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Bioengineering

Chip de glomérulo renal isogénico diseñado a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Published: November 4, 2022 doi: 10.3791/63821
Automatic Translation
1, 1,2,3,4
1Department of Biomedical Engineering, Pratt School of Engineering, Duke University, 2Department of Medicine, Division of Nephrology, Duke University School of Medicine, 3Department of Cell Biology, Duke University, 4Center for Biomolecular and Tissue Engineering, Duke University

Summary

Aquí se presenta un protocolo para diseñar un sistema personalizado de órgano en un chip que recapitula la estructura y función de la barrera de filtración glomerular renal mediante la integración de células endoteliales epiteliales y vasculares genéticamente emparejadas diferenciadas de las células madre pluripotentes inducidas por humanos. Este sistema de bioingeniería puede avanzar en la medicina de precisión renal y aplicaciones relacionadas.

Abstract

La enfermedad renal crónica (ERC) afecta al 15% de la población adulta de los Estados Unidos, pero el establecimiento de terapias dirigidas se ha visto limitado por la falta de modelos funcionales que puedan predecir con precisión las respuestas biológicas humanas y la nefrotoxicidad. Los avances en la medicina de precisión renal podrían ayudar a superar estas limitaciones. Sin embargo, los modelos in vitro previamente establecidos del glomérulo renal humano, el sitio primario para la filtración de sangre y un objetivo clave de muchas enfermedades y toxicidades farmacológicas, generalmente emplean poblaciones celulares heterogéneas con características funcionales limitadas y antecedentes genéticos inigualables. Estas características limitan significativamente su aplicación para el modelado de enfermedades específicas del paciente y el descubrimiento terapéutico.

Este artículo presenta un protocolo que integra epitelio glomerular derivado de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPS) y endotelio vascular de un solo paciente para diseñar un chip de glomérulo renal microfluídico isogénico y vascularizado. El chip de glomérulo resultante está compuesto por capas de células endoteliales y epiteliales derivadas de células madre que expresan marcadores específicos del linaje, producen proteínas de la membrana basal y forman una interfaz tejido-tejido que se asemeja a la barrera de filtración glomerular del riñón. El chip de glomérulo diseñado filtra selectivamente las moléculas y recapitula la lesión renal inducida por fármacos. La capacidad de reconstituir la estructura y función del glomérulo renal utilizando tipos de células isogénicas crea la oportunidad de modelar la enfermedad renal con la especificidad del paciente y avanzar en la utilidad de los órganos en chips para la medicina de precisión renal y aplicaciones relacionadas.

Introduction

Los dispositivos de órgano en un chip son modelos 3D dinámicos in vitro que emplean estimulación molecular y mecánica, así como vascularización, para formar interfaces tejido-tejido que modelan la estructura y función de órganos específicos. Los dispositivos de órgano en un chip previamente establecidos que tenían como objetivo recapitular el glomérulo del riñón (chips de glomérulo) consistían en líneas celulares animales1 o líneas celulares primarias e inmortalizadas humanas de fuentes heterogéneas 2,3. El uso de fuentes celulares genéticamente heterogéneas presenta variaciones que limitan significativamente los estudios de respuestas específicas del paciente y genética o mecanismos de enfermedad 4,5. Abordar este desafío depende de la disponibilidad de líneas celulares isogénicas originadas en individuos específicos con perfiles moleculares y genéticos preservados para proporcionar un microambiente más preciso para la ingeniería de modelos in vitro 2,3,6. Las líneas celulares isogénicas de origen humano ahora se pueden generar fácilmente debido a los avances en el cultivo celular iPS humano. Debido a que las células iPS humanas son típicamente de origen no invasivo, pueden autorrenovarse indefinidamente y diferenciarse en casi cualquier tipo de célula, sirven como una fuente atractiva de células para el establecimiento de modelos in vitro, como el chip glomérulo 7,8. La barrera de filtración glomerular es el sitio principal para la filtración de sangre. La sangre se filtra primero a través del endotelio vascular, la membrana basal glomerular, y finalmente a través de epitelio especializado llamado podocitos. Los tres componentes de la barrera de filtración contribuyen a la filtración selectiva de moléculas. Aquí se presenta un protocolo para establecer un dispositivo de órgano en un chip interconectado con endotelio vascular y epitelio glomerular de una sola fuente de células iPS humanas. Si bien este protocolo es especialmente útil para diseñar un chip isogénico y vascularizado para recapitular la barrera de filtración glomerular, también proporciona un plan para desarrollar otros tipos de órganos personalizados en chips y plataformas multiorgánicas, como un sistema isogénico de "cuerpo en un chip".

El protocolo descrito en este documento comienza con la diferenciación divergente de las células iPS humanas en dos linajes separados: mesodermo lateral y células de mesodermo, que posteriormente se diferencian en endotelio vascular y epitelio glomerular, respectivamente. Para generar células de mesodermo lateral, las células iPS humanas se sembraron en placas recubiertas con matriz de membrana basal 1 y se cultivaron durante 3 días (sin intercambio de medios) en medio N2B27 suplementado con el activador Wnt, CHIR 99021, y el potente inductor del mesodermo, morfogenético óseo 4 (BMP4). Las células del mesodermo lateral resultantes se caracterizaron previamente por la expresión de braquiuria (T), homeobox mixto pareado (MIXL) y eomesodermina (EOMAS)9. Posteriormente, las células del mesodermo lateral se cultivaron durante 4 días en un medio suplementado con VEGF165 y Forskoline para inducir células endoteliales vasculares que se clasificaron en función de la expresión de VE-Cadherina y / o PECAM-1 utilizando clasificación celular activada magnéticamente (MACS). Las células endoteliales vasculares resultantes (viEC) se expandieron cultivándolas en matraces recubiertos de 3 de la matriz de la membrana basal hasta que estuvieran listas para sembrar en el dispositivo microfluídico.

Para generar células de mesodermo, las células iPS humanas se sembraron en placas recubiertas de matriz de membrana basal 2 y se cultivaron durante 2 días en un medio que contenía activina A y CHIR99021. Las células del mesodermo resultantes se caracterizaron por la expresión de HAND1, grosecoide y brachury (T) como se describió anteriormente 2,10,11. Para inducir la diferenciación celular intermedia del mesodermo (IM), las células del mesodermo se cultivaron durante 14 días en un medio suplementado con BMP-7 y CHIR99021. Las células IM resultantes expresan el tumor de Wilm 1 (WT1), el gen de caja pareada 2 (PAX2) y la proteína relacionada 1 omitida impares (OSR-1)2,10,11.

Se diseñó un chip microfluídico basado en polidimetilsiloxano (PDMS) de dos canales para recapitular la estructura de la barrera de filtración glomerular in vitro. El canal urinario es de 1.000 μm x 1.000 μm (ancho x alto) y la dimensión del canal capilar es de 1.000 μm x 200 μm (ancho x alto). Los ciclos cíclicos de estiramiento y relajación fueron facilitados por las cámaras huecas presentes a cada lado de los canales fluídicos. Las células se sembraron en una membrana flexible de PDMS (50 μm de espesor) que separa los canales urinario y capilar. La membrana está equipada con poros hexagonales (7 μm de diámetro, 40 μm de separación) para ayudar a promover la señalización intercelular (Figura 1A)2,12. Dos días antes de que se completara la inducción IM, los chips microfluídicos se recubrieron con la matriz de membrana basal 2. Los viECs se sembraron en el canal capilar del chip microfluídico utilizando medio de mantenimiento endotelial 1 día antes de que se completara la inducción IM, y el chip se volteó boca abajo para permitir la adhesión celular en el lado basal de la membrana PDMS recubierta de ECM. El día en que se completó la inducción IM, las células se sembraron en el canal urinario del chip microfluídico utilizando un medio suplementado con BMP7, Activin A, CHIR99021, VEGF165 y todo el ácido transretinoico para inducir la diferenciación de podocitos dentro del chip. Al día siguiente, los depósitos de medios se llenaron con medio de inducción de podocitos y medio de mantenimiento endotelial, y se aplicó una tensión mecánica del 10% a 0,4 Hz y flujo de fluido (60 μL / h) a los chips.

Los chips microfluídicos celularizados se cultivaron durante 5 días adicionales utilizando medio de inducción de podocitos (en el canal urinario) y medio de mantenimiento endotelial (en el canal vascular). Los chips de glomérulo renal resultantes se cultivaron durante hasta 7 días adicionales en medios de mantenimiento tanto para el podocitos como para las células endoteliales. Los podocitos diferenciados expresaron positivamente proteínas específicas del linaje, incluyendo podocina y nefrina 13,14, mientras que los viECs expresaron positivamente las proteínas de identificación de linaje PECAM-1 y VE-Cadherina, todas moléculas esenciales para mantener la integridad de la barrera de filtración glomerular 15,16 . Se encontró que los podocitos y los viEC secretan la proteína de la membrana basal glomerular más abundante, el colágeno IV, que también es importante para la maduración y función del tejido.

Se encontró que el sistema de tres componentes de la barrera de filtración (endotelio, membrana basal y epitelio) en los chips de glomérulo filtra selectivamente las moléculas y responde a un tratamiento farmacológico nefrotóxico quimioterápico. Los resultados del tratamiento farmacológico indicaron que el chip de glomérulo se puede utilizar para estudios de nefrotoxicidad y para el modelado de enfermedades. Este protocolo proporciona la guía general para diseñar un chip de glomérulo renal microfluídico funcional a partir de derivados isogénicos de células iPS. Los análisis posteriores del chip de ingeniería se pueden llevar a cabo según lo desee el investigador. Para obtener más información sobre el uso del chip glomérulo para modelar la lesión glomerular inducida por fármacos, consulte publicaciones anteriores 2,12.

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Protocol

1. Preparar soluciones de matriz de membrana basal y sustratos recubiertos

  1. Descongelar la matriz de la membrana basal 1 durante la noche en hielo a 4 °C. Alícuota según la sugerencia del fabricante para la relación de dilución. Usando un tubo cónico de 50 ml y una pipeta, mezcle bien una cantidad adecuada de matriz de membrana basal 1 en 25 ml de DMEM/F12 frío hasta que se descongele y disuelva por completo.
    1. Para disolver una alícuota congelada, tome ~200 μL de los 25 ml de DMEM/F12 frío y transfiéralo al tubo alícuota congelado. Pipetear hacia arriba y hacia abajo hasta que la matriz esté completamente descongelada y disuelta. Transfiera el contenido completo del tubo de la matriz 1 de la membrana basal al resto del DMEM/F12 frío.
  2. Pipetear 1 ml de solución de matriz de membrana basal 1 en cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Para utilizar las placas recubiertas el mismo día, incubar a 37 °C durante 2 h.
    1. Alternativamente, las placas recubiertas pueden envolverse con parafilm y almacenarse a 4 °C durante un máximo de 2 semanas. Cuando esté listo para usar la placa almacenada, incubar a 37 °C durante 30 min.
  3. Diluir la matriz de la membrana basal 2 en 9 mL de agua destilada estéril para alcanzar una concentración final de 5 μg/mL. Pipetear 700 μL de solución de matriz 2 de membrana basal en cada pocillo de una placa de 12 pocillos. Envuelva las placas recubiertas de 2 de la matriz de membrana basal con parafilm y guárdelas a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
  4. Reconstituir la matriz 3 de la membrana basal liofilizada para lograr una concentración final de 1 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS, Ca+2- y Mg+2-libre) según lo sugerido por el fabricante. Diluir una alícuota de 250 μL hasta una concentración final de 25 μg/ml en 9,75 ml de PBS (libre de Ca+2 y Mg+2). Utilizar 6 ml de esta solución para recubrir un matraz T75 (una concentración final de 2 μg/cm2). Conservar los matraces recubiertos de matriz a 4 °C durante un máximo de 1 semana.

2. Cultivo celular iPS humano

NOTA: La línea DU11 utilizada en este protocolo se probó y se encontró que estaba libre de anomalías de micoplasma y cariotipo.

  1. Incubar placas recubiertas de matriz de membrana basal 1 a 37°C durante 1-2 h.
  2. Lave cada pocillo de la placa de 6 pocillos 3x con 1 ml de DMEM/F12 tibio (37 °C). Agregue 2 ml de medio de cultivo celular iPS humano (MCC) (Tabla suplementaria S1) a cada pocillo de la placa de 6 pocillos. Incubar las placas a 37 °C mientras se preparan las células para la siembra como se describe a continuación.
  3. Lave cada pocillo de la placa de 6 pocillos que contiene células iPS humanas con 1 ml de DMEM/F12 caliente.
  4. Aspirar el DMEM/F12. Agregue 1 ml de tampón de desprendimiento de células calientes a cada pocillo de la placa de 6 pocillos. Incubar a 37 °C durante 1 min.
  5. Inspeccione visualmente cada pocillo bajo un microscopio para la disociación alrededor de los bordes de la colonia celular. Aspire cuidadosamente el tampón de desprendimiento celular de las células. Lave suavemente cada pocillo con 1 ml de DMEM/F12 tibio.
  6. Inspeccione las placas bajo el microscopio para asegurarse de que las células no se hayan desprendido completamente de la placa o hayan sido aspiradas accidentalmente.
  7. Agregue 3 ml de CCM iPS humano caliente a cada pocillo de la placa de 6 pocillos con células. Usando un elevador de células, raspe suavemente las colonias. Con una pipeta serológica de 5 ml, mezclar suavemente la suspensión celular en cada pocillo hacia arriba y hacia abajo una vez.
  8. Saque la nueva placa recubierta de matriz de membrana basal 1 de la incubadora. Transfiera 0,5 ml de la suspensión celular a cada pocillo de la nueva placa recubierta de matriz de membrana basal 1. Mueva la placa en un movimiento en forma de ocho para distribuir las celdas uniformemente. Incubar a 37 °C en una incubadora deCO2 al 5%.
  9. Aspirar el medio gastado y reemplazarlo con 3 ml de iPS CCM humano todos los días de cultivo hasta que las células estén 70% confluentes (aproximadamente 4 días después del paso).

3. Días 0-16: diferenciación de iPSCs humanas en células intermedias de mesodermo

  1. Días 0-2: inducción del mesodermo
    1. Mover las placas recubiertas de la matriz de membrana basal de 2 °C a temperatura ambiente durante 2 h para equilibrarse después del almacenamiento.
    2. Aspirar el medio gastado de cada pocillo de la placa de 6 pocillos que contiene aproximadamente un 70% de células iPS humanas confluentes. Lave suavemente las células 3 veces con 1 ml de DMEM/F12 tibio.
    3. Aspirar el DMEM/F12. Agregue 1 ml de tampón de desprendimiento celular a cada pocillo de la placa de 6 pocillos de células iPS humanas. Incubar a 37 °C durante 5-7 min.
    4. Inspeccione visualmente cada pocillo bajo un microscopio para la disociación alrededor de los bordes de la colonia celular. Usando un elevador de células, raspe suavemente las colonias.
    5. Transfiera las suspensiones celulares de todos los pocillos de la placa de 6 pocillos a un tubo cónico de 15 ml y use un P1000 para pipetear hacia arriba y hacia abajo varias veces para obtener una suspensión de una sola celda de las células iPS.
    6. Llene la suspensión celular en el tubo cónico hasta 14 ml con DMEM/F12. Centrifugar durante 5 min a 200 × g a temperatura ambiente.
    7. Aspirar el sobrenadante. Resuspender el pellet celular en 14 ml de DMEM/F12 caliente. Repita la centrifugación durante 5 min a 200 × g a temperatura ambiente.
    8. Aspirar el sobrenadante. Resuspender las células en 1 mL de medio de inducción del mesodermo (Tabla suplementaria S1). Contar las células con un hemocitómetro. Diluir en medio de inducción de mesodermo para lograr una concentración final de 1 × 105 células/ml.
    9. Aspire el recubrimiento de la placa recubierta de 2 de la matriz de membrana basal. Enjuague cada pocillo de la matriz de membrana basal 2-recubierta 2x con 1 ml de DMEM/F12 caliente.
    10. Pipetear suavemente la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo 2x. Transfiera 1 ml de la suspensión celular a cada pocillo de la placa recubierta de 2 de la matriz de membrana basal. Mueva suavemente la placa en un movimiento en forma de ocho para distribuir las celdas de manera uniforme.
    11. Incubar la placa a 37 °C durante la noche. Al día siguiente (día 1), aspire el medio gastado de cada pocillo de la placa de 12 pocillos. Reemplácelo con 1 ml de medio de inducción de mesodermo caliente. Incubar a 37 °C durante la noche.
  2. Días 2-16: inducción intermedia del mesodermo
    1. Aspirar el medio de inducción del mesodermo gastado. Reemplácese con 1 m L de medio de inducción de mesodermo intermedio caliente (Tabla suplementaria S1). Aspire el medio gastado y reemplácelo con 1 ml de medio de inducción de mesodermo intermedio caliente todos los días durante 14 días.

4. Días 0-15: diferenciación y expansión de iPSCs humanas en células endoteliales vasculares

  1. Día 0: siembra de células iPS humanas
    1. Preparar 15 ml de iPS CCM humano con inhibidor de ROCK (Tabla suplementaria S1). Mantener caliente a 37 °C.
    2. Incubar una placa recubierta de matriz de membrana basal de 1 durante 1-2 h a 37 °C. Aspirar la matriz de la membrana basal 1. Lave 3 veces con 1 ml de DMEM/F12 caliente.
    3. Aspirar el DMEM/F12. Agregue 2 ml de iPS CCM humano con inhibidor de ROCK a cada pocillo de la placa de 6 pocillos. Incubar las placas a 37 °C mientras se preparan las células para la siembra como se describe a continuación.
    4. Aspirar el medio gastado de cada pocillo de la placa de 6 pocillos que contiene aproximadamente un 70% de células iPS humanas confluentes. Lave suavemente las células 3 veces con 1 ml de DMEM/F12 tibio.
    5. Aspirar el DMEM/F12. Agregue 1 ml de tampón de desprendimiento celular a cada pocillo de la placa de 6 pocillos de células iPS humanas. Incubar a 37 °C durante 5-7 min para disociar las células en células individuales.
      NOTA: Debido a las diferencias inherentes entre las líneas celulares iPS, el usuario deberá inspeccionar visualmente las células después de 5 minutos para determinar el tiempo de incubación óptimo.
    6. Transfiera las células a un tubo cónico de 15 ml. Lleve la suspensión celular hasta 14 ml con DMEM/F12 caliente para neutralizar el tampón de desprendimiento. Centrifugar durante 5 min a 200× g a temperatura ambiente.
    7. Aspire suavemente el sobrenadante. Resuspender las células en 1 mL de Human iPS CCM con inhibidor ROCK. Contar el número total de células con un hemocitómetro.
    8. Sembrar las células entre 37.000 a 47.000 células/cm2 (355.200 a 451.200 células/pocillo de una placa de 6 pocillos). Incubar a 37 °C durante la noche.
      NOTA: Debido a las diferencias inherentes entre las líneas celulares iPS, el usuario deberá determinar la densidad de siembra óptima.
  2. Días 1-3: inducción del mesodermo lateral
    1. Al día siguiente (día 1), aspire el medio gastado de cada pocillo de la placa de 6 pocillos de células iPS humanas. Reemplace cada pocillo de la placa de 6 pocillos con 5 ml de medio de inducción de mesodermo lateral (Tabla suplementaria S1). Al escalar el recipiente de cultivo (por ejemplo, matrazs), generalmente, reemplace con 3 veces el volumen de trabajo en el recipiente de cultivo.
    2. No cambie este medio durante 3 días.
      NOTA: El medio de inducción de mesodermo lateral en los pozos normalmente cambiará de color de rojo a amarillo a medida que las células consumen los nutrientes. Sin embargo, el medio o medio nublado con crecimiento bacteriano no es normal y debe descontaminarse y desecharse como tal.
  3. Días 4-6: inducción de células endoteliales
    1. Aspire el medio gastado de cada pocillo de la placa de 6 pocillos. Reemplace cada pocillo de la placa de 6 pocillos con 3 ml de medio de inducción endotelial caliente (Tabla suplementaria S1). Incubar la placa a 37 °C durante la noche.
    2. Durante los siguientes 2 días (días 5 y 6), recoja el medio gastado de todos los pocillos en un tubo cónico de 50 ml. Conservar el tubo cónico a 4 °C. Reponer las células con 3 ml de medio de inducción endotelial caliente. Incubar la placa a 37 °C.
  4. Día 7: clasificación de células endoteliales (viEC)
    1. Saque los matraces de la matriz de membrana basal 3 y déjelos a temperatura ambiente durante 1 h.
    2. Prepare 50 ml de tampón MACS (Tabla suplementaria S1).
    3. Coloque el tampón de desprendimiento celular, el tampón MACS, el CCM endotelial y el PBS (libre de Ca 2+ y Mg2+) sobre hielo en la campana de cultivo de tejidos.
    4. Coloque el imán en el soporte MACS. Coloque dos tubos cónicos de 50 ml y uno de 15 ml en un soporte de tubo cónico.
    5. Coloque el soporte MACS (con el imán conectado) y una columna LS en la campana de cultivo de tejidos. Coloque el soporte de tubo cónico (con tubos cónicos en el interior) en el soporte MACS, debajo del imán (Figura suplementaria S1A).
    6. Recoger el medio gastado de cada pocillo de la placa de 6 pocillos en el tubo cónico de 50 ml del paso 4.3.2. Lave cada pocillo de la placa de 6 pocillos con PBS (libre de Ca 2+ y Mg2+).
    7. Aspirar el PBS. Agregue 1 ml de tampón de desprendimiento celular. Incubar a 37 °C durante 5-7 min para disociar completamente las células.
    8. Transfiera las células a un tubo cónico de 50 ml. Llevar la suspensión celular a 15 mL con CCM endotelial fría. Centrifugar a 200 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
    9. Aspirar el sobrenadante. Resuspender las células en 1 ml de tampón MACS frío. Cuente las células con un hemocitómetro.
    10. Agregue 10 ml de tampón MACS a la suspensión celular. Centrifugar durante 5 min a 200 × g a temperatura ambiente.
    11. Aspirar el sobrenadante. Resuspender las células en 80 μL de tampón MACS por cada 10 millones de células. Agregue 20 μL por cada 10 millones de células de reactivo bloqueador FcR, microperlas CD31 y microperlas CD144. Incubar durante 15 min sobre hielo.
    12. Mientras la suspensión celular se está incubando, centrifugar el medio recogido de la inducción endotelial (paso 4.3.2) a 200 × g durante 10 min.
    13. Recoja el sobrenadante en un filtro de vacío de 500 ml a 0,22 μm. Preparar el medio Endotelial Condicionado (Tabla Suplementaria S1). Filtrar el medio en condiciones estériles y mantener el medio caliente a 37 °C.
      NOTA: La tasa de proliferación de células endoteliales comenzará a disminuir después del pasaje 3. Para lograr un crecimiento exponencial después del paso 3, el medio endotelial acondicionado y de mantenimiento puede complementarse con un inhibidor de TGF-Beta de 10 μM (SB431542) a partir del pasaje 1.
    14. Después de la incubación de 15 minutos en el paso 4.4.11, agregue 10 ml de tampón MACS por 10 millones de células (máximo 30 ml de tampón MACS) a la suspensión celular. Centrifugar a 200 × g durante 5 min.
    15. Aspirar el sobrenadante. Resuspender en 1 ml de tampón MACS.
    16. Tome la columna LS y saque el émbolo de la jeringa. Vuelva a colocar el émbolo en la funda de plástico. Coloque la columna sobre el imán.
    17. Coloque el primer tubo cónico de 50 ml debajo de la columna. Agregue 1 ml de búfer MACS a la columna. Recoja en el tubo cónico de 50 ml debajo.
    18. Deje que el líquido fluya, aunque no completamente para evitar que la columna se seque. Cuando las gotas de líquido comiencen a gotear lentamente, agregue la suspensión celular a la columna. Recoja el flujo en el mismo tubo cónico de 50 ml.
    19. Cuando las gotas de líquido comiencen a gotear lentamente, coloque el siguiente tubo cónico de 50 ml debajo de la columna. Agregue el flujo inicial (paso 4.4.18) a la columna. Recoja en el tubo cónico de 50 ml debajo.
    20. Cuando las gotas líquidas comiencen a gotear lentamente, agregue 500 μL de tampón MACS 3x para lavar la columna.
    21. Retire la columna del imán. Coloque la columna en el tubo cónico de 15 ml. Agregue 1 ml de PBS frío a la columna.
    22. Para recoger las células, tome el émbolo de la manga de plástico y empújelo firmemente en la columna.
    23. Contar las células con un hemocitómetro. Lleve la suspensión celular a 5 ml con PBS. Centrifugar durante 5 min a 200 × g.
    24. Mientras las células están sometidas a centrifugación, lave el matraz 3 recubierto de matriz de membrana basal 3x con 5 ml de PBS para prepararse para la siembra celular. Aspirar el PBS y añadir 20 mL de medio Endotelial Acondicionado al matraz 3-recubierto de la matriz de membrana basal.
    25. Retire las células de la centrífuga y aspire el sobrenadante. Resuspender las células en medio Acondicionado Endotelial para ser sembradas a 26.000 células/cm2 (1,95 × 106 células /matraz T75). Siembra las células.
    26. Para calcular la eficiencia de clasificación y el rendimiento de celdas, divida el recuento de celdas del paso 4.4.23 por el recuento de celdas del paso 4.4.9.
  5. Días 8-15: expansión de viECs
    1. Al día siguiente (día 8), aspirar el medio gastado del matraz. Reemplazar con 10 mL de medio Endotelial Acondicionado. Reemplace el medio acondicionado endotelial cada dos días hasta que el matraz esté en un 90% de fluidez o hasta que el frasco de medio acondicionado endotelial esté completamente utilizado.
    2. Aspirar el medio gastado y reemplazarlo con 10 ml de medio de mantenimiento endotelial (Tabla suplementaria S1) cada dos días para continuar la expansión.
    3. Para pasar los viECs, preparar dos matraces T75 recubiertos con matriz de membrana basal 3. Dejar los matraces a temperatura ambiente durante 1 h. Lave bien los matraces recién preparados 3 veces con 5 ml de PBS.
    4. Aspirar el PBS. Añadir 10 ml de medio de mantenimiento endotelial tibio a cada matraz recién preparado. Incubar las placas a 37 °C mientras se preparan las células para la siembra como se describe a continuación.
    5. Añadir 5 ml de tampón de desprendimiento celular a un matraz T75 confluente al 90% de viECs. Incubar a 37 °C durante 5-7 min. Transfiera las células a un tubo cónico de 15 ml. Agregue 5 ml de DMEM/F12 caliente. Centrifugar a 200 × g durante 5 min.
    6. Aspirar el sobrenadante. Resuspender en 1 mL de medio de mantenimiento endotelial caliente. Añadir 500 μL de suspensión celular a cada uno de los matraces T75 recién preparados.
    7. Al día siguiente, aspira el medio gastado. Reemplácese con 10 mL de medio de Mantenimiento Endotelial. Aspirar el medio gastado y reemplazar con 10 ml de medio de mantenimiento endotelial cada dos días hasta que el matraz esté al 90% confluente.

5. Día 14: preparación de dispositivos de chips de órganos microfluídicos para cultivo celular

  1. Tratamiento de plasma y recubrimiento de matriz 2 de membrana basal
    1. Preparar la solución de la matriz 2 de la membrana basal (paso 1.3). Déjalo a un lado.
    2. En una campana de cultivo de tejidos estéril, desembale la placa de Petri redonda estéril de 100 mm x 15 mm. Coloque la parte superior de la placa de Petri, mirando hacia abajo, debajo de la parte inferior de la placa de Petri (Figura suplementaria S1B).
    3. Usando pinzas, saque los chips microfluídicos del paquete y colóquelos dentro de la placa de Petri. Cierre la placa de Petri usando la tapa de debajo del plato.
    4. En el asher de plasma, coloque la tapa de la placa de Petri debajo del plato, con la parte superior hacia abajo, manteniéndolos juntos como una unidad. Coloque la unidad de placa de Petri en la cámara de plasma asher. Inicie el asher de plasma con oxígeno a 100 W, 15 SCCM, 30 s.
    5. Sensible al tiempo: Una vez que se complete el tratamiento, saque la unidad de placa de Petri del aher de plasma. Limpie rápida y ligeramente la tapa de la placa de Petri con etanol al 70% rociado sobre una toallita de laboratorio. Cubra la placa de Petri con su tapa.
    6. Lleve la placa de Petri a la campana de cultivo de tejidos estériles. Agregue suavemente 25 μL de solución de matriz 2 de membrana basal en el canal urinario (superior) del chip. Agregue 20 μL de solución de matriz 2 de membrana basal en el canal capilar (inferior) del chip.
    7. Tome dos tapas de tubo cónicas estériles de 15 ml y llénelas con agua destilada estéril (~ 500 μL). Coloque la tapa en la placa de Petri para evitar que los canales de chip y la membrana se sequen. Coloque la tapa sobre el plato. Incubar a 37 °C durante la noche.

6. Siembra de viECs y células intermedias del mesodermo en los dispositivos microfluídicos

  1. Día 15: viECs
    1. Aspirar el medio a partir de matraces T75 que contengan un 90% de viECs confluentes. Añadir 5 ml de tampón de desprendimiento celular e incubar a 37 °C durante 5-7 min.
    2. Transfiera las células a un tubo cónico de 15 ml. Añadir 5 ml de DMEM/F12. Centrifugar a 200 × g durante 5 min.
      NOTA: Cada matraz T75 con aproximadamente un 90% de viECs confluentes producirá ~3 millones de células.
    3. Aspirar el sobrenadante. Resuspender las células en 300 μL de medio de mantenimiento endotelial para obtener aproximadamente 2 millones de células/300 μL. Contar las células con un hemocitómetro. Deje a un lado la suspensión de la celda.
    4. Transfiera la placa de Petri que contiene los chips microfluídicos a la campana de cultivo de tejidos. Coloque una punta de barrera P200 en la punta de un aspirador.
    5. Enjuague los canales superior e inferior del chip microfluídico con 200 μL de DMEM/F12 mientras aspira simultáneamente la periferia de la salida.
    6. Sostenga el chip firmemente con la punta de barrera P200 unida al aspirador, lejos de la salida del canal inferior. Inyecte firmemente 20 μL de la suspensión viEC con aproximadamente 134.000 células en el canal capilar (inferior) del chip. Aspire cuidadosamente el medio desde la periferia de la salida.
    7. Verifique bajo el microscopio si hay burbujas o una densidad de siembra viEC desigual.
    8. Voltee suavemente el chip para invertirlo de modo que los viEC puedan adherirse al lado basal de la membrana flexible de PDMS. Coloque el chip en el cartucho del soporte. Agregue 3 ml de PBS en el cartucho portachips para evitar que la membrana se seque. Incubar el chip a 37 °C durante 3 h.
    9. Verifique el canal inferior bajo el microscopio para ver si hay una capa confluente de viECs unidos a la membrana flexible de PDMS. Coloque 200 μL de medio de mantenimiento endotelial en la entrada del canal inferior y deje que fluya a través del canal para lavar el canal de células endoteliales no unidas mientras aspira cuidadosamente desde la periferia de la salida del canal capilar (inferior).
    10. Vuelva a colocar el chip en el cartucho del soporte. Incubar a 37 °C durante la noche.
  2. Día 16: células intermedias del mesodermo (IM)
    1. Enjuague suavemente el canal capilar (inferior) con 200 μL de medio de mantenimiento endotelial mientras aspira cuidadosamente la periferia del puerto de salida.
    2. Enjuague el canal urinario (superior) con 200 μL de DMEM/F12 mientras aspira cuidadosamente la periferia de la salida. Deje caer ~50 μL de DMEM/F12 en los puertos de entrada y salida.
    3. Aspirar el medio de inducción del mesodermo intermedio de cada pocillo de la placa de 12 pocillos.
      NOTA: Cada pocillo al final de la diferenciación da aproximadamente 1,5 millones de células IM.
    4. Añadir 1 ml de tripsina-EDTA a cada pocillo de la placa de 12 pocillos e incubar a 37 °C durante 5 min.
    5. Raspa suavemente las células con un elevador de células y pipetea hacia arriba y hacia abajo para disociar las células con un P1000. Agregue 2 ml de solución de neutralización de tripsina (Tabla suplementaria S1) a cada pocillo. Transfiera las células a un tubo cónico de 50 ml. Llevar el volumen de suspensión celular a 50 ml con DMEM/F12 y centrifugar a 200 × g durante 5 min.
    6. Aspirar el sobrenadante. Resuspender las células en 500 μL de medio de inducción de mesodermo intermedio para obtener aproximadamente 3 millones de células/500 μL. Contar las células con un hemocitómetro.
    7. Sostenga el chip firmemente con la punta de barrera P200 unida al aspirador, lejos de la salida del canal urinario (superior). Inyecte firmemente 25 μL de suspensión celular con aproximadamente 112.500 células IM en el canal urinario (superior) del chip y aspire cuidadosamente el medio desde la periferia de la salida.
    8. Verifique bajo el microscopio si hay burbujas o una densidad de siembra de células IM desigual. Agregue 3 ml de PBS en el cartucho del soporte del chip. Incubar a 37 °C durante 3 h.
    9. Enjuague ambos canales con 200 μL de su respectivo medio de cultivo celular mientras aspira cuidadosamente la periferia de las salidas del chip para ayudar a evitar el flujo hacia atrás del medio gastado y los desechos celulares.
    10. Coloque puntas de barrera P200 vacías en ambas salidas de los canales urinario y capilar. Pipetear 200 μL de medio de mantenimiento endotelial e inyectar la mitad del mismo en la entrada del canal capilar. Suelte la punta de la pipeta dentro de la entrada de tal manera que tanto la entrada como la salida del canal estén ahora unidas a las puntas de pipeta llenas de medio.
    11. Pipetear 200 μL de medio de mantenimiento IM e inyectar la mitad en la entrada del canal urinario. Suelte la punta de la pipeta dentro de la entrada de tal manera que tanto la entrada como la salida del canal estén ahora unidas a las puntas de pipeta llenas de medio. Incubar las patatas fritas con puntas incrustadas a 37 °C durante la noche.
  3. Conecte los chips al biorreactor Organ Chip para aplicar flujo de fluido y tensión mecánica.
    1. Retire las puntas P200 de los canales urinario y capilar. Agregue gotitas de los medios respectivos a la entrada y salida de los canales urinario y capilar para evitar que se sequen.
    2. Agregue 3 ml de medio de inducción de podocitos caliente (Tabla suplementaria S1) al depósito de entrada urinaria. Agregue 3 ml de medio de mantenimiento endotelial caliente al depósito de entrada capilar.
    3. Agregue 300 μL de medio de inducción de podocitos caliente al depósito de salida del canal urinario directamente sobre el puerto de salida. Agregue 300 μL de medio de mantenimiento endotelial caliente al depósito de salida del canal capilar directamente sobre el puerto de salida.
    4. Deslice las cápsulas en la bandeja y en el biorreactor Organ Chip.
    5. Utilice el dial giratorio del biorreactor Organ Chip para seleccionar e iniciar el Prime Cycle (2 min). Inspeccione visualmente la parte inferior de la cápsula en busca de pequeñas gotas en los cuatro puertos fluídicos.
    6. Para lograr el contacto fluido-fluido entre la parte inferior del Pod y los puertos del chip microfluídico, deslice suavemente el portador del chip en el Pod. Presione suavemente la pestaña del portador de chip hacia adentro y hacia arriba. Aspire el exceso de medio de la superficie del chip.
    7. Ajuste el caudal del biorreactor Organ Chip a 60 μL/h. Ajuste la deformación cíclica al 10% a 0,4 Hz. Utilice el dial giratorio del biorreactor Organ Chip para seleccionar el ciclo de regulación y funcionar durante 2 h.
    8. Inspeccione visualmente los depósitos de salida para un aumento en el nivel de medio.
    9. Utilice el dial giratorio del biorreactor Organ Chip para seleccionar el ciclo Regular.

7. Días 17-21 y más allá: inducción de podocitos y mantenimiento de chips

  1. Aspirar el medio de los depósitos de salida del canal urinario en diagonal lejos del puerto, pero mantener algo de medio en el reservorio todos los días de cultivo. Reponga el depósito de entrada del canal urinario con hasta 3 ml de medio de inducción de podocitos cada 2 días durante 5 días.
    1. Después de 5 días, aspire el medio del canal urinario, pero mantenga algo de medio en el reservorio. Reponer diariamente el depósito de entrada del canal urinario con 3 mL de medio de mantenimiento de podocitos.
  2. Aspirar el medio de los depósitos de salida del canal capilar en diagonal lejos del puerto, pero mantener algo de medio en el depósito todos los días de cultivo. Reponer diariamente el depósito de entrada del canal capilar con hasta 3 mL de medio de mantenimiento endotelial.

8. Ensayo funcional e imágenes de inmunofluorescencia

NOTA: Consulte el Archivo suplementario 1 para obtener detalles sobre el análisis de citometría de flujo, ELISA para efluentes de chip y aislamiento de ARNm.

  1. Ensayo funcional (filtración molecular) con inulina y albúmina
    1. Aspire el medio desde el depósito de salida del canal capilar en diagonal lejos del puerto, pero mantenga algo de medio en el depósito. Reemplazar con 3 mL de medio de Mantenimiento Endotelial suplementado con inulina y albúmina (Tabla Suplementaria S1) durante 6 h.
    2. Con una pipeta serológica de 5 ml, medir el volumen (en ml) del medio desde el canal urinario y transferir a un tubo cónico de 15 ml. Envuelva el tubo en papel de aluminio para protegerlo de la luz y minimizar el fotoblanqueo de la inulina y la albúmina conjugadas con fluoróforos. Reponer el reservorio con 3 mL de medio de mantenimiento de podocitos.
    3. Preparar una solución madre de inulina en medio de mantenimiento de podocitos. A partir de 25 μg/ml de inulina, preparar ocho patrones de inulina mediante una dilución seriada 2x en medio de mantenimiento de podocitos.
    4. Del mismo modo, prepare una solución madre de albúmina en medio de mantenimiento de podocitos. A partir de 150 μg/ml de albúmina, preparar ocho patrones de albúmina mediante una dilución seriada 2x en medio de mantenimiento de podocitos.
    5. Pipetear por duplicado 100 μL de cada concentración estándar de inulina en cada pocillo de una placa negra de 96 pocillos (o 16 pocillos totales de inulina). Pipetear por duplicado 100 μL de cada concentración estándar de albúmina en cada pocillo de la misma placa de 96 pocillos (16 pocillos totales de albúmina). Pipetear en medio duplicado de mantenimiento de podocitos de 100 μL para que sirva como blanco (o dos pocillos totales de medio de mantenimiento de podocitos).
    6. Pipetear por duplicado 100 μL de medio efluente del canal urinario a cada pocillo de la misma placa de 96 pocillos. Pipetear por duplicado 100 μL de medio efluente del canal capilar.
    7. Inserte la placa en el lector de placas y mida la fluorescencia de la albúmina a excitación de 550 nm y la emisión de 615 nm. Mida la misma placa para la inulina a excitación 513 nm y emisión 577 nm.
    8. A partir de los datos generados, promedie las mediciones duplicadas (por chip). Resta el valor en blanco correspondiente a esa lectura de placa del resto de los datos de la hoja.
    9. Trazar los valores correspondientes a los patrones de albúmina para crear una curva estándar con concentración [μg/mL] en el eje x y fluorescencia en el eje y. Trazar los valores correspondientes a los patrones de inulina para crear una curva estándar con concentración [μg/mL] en el eje x y fluorescencia en el eje y.
    10. Utilice un paquete de software de análisis estadístico e interpolación lineal para determinar la concentración urinaria de inulina y albúmina, respectivamente, en el medio efluente de los chips.
    11. Determine el aclaramiento urinario de inulina/albúmina de los chips usando la ecuación (1)2:
      Aclaramiento urinario = ([U] × UV) / [P] (1)
      Donde [U] es la concentración urinaria del paso 8.1.10, UV es el volumen de efluente del canal urinario recogido del paso 8.1.2, y [P] es la concentración capilar de inulina o albúmina (10 μg/ml de inulina o 100 μg/ml de albúmina).
  2. Imágenes de inmunofluorescencia
    1. Inyecte una punta P200 vacía en los puertos de salida de los canales urinario y capilar. Para fijar las células, pipetear 200 μL de formaldehído al 4% e inyectar la mitad en la entrada del canal inferior. Suelte la punta de la pipeta dentro de la entrada.
    2. Pipetear 200 μL de formaldehído al 4% e inyectar la mitad en la entrada del canal urinario. Suelte la punta de la pipeta dentro de la entrada de tal manera que tanto la entrada como la salida del canal estén ahora unidas a puntas de pipeta llenas de fijador.
    3. Incubar las patatas fritas a temperatura ambiente durante 20 min.
    4. Después de 20 minutos, deseche todas las puntas de la pipeta. Inyecte puntas P200 limpias y vacías en los puertos de salida de los canales urinario y capilar. Para permeabilizar las células, pipetear 200 μL de Triton X-100/PBS al 0,125% e inyectar la mitad en la entrada del canal capilar. Suelte la punta de la pipeta dentro de la entrada.
    5. Pipetear 200 μL de Triton X-100/PBS al 0,125% e inyectar la mitad en la entrada del canal urinario. Suelte la punta de la pipeta dentro de la entrada. Incubar el chip a temperatura ambiente durante 5 min.
    6. Deseche todas las puntas de la pipeta. Inyecte puntas P200 limpias y vacías en los puertos de salida de los canales urinario y capilar. Para bloquear las células, pipetear 200 μL de albúmina sérica bovina (BSA) al 1% en Triton X-100/PBS al 0,125% e inyectar la mitad en la entrada del canal capilar. Suelte la punta de la pipeta dentro de la entrada.
    7. Pipetear 200 μL de BSA al 1% en Triton X-100/PBS al 0,125% e inyectar la mitad en la entrada del canal urinario. Suelte la punta de la pipeta dentro de la entrada. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
    8. Deseche todas las puntas de la pipeta. Lave ambos canales 3 veces pipeteando 200 μL de Triton X-100/PBS al 0,125% en cada canal e incubando a temperatura ambiente durante 5 min.
    9. Preparar 100 μL de anticuerpo primario por canal con la dilución recomendada por el fabricante en Triton X-100/PBS al 0,125%. Inyecte puntas P200 limpias y vacías en los puertos de salida de los canales urinario y capilar. Pipetear 100 μL de anticuerpo primario e inyectar la mitad en los canales respectivos. Suelte la punta de la pipeta dentro de la entrada.
    10. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente o, para obtener mejores resultados, durante la noche a 4 °C.
      NOTA: Se pueden aplicar múltiples anticuerpos primarios a la vez; Sin embargo, la solución primaria de anticuerpos debe diluirse de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    11. Lave los canales 3 x 10 min como se describe en el paso 8.2.8.
    12. Preparar 100 μL de anticuerpo secundario por canal con el factor de dilución recomendado por el fabricante en Triton X-100/PBS al 0,125%. Inyecte puntas P200 limpias y vacías en los puertos de salida de los canales urinario y capilar. Pipetear 100 μL de anticuerpo secundario e inyectar la mitad en los canales respectivos. Suelte las puntas de la pipeta dentro de la entrada. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
      NOTA: Cada anticuerpo secundario debe aplicarse por separado. Lavar al menos 3 x 10 min entre cada aplicación según el paso 8.2.8.
    13. Lave los canales 3 x 10 min como se describe en el paso 8.2.8.
    14. Enjuague ambos canales una vez con 200 μL de agua destilada mientras aspira el líquido residual desde la periferia de los puertos de salida del chip.
    15. Inyecte P200 limpio y vacío en los puertos de salida de los canales urinario y capilar. Para contrarrestar la tinción de las células, pipetear 200 μL de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, dilución 1:1.000 en agua destilada) e inyectar la mitad en la entrada del canal capilar. Suelte la punta de la pipeta dentro de la entrada, y pipete 200 μL de DAPI e inyecte la mitad en la entrada del canal urinario. Suelte la punta de la pipeta dentro de la entrada e incube a temperatura ambiente durante 5 min.
    16. Deseche todas las puntas de la pipeta. Inyecte puntas P200 limpias y vacías en los puertos de salida de los canales urinario y capilar. Para contrarrestar las células, pipetear 200 μL de faloidina (dilución 1:1.000 en PBS sin Ca2+ y Mg2+) e inyectar la mitad en la entrada del canal capilar y liberar la punta de la pipeta dentro de la entrada. Pipetear 200 μL de faloidina (dilución 1:1.000 en PBS sin Ca 2+ y Mg2+) e inyectar la mitad en la entrada del canal urinario y liberar la punta de la pipeta dentro de la entrada. Incubar a temperatura ambiente durante 15 min.
    17. Enjuague los canales 3x con 200 μL de PBS sin Ca 2+ y Mg2+, y aspire el exceso de líquido desde la periferia de los puertos de salida.
    18. Visualiza los chips.

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Representative Results

Aquí mostramos que un modelo funcional 3D in vitro del glomérulo puede ser vascularizado y epitelizado a partir de una fuente isogénica de células iPS humanas. Específicamente, este protocolo proporciona instrucciones sobre cómo aplicar la tecnología de células iPS humanas, particularmente su capacidad para diferenciarse en tipos de células especializadas, para generar epitelio glomerular renal (podocitos) y endotelio vascular (viECs) que pueden integrarse con dispositivos microfluídicos para modelar la estructura y función del riñón humano a nivel específico del paciente. Una descripción esquemática de este protocolo y línea de tiempo (Figura 1A) describe cómo cultivar células iPS humanas mitóticamente activas (Figura 1B) y luego diferenciarlas (en paralelo) en linajes celulares de mesodermo y mesodermo lateral (Figura 1C, D). Se encontró que las células del mesodermo resultantes expresaban braquiuria (T), mientras que las células del mesodermo lateral expresaban braquiuria (T), MIXL y EOMES 2,9,10,11.

La diferenciación posterior de las células del mesodermo produjo células intermedias del mesodermo (IM), mientras que la diferenciación de las células del mesodermo lateral produjo viECs (Figura 1D)2,10,11,17. El análisis de citometría de flujo se utilizó para examinar la expresión de CD144 en viECs diferenciadas (antes y después de la clasificación MAC) en comparación con los controles negativos (incluidas las células iPS humanas indiferenciadas teñidas y no teñidas y el endotelio no teñido). Una diferenciación endotelial optimizada dará como resultado un 50% o más de células CD31/CD144 positivas antes de la clasificación MAC, lo que mejorará significativamente después de la clasificación celular en comparación con los controles. Los resultados representativos muestran una eficiencia de diferenciación del 59% para CD144 antes de la clasificación MAC, que aumentó a 77% o más células CD144 positivas (sin incluir las células CD31 positivas) después de la clasificación MAC (Figura 1E).

En el día 14 de este protocolo (antes de la finalización de la diferenciación IM y la expansión viEC), los dispositivos de órgano en un chip se prepararon para la siembra celular mediante tratamiento con plasma y funcionalización con matriz de membrana basal 2. Al día siguiente (día 15 del protocolo), los viECs se sembraron en el canal capilar (inferior) del dispositivo microfluídico con medio viEC. El día después de la siembra viEC (día 16 del protocolo), las células IM se sembraron en el canal urinario (superior) del dispositivo microfluídico con medio de inducción de podocitos. Al día siguiente de la siembra de células IM (día 17 de este protocolo), se aplicó un caudal de fluido de 60 μL/h y una deformación del 10% a 0,4 Hz a los chips de glomérulo. Estos chips experimentan un esfuerzo cortante de 0.017dyn cm−2 y 0.0007dyn cm−2 en los canales capilar y urinario, respectivamente 2,12. Después de hasta 5 días de inducción de podocitos y 6 días de propagación del endotelio vascular en el chip (día 21 de este protocolo) (Figura 2A), las células resultantes dentro de los chips de glomérulo expresaron marcadores de identificación de linaje.

Específicamente, los podocitos en el canal urinario expresaron podocina y nefrina (Figura 2B, panel superior), y los viECs en el canal capilar expresaron PECAM-1 (CD31) y VE-Cadherina (CD144) (Figura 2B, panel inferior). Además, tanto la capa de podocitos como la de viEC expresan colágeno IV, la proteína GBM más abundante (Figura 2B) en el glomérulo renal. Se expresa más colágeno IV en el canal urinario porque los podocitos son los productores predominantes de colágeno IV, incluida la isoforma α3α4α5, que es la principal isoforma heterotrímero del colágeno en el glomérulo maduro. Además, los podocitos propagados en los chips del glomérulo desarrollaron procesos del pie y secretaron VEGF165, ambos rasgos característicos de los modelos funcionales del glomérulo renal 2,12. Este protocolo también proporciona una evaluación de la función de filtración molecular selectiva del glomérulo renal utilizando inulina y albúmina, a partir de las cuales los chips de glomérulo filtran selectivamente pequeñas moléculas (inulina) del capilar hacia el canal urinario, evitando que las proteínas grandes (albúmina) salgan del canal capilar (Figura 2C)2,10,12.

Como cada línea celular iPS humana exhibe diferencias inherentes en el tiempo de duplicación, es importante tener en cuenta que las densidades óptimas de siembra celular para diferentes líneas celulares pueden variar y, por lo tanto, deben ser optimizadas por el investigador. Para la diferenciación de células endoteliales, si la densidad de siembra de las células iPS humanas es demasiado baja, el investigador puede observar un menor rendimiento de células endoteliales diferenciadas (<30% de eficiencia). Si la densidad de siembra de las células iPS humanas es demasiado alta, el investigador puede observar un rápido crecimiento excesivo de las células, desprendimiento o adhesión más pobre, aumento de la muerte celular y bajo rendimiento (<30% de eficiencia). Durante la inducción endotelial (días 4-7 de diferenciación), un aumento en el número de células que resulta en una capa secundaria de células es normal, pero debe mantenerse al mínimo (Figura 3A). Para la diferenciación IM y de podocitos, la sobresiembra de células iPS humanas (>100.000 células/pocillo de una placa de 12 pocillos) puede dar lugar a células IM que crecen en grandes grupos o forman agregados, lo que puede impedir la diferenciación y dar lugar a podocitos con un fenotipo morfológico menos maduro de células agregadas y menos procesos secundarios y/o terciariosdel pie 10, 11.

Durante el cultivo de chips microfluídicos, se puede observar un flujo cruzado de fluido inesperado entre los canales urinario y capilar (Figura 3B) si hay ruptura o unión inadecuada de los componentes del chip PDMS, o si se bloquea la trayectoria del flujo de fluido. Este flujo cruzado de fluido no deseado también puede ser el resultado de una barrera de filtración comprometida, como modelos de tejido de siembra celular inadecuada (baja) o capas celulares dañadas. Para evitar este problema, se recomienda que el investigador siga el protocolo recomendado y las densidades de siembra celular, así como inspeccione visualmente los chips en busca de burbujas de aire en los canales en cada etapa del proceso. Si se observan burbujas de aire en los depósitos de medios de los chips microfluídicos que están bajo flujo de fluido, la bomba puede detenerse y el medio desgasificarse en condiciones estériles.

Juntos, este protocolo y los resultados representativos describen la derivación del endotelio vascular (viECs) y el epitelio glomerular (podocitos) de una línea celular iPS humana isogénica, y su reconstitución en un dispositivo microfluídico de órgano en un chip para recapitular la estructura y función de la barrera de filtración glomerular renal de una manera específica para el paciente.

Figure 1
Figura 1: Derivación del epitelio glomerular isogénico y del endotelio vascular a partir de células iPS humanas. (A) Línea de tiempo esquemática de la inducción intermedia de mesodermo y viEC, diseño de órgano en un chip y recubrimiento de matriz de membrana basal, siembra celular en el chip e inducción de podocitos dentro del chip. (B) Imágenes representativas de campo claro de células iPS humanas PGP1 antes de la disociación en el día 0 del protocolo. (C) Imágenes representativas de campo claro de células de mesodermo PGP1 en el día 2 de diferenciación (izquierda) y células intermedias de mesodermo en el día 8 de diferenciación (derecha). (D) Imágenes representativas de campo claro de células de mesodermo lateral PGP1 en el día 3 de diferenciación (izquierda) y viECs PGP1 en el día 9 de diferenciación (2 días de expansión) (derecha). Barras de escala = 275 μm (B-D). (E) Cuantificación de la diferenciación viEC mediante análisis de citometría de flujo para células CD144 positivas en el día 7 de diferenciación de células endoteliales antes de MACS (azul) y en el día 9 de expansión de células endoteliales después de MACS (rosa) en comparación con iPSCs humanas teñidas con CD144 (negro) y células endoteliales no teñidas (rojo). Esta cifra se ha modificado de12. Abreviaturas: iPSCs = células madre pluripotentes inducidas; viEC = células endoteliales vasculares; BMP4/7 = proteína morfogenética ósea 4/7; AR = ácido retinoico; VEGF = factor de crecimiento endotelial vascular; MACS = clasificación celular activada magnéticamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Imágenes representativas del endotelio vascular y epitelio glomerular (capa de podocitos) cultivadas dentro del chip del glomérulo renal microfluídico. Imágenes representativas de campo claro de viECs (izquierda) y epitelio glomerular (podocitos) (derecha) propagadas en el chip de glomérulo. Barras de escala = 183 μm. (B) Imágenes inmunofluorescentes representativas del epitelio glomerular (podocitos) y viEC que muestran la expresión de marcadores específicos del linaje. Barras de escala = 100 μm. (C) Datos representativos que muestran filtración molecular selectiva en el chip de glomérulo. Las barras de error representan SD. p < 0,0001. Esta cifra se ha reproducido a partir de 12. Abreviaturas: viECs = células endoteliales vasculares; VE-cadherina = CD144; PECAM-1 (= CD31) = molécula de adhesión de células endoteliales plaquetarias. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Imágenes de densidad de siembra de endotelio subóptima y flujo de fluido desigual en los chips microfluídicos . (A) Imágenes representativas de campo claro de cultivos celulares óptimos (izquierda) y sobresembrados (derecha) en el día 6 de diferenciación viEC. Barras de escala = 275 μm. (B) Imágenes representativas de depósitos de salida de chips microfluídicos con un flujo de fluido uniforme y una barrera funcional (izquierda). Imagen de un chip con flujo de fluido desigual o barrera disfuncional (derecha). Las flechas denotan niveles de líquido en los depósitos de salida para los canales capilares y urinarios de los chips. Abreviatura: viECs = células endoteliales vasculares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo complementario 1: Citometría de flujo, ELISA para efluentes de chip y aislamiento de ARNm. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S1: Configuraciones de materiales de campana de cultivo en tejidos. (A) Material de la campana de cultivo en el tejido configurado para MACS, incluido el cubo de hielo con medios, el imán en el soporte del imán y los tubos cónicos debajo del imán. (B) Configuración del material de la campana de cultivo en el tejido de la placa de Petri para chips, con la parte superior, hacia abajo, debajo del fondo de la placa de Petri. Abreviatura: MACS = clasificación celular activada magnéticamente. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria S1: Medios y búferes utilizados en este protocolo. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

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Discussion

En este informe, describimos un protocolo para derivar endotelio vascular y epitelio glomerular (podocitos) de una línea celular iPS humana isogénica y el uso de estas células para diseñar un sistema 3D de órgano en un chip que imita la estructura, la interfaz tejido-tejido y la función de filtración molecular del glomérulo renal. Este chip de glomérulo está equipado con endotelio y epitelio glomerular que, juntos, proporcionan una barrera para filtrar selectivamente las moléculas.

Los investigadores interesados en adaptar este protocolo deben hacer las siguientes consideraciones: primero, la optimización puede ser necesaria para la siembra celular dependiendo de las características de crecimiento inherentes de las líneas de células madre que se utilizan. La densidad de siembra celular puede variar debido a las diferencias intrínsecas en las tasas de proliferación de células iPS humanas. Se recomienda que los investigadores comiencen con la densidad de siembra del mesodermo sugerida por el protocolo y luego se ajusten si es necesario. Del mismo modo, se recomienda que la diferenciación lateral del mesodermo comience con la densidad de siembra celular sugerida antes de ajustarse según sea necesario para lograr un rendimiento viEC y una eficiencia de clasificación del 50% o más. Si no se diferencian suficientes células después de la clasificación, el inhibidor de TGF-Beta (SB431542) se puede usar para prevenir la inactividad y ayudar a expandir exponencialmente los viEC (paso 3). Sin embargo, varios procesos celulares o vías de señalización dependen de TGF-Beta (por ejemplo, patogénesis de la hiperglucemia / diabetes, homeostasis inmune); como tal, se recomienda que los investigadores consideren los efectos de la inhibición de TGF-Beta en el análisis posterior o garanticen pruebas adecuadas para evitar resultados experimentales no deseados.

En segundo lugar, es importante tener en cuenta las posibles variaciones en la calidad del reactivo y las especificaciones del fabricante, en particular para los componentes adquiridos de proveedores distintos de los especificados por el protocolo. Por lo tanto, se recomienda que el investigador pruebe reactivos de diferentes números de lote, proveedores y vendedores para garantizar la reproducibilidad de los experimentos y los resultados. En general, el investigador debe evitar la exposición excesiva de las células iPS humanas a las enzimas de disociación en los tampones de desprendimiento, ya que esto puede conducir a una disminución de la viabilidad celular y un perfil molecular alterado de las células. Además, el medio de inducción de podocitos debe protegerse de la luz para evitar la inactivación de todo el ácido transretinoico. En tercer lugar, durante el cultivo celular de órgano en un chip, es fundamental evitar burbujas de aire en los canales del dispositivo microfluídico al perfundir los chips. La aparición de burbujas de aire se puede minimizar o prevenir inspeccionando regularmente las virutas durante la siembra celular, manteniendo el contacto líquido-líquido en cada paso que involucre la perfusión de virutas, y no empujando o tirando de aire hacia los canales fluídicos cuando se usan puntas de pipeta y / o aspiración.

Los esfuerzos previos para diseñar chips de glomérulo renal con epitelio y endotelio genéticamente compatibles se han basado en el uso de células derivadas de animales1. Si bien estas líneas celulares derivadas de animales se han utilizado tradicionalmente para estudios preclínicos, a menudo no logran recapitular las respuestas fisiológicas humanas, que contribuyen a la alta tasa de fracaso (89,5%) de los ensayos clínicos en humanos18. Para ayudar a superar algunos de estos problemas, son deseables modelos funcionales in vitro que recapitulen más de cerca la biología humana. Se ha avanzado en el desarrollo de modelos multicelulares del riñón humano; Sin embargo, los chips de glomérulo emplearon células humanas de fuentes heterogéneas, no isogénicas. Por ejemplo, previamente establecimos un chip de glomérulo reconstituido a partir de podocitos derivados de células iPS humanas y endotelio primario derivado de tejidos10. Los estudios de otros grupos de investigación emplearon una mezcla de células primarias 4,9, células inmortalizadas 3 o células derivadas del líquido amniótico 3,6 que limitan su uso para estudiar respuestas o aplicaciones específicas del paciente en medicina personalizada.

El protocolo descrito en este documento supera estas limitaciones al permitir la derivación tanto del endotelio vascular (viECs) como del epitelio glomerular (podocitos) de la misma línea celular iPS humana e integrar estas células en dispositivos microfluídicos compartimentados de órgano en un chip para modelar la estructura y función de la pared capilar glomerular renal in vitro. . Dada la autorrenovación ilimitada de las células iPS humanas, combinada con su capacidad para diferenciarse en casi cualquier tipo de célula, este protocolo también proporciona una vía para el abastecimiento continuo de podocitos humanos y viECs para ingeniería de tejidos y otras aplicaciones biomédicas. Este enfoque para las derivaciones de podocitos y viECs se ha reproducido en múltiples líneas celulares iPS humanas específicas del paciente, incluyendo PGP1- y DU11 2,10,12,17,19, lo que permite el establecimiento de chips de glomérulo renal personalizados de las poblaciones de pacientes deseadas.

La estrategia para diferenciar los podocitos dentro de los chips microfluídicos permite el estudio mecanicista del glomérulo renal humano en desarrollo y el modelado de enfermedades. Sin embargo, el estudio del glomérulo renal humano en desarrollo está limitado por los viECs que requieren clasificación para enriquecer a la población deseada. Este trabajo podría beneficiarse del establecimiento de métodos para la diferenciación de viECs sin necesidad de selección de subpoblaciones. Este estudio también está limitado por la gruesa membrana PDMS que separa el endotelio vascular y las capas celulares de podocitos. El trabajo futuro podría integrar nuevos biomateriales para reemplazar el PDMS grueso para imitar mejor las propiedades moleculares y biofísicas de la membrana basal glomerular. Por ejemplo, una membrana alternativa podría diseñarse para poseer cualidades biodegradables con porosidad sintonizable y ser más delgada (más similar a GBM) que la membrana PDMS de 50 μm de espesor utilizada en este protocolo.

Sin embargo, el chip de glomérulo producido por este protocolo se puede aplicar para estudiar los mecanismos de las enfermedades renales debilitantes y servir como plataforma para pruebas de nefrotoxicidad y descubrimiento de fármacos. Debido a que las células iPS humanas mantienen el perfil genético del donante y el chip glomérulo es capaz de modelar la enfermedad renal12, se podrían descubrir nuevos objetivos terapéuticos en el futuro para beneficiar a aquellos que sufren de formas hereditarias de enfermedad renal. Además, las respuestas biológicas específicas del paciente a los medicamentos posteriores al trasplante se pueden evaluar con mayor precisión utilizando un chip de riñón isogénico como el descrito en este estudio. Finalmente, este chip de glomérulo está preparado para estudiar los efectos de la dinámica de fluidos y la tensión mecánica diferencial, como los observados en pacientes con enfermedad renal con hipertensión o síndrome cardiorrenal, dada la relativa facilidad de modular las tasas de flujo de fluidos, estiramiento de tejidos o tensión mecánica. Es concebible que este protocolo pueda avanzar en la comprensión actual del desarrollo del riñón humano y los mecanismos de la enfermedad, así como facilitar el desarrollo de terapias personalizadas en el futuro.

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Disclosures

S.M. es un inventor en una patente relacionada con la diferenciación de podocitos de células iPS humanas. El otro autor no tiene nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la Escuela Pratt de Ingeniería de la Universidad de Duke, la División de Nefrología del Departamento de Medicina de Duke, una Beca Whitehead en Investigación Biomédica y un Premio de Investigación Genentech para S. Musah. Y. Roye recibió la beca de la Fundación Alfred P. Sloan de la Universidad de Duke y la beca de posgrado William M. "Monty" Reichert del Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad de Duke. La línea celular iPS DU11 (clon #11 de la Universidad de Duke) se generó en la instalación central de Duke iPSC y nos la proporcionó el Laboratorio Bursac de la Universidad de Duke. Los autores agradecen a N. Abutaleb, J. Holmes, R. Bhattacharya e Y. Zhou por su asistencia técnica y útiles discusiones. Los autores también desean agradecer a los miembros del Musah Lab por sus útiles comentarios sobre el manuscrito. Los autores agradecen al Laboratorio Segura el regalo de un citómetro de flujo Acuri C6.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
Alexa Fluor 488- and Alexa Fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo/Life Technologies A32744; A32754; A-11076; A32790; A21203; A11015
Collagen IV Thermo/Life Technologies 14-9871-82
Nephrin Progen GP-N2
PECAM-1 R&D Systems AF806
Podocin Abcam ab50339
VE-Cadherin Santa Cruz sc-9989
Basement membrane matrices
Corning Fibronectin, Human Corning 356008 Basement membrane (3)
iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment Iwai North America N8922012 Basement membrane matrix (2)
Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial BD Biosciences 354277 Basement membrane matrix (1); may show lot-to-lot variation
Cells
DU11 human iPS cells The DU11 (Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. The line has been tested and found to be free of mycoplasma (last test in November 2021) and karyotype abnormalities (July 2019)
Culture medium growth factors and media supplements
0.5M EDTA, pH 8.0 Invitrogen 15575020
2-Mercaptoethanol Thermo/Life Technologies 21985023
Albumin from Bovine serum, Texas Red conjugate Thermo/Life Technologies A23017
All-trans retinoic acid (500 mg) Stem Cell Technologies 72262
B27 serum-free supplement Thermo/Life Technologies 17504044
B-27 supplement (50x) without Vitamin A Thermo/Life Technologies 12587010
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A9418
CHIR99021 Stemgent 04-0004 May show lot-to-lot variation
Complete medium kit with CultureBoost-R Cell Systems 4Z0-500-R Podocyte maintenance media
DMEM/F12 Thermo/Life Technologies 12634028
DMEM/F12 with GlutaMAX supplement Thermo/Life Technologies 10565042 DMEM/F12 with glutamine
Forskolin (Adenylyl cyclase activator) Abcam ab120058
GlutaMAX supplement Thermo/Life Technologies 35050061 glutamine supplement
Heat-inactivated FBS Thermo/Life Technologies 10082147
Heparin solution Stem Cell Technologies 7980
Human Activin A Thermo/Life Technologies PHC9544
Human BMP4 Preprotech 120-05ET
Human BMP7 Thermo/Life Technologies PHC9544
Human VEGF Thermo/Life Technologies PHC9394
Inulin-FITC Sigma-Aldrich F3272
mTeSR1 medium Stem Cell Technologies 05850 Human iPS cell culture media (CCM). Add 5x supplement according to the manufacturer. Human iPS CCM can be stored for up to 6 months at -20 °C.
N-2 Supplement (100x) Thermo/Life Technologies 17502048
Neurobasal media Thermo/Life Technologies 21103049 Lateral mesoderm basal media
PBS (Phosphate-buffered saline) Thermo/Life Technologies 14190-250
Penicillin-streptomycin, liquid (100x) Thermo/Life Technologies 15140-163
ROCK inhibitor (Y27632) Tocris 1254
StemPro-34 SFM Thermo/Life Technologies 10639011 Endothelial cell culture medium (CCM). Add supplement according to manufacturer. Endothelial CCM can be stored for up to two weeks at 4 °C or -20 °C for up to 6 months.
TGF-Beta inhibitor (SB431542) Stem Cell Technologies 72234
Enzymes and other reagents
Accutase Thermo/Life Technologies A1110501 Cell detachment buffer
Dimethyl Suloxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2438
Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade VWR 97065-058
Paraformaldehyde (PFA) Thermo/Life Technologies 28906
Sterile distilled water Thermo/Life Technologies 15230162
Triton X-100 VWR 97062-208
Equipment
Trypsin EDTA, 0.05% Thermo/Life Technologies 25300-120
(Orb) Hub module Emulate ORB-HM1
100mm x 15 mm round petri dish Fisherbrand FB087579B
120 x 120 mm square cell culture dish VWR 688161
Accuri C6 BD Biosciences
Aspirating pipettes, individually wrapped Corning 29442-462
Aspirating Unit SP Bel-Art F19917-0150
Avanti J-15R Centrifuge Beckman Coulter B99516
Conical centrifuge tube, 15 mL Corning 352097
Conical centrifuge tube, 50 mL Corning 352098
EVOS M7000 Thermo/Life Technologies AMF7000 Fluorescent microscope to take images of fixed and stained cells.
Hemocytometer VWR 100503-092
Heracell VIOS 160i CO2 incubator Thermo/Life Technologies 51030403
Inverted Zeiss Axio Observer equipeed with AxioCam 503 camera Carl Zeiss Micrscopy 491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera)
Kimberly-Clark nitrile gloves VWR 40101-346
Kimwipes, large VWR 21905-049
Leoca SP8 Upright Confocal Microscope
Media reservoir (POD Portable Module) Emulate POD-1
Microplate shaker VWR 12620-926
Organ-chip Emulate S-1 Chip
Organ-chip holder Emulate AK-CCR
P10 precision barrier pipette tips Denville Scientific P1096-FR
P100 barrier pipette tips Denville Scientific P1125
P1000 barrier pipette tips Denville Scientific P1121
P20 barrier pipette tips Denville Scientific P1122
P200 barrier pipette tips Denville Scientific P1122
Plasma Asher Quorum tech K1050X RF This Plasma Etcher/Asher/Cleaner was used as a part of Duke University's Shared Materials Instrumentation Facility (SMiF).
Round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap Corning 352235
Serological pipette, 10 mL, indivdually wrapped Corning 356551
Serological pipette, 25 mL, indivdually wrapped Corning 356525
Serological pipette, 5 mL, indivdually wrapped Corning 356543
Steriflip, 0.22 µm, PES EMD Millipore SCGP00525
Sterile Microcentrifuge tubes Thomas Scientific 1138W14
T75cm2 cell culture flask with vent cap Corning 430641U
Tissue culture-treated 12 well plates Corning 353043
Tissue culture-treated 6 well plates Corning 353046
Vacuum modulator and perstaltic pump (Zoe Culture Module) Emulate ZOE-CM1 Organ Chip Bioreactor
VE-Cadherin CD144 anti-human antibody - APC conjugated Miltenyi Biotec 130-126-010
Wide-beveled cell lifter Corning 3008
MACS
CD144 MicroBeads, human Miltenyi Biotec 130-097-857
CD31 MicroBead Kit, human Miltenyi Biotec 130-091-935
LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401

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References

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Bioingeniería Número 189
Chip de glomérulo renal isogénico diseñado a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos
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Roye, Y., Musah, S. Isogenic Kidney… More

Roye, Y., Musah, S. Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (189), e63821, doi:10.3791/63821 (2022).

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