Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

שבב גלומרולוס כליות איזוגני מהונדס מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

Published: November 4, 2022 doi: 10.3791/63821
Automatic Translation
1, 1,2,3,4
1Department of Biomedical Engineering, Pratt School of Engineering, Duke University, 2Department of Medicine, Division of Nephrology, Duke University School of Medicine, 3Department of Cell Biology, Duke University, 4Center for Biomolecular and Tissue Engineering, Duke University

Summary

מוצג כאן פרוטוקול להנדס מערכת איבר-על-שבב מותאמת אישית המשחזרת את המבנה והתפקוד של מחסום הסינון הגלומרולרי בכליות על ידי שילוב תאי אפיתל וכלי דם מותאמים גנטית המובחנים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם. מערכת מהונדסת ביולוגית זו יכולה לקדם את רפואת דיוק הכליות ואת היישומים הקשורים אליה.

Abstract

מחלת כליות כרונית (CKD) משפיעה על 15% מהאוכלוסייה הבוגרת בארה"ב, אך הקמת טיפולים ממוקדי מטרה הוגבלה על ידי היעדר מודלים פונקציונליים שיכולים לחזות במדויק תגובות ביולוגיות אנושיות ונפרוטוקסיות. ההתקדמות ברפואה המדויקת של הכליות עשויה לסייע להתגבר על מגבלות אלה. עם זאת, מודלים שהוקמו בעבר במבחנה של גלומרולוס הכליות האנושיות - האתר העיקרי לסינון דם ויעד מרכזי למחלות רבות ורעילות לתרופות - משתמשים בדרך כלל באוכלוסיות תאים הטרוגניות עם מאפיינים תפקודיים מוגבלים ורקע גנטי שאין שני לו. מאפיינים אלה מגבילים באופן משמעותי את היישום שלהם עבור מודלים ספציפיים למחלה וגילוי טיפולי.

מאמר זה מציג פרוטוקול המשלב אפיתל גלומרולרי (פודוציטים) המושרה על ידי האדם ואנדותל כלי דם מחולה יחיד כדי להנדס שבב גלומרולוס כליות איזוגני וסקולרי. שבב הגלומרולוס המתקבל מורכב משכבות תאי אנדותל ותאי אפיתל שמקורם בתאי גזע, המבטאות סמנים ספציפיים לשושלת, מייצרות חלבוני קרום מרתף ויוצרות ממשק רקמה-רקמה הדומה למחסום הסינון הגלומרולרי של הכליה. שבב הגלומרולוס המהונדס מסנן באופן סלקטיבי מולקולות ומשחזר פגיעה בכליות הנגרמת על ידי תרופות. היכולת לשחזר את המבנה והתפקוד של גלומרולוס הכליה באמצעות סוגי תאים איזוגניים יוצרת את ההזדמנות למדל מחלת כליות עם ספציפיות המטופל ולקדם את התועלת של איברים על שבבים לרפואה מדויקת של כליות ויישומים קשורים.

Introduction

התקני איבר על שבב הם מודלים דינמיים תלת-ממדיים במבחנה המשתמשים בגירוי מולקולרי ומכני, כמו גם בכלי דם, כדי ליצור ממשקי רקמה-רקמה המדגימים את המבנה והתפקוד של איברים ספציפיים. התקנים שהוקמו בעבר איברים על שבב שמטרתם לסכם את הגלומרולוס (שבבי גלומרולוס) של הכליה, כללו קווי תאים של בעלי חיים1 או קווי תאים ראשוניים ואימורטליים אנושיים של מקורות הטרוגניים 2,3. השימוש במקורות תאים הטרוגניים מבחינה גנטית מציג וריאציות המגבילות באופן משמעותי את המחקרים על תגובות ספציפיות לחולה וגנטיקה או מנגנונים של מחלה 4,5. ההתמודדות עם אתגר זה תלויה בזמינותם של קווי תאים איזוגניים שמקורם באנשים ספציפיים בעלי פרופילים מולקולריים וגנטיים משומרים כדי לספק מיקרו-סביבה מדויקת יותר להנדסת מודלים במבחנה 2,3,6. קווי תאים איזוגניים ממוצא אנושי יכולים כעת להיווצר בקלות עקב ההתקדמות בתרבית תאי iPS אנושית. מאחר שתאי iPS אנושיים הם בדרך כלל ממקור לא פולשני, יכולים להתחדש בעצמם ללא הגבלת זמן, ולהתמיין כמעט לכל סוג תא, הם משמשים כמקור אטרקטיבי של תאים להקמת מודלים במבחנה, כגון שבב גלומרולוס 7,8. מחסום הסינון הגלומרולרי הוא האתר העיקרי לסינון דם. הדם מסונן תחילה דרך אנדותל כלי הדם, קרום המרתף הגלומרולרי, ולבסוף דרך אפיתל מיוחד בשם פודוציטים. כל שלושת המרכיבים של מחסום הסינון תורמים לסינון סלקטיבי של מולקולות. מוצג כאן פרוטוקול להקמת התקן איבר-על-שבב המתממשק עם אנדותל וסקולרי ואפיתל גלומרולרי ממקור תאי iPS אנושי יחיד. בעוד שפרוטוקול זה שימושי במיוחד כדי להנדס שבב איזוגני וכלי דם כדי לשחזר את מחסום הסינון הגלומרולרי, הוא גם מספק תוכנית לפיתוח סוגים אחרים של איברים על שבבים מותאמים אישית ופלטפורמות מרובות איברים כגון מערכת איזוגנית 'גוף על שבב'.

הפרוטוקול המתואר כאן מתחיל בהתמיינות מסתעפת של תאי iPS אנושיים לשתי שושלות נפרדות - מזודרם לרוחב ותאי מזודרם, אשר לאחר מכן מתמיינים לאנדותל וסקולרי ואפיתל גלומרולרי, בהתאמה. כדי ליצור תאי מזודרם לרוחב, תאי iPS אנושיים נזרעו על לוחות מצופים 1 של מטריצת ממברנת מרתף וגודלו בתרבית במשך 3 ימים (ללא חילופי מדיה) בתווך N2B27 בתוספת מפעיל Wnt, CHIR 99021, וגורם המזודרם החזק, עצם-מורפוגנטית 4 (BMP4). תאי המזודרם הלטרליים שהתקבלו התאפיינו בעבר בביטוי של ברכיורי (T), תיבת הומיאובוקס דמוית תערובת זוגית (MIXL) ו-eomesodermin (EOMES)9. לאחר מכן, תאי המזודרם הלטרליים עברו תרבית במשך 4 ימים בתווך בתוספת VEGF165 ופורסקולין כדי לגרום לתאי אנדותל וסקולריים שמוינו על בסיס VE-קדהרין ו/או ביטוי PECAM-1 באמצעות מיון תאים המופעל על ידי מגנט (MACS). תאי האנדותל הווסקולריים שנוצרו כתוצאה מכך (viEC) הורחבו על ידי גידולם על צלוחיות ממברנת מרתף 3 מצופות עד שהם מוכנים לזרע במכשיר המיקרופלואידי.

כדי ליצור תאי מזודרם, תאי iPS אנושיים נזרעו על לוחות מצופים 2 ממברנות מרתף וגודלו בתרבית במשך יומיים בתווך המכיל Activin A ו- CHIR99021. תאי המזודרם שהתקבלו התאפיינו בביטוי של HAND1, goosecoid ו-brachury (T) כפי שתואר קודם לכן 2,10,11. כדי לגרום להתמיינות של תאי מזודרם ביניים (IM), תאי המזודרם גודלו בתרבית במשך 14 יום בתווך בתוספת BMP-7 ו-CHIR99021. תאי ה-IM המתקבלים מבטאים את הגידול 1 של וילם (WT1), את גן התיבה הזוגית 2 (PAX2) ואת החלבון הקשור 1 (OSR-1)2,10,11.

שבב מיקרופלואידי דו-ערוצי המבוסס על פולידימתילסילוקסן (PDMS) תוכנן לסכם מחדש את מבנה מחסום הסינון הגלומרולרי במבחנה. תעלת השתן היא 1,000 מיקרומטר x 1,000 מיקרומטר (רוחב x גובה) וממד הערוץ הנימי הוא 1,000 מיקרומטר x 200 מיקרומטר (רוחב x גובה). מחזורי מתיחה והרפיה מחזוריים התאפשרו על ידי התאים החלולים הנמצאים בכל צד של תעלות הנוזלים. התאים נזרעו על קרום PDMS גמיש (בעובי 50 מיקרומטר) המפריד בין תעלות השתן לתעלות הנימים. הממברנה מצוידת בנקבוביות משושה (קוטר 7 מיקרומטר, במרחק של 40 מיקרומטר זו מזו) כדי לסייע בקידום איתות בין-תאי (איור 1A)2,12. יומיים לפני השלמת אינדוקציה של IM, השבבים המיקרופלואידיים היו מצופים במטריצת קרום מרתף 2. viECs נזרעו לתוך הערוץ הנימי של השבב המיקרופלואידי באמצעות מדיום תחזוקה אנדותליאלי יום אחד לפני השלמת אינדוקציה של IM, והשבב התהפך הפוך כדי לאפשר הידבקות תאים בצד הבסיסי של קרום PDMS מצופה ECM. ביום שבו הושלמה אינדוקציה של IM, התאים נזרעו לתעלת השתן של השבב המיקרופלואידי באמצעות מדיום בתוספת BMP7, Activin A, CHIR99021, VEGF165, וכל החומצה הטרנס-רטינואית כדי לגרום להתמיינות פודוציטים בתוך השבב. למחרת, מאגרי המדיה מולאו במדיום אינדוקציה של פודוציטים ובמדיום תחזוקה אנדותליאלי, ומתח מכני של 10% ב-0.4 הרץ וזרימת נוזלים (60 μL/h) הוחלו על השבבים.

השבבים המיקרופלואידיים התאיים גודלו בתרבית במשך 5 ימים נוספים באמצעות מדיום אינדוקציה פודוציטים (בתעלת השתן) ומדיום תחזוקה אנדותליאלי (בתעלת כלי הדם). שבבי גלומרולוס הכליות שהתקבלו גודלו בתרבית במשך עד 7 ימים נוספים באמצעי תחזוקה הן עבור תאי הפודוקיטים והן עבור תאי האנדותל. הפודוקיטים המובחנים ביטאו באופן חיובי חלבונים ספציפיים לשושלת, כולל פודוצין ונפרין 13,14, בעוד ש- viECs ביטאו באופן חיובי את חלבוני זיהוי השושלת PECAM-1 ו- VE-Cadherin, כולם מולקולות חיוניות לשמירה על שלמות מחסום הסינון הגלומרולרי 15,16 . נמצא כי הפודוקיטים וה-viECs מפרישים את חלבון קרום המרתף הגלומרולרי הנפוץ ביותר, קולגן IV, החשוב גם להבשלת רקמות ולתפקודן.

המערכת התלת-מרכיבית של מחסום הסינון - אנדותל, קרום מרתף ואפיתל - בשבבי הגלומרולוס נמצאה כמסננת מולקולות באופן סלקטיבי ומגיבה לטיפול תרופתי כימותרפי ונפרוטוקסי. תוצאות הטיפול התרופתי הצביעו על כך שניתן להשתמש בשבב הגלומרולוס למחקרי נפרוטוקסיות ולמודלים של מחלות. פרוטוקול זה מספק את ההנחיה הכללית להנדסת שבב גלומרולוס כליות מיקרופלואידי פונקציונלי מנגזרות תאי iPS איזוגניים. ניתוחים במורד הזרם של השבב המהונדס יכולים להתבצע לפי רצונו של החוקר. למידע נוסף על השימוש בשבב הגלומרולוס למודל של פגיעה גלומרולרית הנגרמת על ידי תרופות, עיין בפרסומים קודמים 2,12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכן פתרונות מטריצת ממברנות מרתף ומצעים מצופים

  1. להפשיר מטריצת קרום מרתף 1 לילה על קרח ב 4 מעלות צלזיוס. Aliquot על פי הצעת היצרן ליחס דילול. באמצעות צינור חרוטי של 50 מ"ל ופיפטה, יש לערבב היטב כמות מתאימה של מטריצת קרום מרתף 1 ל-25 מ"ל של DMEM/F12 קר עד להפשרה מלאה ולהמסה.
    1. כדי להמיס אליקוט קפוא, יש לקחת ~200 μL מ-25 מ"ל של DMEM/F12 קר ולהעביר אותו לצינור האליקוט הקפוא. פיפטה למעלה ולמטה עד שהמטריצה מופשרת ומתמוססת היטב. העבר את תכולת הצינור המלאה של מטריצת קרום המרתף 1 לשאר ה- DMEM / F12 הקר.
  2. פיפטה 1 מ"ל של מטריצת קרום מרתף 1 תמיסה לתוך כל באר של צלחת 6 באר. כדי להשתמש בלוחות המצופים באותו יום, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 2 שעות.
    1. לחלופין, ניתן לעטוף את הצלחות המצופות בפרפילם ולאחסן אותן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים. כאשר אתה מוכן להשתמש בצלחת המאוחסנת, דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  3. לדלל מטריצת קרום מרתף 2 ב 9 מ"ל של מים מזוקקים סטריליים כדי להשיג ריכוז סופי של 5 מיקרוגרם / מ"ל. פיפטה 700 μL של מטריצת קרום מרתף 2 תמיסה לתוך כל באר של צלחת 12 באר. לעטוף את מטריצת קרום המרתף 2 לוחות מצופים עם parafilm ולאחסן ב 4 °C עד 2 שבועות.
  4. שחזרו את מטריצת קרום המרתף הליופילית 3 כדי להשיג ריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל במי מלח עם מאגרי פוספט (PBS, Ca+2 ו-Mg+2-free) כפי שהציע היצרן. יש לדלל אליקוט אחד של 250 μL לריכוז סופי של 25 מיקרוגרם/מ"ל ב-9.75 מ"ל של PBS (ללא Ca+2 ו-Mg+2). השתמש ב-6 מ"ל של תמיסה זו כדי לצפות בקבוק T75 אחד (ריכוז סופי של 2 מיקרוגרם לס"מ2). אחסנו את הצלוחיות המצופות במטריקס בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.

2. תרבית תאי iPS אנושית

הערה: קו DU11 המשמש בפרוטוקול זה נבדק ונמצא נקי מהפרעות מיקופלסמה וקריוטיפ.

  1. מטריצת קרום מרתף דגירה לוחות מצופים 1 ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1-2 שעות.
  2. יש לשטוף כל באר של צלחת 6 בארות 3x עם 1 מ"ל של חם (37 מעלות צלזיוס) DMEM / F12. הוסף 2 מ"ל של מדיום תרבית תאי iPS אנושי (CCM) (טבלה משלימה S1) לכל באר של צלחת 6 בארות. דגירה של הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בזמן שהתאים מוכנים לזריעה כמתואר להלן.
  3. שטפו כל באר של צלחת 6 בארות המכילה תאי iPS אנושיים עם 1 מ"ל של DMEM/F12 חם.
  4. שאף את DMEM/F12. הוסף 1 מ"ל של חיץ ניתוק תאים חמים לכל באר של צלחת 6 בארות. דגירה ב-37°C למשך דקה אחת.
  5. בדוק באופן חזותי כל באר תחת מיקרוסקופ לדיסוציאציה סביב קצוות מושבת התאים. שאפו בזהירות את מאגר ניתוק התאים מהתאים. יש לשטוף בעדינות כל באר עם 1 מ"ל של DMEM/F12 חם.
  6. בדוק את הלוחות מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים לא התנתקו לחלוטין מהצלחת או שאפו בטעות.
  7. הוסף 3 מ"ל של iPS CCM אנושי חם לכל באר של צלחת 6 בארות עם תאים. בעזרת מרים תאים, מגרדים בעדינות את המושבות. באמצעות פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל, מערבבים בעדינות את מתלה התא בכל באר למעלה ולמטה פעם אחת.
  8. הוציאו את מטריצת קרום המרתף החדשה צלחת מצופה 1 מהאינקובטור. העבר 0.5 מ"ל של ההשעיה התא לכל באר של מטריצת קרום המרתף החדשה צלחת 1 מצופה. הזיזו את הצלחת בתנועה של מספר שמונה כדי לפזר את התאים באופן שווה. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO2 .
  9. שאפו את המדיום המושקע והחליפו ב-3 מ"ל של iPS CCM אנושי בכל יום של תרבית עד שהתאים נפגשים ב-70% (כ-4 ימים לאחר המעבר).

3. ימים 0-16: התמיינות של iPSCs אנושיים לתאי מזודרם ביניים

  1. ימים 0-2: אינדוקציה מזודרם
    1. הזיזו את מטריצת קרום המרתף עם לוחות מצופים 2 מעלות צלזיוס לטמפרטורת החדר למשך שעתיים כדי שיווי משקל לאחר האחסון.
    2. שאפו את המדיום המושקע מכל באר של צלחת 6 בארות המכילה כ-70% תאי iPS אנושיים מקבילים. יש לשטוף בעדינות את התאים פי 3 עם 1 מ"ל של DMEM/F12 חם.
    3. שאף את DMEM/F12. הוסף 1 מ"ל של מאגר ניתוק תאים לכל באר של צלחת 6 בארות של תאי iPS אנושיים. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5-7 דקות.
    4. בדוק באופן חזותי כל באר תחת מיקרוסקופ לדיסוציאציה סביב קצוות מושבת התאים. בעזרת מרים תאים, מגרדים בעדינות את המושבות.
    5. העבירו את מתלי התאים מכל הבארות של צלחת 6 הבארות לצינור חרוטי של 15 מ"ל והשתמשו ב-P1000 כדי לקטר למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לקבל תרחיף חד-תאי של תאי ה-iPS.
    6. מלא את מתלה התא בצינור החרוטי עד 14 מ"ל באמצעות DMEM/F12. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 200 × גרם בטמפרטורת החדר.
    7. שאפו את הסופר-נטנט. יש להשעות את כדור התא ב-14 מ"ל של DMEM/F12 חם. חזור על צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 200 × גרם בטמפרטורת החדר.
    8. שאפו את הסופר-נטנט. יש לתלות את התאים ב-1 מ"ל של מדיום אינדוקציה Mesoderm (טבלה משלימה S1). לספור את התאים באמצעות hemocytometer. יש לדלל במדיום אינדוקציה Mesoderm כדי להשיג ריכוז סופי של 1 × 105 תאים למ"ל.
    9. שאפו את הציפוי ממטריצת קרום המרתף צלחת 2 מצופה. יש לשטוף כל באר של מטריצת קרום המרתף 2-צלחת מצופה 2x עם 1 מ"ל של DMEM/F12 חם.
    10. העבירו בעדינות את מתלה התא למעלה ולמטה פי 2. העבר 1 מ"ל של ההשעיה התא לכל באר של מטריצת קרום המרתף 2 צלחת מצופה. הזיזו בעדינות את הצלחת בתנועה של מספר שמונה כדי לפזר את התאים באופן שווה.
    11. לדגום את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס לילה. למחרת (יום 1), שאפו את המדיום המושקע מכל באר של צלחת 12 הבאר. החלף עם 1 מ"ל של מדיום אינדוקציה Mesoderm חם. דגירה ב-37 °C ללילה.
  2. ימים 2-16: אינדוקציה של מזודרם ביניים
    1. לשאוף את מדיום אינדוקציה Mesoderm בילה. יש להחליף ב-1 מ' ליטר של מדיום אינדוקציה בינוני חם (טבלה משלימה S1). שאפו את המדיום בילה ולהחליף עם 1 מ"ל של בינוני ביניים חם Mesoderm אינדוקציה מדיום כל יום במשך 14 ימים.

4. ימים 0-15: התמיינות והרחבה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לתאי אנדותל וסקולריים

  1. יום 0: זריעת תאי iPS אנושיים
    1. הכינו 15 מ"ל של iPS CCM אנושי עם מעכב ROCK (טבלה משלימה S1). יש לחמם בטמפרטורה של 37°C.
    2. לדגום מטריצת קרום מרתף אחת צלחת 1-מצופה במשך 1-2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. שאפו את מטריצת קרום המרתף 1. יש לשטוף 3x עם 1 מ"ל של DMEM/F12 חם.
    3. שאף את DMEM/F12. הוסף 2 מ"ל של iPS CCM אנושי עם מעכב ROCK לכל באר של צלחת 6 בארות. דגירה של הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בזמן שהתאים מוכנים לזריעה כמתואר להלן.
    4. שאפו את המדיום המושקע מכל באר של צלחת 6 בארות המכילה כ-70% תאי iPS אנושיים מקבילים. יש לשטוף בעדינות את התאים פי 3 עם 1 מ"ל של DMEM/F12 חם.
    5. שאף את DMEM/F12. הוסף 1 מ"ל של מאגר ניתוק תאים לכל באר של צלחת 6 בארות של תאי iPS אנושיים. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5-7 דקות כדי לנתק את התאים לתאים בודדים.
      הערה: בשל הבדלים מובנים בין קווי תאי iPS, המשתמש יצטרך לבדוק חזותית את התאים לאחר 5 דקות כדי לקבוע את זמן הדגירה האופטימלי.
    6. מעבירים את התאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל. הביאו את מתלי התא לקיבולת של עד 14 מ"ל עם DMEM/F12 חם כדי לנטרל את מאגר הניתוק. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 200× גרם בטמפרטורת החדר.
    7. שאפו בעדינות את הסופרנטנט. השהה את התאים ב-1 מ"ל של iPS CCM אנושי עם מעכב ROCK. לספור את המספר הכולל של תאים באמצעות hemocytometer.
    8. זרע את התאים בין 37,000 ל-47,000 תאים/ס"מ2 (355,200 עד 451,200 תאים/באר של צלחת 6 בארות). דגירה ב-37 °C ללילה.
      הערה: בשל הבדלים מובנים בין קווי תאי iPS, המשתמש יצטרך לקבוע את צפיפות הזריעה האופטימלית.
  2. ימים 1-3: אינדוקציה של מזודרם לרוחב
    1. למחרת (יום 1), שאפו את המדיום המושקע מכל באר של צלחת 6 בארות של תאי iPS אנושיים. החלף כל באר של צלחת 6 בארות עם 5 מ"ל של מדיום אינדוקציה Mesoderm לרוחב (טבלה משלימה S1). בעת הגדלת כלי התרבות (למשל, צלוחיות), בדרך כלל, החלף פי 3 את נפח העבודה בכלי התרבית.
    2. אל תשנה מדיום זה במשך 3 ימים.
      הערה: מדיום אינדוקציה לרוחב Mesoderm בבארות בדרך כלל ישנה את צבעו מאדום לצהוב כאשר התאים משתמשים בחומרים המזינים. עם זאת, בינוני מעונן או בינוני עם צמיחת חיידקים אינו נורמלי ויש לפרק ולהשליך אותו ככזה.
  3. ימים 4-6: אינדוקציה של תאי אנדותל
    1. שאפו את המדיום המושקע מכל באר של צלחת 6 הבארות. החלף כל באר של צלחת 6 בארות עם 3 מ"ל של מדיום אינדוקציה אנדותליאלי חם (טבלה משלימה S1). לדגום את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס לילה.
    2. במשך היומיים הבאים (ימים 5 ו -6), לאסוף את המדיום בילה מכל הבארות לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. אחסן את הצינור החרוטי ב 4 °C. לחדש את התאים עם 3 מ"ל של מדיום אינדוקציה אנדותל חם. לדגור את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס.
  4. יום 7: מיון תאי אנדותל (viEC)
    1. מוציאים מטריצת קרום מרתף 3 צלוחיות ומשאירים בטמפרטורת החדר למשך שעה.
    2. הכן 50 מ"ל של מאגר MACS (טבלה משלימה S1).
    3. הניחו את מאגר ניתוק התאים, מאגר MACS, CCM אנדותליאלי ו-PBS (ללא Ca 2+ ו-Mg2+) על קרח במכסה המנוע של תרבית הרקמה.
    4. הניחו את המגנט על מעמד ה-MACS. מניחים שני צינורות חרוטיים של 50 מ"ל וצינור חרוטי אחד של 15 מ"ל במחזיק צינור חרוטי.
    5. הניחו את מעמד ה-MACS (עם מגנט מחובר) ועמוד LS אחד במכסה המנוע של תרבית הרקמה. הגדר את מחזיק הצינור החרוטי (עם צינורות חרוטיים בתוכו) על מעמד ה-MACS, מתחת למגנט (איור משלים S1A).
    6. אסוף את המדיום בילה מכל באר של צלחת 6 באר לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל משלב 4.3.2. שטפו כל באר של צלחת 6 בארות עם PBS (Ca 2+ ו- Mg2+ חינם).
    7. שאפו את ה-PBS. הוסף 1 מ"ל של מאגר ניתוק תאים. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5-7 דקות כדי לנתק את התאים לחלוטין.
    8. מעבירים את התאים לצינור חרוטי של 50 מ"ל. הבא את ההשעיה התא ל 15 מ"ל עם CCM אנדותל קר. צנטריפוגה ב 200 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    9. שאפו את הסופר-נטנט. השהה את התאים ב-1 מ"ל של מאגר MACS קר. לספור את התאים עם hemocytometer.
    10. הוסף 10 מ"ל של מאגר MACS להשעיית התא. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 200 × גרם בטמפרטורת החדר.
    11. שאפו את הסופר-נטנט. השהה את התאים ב-80 μL של מאגר MACS לכל 10 מיליון תאים. הוסף 20 μL לכל 10 מיליון תאים של ריאגנט חוסם FcR, מיקרובי CD31 ומיקרובי CD144. דגירה במשך 15 דקות על קרח.
    12. בזמן שתרחיף התאים דוגר, צנטריפוגה של המדיום שנאסף מהשראת אנדותל (שלב 4.3.2) ב-200 × גרם למשך 10 דקות.
    13. אסוף את הסופרנטנט במסנן ואקום של 500 מ"ל 0.22 מיקרומטר. הכן את המדיום המותנה באנדותל (טבלה משלימה S1). מסננים את המדיום בתנאים סטריליים ושומרים על חום בינוני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: קצב התפשטות תאי האנדותל יתחיל לרדת לאחר מעבר 3. כדי להשיג צמיחה מעריכית לאחר מעבר 3, ניתן להשלים את האנדותל מותנה ואמצעי תחזוקה עם מעכב TGF-Beta 10 μM (SB431542) החל ממעבר 1.
    14. לאחר הדגירה של 15 דקות בשלב 4.4.11, הוסף 10 מ"ל של מאגר MACS לכל 10 מיליון תאים (מאגר MACS מרבי של 30 מ"ל) לתרחיף התא. צנטריפוגה ב 200 × גרם במשך 5 דקות.
    15. שאפו את הסופר-נטנט. יש להשעות ב-1 מ"ל של מאגר MACS.
    16. קח את עמוד LS ומשוך את הבוכנה מתוך המזרק. החזירו את הבוכנה לשרוול הפלסטיק. הניחו את העמוד על המגנט.
    17. מקם את הצינור החרוטי הראשון של 50 מ"ל מתחת לעמודה. הוסף 1 מ"ל של מאגר MACS לעמודה. לאסוף את הצינור החרוטי 50 מ"ל מתחת.
    18. תן לנוזל לזרום דרך, אם כי לא לחלוטין כדי למנוע את הטור מלהתייבש. כאשר טיפות הנוזל מתחילות לטפטף לאט, הוסף את השעיית התא לעמודה. לאסוף את flowthrough באותו צינור חרוטי 50 מ"ל.
    19. כאשר טיפות הנוזל מתחילות לטפטף לאט, מקמו את הצינור החרוטי הבא של 50 מ"ל מתחת לעמודה. הוסף את הזרימה הראשונית (שלב 4.4.18) לעמודה. לאסוף את הצינור החרוטי 50 מ"ל מתחת.
    20. כאשר טיפות הנוזל מתחילות לטפטף לאט, הוסף 500 μL של מאגר MACS 3x כדי לשטוף את העמודה.
    21. הסר את העמודה מהמגנט. מניחים את העמודה על צינור חרוטי 15 מ"ל. הוסף 1 מ"ל של PBS קר לעמודה.
    22. כדי לאסוף את התאים, קח את הבוכנה משרוול הפלסטיק ודחף אותה בחוזקה לתוך העמוד.
    23. לספור את התאים באמצעות hemocytometer. הבא את ההשעיה התא ל 5 מ"ל עם PBS. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 200 × גרם.
    24. בזמן שהתאים עוברים צנטריפוגה, שטפו את מטריצת קרום המרתף 3-ציפוי בקבוקון 3x עם 5 מ"ל של PBS כדי להתכונן לזריעת תאים. שאפו את ה- PBS והוסיפו 20 מ"ל של מדיום מותנה אנדותליאלי למטריצת קרום המרתף 3 מצופה בקבוקון.
    25. הסר את התאים מהצנטריפוגה ושאף את הסופרנטנט. יש לתלות את התאים במדיום מותנה אנדותליאלי כדי לזרוע אותם ב-26,000 תאים/ס"מ2 (1.95 × 106 תאים /בקבוקון T75). זרע את התאים.
    26. כדי לחשב את יעילות המיון ותפוקת התאים, חלק את ספירת התאים משלב 4.4.23 בספירת התאים משלב 4.4.9.
  5. ימים 8-15: הרחבת viECs
    1. למחרת (יום 8), לשאוף את המדיום בילה מן הבקבוק. החלף עם 10 מ"ל של אנדותל מותנה בינוני. יש להחליף את המדיום המותנה באנדותל אחת ליומיים עד שהבקבוקון יהיה 90% מחובר או עד לשימוש מלא בבקבוק הבינוני המותנה באנדותל.
    2. שאפו את המדיום המבוזבז והחליפו ב-10 מ"ל של מדיום תחזוקה אנדותליאלי (טבלה משלימה S1) כל יומיים להמשך הרחבה.
    3. כדי להעביר את viECs, להכין שתי מטריצת קרום מרתף 3-מצופה T75 צלוחיות. השאירו את הצלוחיות בטמפרטורת החדר למשך שעה. שטפו היטב את הבקבוקונים הטריים 3x עם 5 מ"ל של PBS.
    4. שאפו את ה-PBS. הוסף 10 מ"ל של מדיום תחזוקה אנדותליאלי חם לכל בקבוקון טרי מוכן. דגירה של הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בזמן שהתאים מוכנים לזריעה כמתואר להלן.
    5. הוסף 5 מ"ל של מאגר ניתוק תאים לבקבוקון T75 בעל מפגש של 90% של viECs. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5-7 דקות. מעבירים את התאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל. יש להוסיף 5 מ"ל של DMEM/F12 חם. צנטריפוגה ב 200 × גרם במשך 5 דקות.
    6. שאפו את הסופר-נטנט. יש להשעות ב-1 מ"ל של מדיום תחזוקה אנדותליאלי חם. הוסף 500 μL של מתלה התא לכל אחד מהצלוחיות T75 המוכנות הטריות.
    7. למחרת, לשאוף את המדיום בילה. החלף עם 10 מ"ל של מדיום תחזוקה אנדותל. שאפו את המדיום המבוזבז והחליפו ב-10 מ"ל של מדיום תחזוקה אנדותליאלי כל יומיים עד שהבקבוקון יהיה 90% נפגש.

5. יום 14: הכנת מכשירי שבבי איברים מיקרופלואידיים לתרבית תאים

  1. טיפול פלזמה ומטריצת קרום מרתף 2 ציפוי
    1. הכן מטריצת קרום מרתף 2 פתרון (שלב 1.3). הניחו אותו בצד.
    2. במכסה מנוע של תרבית רקמה סטרילית, פרקו את צלחת הפטרי העגולה בגודל 100 מ"מ על 15 מ"מ. מקם את החלק העליון של צלחת פטרי, פונה כלפי מטה, מתחת לתחתית צלחת פטרי (איור משלים S1B).
    3. בעזרת פינצטה, מוציאים את השבבים המיקרופלואידיים מהאריזה ומניחים אותם בתוך צלחת פטרי. סגרו את צלחת הפטרי באמצעות המכסה שמתחת לתבשיל.
    4. בפתח הפלזמה, הניחו את מכסה צלחת פטרי מתחת לצלחת, כשהחלק העליון פונה כלפי מטה, ושומרים אותם יחד כיחידה אחת. הניחו את יחידת צלחת הפטרי בתא אשר הפלזמה. התחל את אשר פלזמה עם חמצן ב 100 W, 15 SCCM, 30 שניות.
    5. רגישות לזמן: לאחר סיום הטיפול, הוציאו את יחידת צלחת פטרי מאשרת הפלזמה. נגבו במהירות ובעדינות את מכסה צלחת הפטרי עם 70% אתנול שרוסס על מגבון מעבדה. מכסים את צלחת הפטרי במכסה שלה.
    6. הביאו את צלחת הפטרי למכסה המנוע של תרבית הרקמה הסטרילית. הוסף בעדינות 25 μL של תמיסת מטריצת קרום מרתף 2 לערוץ השתן (העליון) של השבב. הוסף 20 μL של מטריצת קרום מרתף 2 פתרון לתוך הערוץ הנימי (התחתון) של השבב.
    7. קח שני כובעי צינור חרוטיים סטריליים של 15 מ"ל ומלא אותם במים מזוקקים סטריליים (~ 500 μL). הניחו את הפקק בצלחת הפטרי כדי למנוע את התייבשות תעלות השבב והממברנה. מניחים את המכסה על הכלים. דגירה ב-37 °C ללילה.

6. זריעה של viECs ותאי מזודרם ביניים לתוך התקנים microfluidic

  1. יום 15: viECs
    1. שאפו את המדיום מ-T75-צלוחיות המכילות 90% מפגשים של viECs. יש להוסיף 5 מ"ל של מאגר ניתוק תאים ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 5-7 דקות.
    2. מעבירים את התאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל. הוסף 5 מ"ל של DMEM/F12. צנטריפוגה ב 200 × גרם במשך 5 דקות.
      הערה: כל בקבוקון T75 עם כ-90% נוכחות של viECs יניב ~3 מיליון תאים.
    3. שאפו את הסופר-נטנט. החזירו את התאים ל-300 μL של מדיום תחזוקת האנדותל כדי לקבל כ-2 מיליון תאים/300 μL. ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר. הניחו את מתלה התא בצד.
    4. מעבירים את צלחת הפטרי המכילה את השבבים המיקרופלואידיים למכסה המנוע של תרבית הרקמה. חברו קצה מחסום P200 לקצה השואף.
    5. שטפו הן את הערוצים העליונים והן את הערוצים התחתונים של השבב המיקרופלואידי עם 200 μL של DMEM/F12 ובמקביל שאפו לפריפריה של השקע.
    6. החזק את השבב בחוזקה כאשר קצה מחסום P200 מחובר לאספירטור, הרחק מהשקע של הערוץ התחתון. הזריקו בחוזקה 20 μL של מתלה viEC עם כ -134,000 תאים לתוך הערוץ הנימי (התחתון) של השבב. בזהירות לשאוף מדיום מן הפריפריה של מוצא.
    7. בדוק מתחת למיקרוסקופ אם יש בועות או צפיפות זריעה לא אחידה של viEC.
    8. הפוך בעדינות את השבב כדי להפוך אותו כך שה- viECs יוכלו להיצמד לצד הבסיסי של קרום PDMS הגמיש. הכנס את השבב למחסנית המחזיק. הוסף 3 מ"ל של PBS למחסנית מחזיק השבב כדי למנוע את התייבשות הממברנה. לדגום את השבב ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.
    9. בדוק את התעלה התחתונה מתחת למיקרוסקופ עבור שכבה מקבילה של viECs המחוברים לממברנת PDMS הגמישה. יש לטפטף 200 μL של מדיום תחזוקה אנדותליאלי על פתח הערוץ התחתון ולאפשר לו לזרום דרך הערוץ כדי לשטוף את הערוץ של תאי אנדותל לא מחוברים תוך שאיפה זהירה מהפריפריה של מוצא הערוץ הנימי (התחתון).
    10. החלף את השבב בחזרה למחסנית המחזיק. דגירה ב-37 °C ללילה.
  2. יום 16: תאי מזודרם ביניים (IM)
    1. שטפו בעדינות את התעלה הנימית (התחתונה) עם 200 μL של מדיום תחזוקת אנדותל תוך שאיפה קפדנית לפריפריה של יציאת היציאה.
    2. יש לשטוף את תעלת השתן (העליונה) עם 200 μL של DMEM/F12 תוך שאיפה קפדנית לשולי השקע. שחרר ~ 50 μL של DMEM / F12 על פתחי הכניסה והיציאה.
    3. שאפו את מדיום אינדוקציה Mesoderm ביניים מכל באר של צלחת 12 בארות.
      הערה: כל באר בסוף ההתמיינות נותנת כ-1.5 מיליון תאי IM.
    4. יש להוסיף 1 מ"ל של טריפסין-EDTA לכל באר של צלחת 12 בארות ולדגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    5. גרד בעדינות את התאים באמצעות מרים תאים, ופיפט למעלה ולמטה כדי לנתק את התאים באמצעות P1000. הוסף 2 מ"ל של תמיסת נטרול טריפסין (טבלה משלימה S1) לכל באר. מעבירים את התאים לצינור חרוטי של 50 מ"ל. הביאו את נפח מתלי התא ל-50 מ"ל עם DMEM/F12 וצנטריפוגה ב-200 × גרם למשך 5 דקות.
    6. שאפו את הסופר-נטנט. החזירו את התאים ב-500 μL של מדיום אינדוקציה ביניים Mesoderm כדי לקבל כ-3 מיליון תאים/500 μL. ספרו את התאים בעזרת המוציטומטר.
    7. החזק את השבב בחוזקה כאשר קצה מחסום P200 מחובר לאספירטור, הרחק מהשקע של ערוץ השתן (העליון). להזריק בחוזקה 25 μL של תרחיף התא עם כ 112,500 תאי IM לתוך ערוץ השתן (העליון) של השבב, בזהירות לשאוף את המדיום מן הפריפריה של השקע.
    8. בדוק מתחת למיקרוסקופ אם יש בועות או צפיפות זריעה לא אחידה של תאי IM. הוסף 3 מ"ל של PBS למחסנית מחזיק השבב. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות.
    9. שטפו את שני הערוצים עם 200 μL של מדיום תרבית התאים המתאים להם, תוך שאיפה זהירה לפריפריה של שקעי השבב כדי לסייע במניעת זרימה לאחור של פסולת המדיום והתאים.
    10. חברו קצוות מחסום P200 ריקים לשני השקעים של תעלות השתן והנימים. Pipette 200 μL של מדיום תחזוקה אנדותליאלי ולהזריק חצי ממנו לתוך פתח הערוץ הנימי. שחררו את קצה הפיפטה בתוך הכניסה כך שגם הכניסה וגם היציאה של הערוץ מחוברים כעת לקצוות פיפטה מלאים במדיום.
    11. Pipette 200 μL של תחזוקת IM בינוני ולהזריק חצי לתוך פתח ערוץ השתן. שחררו את קצה הפיפטה בתוך הכניסה כך שגם הכניסה וגם היציאה של הערוץ מחוברים כעת לקצוות פיפטה מלאים במדיום. דגרו את השבבים בעזרת קצוות המוטמעים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  3. חבר שבבים לביוריאקטור של שבב איברים כדי להפעיל זרימת נוזלים ומתח מכני.
    1. הסר טיפים P200 מתעלות השתן והנימים. הוסיפו טיפות של מדיה מתאימה לכניסה ולשקע של תעלות השתן והנימים כדי למנוע התייבשות.
    2. הוסף 3 מ"ל של מדיום אינדוקציה פודוציטים חם (טבלה משלימה S1) למאגר כניסת השתן. הוסף 3 מ"ל של מדיום תחזוקת אנדותל חם למאגר הכניסה הנימי.
    3. הוסף 300 μL של מדיום אינדוצין פודוציטים חם למאגר מוצא תעלת השתן ישירות מעל יציאת היציאה. הוסף 300 μL של מדיום תחזוקה אנדותליאלי חם למאגר יציאת התעלה הנימית ישירות מעל יציאת היציאה.
    4. החליקו את התרמילים על המגש ולתוך הביוריאקטור של שבבי האיברים.
    5. השתמש בחוגה הסיבובית בביוריאקטור של שבב האיברים כדי לבחור ולהתחיל את מחזור הפריים (2 דקות). בדוק באופן חזותי את החלק התחתון של התרמיל לאיתור טיפות קטנות בכל ארבע יציאות הנוזלים.
    6. כדי להשיג מגע נוזלי-נוזלי בין החלק התחתון של ה-Pod לבין יציאות השבב המיקרופלואידי, החלק בעדינות את מנשא השבב לתוך ה-Pod. לחצו בעדינות על לשונית מנשא השבב פנימה ולמעלה. שאפו מדיום עודף ממשטח השבב.
    7. הגדר את קצב הזרימה של ביוריאקטור שבב איברים ל-60 μL/h. הגדר את הזן המחזורי ל-10% ב-0.4 הרץ. השתמש בחוגה הסיבובית על ביוריאקטור שבב האיברים כדי לבחור את מחזור הוויסות ולהפעיל במשך 2 שעות.
    8. בדוק חזותית את מאגרי מוצא עבור עלייה ברמת המדיום.
    9. השתמש בחוגה הסיבובית בביוריאקטור שבב האיברים כדי לבחור את מחזור הסידור.

7. ימים 17-21 ואילך: אינדוקציה פודוציטים ותחזוקת שבבים

  1. שאפו את המדיום ממאגרי היציאה של תעלת השתן באלכסון הרחק מהנמל, אך שמרו על מדיום כלשהו במאגר בכל יום של תרבות. לחדש את מאגר פתח השתן עם עד 3 מ"ל של Podocyte אינדוקציה בינונית כל 2 ימים במשך 5 ימים.
    1. לאחר 5 ימים, לשאוף את המדיום מן ערוץ השתן אבל לשמור על כמה מדיום במאגר. לחדש את מאגר פתח השתן מדי יום עם 3 מ"ל של מדיום תחזוקה Podocyte.
  2. שאפו את המדיום ממאגרי היציאה הנימיים באלכסון הרחק מהנמל, אך שמרו על מדיום כלשהו במאגר בכל יום של תרבות. חדש את מאגר כניסת התעלה הנימית מדי יום עם עד 3 מ"ל של מדיום תחזוקה אנדותליאלי.

8. בדיקה תפקודית והדמיית אימונופלואורסצנציה

הערה: ראה קובץ משלים 1 לקבלת פרטים על ניתוח ציטומטריה של זרימה, ELISA עבור שפכי שבב ובידוד mRNA.

  1. בדיקה פונקציונלית (סינון מולקולרי) באמצעות אינולין ואלבומין
    1. שאפו את המדיום ממאגר מוצא התעלה הנימית באלכסון הרחק מהנמל, אך שמרו על מדיום כלשהו במאגר. החלף עם 3 מ"ל של מדיום תחזוקה אנדותליאלי בתוספת אינולין ואלבומין (טבלה משלימה S1) במשך 6 שעות.
    2. באמצעות פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל, מודדים את הנפח (במ"ל) של המדיום מערוץ השתן ומעבירים לצינור חרוטי של 15 מ"ל. יש לעטוף את השפופרת בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור ולמזער את ההלבנה של אינולין ואלבומין מצומדים לפלואורופור. לחדש את המאגר עם 3 מ"ל של פודוציט תחזוקה בינוני.
    3. הכינו פתרון מלאי של אינולין במדיום תחזוקה של פודוציטים. החל מ-25 מיקרוגרם/מ"ל אינולין, הכינו שמונה תקנים של אינולין באמצעות דילול טורי פי 2 במדיום תחזוקה של פודוציטים.
    4. באופן דומה, הכינו פתרון מלאי של אלבומין במדיום תחזוקה של פודוציטים. החל מ-150 מיקרוגרם/מ"ל אלבומין, הכינו שמונה תקנים של אלבומין באמצעות דילול סדרתי פי 2 במדיום תחזוקה של פודוציטים.
    5. פיפטה ב-100 μL משוכפלים של כל ריכוז אינולין סטנדרטי לתוך כל באר של צלחת שחורה, 96 בארות (או 16 בארות סה"כ של אינולין). פיפטה בשכפול 100 μL של כל ריכוז אלבומין סטנדרטי לתוך כל באר של אותה צלחת 96 באר (16 בארות סה"כ של אלבומין). פיפטה במדיום תחזוקה כפול של 100 μL Podocyte כדי לשמש כריק (או שתי בארות סה"כ של מדיום תחזוקה Podocyte).
    6. פיפטה בשכפול 100 μL של תווך שפכים מתעלת השתן לתוך כל באר של אותה צלחת 96 באר. פיפטה בשכפול 100 μL של תווך שפכים מן הערוץ הנימי.
    7. הכנס את הצלחת לקורא הלוחות ומדוד את הפלואורסצנטיות של אלבומין בעירור 550 ננומטר ופליטה 615 ננומטר. מדוד את אותה צלחת עבור אינולין בעירור 513 ננומטר ופליטה 577 ננומטר.
    8. מהנתונים שנוצרו, ממוצע המדידות הכפולות (לכל שבב). הפחת את הערך הריק המתאים לקריאת לוח זה משאר הנתונים בגיליון.
    9. התווה את הערכים המתאימים לתקני האלבומין כדי ליצור עקומה סטנדרטית עם ריכוז [μg/mL] על ציר ה-x ופלואורסצנציה על ציר ה-y. התווה את הערכים המתאימים לתקני האינולין כדי ליצור עקומה סטנדרטית עם ריכוז [μg/mL] על ציר x ופלואורסצנטיות על ציר y.
    10. השתמש בחבילת תוכנה לניתוח סטטיסטי ובאינטרפולציה ליניארית כדי לקבוע את ריכוז האינולין והאלבומין בשתן בהתאמה, בתווך הקולחין מהשבבים.
    11. קבע את מרווח השתן של אינולין/אלבומין מהשבבים באמצעות משוואה (1)2:
      פינוי שתן = ([U] × UV) / [P] (1)
      כאשר [U] הוא ריכוז השתן משלב 8.1.10, UV הוא נפח שפכי תעלות השתן שנאספו משלב 8.1.2, ו-[P] הוא הריכוז הנימי של אינולין או אלבומין (10 מיקרוגרם/מ"ל אינולין או 100 מיקרוגרם/מ"ל אלבומין).
  2. הדמיה אימונופלואורסצנטית
    1. הזריקו קצה P200 ריק ליציאות היציאה של תעלות השתן והנימים. כדי לתקן את התאים, פיפטה 200 μL של 4% פורמלדהיד ולהזריק חצי ממנו לתוך פתח הערוץ התחתון. שחררו את קצה הפיפטה בתוך הכניסה.
    2. Pipette 200 μL של 4% פורמלדהיד ולהזריק חצי ממנו לתוך פתח צינור השתן. שחררו את קצה הפיפטה בתוך הכניסה כך שגם הכניסה וגם היציאה של הערוץ מחוברים כעת לקצות פיפטה מלאים בקיבוע.
    3. לדגור את השבבים בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
    4. לאחר 20 דקות, השליכו את כל קצות הפיפטה. הזרימו קצוות P200 נקיים וריקים ליציאות המוצא של תעלות השתן והנימים. כדי לחדור לתאים, פיפטה 200 μL של 0.125% טריטון X-100 / PBS ולהזריק חצי ממנו לתוך פתח ערוץ נימי. שחררו את קצה הפיפטה בתוך הכניסה.
    5. Pipette 200 μL של 0.125% Triton X-100/PBS ולהזריק חצי ממנו לתוך פתח צינור השתן. שחררו את קצה הפיפטה בתוך הכניסה. לדגור את השבב בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
    6. השליכו את כל קצוות הפיפטה. הזרימו קצוות P200 נקיים וריקים ליציאות המוצא של תעלות השתן והנימים. כדי לחסום את התאים, פיפטה 200 μL של 1% אלבומין בסרום בקר (BSA) ב 0.125% Triton X-100 / PBS ולהזריק חצי ממנו לתוך פתח הערוץ הנימי. שחררו את קצה הפיפטה בתוך הכניסה.
    7. Pipette 200 μL של 1% BSA ב 0.125% Triton X-100 / PBS ולהזריק חצי ממנו לתוך פתח צינור השתן. שחררו את קצה הפיפטה בתוך הכניסה. לדגור בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
    8. השליכו את כל קצוות הפיפטה. יש לשטוף את שני הערוצים פי 3 על ידי הזרמת 200 μL של 0.125% Triton X-100/PBS לכל ערוץ ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
    9. הכן 100 μL של נוגדן ראשוני לכל ערוץ עם הדילול המומלץ על ידי היצרן ב 0.125% Triton X-100 / PBS. הזרימו קצוות P200 נקיים וריקים ליציאות המוצא של תעלות השתן והנימים. Pipette 100 μL של נוגדן ראשוני ולהזריק חצי לתוך הערוצים המתאימים. שחררו את קצה הפיפטה בתוך הכניסה.
    10. דגירה במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר או, לקבלת תוצאות טובות יותר, לילה ב 4 °C (60 °F).
      הערה: ניתן להשתמש במספר נוגדנים ראשוניים בבת אחת; עם זאת, יש לדלל את תמיסת הנוגדנים העיקרית בהתאם להוראות היצרן.
    11. שטפו את הערוצים 3 x 10 דקות כמתואר בשלב 8.2.8.
    12. הכן 100 μL של נוגדן משני לכל ערוץ עם מקדם הדילול המומלץ על ידי היצרן ב- 0.125% Triton X-100/PBS. הזרימו קצוות P200 נקיים וריקים ליציאות המוצא של תעלות השתן והנימים. Pipette 100 μL של נוגדן משני ולהזריק חצי לתוך הערוצים המתאימים. שחררו את קצות הפיפטה בתוך הכניסה. לדגור במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
      הערה: יש להשתמש בכל נוגדן משני בנפרד. יש לשטוף לפחות 3 x 10 דקות בין כל יישום בהתאם לשלב 8.2.8.
    13. שטפו את הערוצים 3 x 10 דקות כמתואר בשלב 8.2.8.
    14. יש לשטוף את שני הערוצים פעם אחת עם 200 μL של מים מזוקקים תוך שאיפת שאריות הנוזל מהפריפריה של יציאות יציאת השבב.
    15. הזריקו P200 נקי וריק ליציאות המוצא של תעלות השתן והנימים. כדי לנטרל את התאים, פיפטה 200 μL של 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, דילול 1:1,000 במים מזוקקים) ולהזריק חצי ממנו לתוך פתח ערוץ נימי. שחררו את קצה הפיפטה בתוך הכניסה, ופיפטה 200 μL של DAPI והזריקו מחצית ממנו לכניסת תעלת השתן. משחררים את קצה הפיפטה בתוך הכניסה, ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
    16. השליכו את כל קצוות הפיפטה. הזרימו קצוות P200 נקיים וריקים ליציאות המוצא של תעלות השתן והנימים. כדי לנטרל את התאים, פיפטה 200 μL של phalloidin (דילול 1:1,000 ב- PBS ללא Ca 2+ ו- Mg2+) ולהזריק מחצית ממנו לתוך פתח התעלה הנימי ולשחרר את קצה הפיפטה בתוך הכניסה. פיפטה 200 μL של phalloidin (דילול 1:1,000 ב- PBS ללא Ca 2+ ו- Mg2+) ולהזריק מחצית ממנו לתוך פתח תעלת השתן ולשחרר את קצה הפיפטה בתוך הכניסה. לדגור בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.
    17. שטפו את הערוצים פי 3 עם 200 μL של PBS ללא Ca 2+ ו-Mg2+, ושאפו לנוזלים עודפים מהפריפריה של יציאות היציאה.
    18. דמיינו את השבבים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאן אנו מראים כי מודל תלת-ממדי פונקציונלי במבחנה של הגלומרולוס יכול לעבור כלי דם ואפיתל ממקור איזוגני של תאי iPS אנושיים. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מספק הוראות כיצד ליישם את טכנולוגיית תאי ה- iPS האנושיים, במיוחד את יכולתם להתמיין לסוגי תאים מיוחדים, כדי ליצור אפיתל גלומרולרי בכליות (פודוציטים) ואנדותל כלי דם (viECs) שניתן לשלב עם התקנים מיקרופלואידיים כדי למדל את המבנה והתפקוד של הכליה האנושית ברמה הספציפית למטופל. סקירה סכמטית של הפרוטוקול וציר הזמן הזה (איור 1A) מתארת כיצד לתרבת תאי iPS אנושיים פעילים מיטוטית (איור 1B) ואז להבדיל אותם (במקביל) לשושלות של תאי מזודרם ומזודרם לרוחב (איור 1C,D). תאי המזודרם שהתקבלו נמצאו כמבטאים ברכיורי (T), בעוד שתאי המזודרם הלטרליים ביטאו ברכיורי (T), MIXL ו-EOMES 2,9,10,11.

התמיינות מאוחרת יותר של תאי המזודרם ייצרה תאי מזודרם ביניים (IM), בעוד שהתמיינות של תאי המזודרם הלטרליים ייצרה viECs (איור 1D)2,10,11,17. ניתוח ציטומטריה של זרימה שימש לבחינת הביטוי של CD144 ב- viECs מובחנים (לפני ואחרי מיון MAC) בהשוואה לבקרות שליליות (כולל תאי iPS אנושיים מוכתמים ולא מוכתמים ואנדותל לא מוכתם). התמיינות אופטימלית של האנדותל תגרום לתאים חיוביים ל-CD31/CD144 ב-50% או יותר לפני מיון MAC, מה שישתפר משמעותית לאחר מיון התאים בהשוואה לפקדים. תוצאות מייצגות מראות יעילות התמיינות של 59% עבור CD144 לפני מיון MAC, אשר עלתה ל-77% או יותר תאים חיוביים ל-CD144 (לא כולל תאים חיוביים ל-CD31) לאחר מיון MAC (איור 1E).

ביום ה -14 של פרוטוקול זה (לפני השלמת התמיינות IM והרחבת viEC), התקני האיברים על שבב הוכנו לזריעת תאים על ידי טיפול בפלזמה ופונקציונליזציה עם מטריצת קרום מרתף 2. למחרת (היום ה-15 לפרוטוקול), viECs נזרעו לערוץ הנימי (התחתון) של המכשיר המיקרופלואידי עם מדיום viEC. יום לאחר זריעת viEC (היום ה-16 של הפרוטוקול), תאי IM נזרעו לתעלת השתן (העליונה) של המכשיר המיקרופלואידי עם מדיום אינדוקציה פודוציטים. ביום שלאחר זריעת תאי IM (היום ה-17 לפרוטוקול זה), קצב זרימת נוזל של 60 μL/h ומתח של 10% ב-0.4 הרץ הוחלו על שבבי הגלומרולוס. שבבים אלה חווים לחץ גזירה של 0.017dyn cm−2 ו- 0.0007dyn cm−2 בתעלות הנימים והשתן,בהתאמה 2,12. לאחר עד 5 ימים של אינדוקציה של פודוציטים ו-6 ימים של התפשטות אנדותל וסקולרי בשבב (היום ה-21 של פרוטוקול זה) (איור 2A), התאים שהתקבלו בתוך שבבי הגלומרולוס ביטאו סמני זיהוי שושלת.

באופן ספציפי, הפודוקיטים בתעלת השתן ביטאו פודוצין ונפרין (איור 2B, פאנל עליון), וה-viECs בערוץ הנימי ביטאו PECAM-1 (CD31) ו-VE-Cadherin (CD144) (איור 2B, פאנל תחתון). בנוסף, גם שכבת הפודוקיטים וגם שכבת ה-viEC ביטאו את הקולגן IV, חלבון ה-GBM הנפוץ ביותר (איור 2B) בגלומרולוס הכליות. יותר קולגן IV מתבטא בתעלת השתן מכיוון שפודוציטים הם היצרנים השולטים של קולגן IV, כולל איזופורם α3α4α5, שהוא האיזופורם ההטרוטרימר העיקרי של קולגן בגלומרולוס הבוגר. בנוסף, הפודוציטים שהופצו בשבבי הגלומרולוס פיתחו תהליכים רגליים והפרישו VEGF165, שניהם מאפיינים אופייניים למודלים פונקציונליים של הכליה גלומרולוס 2,12. פרוטוקול זה מספק גם הערכה של תפקוד הסינון המולקולרי הסלקטיבי של גלומרולוס הכליות באמצעות אינולין ואלבומין, שממנו שבבי הגלומרולוס מסננים באופן סלקטיבי מולקולות קטנות (אינולין) מהנימי לתעלת השתן, תוך מניעת יציאת חלבונים גדולים (אלבומין) מהתעלה הנימית (איור 2C)2,10,12.

מכיוון שכל קו תאי iPS אנושי מציג הבדלים מובנים בזמן ההכפלה, חשוב לציין כי צפיפות זריעת התאים האופטימלית עבור קווי תאים שונים עשויה להשתנות ולכן חייבת להיות אופטימלית על ידי החוקר. עבור התמיינות תאי אנדותל, אם צפיפות הזריעה של תאי iPS אנושיים נמוכה מדי, החוקר עשוי לצפות בתפוקה נמוכה יותר של תאי אנדותל ממוינים (יעילות של <30%). אם צפיפות הזריעה של תאי iPS אנושיים גבוהה מדי, החוקר עשוי להבחין בצמיחת יתר מהירה של תאים, ניתוק או הידבקות גרועה יותר, מוות תאי מוגבר ותפוקה נמוכה (יעילות של <30%). במהלך אינדוקציה של האנדותל (ימים 4-7 של התמיינות), עלייה במספר התאים וכתוצאה מכך שכבה משנית של תאים היא נורמלית, אך יש לשמור אותה למינימום (איור 3A). עבור התמיינות IM ופודוציטים, הזרמת יתר של תאי iPS אנושיים (>100,000 תאים/באר של צלחת 12 בארות) עלולה לגרום לתאי IM הגדלים באשכולות גדולים או יוצרים אגרגטים, מה שיכול לעכב התמיינות ולגרום לפודוציטים עם פנוטיפ מורפולוגי פחות בוגר של תאים מצטברים ופחות תהליכים משניים ו/או שלישוניים בכף הרגל10, 11.

במהלך תרבית שבבים מיקרופלואידיים, ניתן לצפות בזרימה צולבת בלתי צפויה של נוזלים בין תעלות השתן לתעלות הנימיות (איור 3B) אם יש קרע או הדבקה לא מספקת של רכיבי שבב PDMS, או אם נתיב זרימת הנוזל חסום. זרימה צולבת בלתי רצויה זו של נוזלים עשויה גם לנבוע ממחסום סינון פגום כגון מודלים של רקמות מזריעת תאים לקויה (נמוכה) או שכבות תאים פגומות. כדי למנוע בעיה זו, מומלץ כי החוקר עוקב אחר הפרוטוקול המומלץ ואת צפיפות זריעת התא, כמו גם בודק חזותית את השבבים עבור בועות אוויר בתעלות בכל שלב של התהליך. אם בועות אוויר נצפות במאגרי המדיה של השבבים המיקרופלואידיים שנמצאים תחת זרימת נוזלים, ניתן לעצור את המשאבה ולהוריד את המדיום בתנאים סטריליים.

יחד, פרוטוקול זה ותוצאות מייצגות מתארים את הנגזרת של אנדותל וסקולרי (viECs) ואפיתל גלומרולרי (פודוציטים) מקו תאי iPS אנושי איזוגני, ואת שחזורם מחדש בהתקן מיקרופלואידי של איבר על שבב כדי לשחזר את המבנה והתפקוד של מחסום סינון גלומרולרי הכליות באופן ספציפי למטופל.

Figure 1
איור 1: נגזרת של אפיתל גלומרולרי איזוגני ואנדותל כלי דם מתאי iPS אנושיים. (A) ציר זמן סכמטי של אינדוקציה ביניים של מזודרם ו-viEC, תכנון איבר על שבב וציפוי מטריצת ממברנות מרתף, זריעת תאים לתוך השבב והשראת פודוציטים בתוך השבב. (B) תמונות שדה בהירות מייצגות של תאי iPS אנושיים מסוג PGP1 לפני הדיסוציאציה ביום 0 של הפרוטוקול. (C) תמונות שדה בהירות מייצגות של תאי מזודרם PGP1 ביום 2 של התמיינות (משמאל) ותאי מזודרם ביניים ביום 8 של התמיינות (מימין). (D) תמונות שדה בהירות מייצגות של תאי מזודרם רוחביים PGP1 ביום 3 של התמיינות (משמאל) ו- PGP1 viECs ביום 9 של התמיינות (2 ימים של התרחבות) (מימין). פסי קנה מידה = 275 מיקרומטר (B-D). (E) כימות התמיינות viEC באמצעות ניתוח ציטומטריה של זרימה עבור תאים חיוביים ל-CD144 ביום 7 של התמיינות תאי אנדותל לפני MACS (כחול) וביום 9 של התפשטות תאי אנדותל לאחר MACS (ורוד) בהשוואה לתאי iPSCs אנושיים מוכתמים ב-CD144 (שחור) ותאי אנדותל לא מוכתמים (באדום). נתון זה שונהמ-12. קיצורים: iPSCs = תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים; viEC = תאי אנדותל וסקולריים; BMP4/7 = חלבון מורפוגנטי עצם 4/7; RA = חומצה רטינואית; VEGF = גורם גדילה אנדותל וסקולרי; MACS = מיון תאים המופעל מגנטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: תמונות מייצגות של אנדותל כלי דם ואפיתל גלומרולרי (שכבת פודוציטים) בתרבית בתוך שבב גלומרולוס הכליה המיקרופלואידית. תמונות שדה בהירות מייצגות של viECs (משמאל) ואפיתל גלומרולרי (פודוציטים) (מימין) המופצים בשבב הגלומרולוס. פסי קנה מידה = 183 מיקרומטר. (B) תמונות אימונופלואורסצנטיות מייצגות של אפיתל גלומרולרי (פודוציטים) ו- viEC המציגות את הביטוי של סמנים ספציפיים לשושלת. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. (C) נתונים מייצגים המציגים סינון מולקולרי סלקטיבי בשבב הגלומרולוס. קווי שגיאה מייצגים את SD. p < 0.0001. נתון זה הועתק מ-12. קיצורים: viECs = תאי אנדותל וסקולריים; VE-cadherin = CD144; PECAM-1 (= CD31) = מולקולת הידבקות תאי אנדותל טסיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: תמונות של צפיפות זריעת אנדותל תת-אופטימלית וזרימת נוזלים לא אחידה בשבבים המיקרופלואידיים. (A) תמונות שדה בהיר מייצגות של תרביות תאים אופטימליות (משמאל) ושל תרביות תאים מוגזמות (מימין) ביום 6 של התמיינות viEC. פסי קנה מידה = 275 מיקרומטר. (B) תמונות מייצגות של מאגרי מוצא משבבים מיקרופלואידיים עם זרימת נוזל אחידה ומחסום פונקציונלי (משמאל). תמונה משבב עם זרימת נוזלים לא אחידה או מחסום לא מתפקד (מימין). חצים מציינים רמות נוזלים במאגרי מוצא עבור תעלות נימי ושתן של השבבים. קיצור: viECs = תאי אנדותל וסקולריים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

קובץ משלים 1: ציטומטריה של זרימה, ELISA לשפכי שבבים, ובידוד mRNA. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S1: תצורות חומרים של קולט אדים בתרבית רקמה. (A) חומר קולט אדים בתרבית רקמה שהוגדר עבור MACS, כולל דלי קרח עם מדיה, מגנט על מעמד מגנט וצינורות חרוטיים מתחת למגנט. (B) מתקן חומר בתרבית רקמה של צלחת פטרי עבור שבבים, כאשר החלק העליון, פונה כלפי מטה, מתחת לתחתית צלחת פטרי. קיצור: MACS = מיון תאים המופעל על ידי מגנטית. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה S1: מדיה ומאגרים המשמשים בפרוטוקול זה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בדו"ח זה, אנו מתארים פרוטוקול לגזירת אנדותל וסקולרי ואפיתל גלומרולרי (פודוציטים) מקו תאי iPS אנושי איזוגני ואת השימוש בתאים אלה כדי להנדס מערכת תלת-ממדית של איבר על שבב המחקה את המבנה, ממשק הרקמה-רקמה ותפקוד הסינון המולקולרי של גלומרולוס הכליה. שבב גלומרולוס זה מצויד באנדותל ובאפיתל גלומרולרי, אשר יחד מספקים מחסום לסינון סלקטיבי של מולקולות.

חוקרים המעוניינים להתאים פרוטוקול זה צריכים לעשות את השיקולים הבאים: ראשית, אופטימיזציה עשויה להיות נחוצה לזריעת תאים בהתאם למאפייני הגדילה האינהרנטיים של קווי תאי הגזע המשמשים. צפיפות זריעת התאים עשויה להשתנות עקב הבדלים מהותיים בשיעורי ההתרבות של תאי iPS אנושיים. מומלץ לחוקרים להתחיל עם צפיפות זריעת המזודרם המוצעת על ידי הפרוטוקול, ולאחר מכן להתאים במידת הצורך. באופן דומה, מומלץ שהתמיינות המזודרם הלטרלי תתחיל בצפיפות הזרעים המוצעת של התאים לפני ההתאמה לפי הצורך כדי להשיג תפוקת viEC ויעילות מיון של 50% או יותר. אם לא מתמיינים מספיק תאים לאחר המיון, ניתן להשתמש במעכב TGF-Beta (SB431542) כדי למנוע שקט ולעזור להרחיב באופן אקספוננציאלי את ה- viECs (מעבר לקטע 3). עם זאת, מספר תהליכים תאיים או מסלולי איתות תלויים ב-TGF-Beta (למשל, פתוגנזה של היפרגליקמיה/סוכרת, הומאוסטזיס חיסוני); ככזה, מומלץ לחוקרים לשקול את ההשפעות של עיכוב TGF-Beta על ניתוח במורד הזרם או להבטיח בדיקות נאותות כדי למנוע תוצאות ניסוי לא מכוונות.

שנית, חשוב לציין שינויים אפשריים באיכות הריאגנטים ובמפרטי היצרן, במיוחד עבור רכיבים שנרכשו מספקים אחרים מאלה שצוינו בפרוטוקול. לפיכך, מומלץ לחוקר לבדוק ריאגנטים ממספרי לוט, ספקים וספקים שונים כדי להבטיח שכפול של ניסויים ותוצאות. באופן כללי, על החוקר להימנע מחשיפה מוגזמת של תאי ה-iPS האנושיים לאנזימי דיסוציאציה במאגרי הניתוק, שכן הדבר עלול להוביל לירידה בחיוניות התאים ולשינוי בפרופיל המולקולרי של התאים. בנוסף, יש להגן על מדיום האינדוקציה פודוציטים מפני אור כדי למנוע השבתה של כל החומצה הטרנס-רטינואית. שלישית, במהלך תרבית תאי איבר-על-שבב, חיוני להימנע מבועות אוויר בתעלות המכשיר המיקרופלואידי בעת חדירת השבבים. ניתן למזער או למנוע את הופעתן של בועות אוויר על ידי בדיקה קבועה של השבבים במהלך זריעת התאים, על ידי שמירה על מגע נוזלי-נוזלי בכל שלב הכרוך בזליגת שבבים, ועל ידי אי דחיפה או משיכה של אוויר לתעלות הנוזלים בעת שימוש בקצות פיפטה ו/או שאיפה.

מאמצים קודמים להנדס שבבי גלומרולוס בכליות עם אפיתל ואנדותל מותאמים גנטית הסתמכו על שימוש בתאים שמקורם בבעלי חיים1. בעוד שקווי תאים אלה שמקורם בבעלי חיים שימשו באופן מסורתי למחקרים פרה-קליניים, לעתים קרובות הם אינם מצליחים לשחזר תגובות פיזיולוגיות אנושיות, התורמות לשיעור הכישלון הגבוה (89.5%) של ניסויים קליניים בבני אדם18. כדי לעזור להתגבר על חלק מהבעיות הללו, רצוי להשתמש במודלים פונקציונליים במבחנה המסכמים בצורה הדוקה יותר את הביולוגיה האנושית. נעשתה התקדמות בפיתוח מודלים רב-תאיים של הכליה האנושית; עם זאת, שבבי הגלומרולוס השתמשו בתאים אנושיים ממקורות הטרוגניים ולא איזוגניים. לדוגמה, בעבר הקמנו שבב גלומרולוס ששוחזר מפודוקיטים שמקורם בתאי iPS אנושיים ואנדותל10 שמקורו ברקמות ראשוניות. מחקרים מקבוצות מחקר אחרות השתמשו בתערובת של תאים ראשוניים 4,9, תאים אימורטליים 3, או תאים שמקורם במי שפיר 3,6 המגבילים את השימוש בהם לחקר תגובות או יישומים ספציפיים למטופל ברפואה מותאמת אישית.

הפרוטוקול המתואר כאן מתגבר על מגבלות אלה בכך שהוא מאפשר לגזור הן אנדותליום וסקולרי (viECs) והן אפיתל גלומרולרי (פודוציטים) מאותו קו תאי iPS אנושי ולשלב תאים אלה בהתקנים מיקרופלואידיים ממודרים של איבר על שבב כדי למדל את המבנה והתפקוד של דופן נימי הכליה הגלומרולרית במבחנה . בהתחשב בהתחדשות העצמית הבלתי מוגבלת של תאי iPS אנושיים, בשילוב עם יכולתם להתמיין כמעט לכל סוג תא, פרוטוקול זה מספק גם דרך למיקור רציף של פודוציטים אנושיים ו- viECs להנדסת רקמות ויישומים ביו-רפואיים אחרים. גישה זו עבור נגזרות של פודוציטים ו-viECs שוכפלה במספר קווי תאי iPS אנושיים ספציפיים למטופל, כולל PGP1- ו- DU11 2,10,12,17,19, ובכך אפשרה הקמת שבבי גלומרולוס כליות מותאמים אישית מאוכלוסיות המטופלים הרצויות.

האסטרטגיה להבחנה בין פודוציטים בתוך השבבים המיקרופלואידיים מאפשרת מחקר מכניסטי של גלומרולוס הכליות האנושי המתפתח ומידול מחלות. עם זאת, המחקר של גלומרולוס הכליות האנושיות המתפתחות מוגבל על ידי ה- viECs הדורשים מיון כדי להעשיר את האוכלוסייה הרצויה. עבודה זו יכולה להפיק תועלת מהקמת שיטות לבידול של viECs ללא צורך בבחירת תת-אוכלוסייה. מחקר זה מוגבל גם על ידי קרום PDMS עבה המפריד בין האנדותל הווסקולרי לשכבות תאי הפודוציטים. עבודה עתידית תוכל לשלב ביו-חומרים חדשניים שיחליפו את ה-PDMS העבה כדי לחקות טוב יותר את התכונות המולקולריות והביופיזיות של קרום המרתף הגלומרולרי. לדוגמה, ממברנה חלופית יכולה להיות מהונדסת כך שתהיה בעלת תכונות מתכלות עם נקבוביות הניתנת לכוונון ותהיה דקה יותר (דומה יותר ל-GBM) מאשר ממברנת PDMS בעובי 50 מיקרומטר המשמשת בפרוטוקול זה.

עם זאת, שבב הגלומרולוס המיוצר על ידי פרוטוקול זה יכול להיות מיושם כדי לחקור את המנגנונים של מחלות כליות מתישות ולשמש פלטפורמה לבדיקות nephrotoxicity וגילוי תרופות. מכיוון שתאי iPS אנושיים שומרים על הפרופיל הגנטי של התורם ושבב הגלומרולוס מסוגל לדגום מחלת כליות12, מטרות טיפוליות חדשניות עשויות להתגלות בעתיד לטובת אלה הסובלים מצורות תורשתיות של מחלת כליות. בנוסף, ניתן להעריך בצורה מדויקת יותר תגובות ביולוגיות ספציפיות למטופלים לתרופות לאחר השתלה באמצעות שבב כליה איזוגני כמו זה שתואר במחקר זה. לבסוף, שבב גלומרולוס זה מיועד לחקר ההשפעות של דינמיקת נוזלים ומתח מכני דיפרנציאלי - כמו אלה שנצפו בחולי מחלות כליות עם יתר לחץ דם או תסמונת לב-ריאה - בהתחשב בקלות היחסית של ויסות קצב זרימת הנוזלים, מתיחת רקמות או מאמץ מכני. ניתן להעלות על הדעת כי פרוטוקול זה יכול לקדם את ההבנה הנוכחית של התפתחות כליות אנושיות ומנגנוני מחלה, כמו גם להקל על פיתוח טיפולים מותאמים אישית בעתיד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

S.M. הוא ממציא על פטנט הקשור להתמיינות פודוציטים מתאי iPS אנושיים. למחבר השני אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי בית הספר להנדסה ע"ש פראט באוניברסיטת דיוק, המחלקה לנפרולוגיה במחלקה לרפואה של דיוק, מלגת וייטהד במחקר ביו-רפואי ופרס מחקר ג'ננטק עבור ס. מוסא. י. רוי זכה במלגת קרן אוניברסיטת דיוק-אלפרד פ. סלואן ובמלגת ויליאם מ. "מונטי" רייכרט מהמחלקה להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת דיוק. קו תאי ה-iPS של DU11 (שיבוט #11) של אוניברסיטת דיוק נוצר במתקן הליבה של Duke iPSC וסופק לנו על ידי מעבדת בורסאק באוניברסיטת דיוק. המחברים מודים לנ 'אבוטאלב, ג'יי הולמס, ר 'בהאטצ'אריה וי' ג'ואו על סיוע טכני ודיונים מועילים. המחברים רוצים גם להודות לחברי מעבדת מוסח על הערות מועילות על כתב היד. המחברים מודים למעבדת סגורה על המתנה של ציטומטר זרימה Acuri C6.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
Alexa Fluor 488- and Alexa Fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo/Life Technologies A32744; A32754; A-11076; A32790; A21203; A11015
Collagen IV Thermo/Life Technologies 14-9871-82
Nephrin Progen GP-N2
PECAM-1 R&D Systems AF806
Podocin Abcam ab50339
VE-Cadherin Santa Cruz sc-9989
Basement membrane matrices
Corning Fibronectin, Human Corning 356008 Basement membrane (3)
iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment Iwai North America N8922012 Basement membrane matrix (2)
Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial BD Biosciences 354277 Basement membrane matrix (1); may show lot-to-lot variation
Cells
DU11 human iPS cells The DU11 (Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. The line has been tested and found to be free of mycoplasma (last test in November 2021) and karyotype abnormalities (July 2019)
Culture medium growth factors and media supplements
0.5M EDTA, pH 8.0 Invitrogen 15575020
2-Mercaptoethanol Thermo/Life Technologies 21985023
Albumin from Bovine serum, Texas Red conjugate Thermo/Life Technologies A23017
All-trans retinoic acid (500 mg) Stem Cell Technologies 72262
B27 serum-free supplement Thermo/Life Technologies 17504044
B-27 supplement (50x) without Vitamin A Thermo/Life Technologies 12587010
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A9418
CHIR99021 Stemgent 04-0004 May show lot-to-lot variation
Complete medium kit with CultureBoost-R Cell Systems 4Z0-500-R Podocyte maintenance media
DMEM/F12 Thermo/Life Technologies 12634028
DMEM/F12 with GlutaMAX supplement Thermo/Life Technologies 10565042 DMEM/F12 with glutamine
Forskolin (Adenylyl cyclase activator) Abcam ab120058
GlutaMAX supplement Thermo/Life Technologies 35050061 glutamine supplement
Heat-inactivated FBS Thermo/Life Technologies 10082147
Heparin solution Stem Cell Technologies 7980
Human Activin A Thermo/Life Technologies PHC9544
Human BMP4 Preprotech 120-05ET
Human BMP7 Thermo/Life Technologies PHC9544
Human VEGF Thermo/Life Technologies PHC9394
Inulin-FITC Sigma-Aldrich F3272
mTeSR1 medium Stem Cell Technologies 05850 Human iPS cell culture media (CCM). Add 5x supplement according to the manufacturer. Human iPS CCM can be stored for up to 6 months at -20 °C.
N-2 Supplement (100x) Thermo/Life Technologies 17502048
Neurobasal media Thermo/Life Technologies 21103049 Lateral mesoderm basal media
PBS (Phosphate-buffered saline) Thermo/Life Technologies 14190-250
Penicillin-streptomycin, liquid (100x) Thermo/Life Technologies 15140-163
ROCK inhibitor (Y27632) Tocris 1254
StemPro-34 SFM Thermo/Life Technologies 10639011 Endothelial cell culture medium (CCM). Add supplement according to manufacturer. Endothelial CCM can be stored for up to two weeks at 4 °C or -20 °C for up to 6 months.
TGF-Beta inhibitor (SB431542) Stem Cell Technologies 72234
Enzymes and other reagents
Accutase Thermo/Life Technologies A1110501 Cell detachment buffer
Dimethyl Suloxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2438
Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade VWR 97065-058
Paraformaldehyde (PFA) Thermo/Life Technologies 28906
Sterile distilled water Thermo/Life Technologies 15230162
Triton X-100 VWR 97062-208
Equipment
Trypsin EDTA, 0.05% Thermo/Life Technologies 25300-120
(Orb) Hub module Emulate ORB-HM1
100mm x 15 mm round petri dish Fisherbrand FB087579B
120 x 120 mm square cell culture dish VWR 688161
Accuri C6 BD Biosciences
Aspirating pipettes, individually wrapped Corning 29442-462
Aspirating Unit SP Bel-Art F19917-0150
Avanti J-15R Centrifuge Beckman Coulter B99516
Conical centrifuge tube, 15 mL Corning 352097
Conical centrifuge tube, 50 mL Corning 352098
EVOS M7000 Thermo/Life Technologies AMF7000 Fluorescent microscope to take images of fixed and stained cells.
Hemocytometer VWR 100503-092
Heracell VIOS 160i CO2 incubator Thermo/Life Technologies 51030403
Inverted Zeiss Axio Observer equipeed with AxioCam 503 camera Carl Zeiss Micrscopy 491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera)
Kimberly-Clark nitrile gloves VWR 40101-346
Kimwipes, large VWR 21905-049
Leoca SP8 Upright Confocal Microscope
Media reservoir (POD Portable Module) Emulate POD-1
Microplate shaker VWR 12620-926
Organ-chip Emulate S-1 Chip
Organ-chip holder Emulate AK-CCR
P10 precision barrier pipette tips Denville Scientific P1096-FR
P100 barrier pipette tips Denville Scientific P1125
P1000 barrier pipette tips Denville Scientific P1121
P20 barrier pipette tips Denville Scientific P1122
P200 barrier pipette tips Denville Scientific P1122
Plasma Asher Quorum tech K1050X RF This Plasma Etcher/Asher/Cleaner was used as a part of Duke University's Shared Materials Instrumentation Facility (SMiF).
Round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap Corning 352235
Serological pipette, 10 mL, indivdually wrapped Corning 356551
Serological pipette, 25 mL, indivdually wrapped Corning 356525
Serological pipette, 5 mL, indivdually wrapped Corning 356543
Steriflip, 0.22 µm, PES EMD Millipore SCGP00525
Sterile Microcentrifuge tubes Thomas Scientific 1138W14
T75cm2 cell culture flask with vent cap Corning 430641U
Tissue culture-treated 12 well plates Corning 353043
Tissue culture-treated 6 well plates Corning 353046
Vacuum modulator and perstaltic pump (Zoe Culture Module) Emulate ZOE-CM1 Organ Chip Bioreactor
VE-Cadherin CD144 anti-human antibody - APC conjugated Miltenyi Biotec 130-126-010
Wide-beveled cell lifter Corning 3008
MACS
CD144 MicroBeads, human Miltenyi Biotec 130-097-857
CD31 MicroBead Kit, human Miltenyi Biotec 130-091-935
LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, L., et al. A disease model of diabetic nephropathy in a glomerulus-on-a-chip microdevice. Lab on a Chip. 17 (10), 1749-1760 (2017).
  2. Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (5), 1-12 (2017).
  3. Petrosyan, A., et al. A glomerulus-on-a-chip to recapitulate the human glomerular filtration barrier. Nature Communications. 10 (1), 3656 (2019).
  4. Hass, R., Kasper, C., Böhm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Communication and Signaling. 9, 12 (2011).
  5. Altschuler, S. J., Wu, L. F. Cellular heterogeneity: when do differences make a difference. Cell. 141 (4), 559-563 (2010).
  6. Da Sacco, S., et al. A novel source of cultured podocytes. PloS One. 8 (12), 81812 (2013).
  7. Singh, V. K., Kalsan, M., Kumar, N., Saini, A., Chandra, R. Induced pluripotent stem cells: applications in regenerative medicine, disease modeling, and drug discovery. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 2 (2015).
  8. Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of cardiovascular pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  9. Patsch, C., et al. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).
  10. Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13 (7), 1662-1685 (2018).
  11. Burt, M., Bhattachaya, R., Okafor, A. E., Musah, S. Guided differentiation of mature kidney podocytes from human induced pluripotent stem cells under chemically defined conditions. Journal of Visualized Experiments. (161), e61299 (2020).
  12. Roye, Y. A personalized glomerulus chip engineered from stem cell-derived epithelium and vascular endothelium. Micromachines. 12 (8), 967 (2021).
  13. Roselli, S., et al. Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area. The American Journal of Pathology. 160 (1), 131-139 (2002).
  14. Ruotsalainen, V., et al. Nephrin is specifically located at the slit diaphragm of glomerular podocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 7962-7967 (1999).
  15. Privratsky, J. R., Newman, P. J. PECAM-1: regulator of endothelial junctional integrity. Cell and Tissue Research. 355 (3), 607-619 (2014).
  16. Menon, M. C., Chuang, P. Y., He, C. J. The glomerular filtration barrier: components and crosstalk. International Journal of Nephrology. 2012, 749010 (2012).
  17. Abutaleb, N. O., Truskey, G. A. Differentiation and characterization of human iPSC-derived vascular endothelial cells under physiological shear stress. STAR Protocols. 2 (2), 100394 (2021).
  18. Pammolli, F., Magazzini, L., Riccaboni, M. The productivity crisis in pharmaceutical R&D. Nature Reviews. Drug Discovery. 10 (6), 428-438 (2011).
  19. Atchison, L., et al. iPSC-derived endothelial cells affect vascular function in a tissue-engineered blood vessel model of Hutchinson-Gilford progeria syndrome. Stem Cell Reports. 14 (2), 325-337 (2020).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 189
שבב גלומרולוס כליות איזוגני מהונדס מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Roye, Y., Musah, S. Isogenic Kidney… More

Roye, Y., Musah, S. Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (189), e63821, doi:10.3791/63821 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter