं को 1 एमएल गर्म डीएमईएम / एफ 12 के साथ धोएं।
    10. धीरे से सेल निलंबन को 2 गुना ऊपर और नीचे करें। तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स 2-लेपित प्लेट के प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन के 1 एमएल को स्थानांतरित करें। कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करने के लिए प्लेट को धीरे-धीरे आठ की गति में स्थानांतरित करें।
    11. प्लेट को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। अगले दिन (दिन 1), 12-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं से खर्च किए गए माध्यम को तैयार करें। गर्म मेसोडर्म प्रेरण माध्यम के 1 एमएल के साथ प्रतिस्थापित करें। रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. दिन 2-16: मध्यवर्ती मेसोडर्म प्रेरण
    1. खर्च किए गए मेसोडर्म प्रेरण माध्यम को एस्पिरेट करें। गर्म मध्यवर्ती मेसोडर्म प्रेरण माध्यम (पूरक तालिका एस 1) के 1 मीटर एल के साथ बदलें। खर्च किए गए माध्यम को एस्पिरेट करें और 14 दिनों के लिए हर दिन 1 एमएल गर्म इंटरमीडिएट मेसोडर्म इंडक्शन माध्यम से बदलें।

4. दिन 0-15: संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाओं में मानव आईपीएससी का भेदभाव और विस्तार

  1. दिन 0: मानव आईपीएस सेल सीडिंग
    1. रॉक इनहिबिटर (पूरक तालिका एस 1) के साथ मानव आईपीएस सीसीएम के 15 एमएल तैयार करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म रखें।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 घंटे के लिए एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स 1-लेपित प्लेट को इनक्यूबेट करें। बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स 1 को एस्पिरेट करें। 1 एमएल गर्म डीएमईएम / एफ 12 के साथ 3x धो लें।
    3. DMEM/F12 को प्रेरित करें। 6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में रॉक इनहिबिटर के साथ मानव आईपीएस सीसीएम के 2 एमएल जोड़ें। प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, जबकि कोशिकाओं को नीचे वर्णित बीज के लिए तैयार किया जा रहा है।
    4. 6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं से खर्च किए गए माध्यम को एस्पिरेट करें जिसमें लगभग 70% मानव आईपीएस कोशिकाएं होती हैं। धीरे से गर्म डीएमईएम / एफ 12 के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को 3 गुना धोएं।
    5. DMEM/F12 को प्रेरित करें। मानव आईपीएस कोशिकाओं की 6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 1 एमएल सेल डिटेचमेंट बफर जोड़ें। कोशिकाओं को एकल कोशिकाओं में अलग करने के लिए 5-7 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: आईपीएस सेल लाइनों के बीच अंतर्निहित अंतर के कारण, उपयोगकर्ता को इष्टतम इनक्यूबेशन समय निर्धारित करने के लिए 5 मिनट के बाद कोशिकाओं का निरीक्षण करने की आवश्यकता होगी।
    6. कोशिकाओं को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। डिटेचमेंट बफर को बेअसर करने के लिए गर्म डीएमईएम / एफ 12 के साथ सेल निलंबन को 14 एमएल तक लाएं। कमरे के तापमान पर 200× ग्राम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
    7. धीरे से सतह पर तैरने वाले को उत्तेजित करें। रॉक अवरोधक के साथ मानव आईपीएस सीसीएम के 1 एमएल में कोशिकाओं को पुन: निलंबित किया गया। हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना करें।
    8. 37,000 से 47,000 कोशिकाओं / सेमी2 (6-वेल प्लेट के 355,200 से 451,200 कोशिकाओं / कुएं) के बीच कोशिकाओं को बीज दें। रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: आईपीएस सेल लाइनों के बीच अंतर्निहित अंतर के कारण, उपयोगकर्ता को इष्टतम सीडिंग घनत्व निर्धारित करने की आवश्यकता होगी।
  2. दिन 1-3: पार्श्व मेसोडर्म प्रेरण
    1. अगले दिन (दिन 1), मानव आईपीएस कोशिकाओं की 6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं से खर्च किए गए माध्यम को एस्पिरेट करें। 6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं को 5 एमएल लेटरल मेसोडर्म इंडक्शन माध्यम (पूरक तालिका एस 1) के साथ बदलें। संस्कृति पोत (जैसे, फ्लास्क) को स्केल करते समय, आम तौर पर, संस्कृति पोत में काम करने की मात्रा को 3 गुना से बदलें।
    2. 3 दिनों के लिए इस माध्यम को न बदलें।
      नोट: कुओं में पार्श्व मेसोडर्म प्रेरण माध्यम सामान्य रूप से लाल से पीले रंग में बदल जाएगा क्योंकि कोशिकाएं पोषक तत्वों का उपयोग करती हैं। हालांकि, बैक्टीरिया के विकास के साथ बादल वाला माध्यम या माध्यम सामान्य नहीं है और इसे परिशोधन किया जाना चाहिए और इस तरह से त्याग दिया जाना चाहिए।
  3. दिन 4-6: एंडोथेलियल सेल प्रेरण
    1. 6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं से खर्च किए गए माध्यम को एस्पिरेट करें। 6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं को 3 एमएल गर्म एंडोथेलियल इंडक्शन माध्यम (पूरक तालिका एस 1) के साथ बदलें। प्लेट को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    2. अगले 2 दिनों (दिन 5 और 6) के लिए, सभी कुओं से खर्च किए गए माध्यम को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में एकत्र करें। शंक्वाकार ट्यूब को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। गर्म एंडोथेलियल प्रेरण माध्यम के 3 एमएल के साथ कोशिकाओं को फिर से भरें। प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  4. दिन 7: एंडोथेलियल सेल (वीआईईसी) सॉर्टिंग
    1. बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स 3 फ्लास्क निकालें और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दें।
    2. एमएसीएस बफर (पूरक तालिका एस 1) के 50 एमएल तैयार करें।
    3. ऊतक संवर्धन हुड में बर्फ पर सेल डिटेचमेंट बफर, एमएसीएस बफर, एंडोथेलियल सीसीएम, और पीबीएस (सीए2 + और एमजी 2 + मुक्त) रखें।
    4. एमएसीएस स्टैंड पर चुंबक रखें। एक शंक्वाकार ट्यूब धारक में दो 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब और एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब रखें।
    5. ऊतक संस्कृति हुड में एमएसीएस स्टैंड (चुंबक संलग्न) और एक एलएस कॉलम रखें। चुंबक के नीचे एमएसीएस स्टैंड पर शंक्वाकार ट्यूब धारक (अंदर शंक्वाकार ट्यूबों के साथ) सेट करें (पूरक चित्रा एस 1 ए)।
    6. चरण 4.3.2 से 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं से खर्च किए गए माध्यम को एकत्र करें। पीबीएस (सीए2 + और एमजी2 + फ्री) के साथ 6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं को धोएं।
    7. पीबीएस को उत्तेजित करें। सेल डिटेचमेंट बफर के 1 एमएल जोड़ें। कोशिकाओं को पूरी तरह से अलग करने के लिए 5-7 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    8. कोशिकाओं को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। ठंडे एंडोथेलियल सीसीएम के साथ सेल निलंबन को 15 एमएल तक लाएं। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
    9. सतह पर तैरने वाले को उत्तेजित करें। ठंडे एमएसीएस बफर के 1 एमएल में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। हेमोसाइटोमीटर के साथ कोशिकाओं की गणना करें।
    10. सेल निलंबन में 10 एमएल एमएसीएस बफर जोड़ें। कमरे के तापमान पर 200 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
    11. सतह पर तैरने वाले को उत्तेजित करें। प्रति 10 मिलियन कोशिकाओं में 80 μL MACS बफर में कोशिकाओं को पुन: निलंबित किया जाता है। एफसीआर ब्लॉकिंग अभिकर्मक, सीडी 31 माइक्रोबीड्स और सीडी 144 माइक्रोबीड्स की प्रति 10 मिलियन कोशिकाओं में 20 μL जोड़ें। बर्फ पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    12. जबकि सेल निलंबन इनक्यूबेट हो रहा है, एंडोथेलियल प्रेरण (चरण 4.3.2) से एकत्र किए गए माध्यम को 10 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    13. सुपरनैटेंट को 500 एमएल 0.22 μm वैक्यूम फिल्टर में इकट्ठा करें। एंडोथेलियल वातानुकूलित माध्यम (पूरक तालिका एस 1) तैयार करें। बाँझ परिस्थितियों में माध्यम को फ़िल्टर करें और मध्यम को 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म रखें।
      नोट: एंडोथेलियल सेल प्रसार दर मार्ग 3 के बाद कम होना शुरू हो जाएगी। मार्ग 3 के बाद घातीय वृद्धि प्राप्त करने के लिए, एंडोथेलियल वातानुकूलित और रखरखाव माध्यम को मार्ग 1 से शुरू होने वाले 10 μM TGF-Beta अवरोधक (SB431542) के साथ पूरक किया जा सकता है।
    14. चरण 4.4.11 में 15 मिनट इनक्यूबेशन के बाद, सेल निलंबन में प्रति 10 मिलियन कोशिकाओं (अधिकतम 30 एमएल एमएसीएस बफर) में 10 एमएल एमएसीएस बफर जोड़ें। सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर।
    15. सतह पर तैरने वाले को उत्तेजित करें। एमएसीएस बफर के 1 एमएल में पुन: निलंबित।
    16. एलएस कॉलम लें और प्लंजर को सिरिंज से बाहर खींचें। प्लंजर को प्लास्टिक आस्तीन में वापस रखें। स्तंभ को चुंबक पर रखें।
    17. कॉलम के नीचे पहली 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब रखें। कॉलम में एमएसीएस बफर का 1 एमएल जोड़ें। नीचे 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में इकट्ठा करें।
    18. तरल को बहने दें, हालांकि स्तंभ को सूखने से रोकने के लिए पूरी तरह से नहीं। जब तरल बूंदें धीरे-धीरे ट्रिकलने लगें, तो कॉलम में सेल सस्पेंशन जोड़ें। उसी 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में प्रवाह एकत्र करें।
    19. जब तरल बूंदें धीरे-धीरे ट्रिकलने लगती हैं, तो कॉलम के नीचे अगले 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब को रखें। स्तंभ में प्रारंभिक प्रवाह (चरण 4.4.18) जोड़ें। नीचे 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में इकट्ठा करें।
    20. जब तरल बूंदें धीरे-धीरे ट्रिकलने लगें, तो कॉलम को धोने के लिए एमएसीएस बफर 3 एक्स के 500 μL जोड़ें।
    21. चुंबक से स्तंभ निकालें। कॉलम को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब पर रखें। कॉलम में 1 एमएल ठंडा पीबीएस जोड़ें।
    22. कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए, प्लास्टिक आस्तीन से प्लंजर लें और इसे स्तंभ में मजबूती से धक्का दें।
    23. हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। पीबीएस के साथ सेल निलंबन को 5 एमएल तक लाएं। सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर।
    24. जबकि कोशिकाएं सेंट्रीफ्यूजेशन से गुजर रही हैं, सेल सीडिंग की तैयारी के लिए बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स 3-लेपित फ्लास्क 3 एक्स को 5 एमएल पीबीएस के साथ धोएं। पीबीएस को एस्पिरेट करें और बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स 3-लेपित फ्लास्क में एंडोथेलियल वातानुकूलित माध्यम के 20 एमएल जोड़ें।
    25. सेंट्रीफ्यूज से कोशिकाओं को हटा दें और सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें। एंडोथेलियल वातानुकूलित माध्यम में कोशिकाओं को 26,000 कोशिकाओं / सेमी2 (1.95 × 106 कोशिकाओं / टी 75 फ्लास्क) पर बीज दिया जाता है। कोशिकाओं को बीज दें।
    26. सॉर्टिंग दक्षता और सेल उपज की गणना करने के लिए, चरण 4.4.9 से सेल गिनती द्वारा चरण 4.4.23 से सेल गिनती को विभाजित करें।
  5. दिन 8-15: VIECs का विस्तार
    1. अगले दिन (8 वें दिन), फ्लास्क से खर्च किए गए माध्यम को एस्पिरेट करें। एंडोथेलियल वातानुकूलित माध्यम के 10 एमएल के साथ बदलें। एंडोथेलियल वातानुकूलित माध्यम को हर दूसरे दिन बदलें जब तक फ्लास्क 90% कंफ्लुएंट न हो जाए या जब तक एंडोथेलियल वातानुकूलित मध्यम बोतल पूरी तरह से उपयोग न हो जाए।
    2. खर्च किए गए माध्यम को एस्पिरेट करें और निरंतर विस्तार के लिए हर दूसरे दिन एंडोथेलियल रखरखाव माध्यम (पूरक तालिका एस 1) के 10 एमएल के साथ प्रतिस्थापित करें।
    3. वीआईईसी को पारित करने के लिए, दो बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स 3-लेपित टी 75 फ्लास्क तैयार करें। फ्लास्क को कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए छोड़ दें। ताजा तैयार फ्लास्क को 5 एमएल पीबीएस के साथ 3 गुना अच्छी तरह से धो लें।
    4. पीबीएस को उत्तेजित करें। प्रत्येक ताजा तैयार फ्लास्क में 10 एमएल गर्म एंडोथेलियल रखरखाव माध्यम जोड़ें। प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, जबकि कोशिकाओं को नीचे वर्णित बीज के लिए तैयार किया जा रहा है।
    5. वीआईईसी के 90% कॉन्फ्लुएंट टी 75 फ्लास्क में 5 एमएल सेल डिटेचमेंट बफर जोड़ें। 5-7 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। कोशिकाओं को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। 5 एमएल गर्म DMEM / F12 जोड़ें। सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर।
    6. सतह पर तैरने वाले को उत्तेजित करें। गर्म एंडोथेलियल रखरखाव माध्यम के 1 एमएल में पुन: निलंबित। ताजा तैयार-टी 75 फ्लास्क में से प्रत्येक में सेल निलंबन का 500 μL जोड़ें।
    7. अगले दिन, खर्च किए गए माध्यम को अस्त-व्यस्त करें। एंडोथेलियल रखरखाव माध्यम के 10 एमएल के साथ बदलें। खर्च किए गए माध्यम को एस्पिरेट करें और हर दूसरे दिन एंडोथेलियल रखरखाव माध्यम के 10 एमएल के साथ बदलें जब तक कि फ्लास्क 90% कॉन्फ्लुएंट न हो।

5. दिन 14: सेल संस्कृति के लिए माइक्रोफ्लुइडिक अंग चिप उपकरणों की तैयारी

  1. प्लाज्मा उपचार और तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स 2 कोटिंग
    1. बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स 2 समाधान (चरण 1.3) तैयार करें। इसे एक तरफ रख दें।
    2. एक बाँझ ऊतक संस्कृति हुड में, बाँझ 100 मिमी x 15 मिमी गोल पेट्री डिश को अनपैक करें। पेट्री डिश के शीर्ष को नीचे की ओर, पेट्री डिश बॉटम (पूरक चित्रा एस 1 बी) के नीचे रखें।
    3. चिमटी का उपयोग करके, पैकेज से माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स निकालें और उन्हें पेट्री डिश के अंदर रखें। डिश के नीचे से ढक्कन का उपयोग करके पेट्री डिश को बंद करें।
    4. प्लाज्मा एशर पर, पेट्री डिश का ढक्कन डिश के नीचे रखें, ऊपर की ओर नीचे की ओर, उन्हें एक इकाई के रूप में एक साथ रखें। पेट्री डिश यूनिट को प्लाज्मा एशर चैंबर में रखें। 100 डब्ल्यू, 15 एससीसीएम, 30 एस पर ऑक्सीजन के साथ प्लाज्मा एशर शुरू करें।
    5. समय संवेदनशील: एक बार उपचार पूरा हो जाने के बाद, पेट्री डिश यूनिट को प्लाज्मा एशर से बाहर निकालें। प्रयोगशाला पोंछे पर छिड़के गए 70% इथेनॉल के साथ पेट्री डिश ढक्कन को जल्दी और हल्के से पोंछ लें। पेट्री डिश को इसके ढक्कन से कवर करें।
    6. पेट्री डिश को बाँझ ऊतक संवर्धन हुड में लाएं। चिप के मूत्र (शीर्ष) चैनल में धीरे से बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स 2 समाधान के 25 μL जोड़ें। चिप के केशिका (नीचे) चैनल में बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स 2 समाधान के 20 μL जोड़ें।
    7. दो बाँझ 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब कैप लें और उन्हें बाँझ आसुत पानी (~ 500 μL) से भरें। चिप चैनलों और झिल्ली को सूखने से रोकने के लिए पेट्री डिश में टोपी रखें। पकवान पर ढक्कन रखें। रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

6. माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में वीआईईसी और मध्यवर्ती मेसोडर्म कोशिकाओं की सीडिंग

  1. दिन 15: VIECs
    1. टी 75-फ्लास्क से माध्यम को एस्पिरेट करें जिसमें 90% कॉन्फ्लुएंट वीआईईसी होते हैं। सेल डिटेचमेंट बफर के 5 एमएल जोड़ें और 5-7 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    2. कोशिकाओं को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। DMEM/F12 के 5 mL जोड़ें। सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर।
      नोट: प्रत्येक टी 75 फ्लास्क लगभग 90% कॉन्फ्लुएंट वीआईईसी के साथ ~ 3 मिलियन कोशिकाओं का उत्पादन करेगा।
    3. सतह पर तैरने वाले को उत्तेजित करें। एंडोथेलियल रखरखाव माध्यम के 300 μL में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें ताकि लगभग 2 मिलियन कोशिकाएं / 300 μL प्राप्त की जा सकें। सेल निलंबन को एक तरफ सेट करें।
    4. माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स युक्त पेट्री डिश को टिशू कल्चर हुड में स्थानांतरित करें। एक एस्पिरेटर के सिरे पर एक पी 200 बैरियर टिप संलग्न करें।
    5. माइक्रोफ्लुइडिक चिप के शीर्ष और निचले दोनों चैनलों को डीएमईएम /एफ 12 के 200 μL के साथ फ्लश करें, जबकि एक साथ आउटलेट की परिधि को अनुकूलित करें।
    6. चिप को नीचे चैनल के आउटलेट से दूर, एस्पिरेटर से जुड़े पी 200 बैरियर टिप के साथ मजबूती से पकड़ें। चिप के केशिका (नीचे) चैनल में लगभग 134,000 कोशिकाओं के साथ वीआईईसी निलंबन के 20 μL को दृढ़ता से इंजेक्ट करें। आउटलेट की परिधि से सावधानीपूर्वक मध्यम को अलग करें।
    7. बुलबुले या असमान वीआईईसी सीडिंग घनत्व के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे जांच करें।
    8. धीरे से चिप को पलटने के लिए पलटें ताकि वीआईईसी लचीले पीडीएमएस झिल्ली के बेसल पक्ष का पालन कर सकें। चिप को होल्डर कारतूस में रखें। झिल्ली को सूखने से रोकने के लिए चिप धारक कारतूस में 3 एमएल पीबीएस जोड़ें। चिप को 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    9. लचीली पीडीएमएस झिल्ली से जुड़े वीआईईसी की एक कंफ्लुएंट परत के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे निचले चैनल की जांच करें। एंडोथेलियल रखरखाव माध्यम के 200 μL को नीचे चैनल के इनलेट पर गिराएं और इसे केशिका (नीचे) चैनल आउटलेट की परिधि से सावधानीपूर्वक एस्पिरेटिंग करते हुए असंबद्ध एंडोथेलियल कोशिकाओं के चैनल को धोने के लिए चैनल के माध्यम से प्रवाह करने की अनुमति दें।
    10. चिप को वापस धारक कारतूस में बदलें। रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. दिन 16: मध्यवर्ती मेसोडर्म (आईएम) कोशिकाएं
    1. धीरे से केशिका (नीचे) चैनल को एंडोथेलियल रखरखाव माध्यम के 200 μL के साथ फ्लश करें, जबकि आउटलेट पोर्ट की परिधि को सावधानीपूर्वक तैयार करें।
    2. आउटलेट की परिधि को ध्यान से स्पर्श करते हुए डीएमईएम /एफ 12 के 200 μL के साथ मूत्र (शीर्ष) चैनल को फ्लश करें। इनलेट और आउटलेट पोर्ट पर डीएमईएम / एफ 12 के ~ 50 μL छोड़ दें।
    3. 12-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं से इंटरमीडिएट मेसोडर्म इंडक्शन माध्यम को एस्पाइरेट करें।
      नोट: विभेदन के अंत में प्रत्येक कुआं लगभग 1.5 मिलियन आईएम कोशिकाएं देता है।
    4. 12-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 1 एमएल ट्रिप्सिन-ईडीटीए जोड़ें और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    5. धीरे से सेल लिफ्टर का उपयोग करके कोशिकाओं को खुरचें, और पी 1000 का उपयोग करके कोशिकाओं को अलग करने के लिए ऊपर और नीचे। प्रत्येक कुएं में ट्रिप्सिन न्यूट्रलाइजेशन समाधान (पूरक तालिका एस 1) के 2 एमएल जोड़ें। कोशिकाओं को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। सेल निलंबन मात्रा को डीएमईएम / एफ 12 के साथ 50 एमएल तक लाएं और 5 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    6. सतह पर तैरने वाले को उत्तेजित करें। लगभग 3 मिलियन कोशिकाओं/500 μL प्राप्त करने के लिए मध्यवर्ती मेसोडर्म प्रेरण माध्यम के 500 μL में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
    7. चिप को मूत्र (शीर्ष) चैनल के आउटलेट से दूर, एस्पिरेटर से जुड़े पी 200 बैरियर टिप के साथ मजबूती से पकड़ें। चिप के मूत्र (शीर्ष) चैनल में लगभग 112,500 आईएम कोशिकाओं के साथ 25 μL सेल निलंबन को दृढ़ता से इंजेक्ट करें, और आउटलेट की परिधि से माध्यम को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें।
    8. बुलबुले या असमान आईएम सेल सीडिंग घनत्व के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे जांच करें। चिप धारक कारतूस में 3 एमएल पीबीएस जोड़ें। 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    9. दोनों चैनलों को उनके संबंधित सेल कल्चर माध्यम के 200 μL के साथ फ्लश करें, जबकि चिप आउटलेट की परिधि को सावधानीपूर्वक बढ़ाएं ताकि खर्च किए गए माध्यम और सेल मलबे के पिछड़े प्रवाह को रोकने में मदद मिल सके।
    10. मूत्र और केशिका चैनलों के दोनों आउटलेट में खाली पी 200 बैरियर टिप्स संलग्न करें। एंडोथेलियल रखरखाव माध्यम के पिपेट 200 μL और इसके आधे हिस्से को केशिका चैनल इनलेट में इंजेक्ट करें। इनलेट के अंदर पिपेट टिप को इस तरह छोड़ दें कि चैनल के इनलेट और आउटलेट दोनों अब माध्यम से भरे पिपेट टिप्स से जुड़े हों।
    11. पिपेट 200 μL आईएम रखरखाव माध्यम है और मूत्र चैनल इनलेट में आधा इंजेक्ट करता है। इनलेट के अंदर पिपेट टिप को इस तरह छोड़ दें कि चैनल के इनलेट और आउटलेट दोनों अब माध्यम से भरे पिपेट टिप्स से जुड़े हों। चिप्स को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर एम्बेडेड युक्तियों के साथ इनक्यूबेट करें।
  3. द्रव प्रवाह और यांत्रिक तनाव को लागू करने के लिए चिप्स को ऑर्गन चिप बायोरिएक्टर से कनेक्ट करें।
    1. मूत्र और केशिका चैनलों से पी 200 युक्तियों को हटा दें। सुखाने से रोकने के लिए मूत्र और केशिका चैनलों के इनलेट और आउटलेट में संबंधित मीडिया की बूंदें जोड़ें।
    2. मूत्र इनलेट जलाशय में 3 एमएल गर्म पोडोसाइट्स प्रेरण माध्यम (पूरक तालिका एस 1) जोड़ें। केशिका इनलेट जलाशय में 3 एमएल गर्म एंडोथेलियल रखरखाव माध्यम जोड़ें।
    3. सीधे आउटलेट पोर्ट पर मूत्र चैनल आउटलेट जलाशय में गर्म पोडोसाइट्स प्रेरण माध्यम के 300 μL जोड़ें। आउटलेट पोर्ट पर सीधे केशिका चैनल आउटलेट जलाशय में गर्म एंडोथेलियल रखरखाव माध्यम के 300 μL जोड़ें।
    4. फली को ट्रे पर और ऑर्गन चिप बायोरिएक्टर में स्लाइड करें।
    5. प्राइम साइकिल (2 मिनट) का चयन करने और प्रारंभ करने के लिए ऑर्गन चिप बायोरिएक्टर पर रोटरी डायल का उपयोग करें। सभी चार द्रविक बंदरगाहों पर छोटी बूंदों के लिए फली के नीचे का निरीक्षण करें।
    6. पॉड अंडरसाइड और माइक्रोफ्लुइडिक चिप पोर्ट के बीच द्रव-द्रव संपर्क प्राप्त करने के लिए, धीरे से चिप वाहक को पॉड में स्लाइड करें। धीरे से चिप वाहक टैब को अंदर और ऊपर दबाएं। चिप की सतह से अतिरिक्त माध्यम को एस्पिरेट करें।
    7. ऑर्गन चिप बायोरिएक्टर प्रवाह दर को 60 μL / h पर सेट करें। चक्रीय तनाव को 0.4 हर्ट्ज पर 10% पर सेट करें। विनियमन चक्र का चयन करने और 2 घंटे तक चलाने के लिए ऑर्गन चिप बायोरिएक्टर पर रोटरी डायल का उपयोग करें।
    8. माध्यम के स्तर में वृद्धि के लिए आउटलेट जलाशयों का नेत्रहीन निरीक्षण करें।
    9. विनियमन चक्र का चयन करने के लिए ऑर्गन चिप बायोरिएक्टर पर रोटरी डायल का उपयोग करें।

7. दिन 17-21 और उससे आगे: पोडोसाइट्स प्रेरण और चिप रखरखाव

  1. मूत्र चैनल आउटलेट जलाशयों से माध्यम को बंदरगाह से विकर्ण रूप से दूर रखें, लेकिन संस्कृति के हर दिन जलाशय में कुछ माध्यम रखें। मूत्र चैनल इनलेट जलाशय को 5 दिनों के लिए हर 2 दिनों में 3 एमएल पोडोसाइट इंडक्शन माध्यम के साथ फिर से भरें।
    1. 5 दिनों के बाद, मूत्र चैनल से माध्यम को उत्तेजित करें लेकिन जलाशय में कुछ माध्यम रखें। 3 एमएल पोडोसाइट्स रखरखाव माध्यम के साथ प्रतिदिन मूत्र चैनल इनलेट जलाशय को फिर से भरें।
  2. केशिका चैनल आउटलेट जलाशयों से माध्यम को बंदरगाह से विकर्ण रूप से दूर रखें, लेकिन संस्कृति के हर दिन जलाशय में कुछ माध्यम रखें। एंडोथेलियल रखरखाव माध्यम के 3 एमएल तक के साथ प्रतिदिन केशिका चैनल इनलेट जलाशय को फिर से भरें।

8. कार्यात्मक परख और इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग

नोट: फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण, चिप प्रवाह प्रवाह के लिए एलिसा, और एमआरएनए अलगाव के बारे में विवरण के लिए पूरक फ़ाइल 1 देखें।

  1. इनुलिन और एल्बुमिन का उपयोग करके कार्यात्मक परख (आणविक निस्पंदन)
    1. केशिका चैनल आउटलेट जलाशय से माध्यम को बंदरगाह से विकर्ण रूप से दूर रखें, लेकिन जलाशय में कुछ माध्यम रखें। 6 घंटे के लिए इनुलिन और एल्बुमिन (पूरक तालिका एस 1) के साथ पूरक एंडोथेलियल रखरखाव माध्यम के 3 एमएल के साथ बदलें।
    2. 5 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके, मूत्र चैनल से माध्यम की मात्रा (एमएल में) को मापें और 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। प्रकाश से बचाने और फ्लोरोफोरे-संयुग्मित इनुलिन और एल्बुमिन के फोटोब्लीचिंग को कम करने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में ट्यूब लपेटें। 3 एमएल पोडोसाइट्स रखरखाव माध्यम के साथ जलाशय को फिर से भरें।
    3. पोडोसाइट्स रखरखाव माध्यम में इनुलिन का स्टॉक समाधान तैयार करें। एमएल इनुलिन से शुरू होकर, पोडोसाइट्स रखरखाव माध्यम में 2x सीरियल कमजोर पड़ने के माध्यम से इनुलिन के आठ मानक तैयार करें।
    4. इसी तरह, पोडोसाइट्स रखरखाव माध्यम में एल्बुमिन का स्टॉक समाधान तैयार करें। एमएल एल्ब्यूमिन से शुरू होकर, पोडोसाइट्स रखरखाव माध्यम में 2x सीरियल कमजोर पड़ने के माध्यम से एल्बुमिन के आठ मानक तैयार करें।
    5. एक काले, 96-वेल प्लेट (या इनुलिन के 16 कुल कुओं) के प्रत्येक कुएं में प्रत्येक मानक इनुलिन एकाग्रता के डुप्लिकेट 100 μL में पिपेट। पिपेट प्रत्येक मानक एल्ब्यूमिन एकाग्रता के डुप्लिकेट 100 μL में उसी 96-वेल प्लेट (एल्बुमिन के 16 कुल कुओं) के प्रत्येक कुएं में। खाली (या पोडोसाइट्स रखरखाव माध्यम के दो कुल कुओं) के रूप में सेवा करने के लिए डुप्लिकेट 100 μL Podocyte रखरखाव माध्यम में पिपेट।
    6. मूत्र चैनल से उसी 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 100 μL प्रवाह माध्यम के डुप्लिकेट में पिपेट। केशिका चैनल से 100 μL बहिःस्राव माध्यम के डुप्लिकेट में पिपेट।
    7. प्लेट रीडर में प्लेट डालें और उत्तेजना 550 एनएम और उत्सर्जन 615 एनएम पर एल्बुमिन के लिए प्रतिदीप्ति को मापें। उत्तेजना 513 एनएम और उत्सर्जन 577 एनएम पर इनुलिन के लिए एक ही प्लेट को मापें।
    8. उत्पन्न डेटा से, डुप्लिकेट माप (प्रति चिप) का औसत निकालें। शीट पर बाकी डेटा से उस प्लेट रीडिंग के अनुरूप रिक्त मान घटाएं।
    9. एल्ब्यूमिन मानकों के अनुरूप मूल्यों को x-अक्ष पर एकाग्रता [μg/mL] और y-अक्ष पर प्रतिदीप्ति के साथ एक मानक वक्र बनाने के लिए प्लॉट करें। इनुलिन मानकों के अनुरूप मानों को x-अक्ष पर एकाग्रता [μg/mL] और y-अक्ष पर प्रतिदीप्ति के साथ एक मानक वक्र बनाने के लिए प्लॉट करें।
    10. चिप्स से बहिस्त्राव माध्यम में क्रमशः इनुलिन और एल्बुमिन की मूत्र एकाग्रता निर्धारित करने के लिए एक सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर पैकेज और रैखिक प्रक्षेप का उपयोग करें।
    11. समीकरण (1)2 का उपयोग करके चिप्स से इनुलिन/एल्बुमिन की मूत्र निकासी ज्ञात कीजिए:
      मूत्र निकासी = ([यू] × यूवी) / [पी] (1)
      जहां चरण 8.1.10 से [यू] मूत्र एकाग्रता है, यूवी चरण 8.1.2 से एकत्रित मूत्र चैनल प्रवाह की मात्रा है, और [पी] इनुलिन या एल्बुमिन (10 μg / mL इनुलिन या 100 μg / mL एल्बुमिन) की केशिका एकाग्रता है।
  2. इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग
    1. मूत्र और केशिका चैनलों के आउटलेट पोर्ट में एक खाली पी 200 टिप इंजेक्ट करें। कोशिकाओं को ठीक करने के लिए, पिपेट 200 μL 4% फॉर्मलाडेहाइड है और इसका आधा हिस्सा निचले चैनल इनलेट में इंजेक्ट करता है। इनलेट के अंदर पिपेट टिप को छोड़ दें।
    2. पिपेट 200 μL 4% फॉर्मलाडेहाइड का उपयोग करता है और इसका आधा हिस्सा मूत्र चैनल इनलेट में इंजेक्ट करता है। इनलेट के अंदर पिपेट टिप को इस तरह छोड़ें कि चैनल के इनलेट और आउटलेट दोनों अब फिक्सेटिव से भरे पिपेट टिप्स से जुड़े हों।
    3. चिप्स को कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. 20 मिनट के बाद, सभी पिपेट युक्तियों को छोड़ दें। मूत्र और केशिका चैनलों के आउटलेट पोर्ट में साफ, खाली पी 200 युक्तियों को इंजेक्ट करें। कोशिकाओं को स्थिर करने के लिए, पिपेट 200 μL 0.125% ट्राइटन X-100 / PBS है और इसका आधा हिस्सा केशिका चैनल इनलेट में इंजेक्ट करता है। इनलेट के अंदर पिपेट टिप को छोड़ दें।
    5. पिपेट 200 μL 0.125% ट्राइटन X-100 / PBS है और इसका आधा हिस्सा मूत्र चैनल इनलेट में इंजेक्ट करता है। इनलेट के अंदर पिपेट टिप को छोड़ दें। चिप को कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    6. सभी पिपेट युक्तियों को त्याग दें। मूत्र और केशिका चैनलों के आउटलेट पोर्ट में साफ, खाली पी 200 युक्तियों को इंजेक्ट करें। कोशिकाओं को अवरुद्ध करने के लिए, पिपेट 200 μL 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) को 0.125% ट्राइटन एक्स -100 / पीबीएस में इंजेक्ट करता है और इसका आधा हिस्सा केशिका चैनल इनलेट में इंजेक्ट करता है। इनलेट के अंदर पिपेट टिप को छोड़ दें।
    7. पिपेट 200 μL 1% 1% BSA में 0.125% ट्राइटन X-100/ PBS में और इसका आधा हिस्सा मूत्र चैनल इनलेट में इंजेक्ट करें। इनलेट के अंदर पिपेट टिप को छोड़ दें। 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    8. सभी पिपेट युक्तियों को त्याग दें। प्रत्येक चैनल में 0.125% ट्राइटन एक्स -100/पीबीएस के 200 μL पाइप करके दोनों चैनलों को 3x धोएं और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    9. 0.125% ट्राइटन एक्स -100 / पीबीएस में निर्माता द्वारा अनुशंसित कमजोर पड़ने के साथ प्रति चैनल 100 μL प्राथमिक एंटीबॉडी तैयार करें। मूत्र और केशिका चैनलों के आउटलेट पोर्ट में साफ, खाली पी 200 युक्तियों को इंजेक्ट करें। पिपेट 100 μL प्राथमिक एंटीबॉडी और संबंधित चैनलों में आधा इंजेक्ट करें। इनलेट के अंदर पिपेट टिप को छोड़ दें।
    10. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए या बेहतर परिणामों के लिए, रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: एक बार में कई प्राथमिक एंटीबॉडी लागू किए जा सकते हैं; हालांकि, निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को पतला किया जाना चाहिए।
    11. चरण 8.2.8 में वर्णित चैनलों को 3 x 10 मिनट धोएं।
    12. 0.125% ट्राइटन एक्स -100 / पीबीएस में निर्माता द्वारा अनुशंसित कमजोर पड़ने वाले कारक के साथ प्रति चैनल 100 μL द्वितीयक एंटीबॉडी तैयार करें। मूत्र और केशिका चैनलों के आउटलेट पोर्ट में साफ, खाली पी 200 युक्तियों को इंजेक्ट करें। पिपेट 100 μL द्वितीयक एंटीबॉडी और संबंधित चैनलों में आधा इंजेक्ट करता है। इनलेट के अंदर पिपेट युक्तियों को छोड़ दें। कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: प्रत्येक द्वितीयक एंटीबॉडी को अलग से लागू किया जाना चाहिए। चरण 8.2.8 के अनुसार प्रत्येक एप्लिकेशन के बीच कम से कम 3 x 10 मिनट धोएं।
    13. चरण 8.2.8 में वर्णित चैनलों को 3 x 10 मिनट धोएं।
    14. चिप आउटलेट पोर्ट की परिधि से अवशिष्ट तरल पदार्थ को अवशोषित करते हुए दोनों चैनलों को 200 μL आसुत जल के साथ एक बार फ्लश करें।
    15. मूत्र और केशिका चैनलों के आउटलेट पोर्ट में साफ, खाली पी 200 इंजेक्ट करें। कोशिकाओं को रोकने के लिए, पिपेट 200 μL 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल (DAPI, आसुत जल में 1: 1,000 कमजोर पड़ने) और इसका आधा हिस्सा केशिका चैनल इनलेट में इंजेक्ट करें। इनलेट के अंदर पिपेट टिप को छोड़ दें, और 200 μL DAPI को छोड़ दें और इसका आधा हिस्सा मूत्र चैनल इनलेट में इंजेक्ट करें। इनलेट के अंदर पिपेट टिप को छोड़ दें, और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    16. सभी पिपेट युक्तियों को त्याग दें। मूत्र और केशिका चैनलों के आउटलेट पोर्ट में साफ, खाली पी 200 युक्तियों को इंजेक्ट करें। कोशिकाओं को रोकने के लिए, पिपेट 200 μL फेलोइडिन (Ca2+ और Mg2+ के बिना PBS में 1: 1,000 कमजोर पड़ना) और इसका आधा हिस्सा केशिका चैनल इनलेट में इंजेक्ट करें और इनलेट के अंदर पिपेट टिप छोड़ दें। पिपेट 200 μL फेलोइडिन (Ca2+ और Mg2+ के बिना PBS में 1: 1,000 कमजोर पड़ना) और इसका आधा हिस्सा मूत्र चैनल इनलेट में इंजेक्ट करें और इनलेट के अंदर पिपेट टिप छोड़ दें। 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    17. चैनलों को सीए 2 +और एमजी 2 + के बिना पीबीएस के200 μL के साथ 3x फ्लश करें, और आउटलेट पोर्ट की परिधि से अतिरिक्त तरल पदार्थ को एस्पिरेट करें।
    18. चिप्स की कल्पना करें।

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Representative Results

यहां हम दिखाते हैं कि ग्लोमेरुलस के एक कार्यात्मक 3 डी इन विट्रो मॉडल को मानव आईपीएस कोशिकाओं के एक आइसोजेनिक स्रोत से संवहनी और उपकलाकृत किया जा सकता है। विशेष रूप से, यह प्रोटोकॉल मानव आईपीएस सेल तकनीक को लागू करने के तरीके पर निर्देश प्रदान करता है, विशेष रूप से विशेष सेल प्रकारों में अंतर करने की उनकी क्षमता, किडनी ग्लोमेरुलर एपिथेलियम (पोडोसाइट्स) और संवहनी एंडोथेलियम (वीआईईसी) उत्पन्न करने के लिए जिन्हें रोगी-विशिष्ट स्तर पर मानव गुर्दे की संरचना और कार्य को मॉडल करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के साथ एकीकृत किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल और समयरेखा का एक योजनाबद्ध अवलोकन (चित्रा 1 ए) वर्णन करता है कि माइटोटिक रूप से सक्रिय मानव आईपीएस कोशिकाओं (चित्रा 1 बी) को कैसे कल्चर किया जाए और फिर उन्हें (समानांतर में) मेसोडर्म और पार्श्व मेसोडर्म सेल वंश (चित्रा 1 सी, डी) में अलग किया जाए। परिणामस्वरूप मेसोडर्म कोशिकाओं को ब्रैकियूरी (टी) को व्यक्त करने के लिए पाया गया, जबकि पार्श्व मेसोडर्म कोशिकाओं ने ब्रैकियूरी (टी), मिक्सल और ईओएमईएस 2,9,10,11 व्यक्त किए।

मेसोडर्म कोशिकाओं के बाद के भेदभाव ने मध्यवर्ती मेसोडर्म (आईएम) कोशिकाओं का उत्पादन किया, जबकि पार्श्व मेसोडर्म कोशिकाओं के भेदभाव ने वीईसी (चित्रा 1 डी) 2,10,11,17 का उत्पादन किया। फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण का उपयोग नकारात्मक नियंत्रणों (दाग और बिना दाग वाले मानव आईपीएस कोशिकाओं और बिना दाग वाले एंडोथेलियम सहित) की तुलना में विभेदित वीआईईसी (मैक सॉर्टिंग से पहले और बाद में) में सीडी 144 की अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए किया गया था। एक अनुकूलित एंडोथेलियल भेदभाव के परिणामस्वरूप मैक सॉर्टिंग से पहले 50% या अधिक सीडी 31 / सीडी 144-पॉजिटिव कोशिकाएं होंगी, जो नियंत्रण की तुलना में सेल सॉर्टिंग के बाद काफी सुधार होगा। प्रतिनिधि परिणाम मैक सॉर्टिंग से पहले सीडी 144 के लिए 59% भेदभाव दक्षता दिखाते हैं, जो मैक सॉर्टिंग के बाद 77% या अधिक सीडी 144-पॉजिटिव कोशिकाओं (सीडी 31-पॉजिटिव कोशिकाओं सहित नहीं) तक बढ़ गया (चित्रा 1 ई)।

इस प्रोटोकॉल के 14 वें दिन (आईएम भेदभाव और वीआईईसी विस्तार के पूरा होने से पहले), अंग-ऑन-ए-चिप उपकरणों को प्लाज्मा-उपचार और तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स 2 के साथ कार्यात्मककरण द्वारा सेल सीडिंग के लिए तैयार किया गया था। अगले दिन (प्रोटोकॉल के 15 वें दिन), वीआईईसी को वीआईईसी माध्यम के साथ माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के केशिका (नीचे) चैनल में बीज दिया गया था। वीआईईसी सीडिंग (प्रोटोकॉल के दिन 16) के अगले दिन, आईएम कोशिकाओं को पोडोसाइट्स प्रेरण माध्यम के साथ माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के मूत्र (शीर्ष) चैनल में बीज दिया गया था। आईएम सेल सीडिंग (इस प्रोटोकॉल का दिन 17) के बाद के दिन, ग्लोमेरुलस चिप्स पर 60 μL / h द्रव प्रवाह दर और 0.4 हर्ट्ज पर 10% तनाव लागू किया गया था। ये चिप्स केशिका और मूत्र चैनलों में क्रमशः 0.017dyn cm-2 और 0.0007dyn cm-2 के कतरनी तनाव का अनुभव करते हैं। 5 दिनों तक पोडोसाइट्स प्रेरण और चिप में संवहनी एंडोथेलियम प्रसार के 6 दिनों (इस प्रोटोकॉल के दिन 21) (चित्रा 2 ए) के बाद, ग्लोमेरुलस चिप्स के भीतर परिणामी कोशिकाओं ने वंश पहचान मार्कर व्यक्त किए।

विशेष रूप से, मूत्र चैनल में पोडोसाइट्स ने पोडोसिन और नेफ्रिन (चित्रा 2 बी, शीर्ष पैनल) व्यक्त किया, और केशिका चैनल में वीईसी ने पीईसीएएम -1 (सीडी 31) और वीई-कैडरिन (सीडी 144) (चित्रा 2 बी, निचला पैनल) व्यक्त किया। इसके अतिरिक्त, पोडोसाइट्स और वीआईईसी परतों दोनों ने कोलेजन IV को व्यक्त किया, जो गुर्दे के ग्लोमेरुलस में सबसे प्रचुर मात्रा में जीबीएम प्रोटीन (चित्रा 2 बी) है। अधिक कोलेजन IV मूत्र चैनल में व्यक्त किया जाता है क्योंकि पोडोसाइट्स कोलेजन IV के प्रमुख उत्पादक हैं, जिसमें 33455 आइसोफॉर्म शामिल है, जो परिपक्व ग्लोमेरुलस में कोलेजन का मुख्य हेटरोट्रिमर आइसोफॉर्म है। इसके अलावा, ग्लोमेरुलस चिप्स में प्रचारित पोडोसाइट्स ने पैर की प्रक्रियाओं को विकसित किया और वीईजीएफ 165 को स्रावित किया, जिनमें से दोनों किडनी ग्लोमेरुलस2,12 के कार्यात्मक मॉडल की विशिष्ट विशेषताएं हैं। यह प्रोटोकॉल इनुलिन और एल्ब्यूमिन का उपयोग करके गुर्दे ग्लोमेरुलस के चयनात्मक आणविक निस्पंदन समारोह का मूल्यांकन भी प्रदान करता है, जिसमें से ग्लोमेरुलस चिप्स चुनिंदा रूप से केशिका से छोटे अणुओं (इनुलिन) को मूत्र चैनल में फ़िल्टर करते हैं, जबकि बड़े प्रोटीन (एल्बुमिन) को केशिका चैनल (चित्रा 2 सी) 2,10,12 छोड़ने से रोकते हैं।

चूंकि प्रत्येक मानव आईपीएस सेल लाइन दोहरीकरण समय में अंतर्निहित अंतर प्रदर्शित करती है, इसलिए यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि विभिन्न सेल लाइनों के लिए इष्टतम सेल सीडिंग घनत्व भिन्न हो सकते हैं और इसलिए शोधकर्ता द्वारा अनुकूलित किया जाना चाहिए। एंडोथेलियल सेल भेदभाव के लिए, यदि मानव आईपीएस कोशिकाओं का सीडिंग घनत्व बहुत कम है, तो शोधकर्ता विभेदित एंडोथेलियल कोशिकाओं (<30% दक्षता) की कम उपज देख सकता है। यदि मानव आईपीएस कोशिकाओं का सीडिंग घनत्व बहुत अधिक है, तो शोधकर्ता तेजी से सेल अतिवृद्धि, अलगाव या खराब आसंजन, कोशिका मृत्यु में वृद्धि और कम उपज (<30% दक्षता) का निरीक्षण कर सकता है। एंडोथेलियल प्रेरण (विभेदन के दिन 4-7) के दौरान, कोशिकाओं की एक द्वितीयक परत के परिणामस्वरूप कोशिका संख्या में वृद्धि सामान्य है, लेकिन इसे न्यूनतम रखा जाना चाहिए (चित्रा 3 ए)। आईएम और पोडोसाइट्स भेदभाव के लिए, मानव आईपीएस कोशिकाओं (>100,000 कोशिकाओं / 12-वेल प्लेट के वेल) की देखरेख के परिणामस्वरूप आईएम कोशिकाएं हो सकती हैं जो बड़े समूहों में बढ़ती हैं या समुच्चय बनाती हैं, जो भेदभाव को बाधित कर सकती हैं और परिणामस्वरूप कुल कोशिकाओं के कम परिपक्व रूपात्मक फेनोटाइप और कम माध्यमिक और / या तृतीयक पैर प्रक्रियाओं के साथ पोडोसाइट्सहो सकते हैं। 11.

माइक्रोफ्लुइडिक चिप संस्कृति के दौरान, मूत्र और केशिका चैनलों (चित्रा 3 बी) के बीच अप्रत्याशित द्रव क्रॉसफ्लो देखा जा सकता है यदि पीडीएमएस चिप घटकों का टूटना या अपर्याप्त संबंध है, या यदि द्रव प्रवाह का मार्ग अवरुद्ध है। यह अवांछित द्रव क्रॉसफ्लो एक समझौता निस्पंदन बाधा के परिणामस्वरूप भी हो सकता है जैसे कि अपर्याप्त (कम) सेल सीडिंग या क्षतिग्रस्त सेल परतों से ऊतक मॉडल। इस समस्या को रोकने के लिए, यह अनुशंसा की जाती है कि शोधकर्ता अनुशंसित प्रोटोकॉल और सेल सीडिंग घनत्व का पालन करता है, साथ ही प्रक्रिया के हर चरण में चैनलों में हवा के बुलबुले के लिए चिप्स का नेत्रहीन निरीक्षण करता है। यदि तरल पदार्थ के प्रवाह के तहत माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स के मीडिया जलाशयों में हवा के बुलबुले देखे जाते हैं, तो पंप को रोका जा सकता है और मध्यम को बाँझ परिस्थितियों में डिगैस किया जा सकता है।

साथ में, यह प्रोटोकॉल और प्रतिनिधि परिणाम एक इसोजेनिक मानव आईपीएस सेल लाइन से संवहनी एंडोथेलियम (वीआईईसी) और ग्लोमेरुलर एपिथेलियम (पोडोसाइट्स) की व्युत्पत्ति का वर्णन करते हैं, और रोगी-विशिष्ट तरीके से किडनी ग्लोमेरुलर निस्पंदन बाधा की संरचना और कार्य को पुन: उत्पन्न करने के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक अंग-ऑन-ए-चिप डिवाइस में उनका पुनर्गठन करते हैं।

Figure 1
चित्र 1: मानव आईपीएस कोशिकाओं से इसोजेनिक ग्लोमेरुलर एपिथेलियम और संवहनी एंडोथेलियम की व्युत्पत्ति। (ए) मध्यवर्ती मेसोडर्म और वीआईईसी प्रेरण की योजनाबद्ध समयरेखा, अंग-ऑन-ए-चिप डिजाइन और बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स कोटिंग, चिप में सेल सीडिंग, और चिप के भीतर पोडोसाइट्स प्रेरण। (बी) प्रोटोकॉल के दिन 0 पर पृथक्करण से पहले पीजीपी 1 मानव आईपीएस कोशिकाओं की प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र छवियां। (सी) विभेदन (बाएं) के दिन 2 पर पीजीपी 1 मेसोडर्म कोशिकाओं की प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र छवियां और भेदभाव (दाएं) के दिन 8 पर मध्यवर्ती मेसोडर्म कोशिकाएं। (डी) विभेदन के दिन 3 (बाएं) पर पीजीपी 1 पार्श्व मेसोडर्म कोशिकाओं की प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र छवियां और भेदभाव के दिन 9 वें दिन पीजीपी 1 वीआईईसी (विस्तार के 2 दिन) (दाएं)। स्केल सलाखों = 275 μm (B-D)। (ई) सीडी144-दाग वाले मानव आईपीएससी (काले) और बिना दाग वाली एंडोथेलियल कोशिकाओं (लाल) की तुलना में एमएसीएस (नीले) से पहले एंडोथेलियल सेल भेदभाव के दिन 7 पर और एमएसीएस (गुलाबी) के बाद एंडोथेलियल सेल विस्तार के 9 वें दिन सीडी 144-पॉजिटिव कोशिकाओं के लिए फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण के माध्यम से वीआईईसी भेदभाव का परिमाणीकरण। इस आंकड़े को12 से संशोधित किया गया है। संक्षेप: आईपीएससी = प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल; वीईसी = संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाएं; बीएमपी 4/7 = हड्डी मोर्फोजेनेटिक प्रोटीन 4/7; आरए = रेटिनोइक एसिड; वीईजीएफ = संवहनी एंडोथेलियल विकास कारक; एमएसीएस = चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: माइक्रोफ्लुइडिक किडनी ग्लोमेरुलस चिप के भीतर संवहनी एंडोथेलियम और ग्लोमेरुलर एपिथेलियम (पोडोसाइट्स परत) की प्रतिनिधि छवियां। ग्लोमेरुलस चिप में प्रसारित वीआईईसी (बाएं) और ग्लोमेरुलर एपिथेलियम (पोडोसाइट्स) (दाएं) की प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र छवियां। (बी) ग्लोमेरुलर एपिथेलियम (पोडोसाइट्स) और वीआईईसी की प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरोसेंट छवियां वंश-विशिष्ट मार्करों की अभिव्यक्ति दिखाती हैं। स्केल बार = 100 μm. (C) ग्लोमेरुलस चिप में चयनात्मक आणविक निस्पंदन दिखाने वाले प्रतिनिधि डेटा। त्रुटि पट्टियाँ SD. p < 0.0001 का प्रतिनिधित्व करती हैं. इस आंकड़े को 12 से पुन: प्रस्तुत किया गया है। संक्षेप: वीईसी = संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाएं; वीई-कैडरिन = सीडी 144; पीईसीएएम -1 (= सीडी 31) = प्लेटलेट एंडोथेलियल सेल आसंजन अणु। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स में उप-मानक एंडोथेलियम सीडिंग घनत्व और असमान द्रव प्रवाह की छवियां। (ए) वीआईईसी भेदभाव के दिन 6 पर इष्टतम (बाएं) और देखरेख (दाएं) सेल संस्कृतियों की प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र छवियां। स्केल बार = 275 μm. (B) एक समान द्रव प्रवाह और एक कार्यात्मक अवरोध (बाएं) के साथ माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स से आउटलेट जलाशयों की प्रतिनिधि छवियां। असमान द्रव प्रवाह या निष्क्रिय बाधा (दाएं) के साथ एक चिप से छवि। तीर चिप्स के केशिका और मूत्र चैनलों के लिए आउटलेट जलाशयों में द्रव के स्तर को दर्शाते हैं। संक्षिप्त नाम: वीईसी = संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 1: फ्लो साइटोमेट्री, चिप प्रवाह के लिए एलिसा, और एमआरएनए अलगाव। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 1: इन-टिशू कल्चर हुड सामग्री सेटअप। (ए) एमएसीएस के लिए स्थापित इन-टिशू कल्चर हुड सामग्री, जिसमें मीडिया के साथ बर्फ की बाल्टी, चुंबक स्टैंड पर चुंबक और चुंबक के नीचे शंक्वाकार ट्यूब शामिल हैं। (बी) चिप्स के लिए पेट्री डिश का इन-टिशू कल्चर हुड सामग्री सेटअप, जिसमें शीर्ष, नीचे की ओर, पेट्री डिश बॉटम के नीचे है। संक्षिप्त नाम: एमएसीएस = चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका एस 1: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले मीडिया और बफर। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस रिपोर्ट में, हम एक इसोजेनिक मानव आईपीएस सेल लाइन से संवहनी एंडोथेलियम और ग्लोमेरुलर एपिथेलियम (पोडोसाइट्स) प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार करते हैं और इन कोशिकाओं का उपयोग 3 डी अंग-ऑन-ए-चिप सिस्टम को इंजीनियर करने के लिए करते हैं जो किडनी ग्लोमेरुलस की संरचना, ऊतक-ऊतक इंटरफ़ेस और आणविक निस्पंदन कार्य की नकल करता है। यह ग्लोमेरुलस चिप एंडोथेलियम और ग्लोमेरुलर एपिथेलियम के साथ तैयार किया जाता है, जो एक साथ, चुनिंदा अणुओं को फ़िल्टर करने के लिए एक बाधा प्रदान करते हैं।

इस प्रोटोकॉल को अपनाने में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं को निम्नलिखित विचार करने चाहिए: सबसे पहले, उपयोग की जा रही स्टेम सेल लाइनों की अंतर्निहित विकास विशेषताओं के आधार पर सेल सीडिंग के लिए अनुकूलन आवश्यक हो सकता है। मानव आईपीएस सेल प्रसार दरों में आंतरिक अंतर के कारण सेल सीडिंग घनत्व भिन्न हो सकता है। यह अनुशंसा की जाती है कि शोधकर्ता प्रोटोकॉल द्वारा सुझाए गए मेसोडर्म सीडिंग घनत्व से शुरू करें, और फिर यदि आवश्यक हो तो समायोजित करें। इसी तरह, यह अनुशंसा की जाती है कि पार्श्व मेसोडर्म भेदभाव वीआईईसी उपज और 50% या उससे अधिक की छंटाई दक्षता प्राप्त करने के लिए आवश्यकतानुसार समायोजित करने से पहले सुझाए गए सेल सीडिंग घनत्व से शुरू होता है। यदि सॉर्टिंग के बाद पर्याप्त कोशिकाओं को विभेदित नहीं किया जाता है, तो टीजीएफ-बीटा अवरोधक (एसबी 431542) का उपयोग गतिशीलता को रोकने और तेजी से विस्तार करने में मदद करने के लिए किया जा सकता है ।। हालांकि, कई सेलुलर प्रक्रियाएं या सिग्नलिंग मार्ग टीजीएफ-बीटा पर निर्भर हैं (उदाहरण के लिए, हाइपरग्लेसेमिया / मधुमेह, प्रतिरक्षा होमियोस्टेसिस का रोगजनन); इस प्रकार, यह अनुशंसा की जाती है कि शोधकर्ता डाउनस्ट्रीम विश्लेषण पर टीजीएफ-बीटा निषेध के प्रभावों पर विचार करें या अनपेक्षित प्रयोगात्मक परिणामों से बचने के लिए पर्याप्त परीक्षण सुनिश्चित करें।

दूसरा, अभिकर्मक गुणवत्ता और निर्माता विनिर्देशों में संभावित भिन्नताओं को नोट करना महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से प्रोटोकॉल द्वारा निर्दिष्ट लोगों के अलावा विक्रेताओं से प्राप्त घटकों के लिए। इस प्रकार, यह अनुशंसा की जाती है कि शोधकर्ता प्रयोगों और परिणामों की प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए विभिन्न लॉट संख्याओं, आपूर्तिकर्ताओं और विक्रेताओं से अभिकर्मकों का परीक्षण करें। आम तौर पर, शोधकर्ता को डिटेचमेंट बफर में पृथक्करण एंजाइमों के लिए मानव आईपीएस कोशिकाओं के अत्यधिक जोखिम से बचना चाहिए क्योंकि इससे कोशिका व्यवहार्यता में कमी आ सकती है और कोशिकाओं की आणविक प्रोफ़ाइल बदल सकती है। इसके अतिरिक्त, सभी ट्रांस रेटिनोइक एसिड की निष्क्रियता को रोकने के लिए पोडोसाइट्स प्रेरण माध्यम को प्रकाश से बचाया जाना चाहिए। तीसरा, ऑर्गन-ऑन-ए-चिप सेल कल्चर के दौरान, चिप्स को संक्रमित करते समय माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के चैनलों में हवा के बुलबुले से बचना महत्वपूर्ण है। सेल सीडिंग के दौरान नियमित रूप से चिप्स का निरीक्षण करके, चिप छिड़काव से जुड़े हर कदम पर तरल-तरल संपर्क बनाए रखकर, और पिपेट युक्तियों और / या आकांक्षा का उपयोग करते समय तरल चैनलों में हवा को धक्का या खींचकर हवा को धक्का या खींचकर हवा के बुलबुले की उपस्थिति को कम या रोका जा सकता है।

आनुवंशिक रूप से मेल खाने वाले एपिथेलियम और एंडोथेलियम के साथ किडनी ग्लोमेरुलस चिप्स को इंजीनियर करने के पिछले प्रयासों ने पशु-व्युत्पन्न कोशिकाओं के उपयोग पर भरोसा कियाहै। जबकि इन पशु-व्युत्पन्न सेल लाइनों का उपयोग पारंपरिक रूप से प्रीक्लिनिकल अध्ययनों के लिए किया जाता है, वे अक्सर मानव शारीरिक प्रतिक्रियाओं को पुन: उत्पन्न करने में विफल रहते हैं, जो इन-ह्यूमन नैदानिक परीक्षणों की उच्च विफलता दर (89.5%) में योगदान करतेहैं। इन समस्याओं में से कुछ को दूर करने में मदद करने के लिए, कार्यात्मक इन विट्रो मॉडल जो मानव जीव विज्ञान को अधिक बारीकी से पुन: परिभाषित करते हैं, वांछनीय हैं। मानव गुर्दे के बहुकोशिकीय मॉडल विकसित करने के लिए प्रगति हुई है; हालांकि, ग्लोमेरुलस चिप्स ने विषम, गैर-इसोजेनिक स्रोतों से मानव कोशिकाओं को नियोजित किया। उदाहरण के लिए, हमने पहले मानव आईपीएस सेल-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स और प्राथमिक ऊतक-व्युत्पन्न एंडोथेलियम10 से पुनर्गठित एक ग्लोमेरुलस चिप की स्थापना की थी। अन्य शोध समूहों के अध्ययनों ने प्राथमिक कोशिकाओं 4,9, अमर कोशिकाओं 3, या एमनियोटिक द्रव-व्युत्पन्न कोशिकाओं 3,6 के मिश्रण को नियोजित किया जो व्यक्तिगत चिकित्सा में रोगी-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं या अनुप्रयोगों का अध्ययन करने के लिए उनके उपयोग को सीमित करते हैं।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक ही मानव आईपीएस सेल लाइन से संवहनी एंडोथेलियम (वीआईईसी) और ग्लोमेरुलर एपिथेलियम (पोडोसाइट्स) दोनों की व्युत्पत्ति को सक्षम करके और इन कोशिकाओं को विट्रो में किडनी ग्लोमेरुलर केशिका दीवार की संरचना और कार्य को मॉडल करने के लिए कंपार्टमेंटलाइज्ड माइक्रोफ्लुइडिक ऑर्गन-ऑन-ए-चिप उपकरणों में एकीकृत करके इन सीमाओं को दूर करता है। . मानव आईपीएस कोशिकाओं के असीमित आत्म-नवीकरण को देखते हुए, लगभग किसी भी सेल प्रकार में अंतर करने की उनकी क्षमता के साथ, यह प्रोटोकॉल ऊतक इंजीनियरिंग और अन्य बायोमेडिकल अनुप्रयोगों के लिए मानव पोडोसाइट्स और वीआईईसी की निरंतर सोर्सिंग के लिए एक अवसर भी प्रदान करता है। पोडोसाइट्स और वीआईईसी की व्युत्पत्ति के लिए इस दृष्टिकोण को कई रोगी-विशिष्ट मानव आईपीएस सेल लाइनों में पुन: पेश किया गया है, जिसमें पीजीपी 1- और डीयू 11 2,10,12,17,19 शामिल हैं, इस प्रकार वांछित रोगी आबादी से व्यक्तिगत किडनी ग्लोमेरुलस चिप्स की स्थापना को सक्षम किया गया है।

माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स के भीतर पोडोसाइट्स को अलग करने की रणनीति विकासशील मानव गुर्दे ग्लोमेरुलस और रोग मॉडलिंग के यांत्रिक अध्ययन को सक्षम बनाती है। हालांकि, विकासशील मानव गुर्दे ग्लोमेरुलस का अध्ययन वांछित आबादी के लिए समृद्ध करने के लिए छंटाई की आवश्यकता वाले वीईसी द्वारा सीमित है। यह काम उप-जनसंख्या चयन की आवश्यकता के बिना वीआईईसी के भेदभाव के तरीकों की स्थापना से लाभान्वित हो सकता है। यह अध्ययन मोटी पीडीएमएस झिल्ली द्वारा भी सीमित है जो संवहनी एंडोथेलियम और पोडोसाइट्स सेल परतों को अलग करता है। भविष्य के काम ग्लोमेरुलर तहखाने झिल्ली के आणविक और बायोफिज़िकल गुणों की बेहतर नकल करने के लिए मोटी पीडीएमएस को बदलने के लिए नए बायोमैटेरियल्स को एकीकृत कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, एक वैकल्पिक झिल्ली को इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले 50 μm मोटी पीडीएमएस झिल्ली की तुलना में पतला (अधिक जीबीएम-जैसा) होने के लिए बायोडिग्रेडेबल गुणों को रखने के लिए इंजीनियर किया जा सकता है।

फिर भी, इस प्रोटोकॉल द्वारा उत्पादित ग्लोमेरुलस चिप को दुर्बल गुर्दे की बीमारियों के तंत्र का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है और नेफ्रोटॉक्सिसिटी परीक्षण और दवा की खोज के लिए एक मंच के रूप में काम करता है। क्योंकि मानव आईपीएस कोशिकाएं दाता की आनुवंशिक प्रोफ़ाइल को बनाए रखती हैं और ग्लोमेरुलस चिप गुर्दे की बीमारी12 को मॉडल करने में सक्षम है, गुर्दे की बीमारी के वंशानुगत रूपों से पीड़ित लोगों को लाभ पहुंचाने के लिए भविष्य में नए चिकित्सीय लक्ष्यों की खोज की जा सकती है। इसके अतिरिक्त, प्रत्यारोपण के बाद की दवाओं के लिए रोगी-विशिष्ट जैविक प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन इसोजेनिक किडनी चिप का उपयोग करके अधिक सटीक रूप से किया जा सकता है जैसे कि इस अध्ययन में वर्णित है। अंत में, यह ग्लोमेरुलस चिप द्रव गतिशीलता और अंतर यांत्रिक तनाव के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए तैयार है - जैसे कि उच्च रक्तचाप या कार्डियो-रीनल सिंड्रोम के साथ गुर्दे की बीमारी के रोगियों में देखा जाता है - द्रव प्रवाह, ऊतक खिंचाव या यांत्रिक तनाव की दरों को संशोधित करने में सापेक्ष आसानी को देखते हुए। यह संभव है कि यह प्रोटोकॉल मानव गुर्दे के विकास और रोग तंत्र की वर्तमान समझ को आगे बढ़ा सकता है, साथ ही भविष्य में व्यक्तिगत चिकित्सीय के विकास की सुविधा प्रदान कर सकता है।

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Disclosures

एसएम मानव आईपीएस कोशिकाओं से पोडोसाइट्स भेदभाव से संबंधित पेटेंट पर एक आविष्कारक है। दूसरे लेखक के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को ड्यूक विश्वविद्यालय में प्रैट स्कूल ऑफ इंजीनियरिंग, ड्यूक डिपार्टमेंट ऑफ मेडिसिन में नेफ्रोलॉजी डिवीजन, बायोमेडिकल रिसर्च में व्हाइटहेड छात्रवृत्ति और एस मुसाह के लिए जेनटेक रिसर्च अवार्ड द्वारा समर्थित किया गया था। वाई रोए ड्यूक विश्वविद्यालय-अल्फ्रेड पी स्लोन फाउंडेशन छात्रवृत्ति और ड्यूक विश्वविद्यालय के बायोमेडिकल इंजीनियरिंग विभाग से विलियम एम "मोंटी" रीचर्ट ग्रेजुएट फैलोशिप के प्राप्तकर्ता हैं। डीयू 11 (ड्यूक विश्वविद्यालय क्लोन # 11) आईपीएस सेल लाइन ड्यूक आईपीएससी कोर सुविधा में उत्पन्न हुई थी और ड्यूक विश्वविद्यालय में बर्साक लैब द्वारा हमें प्रदान की गई थी। लेखक तकनीकी सहायता और सहायक चर्चाओं के लिए एन. अबुतलेब, जे. होम्स, आर. भट्टाचार्य और वाई. झोउ को धन्यवाद देते हैं। लेखक पांडुलिपि पर उपयोगी टिप्पणियों के लिए मुसाह लैब के सदस्यों को भी धन्यवाद देना चाहते हैं। लेखकएकुरी सी 6 प्रवाह साइटोमीटर के उपहार के लिए सेगुरा लैब को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
Alexa Fluor 488- and Alexa Fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo/Life Technologies A32744; A32754; A-11076; A32790; A21203; A11015
Collagen IV Thermo/Life Technologies 14-9871-82
Nephrin Progen GP-N2
PECAM-1 R&D Systems AF806
Podocin Abcam ab50339
VE-Cadherin Santa Cruz sc-9989
Basement membrane matrices
Corning Fibronectin, Human Corning 356008 Basement membrane (3)
iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment Iwai North America N8922012 Basement membrane matrix (2)
Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial BD Biosciences 354277 Basement membrane matrix (1); may show lot-to-lot variation
Cells
DU11 human iPS cells The DU11 (Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. The line has been tested and found to be free of mycoplasma (last test in November 2021) and karyotype abnormalities (July 2019)
Culture medium growth factors and media supplements
0.5M EDTA, pH 8.0 Invitrogen 15575020
2-Mercaptoethanol Thermo/Life Technologies 21985023
Albumin from Bovine serum, Texas Red conjugate Thermo/Life Technologies A23017
All-trans retinoic acid (500 mg) Stem Cell Technologies 72262
B27 serum-free supplement Thermo/Life Technologies 17504044
B-27 supplement (50x) without Vitamin A Thermo/Life Technologies 12587010
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A9418
CHIR99021 Stemgent 04-0004 May show lot-to-lot variation
Complete medium kit with CultureBoost-R Cell Systems 4Z0-500-R Podocyte maintenance media
DMEM/F12 Thermo/Life Technologies 12634028
DMEM/F12 with GlutaMAX supplement Thermo/Life Technologies 10565042 DMEM/F12 with glutamine
Forskolin (Adenylyl cyclase activator) Abcam ab120058
GlutaMAX supplement Thermo/Life Technologies 35050061 glutamine supplement
Heat-inactivated FBS Thermo/Life Technologies 10082147
Heparin solution Stem Cell Technologies 7980
Human Activin A Thermo/Life Technologies PHC9544
Human BMP4 Preprotech 120-05ET
Human BMP7 Thermo/Life Technologies PHC9544
Human VEGF Thermo/Life Technologies PHC9394
Inulin-FITC Sigma-Aldrich F3272
mTeSR1 medium Stem Cell Technologies 05850 Human iPS cell culture media (CCM). Add 5x supplement according to the manufacturer. Human iPS CCM can be stored for up to 6 months at -20 °C.
N-2 Supplement (100x) Thermo/Life Technologies 17502048
Neurobasal media Thermo/Life Technologies 21103049 Lateral mesoderm basal media
PBS (Phosphate-buffered saline) Thermo/Life Technologies 14190-250
Penicillin-streptomycin, liquid (100x) Thermo/Life Technologies 15140-163
ROCK inhibitor (Y27632) Tocris 1254
StemPro-34 SFM Thermo/Life Technologies 10639011 Endothelial cell culture medium (CCM). Add supplement according to manufacturer. Endothelial CCM can be stored for up to two weeks at 4 °C or -20 °C for up to 6 months.
TGF-Beta inhibitor (SB431542) Stem Cell Technologies 72234
Enzymes and other reagents
Accutase Thermo/Life Technologies A1110501 Cell detachment buffer
Dimethyl Suloxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2438
Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade VWR 97065-058
Paraformaldehyde (PFA) Thermo/Life Technologies 28906
Sterile distilled water Thermo/Life Technologies 15230162
Triton X-100 VWR 97062-208
Equipment
Trypsin EDTA, 0.05% Thermo/Life Technologies 25300-120
(Orb) Hub module Emulate ORB-HM1
100mm x 15 mm round petri dish Fisherbrand FB087579B
120 x 120 mm square cell culture dish VWR 688161
Accuri C6 BD Biosciences
Aspirating pipettes, individually wrapped Corning 29442-462
Aspirating Unit SP Bel-Art F19917-0150
Avanti J-15R Centrifuge Beckman Coulter B99516
Conical centrifuge tube, 15 mL Corning 352097
Conical centrifuge tube, 50 mL Corning 352098
EVOS M7000 Thermo/Life Technologies AMF7000 Fluorescent microscope to take images of fixed and stained cells.
Hemocytometer VWR 100503-092
Heracell VIOS 160i CO2 incubator Thermo/Life Technologies 51030403
Inverted Zeiss Axio Observer equipeed with AxioCam 503 camera Carl Zeiss Micrscopy 491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera)
Kimberly-Clark nitrile gloves VWR 40101-346
Kimwipes, large VWR 21905-049
Leoca SP8 Upright Confocal Microscope
Media reservoir (POD Portable Module) Emulate POD-1
Microplate shaker VWR 12620-926
Organ-chip Emulate S-1 Chip
Organ-chip holder Emulate AK-CCR
P10 precision barrier pipette tips Denville Scientific P1096-FR
P100 barrier pipette tips Denville Scientific P1125
P1000 barrier pipette tips Denville Scientific P1121
P20 barrier pipette tips Denville Scientific P1122
P200 barrier pipette tips Denville Scientific P1122
Plasma Asher Quorum tech K1050X RF This Plasma Etcher/Asher/Cleaner was used as a part of Duke University's Shared Materials Instrumentation Facility (SMiF).
Round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap Corning 352235
Serological pipette, 10 mL, indivdually wrapped Corning 356551
Serological pipette, 25 mL, indivdually wrapped Corning 356525
Serological pipette, 5 mL, indivdually wrapped Corning 356543
Steriflip, 0.22 µm, PES EMD Millipore SCGP00525
Sterile Microcentrifuge tubes Thomas Scientific 1138W14
T75cm2 cell culture flask with vent cap Corning 430641U
Tissue culture-treated 12 well plates Corning 353043
Tissue culture-treated 6 well plates Corning 353046
Vacuum modulator and perstaltic pump (Zoe Culture Module) Emulate ZOE-CM1 Organ Chip Bioreactor
VE-Cadherin CD144 anti-human antibody - APC conjugated Miltenyi Biotec 130-126-010
Wide-beveled cell lifter Corning 3008
MACS
CD144 MicroBeads, human Miltenyi Biotec 130-097-857
CD31 MicroBead Kit, human Miltenyi Biotec 130-091-935
LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 189
इसोजेनिक किडनी ग्लोमेरुलस चिप मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से इंजीनियर
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Roye, Y., Musah, S. Isogenic Kidney… More

Roye, Y., Musah, S. Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (189), e63821, doi:10.3791/63821 (2022).

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