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Methodenartikel

Untersuchung der Pathogenese der MYH7-Mutation Gly823Glu bei familiärer hypertropher Kardiomyopathie anhand eines Mausmodells

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DOI:

10.3791/63949

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8. August 2022

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1Department of Cardiovascular Surgery, Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, 2The Second Clinical College of Guangzhou University of Chinese Medicine, 3Department of Cardiovascular Surgery, The First Affiliated Hospital, Jinan University, 4Guangdong Provincial Key Laboratory of Laboratory Animals, Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute, 5Department of Anesthesiology, Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Basierend auf der familiären erblichen Kardiomyopathie-Familie, die in unserer klinischen Arbeit gefunden wurde, erstellten wir ein C57BL / 6N-Mausmodell mit einer Punktmutation (G823E) am MYH7-Locus der Maus durch CRISPR / Cas9-vermitteltes Genom-Engineering, um diese Mutation zu verifizieren.

Zusammenfassung

Die familiäre hypertrophe Kardiomyopathie (HCM, OMIM: 613690) ist die häufigste Kardiomyopathie in China. Die zugrunde liegende genetische Ätiologie von HCM bleibt jedoch schwer fassbar.

Wir haben zuvor eine Myosin-Schwerketten-7 (MYH7)-Gen-heterozygote Variante NM_000257.4: c.G2468A (p.G823E) in einer großen chinesischen Han-Familie mit HCM identifiziert. In dieser Familie ist die Variante G823E mit einer autosomal-dominanten Erkrankung getrennt. Diese Variante befindet sich in der Hebelarmdomäne der Halsregion des MYH7-Proteins und ist unter homologen Myosinen und Spezies hoch konserviert. Um die Pathogenität der G823E-Variante zu überprüfen, produzierten wir ein C57BL/6N-Mausmodell mit einer Punktmutation (G823E) am Maus-MYH7-Locus mit CRISPR/Cas9-vermitteltem Genom-Engineering. Wir entwarfen gRNA-Targeting-Vektoren und Donor-Oligonukleotide (mit Targeting-Sequenzen, die von 134 bp Homologie flankiert werden). Die p.G823E-Stelle (GGG zu GAG) im Donor-Oligonukleotid wurde durch homologiegesteuerte Reparatur in Exon 23 von MYH7 eingebracht. Ein schallgedämpftes p.R819 (AGG zu CGA) wurde ebenfalls eingefügt, um eine gRNA-Bindung und Re-Spaltung der Sequenz nach homologiegesteuerter Reparatur zu verhindern. Die Echokardiographie ergab eine linksventrikuläre hintere Wand (LVPW) Hypertrophie mit Systole bei MYH7 G823E/- Mäusen im Alter von 2 Monaten. Diese Ergebnisse wurden ebenfalls durch histologische Analysen validiert (Abbildung 3).

Diese Ergebnisse zeigen, dass die G823E-Variante eine wichtige Rolle bei der Pathogenese von HCM spielt. Unsere Ergebnisse bereichern das Spektrum der MYH7-Varianten, die mit familiärer HCM verbunden sind, und können eine Anleitung für die genetische Beratung und pränatale Diagnose in dieser chinesischen Familie bieten.

Einleitung

Hypertrophe Kardiomyopathie (HCM, OMIM: 613690) ist mit einer geschätzten Inzidenz von 0,2% die häufigste Kardiomyopathie in China, von der 150.000 Menschen betroffen sind 1,2.

Das pathologische anatomische Merkmal, das HCM charakterisiert, ist die asymmetrische ventrikuläre Hypertrophie, die häufig den ventrikulären Ausflusstrakt und / oder das interventrikuläre Septum3 betrifft. Die klinische Manifestation ist Belastungsdyspnoe, Müdigkeit und Brustschmerzen. Der individuelle Phänotyp der HCM weist eine Variabilität auf, die von klinisch heimtückischer bis zu schwerer Herzinsuffizienz reicht. Patienten mit HCM benötigen medizinische Behandlung, Herztransplantation, lebenserhaltende Ausrüstung und multidisziplinäre Nachsorge4.

Im vergangenen Jahrhundert hat die PCR-Technologie die Art und Weise verändert, wie wir DNA5 untersuchen. Eine DNA-Sequenzierungsmethode für die klinische Diagnose wurde von Sanger und Kollegen entdeckt6. Die Sanger-Technik wurde später auf das Human Genome Project angewendet, aber dieser Ansatz war kostspielig und zeitaufwendig7. Das Aufkommen der Gesamtgenomsequenzierung (WGS) brachte Einblicke in menschliche genetische Krankheiten auf neue Höhen, blieb aber in Bezug auf die Kosten unerschwinglich. Die Whole-Exom-Sequenzierungstechnologie (WES) wird seit langem zum Nachweis von Keimbahnvarianten8 eingesetzt und war erfolgreich bei der Identifizierung somatischer Treibermutationen im Exom verschiedener Krebsarten9. Der Nachweis von DNA-Exons oder kodierenden Regionen durch WES kann verwendet werden, um pathogene Varianten bei den meisten Mendelschen Erkrankungen aufzudecken. Heute, mit den sinkenden Kosten für die Sequenzierung, wird erwartet, dass WGS zu einem wichtigen Werkzeug in der Genomforschung wird und bei der Erkennung pathogener Varianten im Genom weit verbreitet sein kann.

Die WES-Technologie wurde auch bei der erblichen Kardiomyopathie eingesetzt, um pathogene Varianten zu identifizieren, um die Ätiologie weiter aufzuklären. Neue Erkenntnisse deuten darauf hin, dass Gene, die Sarkomer-Strukturprotein-Genmutationen kodieren, wie MYH7 10, MYH6 11, MYBPC3 12, MYL2 13, MYL3 14, TNNT215, TNNI3 16, TNNC1 17 undTPM1 18, für die genetische Ätiologie von HCM verantwortlich sind. Das Bewusstsein für pathogene Varianten in seltenen krankheitsverursachenden Genen (z. B. Obscurin, Zytoskelett-Calmodulin und Titin-interagierendes RhoGEF (OBSCN, OMIM: 608616)19, wirkendes Alpha 2 (ACTN2, OMIM: 102573)20 und Cystein und glycinreiches Protein 3 (CSRP3, OMIM: 600824)21) wurde ebenfalls mit HCM in Verbindung gebracht. Aktuelle genetische Studien haben bei etwa 40% -60% der HCM-Patienten mehrere verschiedene pathogene Varianten im Sarkomerproteingen identifiziert, und Gentests bei HCM-Patienten ergaben, dass die meisten pathogenen Varianten in der Myosin-Schwerkette (MYH7) und dem Myosin-bindenden Protein C (MYBPC3) vorkommen. Die genetische Grundlage für HCM bleibt jedoch schwer fassbar. Die Erforschung der Pathogenität dieser Variationen, die den menschlichen HCM-Patienten zugrunde liegen, bleibt eine große Herausforderung22.

In dieser Studie berichten wir über eine pathogene Variante in MYH7 in einer chinesischen Han-Familie mit HCM von WES. Um die Pathogenität dieser Variante zu überprüfen, haben wir eine C57BL/6N-Myh7em1(G823E) Knockin-Maus mit dem CRISPR/Cas9-System etabliert. Wir diskutieren auch plausible Mechanismen dieser Variante.

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Protokoll

Die Geschichten der Familien wurden durch Interviews mit den Familienmitgliedern gewonnen. Die Studie wurde von der Ethikkommission des Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine (Nr. 2019074) genehmigt. Von allen Familienmitgliedern wurde eine schriftliche Einwilligung eingeholt. Alle Tiere werden in Übereinstimmung mit den ethischen Richtlinien des Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine (Guangzhou, China) behandelt.

1. Studienfächer

HINWEIS: Der Proband III-3 suchte im Juli 2019 medizinischen Rat in der Abteilung für Herz-Kreislauf-Chirurgie des Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine.

  1. Erhalten Sie eine detaillierte Familienanamnese des Probanden. Benachrichtigen und rufen Sie alle Familienmitglieder der Probanden an. Alle Familienmitglieder wurden akribisch untersucht.
    1. Führen Sie eine systematische Überprüfung aller klinischen Daten durch, einschließlich medizinischer Aufzeichnungen, EKGs, Echokardiogramme und Herzkatheterberichte.
    2. Bestätigen Sie die kardialen Phänotypen bei allen Patienten während des Eingriffs oder der Operation.
  2. Wählen Sie insgesamt 174 populationsbasierte gesunde Steuerelemente aus der lokalen Datenbank aus. Sammeln Sie ungefähr 4,0 ml peripheres venöses Blut von jedem Patienten.

2. DNA-Extraktion

HINWEIS: DNA wird mit einem handelsüblichen Blutkit gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert.

  1. Lysieren Sie Blutzellen mit einem anionischen Reinigungsmittel in Gegenwart eines DNA-Stabilisators nach dem Protokoll des Herstellers.
  2. Geben Sie 10 μL RNase A-Lösung in das Zelllysat und mischen Sie es, indem Sie das Röhrchen 25-mal umdrehen. Bei 37 °C 15 min bis 1 h inkubieren.
  3. Entfernen Sie Proteine durch Salzfällung. Verwenden Sie Proteinfällungslösung (0,25 mg Rinderserumalbumin gelöst in 25 ml destilliertem Wasser) und 100% Isopropanol, um Proteine auszufällen. Verwenden Sie dann 200 μL 70% Ethanol und führen Sie eine Zentrifugation bei 12.000 x g / min bei 4 ° C für 15 Minuten durch, um das DNA-Pellet zu waschen.
  4. Die genomische DNA wird durch Fällung mit 500 μL 70% Ethanol gewonnen. Zentrifuge bei 12.000 x g für 30 s. Das Pellet wird angesaugt und dann in Hydratationslösung aufgelöst (1 mM EDTA, 10 mM Tris· Cl, pH 7,5).
  5. Verwenden Sie ein Spektralphotometer (z. B. NanoDrop 2000), um die Reinheit zu bestimmen. Gereinigte DNA hat typischerweise ein A260/A280-Verhältnis zwischen 1,7 und 1,9 und ist bis zu 200 kb groß.
  6. Lagern Sie die DNA langfristig bei 2-8, -20 oder -80 °C.

3. Whole-Exom-Sequenzierung und Variantenanalyse

HINWEIS: Um systematisch nach krankheitsverursachenden Genmutationen zu suchen, wurde eine Exom-Sequenzierung bei betroffenen Personen (II-5, II-7, III-3, III-7, III-8, III-9 und IV-3) und nicht betroffenen Personen (III-2, III-5, IV-4) durchgeführt.

  1. Verwenden Sie die Exomsonde gemäß den Anweisungen des Herstellers, um die Exomerfassung durchzuführen.
  2. Wenden Sie die qualifizierten Bibliotheken auf die 2 × 150 bp Paired-End-Sequenzierung auf der HiSeq X-ten-Plattform an. Siehe Zusatzdatei 1.
  3. Richten Sie FASTQ-Dateien an das menschliche Referenzgenom (hg19/GRCh37) mit BWA v0.7.1318,19 aus. Sortieren Sie die ausgerichteten Dateien (Dateien im Sam/BAM-Format) mit samtools und kennzeichnen Sie dann Duplikate mit Picard. Siehe Zusatzdatei 1.
  4. Verwenden Sie GATK, richten Sie Lesevorgänge lokal neu aus und kalibrieren Sie die Basisqualitäten neu. Siehe Zusatzdatei 1.
  5. Generieren Sie Mapping-Statistiken, die Abdeckung und Tiefe aus neu kalibrierten Dateien von BEDTools und internen Perl / Python-Skripten enthalten.
  6. Genotypvarianten (SNVs und Indels) aus neu kalibrierten BAM-Dateien mit dem Multi-Sample-Verarbeitungsmodus des HaplotypeCaller-Tools von GATK.
  7. Verwenden Sie VQSR (Variant Quality Score Recalibration), um Fehlalarme von Variantenaufrufen zu reduzieren.
  8. Kommentieren Sie SNVs und Indels mit ANNOVAR Software21 gegen mehrere Datenbanken, einschließlich des Exome Aggregation Consortium (ExAC) (http://exac.broadinstitute.org), des Exome Sequencing Project (ESP) (https://esp.gs.washington.edu) und 1.000 G (http://www.1000genomes.org). Interpretieren Sie die Pathogenität der Sequenzvarianten gemäß den ACMG-Richtlinien.

4. Sanger-Sequenzierung

  1. Führen Sie eine Sanger-Sequenzierung durch, um potenzielle ursächliche Varianten zu bestätigen und die Variantentrennung in der Familie unter Verwendung eines ABI 3500-Sequenzers23 zu bestimmen.
  2. Entwerfen Sie Primersequenzen für die Variante im MYH7-Gen (NM_000257) wie folgt: 5'-TTCAAACACAGAGACCTGCAGG-3' und 5'- CGGACTTCTCTAGCGCCTCTT -3'.
  3. Bestätigen Sie eine Variante, überprüfen Sie alle verfügbaren Familienmitglieder, um die Variantentrennung innerhalb der Familiezu bestimmen 23.

5. Erzeugung von C57BL/6N-MYH7em1 (G823E) Knockin-Mäusen

  1. Verwenden Sie das CRISPR/Cas9-System, um C57BL/6N-Myh7em1 (G823E) Knockin-Mäuse zu erzeugen. Das Myh7-Gen der Maus (GenBank-Zugangsnummer: NM_001361607.1; Ensembl: ENSMUSG00000053093) befindet sich auf Mauschromosom 14 und hat 41 Exons. Das ATG-Startcodon in Exon 4 und das TAG-Stopcodon in Exon 41, und das G823E befindet sich auf Exon 23. Wählen Sie Exon 23 als Zielstandort aus.
  2. Design der Sequenz von gRNA-Targeting-Vektor und Donor-Oligo (mit Targeting-Sequenz, flankiert von 134 bp homologen Sequenzen kombiniert auf beiden Seiten).
    1. Melden Sie sich auf der NCBI-Website an und klicken Sie rechts auf die BLAST-Online-Primer-Design-Funktion .
    2. Klicken Sie unten auf der Seite auf die Primer-BLAST-Funktion , um Primer zu entwerfen.
    3. Fügen Sie die MYH7 NCBI-Referenzsequenznummer NM_000257.4 in das PCR-Vorlagenfeld ein.
    4. Amplifizieren Sie das Zielfragment (MYH7 cDNA-Exon 23 und seine angrenzenden Exons), so dass Sie den Upstream-Primer auf Exon 21 (2392-2528) und den Downstream-Primer auf Exon 25 (3205-3350) entwerfen. Geben Sie die Exon-Nummer der Upstream- und Downstream-Primer in das richtige Feld ein.
    5. Klicken Sie unten auf die Schaltfläche Get Primers , um automatisch mehrere Primerpaare zu generieren.
  3. Geben Sie das MYH7-Gen in die ZFIN-Datenbank ein, fügen Sie die p.g823e (GGG zu GAG) Mutationsstelle im Donor-Oligonukleotid und die stille Mutation p.r819 (AGG zu CGA) in Exon 23 ein. Die stille Mutation verhindert die Bindung und das erneute Schneiden der Sequenz durch gRNA nach homologiegesteuerter Reparatur.
    1. Design gRNA gemäß der allgemeinen Sequenz, die Sequenzen an beiden Enden sind TAATACGACTCACTATA- und -GTTTTAGAGCTA. Die Mitte der Sequenz ist die oben erwähnte Zielstelle.
  4. Co-injizieren Sie Cas9-mRNA, gRNA, die durch In-vitro-Transkription und Spenderoligo erzeugt wird, in befruchtete Eizellen für die KI-Mausproduktion.
    1. Verwenden Sie das Cas9/gRNA-Target-Effizienz-Detektionskit, um das entworfene gRNA-Ziel in vitro in gRNA zu transkribieren und die Aktivität des Transkripts (siehe VK007-Kit-Anweisungen für spezifische Nachweismethoden) gemäß dem Protokoll des Herstellers nachzuweisen.
    2. Die T7 ARCA mRNA-Kit-Komponenten auftauen, mischen und in einer Mikrofuge pulsieren, um Lösungen auf den Boden der Röhrchen zu sammeln. Die Reaktion wird bei Raumtemperatur in der folgenden Reihenfolge zusammengesetzt: 2x ARCA/NTP-Mischung auf 10 μL, 1 μg Template-DNA, 2 μL T7-RNA-Polymerase-Mischung und nukleasefreies Wasser auf 20 μL.
    3. Gründlich mischen und in einer Mikrofuge pulsieren. Bei 37 °C 30 min inkubieren.
    4. Entfernen Sie die Template-DNA durch Zugabe von 2 μL DNase I, mischen Sie gut und inkubieren Sie bei 37 °C für 15 Minuten, um mRNA zu erhalten.
    5. Durchführung einer intraperitonealen Injektion von Serumgonadotropin und humanem Choriongonadotropin in vorbereitete weibliche C57BL/6-Mäuse im Alter von etwa 4 Wochen mit einer 0,5-ml-Spritze in einer Dosis von etwa 5 U pro Maus im Abstand zwischen den beiden Injektionen von 48 h.
    6. Achtzehn Stunden nach der Verabreichung opfern Sie C57BL / 6 weibliche Mäuse und eine 8-12 Wochen alte männliche C57BL / 6-Maus durch zervikale Dislokation nach Hormoninjektion. Sammeln Sie die Eier und Spermien getrennt.
    7. Das Sperma wird in der Kapazitivationsflüssigkeit kapazitiert. Nehmen Sie die Spermien und lassen Sie sie am Rand der Flüssigkeit in die kurzlebigen Eizellen fallen, um sie in vitro zu befruchten und für 3-4 h zu befruchten.
    8. Verdünnen Sie die erfolgreich transkribierte gRNA und Cas9 mRNA in vitro mit RNase-freiem Wasser auf 25 ng/μL und 50 ng/μL. Bringen Sie befruchtete Eier der Maus durch Mikroinjektion in das Zytoplasma ein. Verpflanzen Sie befruchtete Eier in gutem Zustand in den vergrößerten Eileiter der weiblichen Mäuse. Co-Käfig mit ligierten männlichen Mäusen.
  5. Genotyp der Welpen durch PCR. Verwenden Sie die folgenden PCR-Bedingungen: 94 °C für 3 min, 35 Zyklen von 94 °C für 30 s, 60 °C für 35 s und 72 °C für 35 s; 72 °C für 5 min. Anschließend erfolgt die Sequenzanalyse.
    1. Schneiden Sie die Schwänze von 4 Monate alten Mäusen mit einer Schere ab und legen Sie sie in eine 1,5 ml EP-Röhre. Fügen Sie 180 μL Buffer GL, 20 μL Proteinase K und 10 μL RNase A pro Steißstück (2-5 mm) in ein Mikrozentrifugenröhrchen hinzu. Achten Sie darauf, nicht zu viel Schwanz zu schneiden.
    2. Das Röhrchen über Nacht bei 56 °C inkubieren.
    3. In einem Mikrozentrifugenröhrchen bei 1.000 x g für 2 min schleudern, um Verunreinigungen zu entfernen.
    4. Fügen Sie 200 μL Buffer GB und 200 μL absoluten Ethylalkohol bei ausreichender Mischung hinzu.
    5. Legen Sie die Spin-Säule in ein Sammelrohr. Tragen Sie die Probe auf den Spin auf und zentrifugieren Sie sie bei 1.000 x g für 2 min. Verwerfen Sie den Durchfluss.
    6. 500 μL Buffer WA in die Spinsäule geben und bei 1.000 x g 1 min zentrifugieren. Verwerfen Sie den Durchfluss.
    7. 700 μL Buffer WB in die Spinsäule geben und bei 1.000 x g für 1 min zentrifugieren. Verwerfen Sie den Durchfluss.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Buffer WB mit 100% Ethanol vorgemischt wurde. Wenn Sie Buffer WB hinzufügen, fügen Sie es der Rohrwand hinzu, um das Restsalz abzuwaschen.
    8. Wiederholen Sie Schritt 5.5.7.
    9. Die Schleudersäule in ein Sammelröhrchen geben und bei 1.000 x g für 2 min zentrifugieren.
    10. Legen Sie die Spin-Säule in ein neues 1,5-ml-Röhrchen. 50-200 μL sterilisiertes Wasser oder Elutionspuffer in die Mitte der Säulenmembran geben und die Säule 5 min stehen lassen.
      HINWEIS: Das Erhitzen von sterilisiertem Wasser oder Elutionspuffer auf bis zu 65 °C kann die Elutionsausbeute erhöhen.
    11. Um DNA zu eluieren, zentrifugieren Sie die Säule bei 1.000 x g für 2 min. Um die Ausbeute an DNA zu erhöhen, fügen Sie den Durchfluss und/oder 50-200 μL sterilisiertes Wasser oder Elutionspuffer in die Mitte der Spinsäulenmembran hinzu und lassen Sie die Säule 5 min stehen. Zentrifugieren bei 1.000 x g für 2 min.
    12. Quantifizieren Sie die eluierte genomische DNA durch Elektrophorese.

6. Beurteilung der kardialen Morphologie und Funktion

HINWEIS: Wenden Sie die M-Mode-Echokardiographie an, um die Herzmorphologie und -funktion von C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E) Knockin-Mäusen zu beurteilen.

  1. Legen Sie die Knockin-Mäuse in eine geschlossene Acrylbox, die mit dem Anästhesiegerät verbunden ist, und stellen Sie die Drei-Wege-Schnittstelle so ein, dass Isofluran (Konzentration: 3%) in die Acrylbox fließen kann. Nachdem sich die Knockin-Mäuse nicht mehr autonom bewegen, entfernen Sie die Knockin-Mäuse.
  2. Legen Sie die Knockin-Mäuse flach auf die Lebensüberwachungsplattform des Kleintieranästhesiegeräts und eine kontinuierliche Inhalationsanästhesie gemischt mit Sauerstoff (Durchfluss: 0,8 l / min) und Isofluran (Konzentration: 3%). Tragen Sie Augengleitmittel auf die betäubten Mäuse auf, um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern.
  3. Befestigen Sie die Knockin-Mäuse horizontal auf der Plattform. Neigen Sie die Plattform um 30° kaudal zur Knockin-Maus. Entfernen Sie Haare an der vorderen Brustwand der klopfenden Maus mit einer Enthaarungscreme.
  4. Positionieren Sie die Sonde senkrecht mit der Beule zum Kopf des Tieres. Drehen Sie dann die Sonde gegen den Uhrzeigersinn, ca. 45°.
  5. Drehen Sie die Sonde in der parasternalen Langachsenansicht um 90° im Uhrzeigersinn, um die parasternale Kurzachsenansicht zu beobachten. Nachdem Sie die Sonde um 90° gedreht haben, stellen Sie die Verschiebung der Y-Achse ein, um die richtige Scheibe zu erhalten.
  6. Beobachten Sie das Langachsenbild des Herzens (Abbildung 1C), und wählen Sie dann M-Mode-Messdaten aus.
  7. Erfassen Sie Ultraschalldaten von parasternalen Langachsenansichten von Mäusen (Abbildung 1). Gemessen werden Herzfrequenz (HR), linksventrikuläre Ejektionsfraktion (LVEF), Herzzeitvolumen (CO), linksventrikuläre enddiastolische Dimension (LVDd), LVDs linksventrikuläre endsystolische Dimension (LVSd), interventrikuläres Septum (IVS) und linksventrikuläres Hinterwand (LVPW).
  8. Stellen Sie den Mäusen nach der Messung Sauerstoff zur Verfügung und setzen Sie sie wieder in ihre jeweiligen Käfige ein, wenn sie wieder autonome Aktivität erlangen.

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Ergebnisse

Klinisches Profil der Familien
Die Familienstammbäume von HCM wurden erhalten und sind in Abbildung 2 dargestellt. Bei allen dokumentierten Familienmitgliedern wurde bei der Einschreibung HCM diagnostiziert.

In der Familie (Abbildung 2A) war der Probande Patient III-7, bei dem im Alter von 46 Jahren HCM und eine Obstruktion des linksventrikulären Ausflusstraktes (LVOTO) diagnostiziert wurden und der sich einer Herzoperation unterzo...

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Diskussion

In dieser Studie beschreiben wir eine chinesische Han-Familie mit HCM. Die genetische Analyse ergab, dass eine heterozygote MYH6-Mutation p.G823E bei Familienmitgliedern mit autosomal-dominanter Vererbung mit der Krankheit kosegnet. Um die Pathogenität der G823E-Mutation zu validieren und die zugrunde liegenden Mechanismen zu diskutieren, erstellten wir ein C57BL/6N-Mausmodell mit G823E am Myh7-Locus der Maus durch CRISPR/Cas9-vermitteltes Genom-Engineering.

Phänotypische Merkmale von C57BL/6N...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine finanziellen Interessenkonflikte zu erklären.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch das Medical Research Fund Projekt der Provinz Guangdong (A2022363) und das Großprojekt des Guangdong Committee of Science and Technology, China (Fördernummer 2022) unterstützt.

Wir danken Qingjian Chen von der University of Maryland, College Park für die Hilfe bei der Vorbereitung dieses Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,5& mal; TBEShanghai Sangon
2&mal; Taq Master Mix (Farbstoff Plus)Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd.
AgaroseRegu
Anästhesiegerät für KleintiereReward Life Technology Co., Ltd.R500
BEDTools2.16.1
Cas9 In-vitro-Verdauungsmethode zum Nachweis des gRNA-Zieleffizienz-KitsViewsolid Biotechnology Co., Ltd.VK007
DNA-MarkerThermo Fisher Scientific
DNA-StabilisatorShanghai Seebiotechnology Co., Ltd.DNAstabiles LDverhindert DNA-Abbau
Elektrisches Paraffin-MikrotomShenyang Hengsong Technology Co., Ltd.HS-S7220-B
GATKv3.5
Gentra Puregene BlutkitSanta Clara
Glasobjektträger, DeckglasJiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd.
Hämatoxylin-Färbelösung, Eosin-FärbelösungShanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.C0107-500ml, C0109
HiSeq X-ten PlattformIlluminaführt Sequenzierung auf den erfassten Bibliotheken durch
Injektion von ChoriongonadotropinLivzon Pharmaceutical Group Inc.
Injektion von Gonadotropin im Serum der trächtigen StuteLivzon Pharmaceutical Group Inc.
IsofluranLokale LieferantenInhalationsanästhesie
MikroinjektionsmikroskopNikonECLIPSE Ts2
NanoDropThermo Fisher Scientific2000
Paraffin-EinbettungsmaschineShenyang Hengsong Technology Co., Ltd.HS-B7126-B
Picard(2.2.4) 20
Proteinase KMerck KGaA
samtools1.3
SequencerApplied BiosystemsABI 3500
StereomikroskopNikonSMZ745T
SureSelect Human All Exon V6Agilent Technology Co., Ltd.Exomsonde
T7 ARCA mRNA KitNew England BioLabs, Inc.NEB-E2065S
TemperaturboxBINDER GmbHKBF-S Solid.Line
Trizma Hydrochloride SolutionSigma, Merck KGaANr. T2663
Ultraschallgerät für VeterinärmedizinRoyal PhilipsCX50

Referenzen

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