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Genetics

माउस मॉडल का उपयोग करके पारिवारिक हाइपरट्रॉफिक कार्डियोमायोपैथी में MYH7 उत्परिवर्तन Gly823Glu के रोगजनन की जांच करना

Published: August 8, 2022 doi: 10.3791/63949
Automatic Translation
*1,2, *3, 4, 4, 1,2, 1,2, 1,2, 2,5, 4, 1,2
1Department of Cardiovascular Surgery, Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, 2The Second Clinical College of Guangzhou University of Chinese Medicine, 3Department of Cardiovascular Surgery, The First Affiliated Hospital, Jinan University, 4Guangdong Provincial Key Laboratory of Laboratory Animals, Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute, 5Department of Anesthesiology, Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine
* These authors contributed equally

Summary

हमारे नैदानिक कार्य में पाए जाने वाले पारिवारिक वंशानुगत कार्डियोमायोपैथी परिवार के आधार पर, हमने इस उत्परिवर्तन को सत्यापित करने के लिए सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9-मध्यस्थता जीनोम इंजीनियरिंग के माध्यम से माउस MYH7 लोकस पर एक बिंदु उत्परिवर्तन (G823E) के साथ एक C57BL / 6N माउस मॉडल बनाया।

Abstract

पारिवारिक हाइपरट्रॉफिक कार्डियोमायोपैथी (एचसीएम, ओआईएम: 613690) चीन में सबसे आम कार्डियोमायोपैथी है। हालांकि, एचसीएम के अंतर्निहित आनुवंशिक एटियलजि अभी भी अस्पष्ट है।

हमने पहले एचसीएम के साथ एक बड़े चीनी हान परिवार में मायोसिन हेवी चेन 7 (MYH7) जीन विषम संस्करण, NM_000257.4: c.G2468A (p.G823E) की पहचान की थी। इस परिवार में, वेरिएंट जी 823 ई एक ऑटोसोमल प्रमुख विकार के साथ अलग हो जाता है। यह संस्करण MYH7 प्रोटीन के गर्दन क्षेत्र के लीवर आर्म डोमेन में स्थित है और समरूप मायोसिन और प्रजातियों के बीच अत्यधिक संरक्षित है। जी 823 ई संस्करण की रोगजनकता को सत्यापित करने के लिए, हमने सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9-मध्यस्थता जीनोम इंजीनियरिंग के साथ माउस MYH7 लोकस पर एक बिंदु उत्परिवर्तन (G823E) के साथ एक C57BL / 6N माउस मॉडल का उत्पादन किया। हमने जीआरएनए लक्ष्यीकरण वैक्टर और दाता ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (134 बीपी होमोलॉजी द्वारा लक्षित अनुक्रमों के साथ) डिजाइन किया। दाता ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड में पीजीजी 823 ई (जीजीजी से जीएजी) साइट को होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत द्वारा एमवाईएच 7 के एक्सॉन 23 में पेश किया गया था। होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत के बाद अनुक्रम के जीआरएनए बाइंडिंग और पुन: दरार को रोकने के लिए एक खामोश पी.आर.819 (एजीजी से सीजीए) भी डाला गया था। इकोकार्डियोग्राफी ने 2 महीने की उम्र में एमवाईएच 7 जी 823 ई / - चूहों में सिस्टोल के साथ बाएं वेंट्रिकुलर पश्चवर्ती दीवार (एलवीपीडब्ल्यू) हाइपरट्रॉफी का खुलासा किया। इन परिणामों को हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण (चित्रा 3) द्वारा भी मान्य किया गया था।

इन परिणामों से पता चलता है कि जी 823 ई संस्करण एचसीएम के रोगजनन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। हमारे निष्कर्ष पारिवारिक एचसीएम से जुड़े एमवाईएच 7 वेरिएंट के स्पेक्ट्रम को समृद्ध करते हैं और इस चीनी परिवार में आनुवंशिक परामर्श और प्रसवपूर्व निदान के लिए मार्गदर्शन प्रदान कर सकते हैं।

Introduction

हाइपरट्रॉफिक कार्डियोमायोपैथी (एचसीएम, ओआईएम: 613690) चीन में सबसे आम कार्डियोमायोपैथी है, जिसमें 0.2% की अनुमानित घटनाएं हैं, जो 150,000लोगों को प्रभावित करती हैं।

पैथोलॉजिकल शारीरिक विशेषता जो एचसीएम की विशेषता है, असममित वेंट्रिकुलर हाइपरट्रॉफी है, जिसमें अक्सर वेंट्रिकुलर बहिर्वाह पथ और / या इंटरवेंट्रिकुलर सेप्टम3 शामिल होता है। नैदानिक अभिव्यक्ति परिश्रमात्मक डिस्पेनिया, थकान और सीने में दर्द है। एचसीएम के व्यक्तिगत फेनोटाइप में नैदानिक रूप से कपटी से लेकर गंभीर दिल की विफलता तक परिवर्तनशीलता होती है। एचसीएम वाले रोगियों को चिकित्सा उपचार, हृदय प्रत्यारोपण, जीवन समर्थन उपकरण और बहु-विषयक अनुवर्ती की आवश्यकता होतीहै।

पिछली शताब्दी में, पीसीआर तकनीक ने डीएनए5 का अध्ययन करने के तरीके को बदल दिया है। नैदानिक निदान के लिए एक डीएनए अनुक्रमण विधि सेंगर और सहयोगियों द्वाराखोजी गई थी। सेंगर तकनीक को बाद में मानव जीनोम परियोजना पर लागू किया गया था, लेकिन यह दृष्टिकोण महंगा औरसमय लेने वाला था। संपूर्ण जीनोम अनुक्रमण (डब्ल्यूजीएस) के आगमन ने मानव आनुवंशिक बीमारी में अंतर्दृष्टि को नई ऊंचाइयों पर लाया, लेकिन यह लागत के मामले में निषेधात्मक बना रहा। होल-एक्सोम सीक्वेंसिंग (डब्ल्यूईएस) तकनीक का उपयोग लंबे समय से जर्मलाइन वेरिएंट8 का पता लगाने के लिए किया गया है और विभिन्न कैंसर के एक्सोम में दैहिक ड्राइवर म्यूटेशन की पहचान करने में सफल रहाहै। डब्ल्यूईएस द्वारा डीएनए एक्सॉन या कोडिंग क्षेत्रों का पता लगाने का उपयोग अधिकांश मेंडेलियन रोगों में रोगजनक वेरिएंट को प्रकट करने के लिए किया जा सकता है। आज, अनुक्रमण की घटती लागत के साथ, डब्ल्यूजीएस जीनोमिक्स अनुसंधान में एक महत्वपूर्ण उपकरण बनने की उम्मीद है और जीनोम में रोगजनक वेरिएंट का पता लगाने में व्यापक रूप से उपयोग किया जा सकता है।

डब्ल्यूईएस तकनीक का उपयोग वंशानुगत कार्डियोमायोपैथी में भी किया गया है ताकि एटियलजि को और स्पष्ट करने के लिए रोगजनक वेरिएंट की पहचान की जा सके। उभरते सबूतों ने बताया है कि जीन कोडिंग सरकोमेरे संरचनात्मक प्रोटीन जीन उत्परिवर्तन, जैसे MYH710, MYH611, MYBPC312, MYL213, MYL314, TNNT215, TNNI316, TNNC117, औरTPM1 18 एचसीएम के आनुवंशिक एटियलजि के लिए जिम्मेदार हैं। दुर्लभ रोग पैदा करने वाले जीनों (जैसे, ऑब्स्स्क्यूलिन, साइटोस्केलेटल कैलमोडुलिन और टिटिन-इंटरैक्टिंग रोडएफ (ओबीएससीएन, ओआईएम: 608616)19, एक्टिंग अल्फा 2 (एसीटीएन 2, ओआईएम: 102573)20, और सिस्टीन और ग्लाइसिन समृद्ध प्रोटीन 3 (सीएसआरपी 3, ओआईएम: 600824)21) में रोगजनक वेरिएंट के बारे में जागरूकता भी एचसीएम से जुड़ी हुई है। वर्तमान आनुवंशिक अध्ययनों ने लगभग 40% -60% एचसीएम रोगियों में सरकोमेरिक प्रोटीन जीन में कई अलग-अलग रोगजनक रूपों की पहचान की है, और एचसीएम रोगियों में आनुवंशिक परीक्षण से पता चला है कि अधिकांश रोगजनक वेरिएंट मायोसिन भारी श्रृंखला (MYH7) और मायोसिन-बाइंडिंग प्रोटीन C (MYBPC3) में होते हैं। हालांकि, एचसीएम के लिए आनुवंशिक आधार अभी भी अज्ञात है। मानव एचसीएम रोगियों को रेखांकित करने वाले इन विविधताओं की रोगजनकता की खोज करना एकबड़ी चुनौती बनी हुई है।

इस अध्ययन में, हम डब्ल्यूईएस द्वारा एचसीएम के साथ एक चीनी हान परिवार में एमवाईएच 7 में एक रोगजनक संस्करण की रिपोर्ट करते हैं। इस वेरिएंट की रोगजनकता को सत्यापित करने के लिए, हमने सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 प्रणाली का उपयोग करके चूहों में एक सी 57 बीएल / 6 एन-मायह 7ईएम 1 (जी 823 ई) नॉकिन स्थापित किया। हम इस संस्करण के प्रशंसनीय तंत्र पर भी चर्चा करते हैं।

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Protocol

परिवार के सदस्यों का साक्षात्कार करके परिवारों के इतिहास प्राप्त किए गए थे। अध्ययन को चीनी चिकित्सा के गुआंग्डोंग प्रांतीय अस्पताल (नंबर 2019074) की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। परिवार के सभी सदस्यों से सूचित लिखित सहमति प्राप्त की गई थी। सभी जानवरों का इलाज चीनी चिकित्सा के गुआंग्डोंग प्रांतीय अस्पताल (गुआंगज़ौ, चीन) के नैतिक दिशानिर्देशों के अनुसार किया जाता है।

1. अध्ययन विषय

नोट: प्रोबैंड III-3 ने जुलाई 2019 में चीनी चिकित्सा के गुआंग्डोंग प्रांतीय अस्पताल के कार्डियोवैस्कुलर सर्जरी विभाग में चिकित्सा सलाह मांगी।

  1. प्रोबैंड का विस्तृत पारिवारिक चिकित्सा इतिहास प्राप्त करें। सूचित करें और प्रोबैंड के सभी परिवार के सदस्यों को बुलाएं। परिवार के सभी सदस्यों की सावधानीपूर्वक शारीरिक जांच की गई है।
    1. मेडिकल रिकॉर्ड, ईसीजी, इकोकार्डियोग्राम और कार्डियक कैथीटेराइजेशन रिपोर्ट सहित सभी नैदानिक डेटा की व्यवस्थित समीक्षा करें।
    2. हस्तक्षेप या सर्जरी के दौरान सभी रोगियों में कार्डियक फेनोटाइप की पुन: पुष्टि करें।
  2. स्थानीय डेटाबेस से कुल 174 जनसंख्या-आधारित स्वस्थ नियंत्रणों का चयन करें। प्रत्येक रोगी से परिधीय शिरापरक रक्त के लगभग 4.0 एमएल एकत्र करें।

2. डीएनए निष्कर्षण

नोट: डीएनए निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वाणिज्यिक रक्त किट के साथ निकाला जाता है।

  1. निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए डीएनए स्टेबलाइजर की उपस्थिति में एक आयनिक डिटर्जेंट के साथ लाइस रक्त कोशिकाएं।
  2. सेल लाइसेट में 10 μL RNase A घोल जोड़ें और ट्यूब को 25 बार मोड़कर मिलाएं। 15 मिनट से 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. नमक वर्षा द्वारा प्रोटीन को हटा दें। प्रोटीन अवक्षेपित करने के लिए प्रोटीन वर्षा समाधान (25 एमएल आसुत जल में घुलने वाले गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन के 0.25 मिलीग्राम) और 100% आइसोप्रोपेनोल का उपयोग करें। फिर, 70% इथेनॉल के 200 μL का उपयोग करें और डीएनए गोली को धोने के लिए 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 12,000 x g / min पर सेंट्रीफ्यूजेशन करें।
  4. 70% इथेनॉल के 500 μL के साथ वर्षा द्वारा जीनोमिक डीएनए को पुनर्प्राप्त करें। 30 सेकंड के लिए 12,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज। एस्पिरेटेड और फिर हाइड्रेशन समाधान में गोली को भंग करें (1 एमएम ईडीटीए, 10 एमएम ट्रिस · सीएल, पीएच 7.5)।
  5. शुद्धता निर्धारित करने के लिए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (जैसे, नैनोड्रॉप 2000) का उपयोग करें। शुद्ध डीएनए में आमतौर पर 1.7 और 1.9 के बीच ए 260 / ए 280 अनुपात होता है और आकार में 200 केबी तक होता है।
  6. डीएनए को 2-8, -20, या -80 डिग्री सेल्सियस पर लंबी अवधि के लिए स्टोर करें।

3. संपूर्ण एक्सोम अनुक्रमण और संस्करण विश्लेषण

नोट: रोग पैदा करने वाले जीन उत्परिवर्तनों की व्यवस्थित खोज के लिए, प्रभावित व्यक्तियों (II-5, II-7, III-3, III-7, III-8, III-9, और IV-3) और अप्रभावित व्यक्तियों (III-2, III-5, IV-4) में एक्सोम अनुक्रमण किया गया था।

  1. एक्सोम कैप्चर करने के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक्सोम जांच का उपयोग करें।
  2. HiSeq X-ten प्लेटफ़ॉर्म पर 2 × 150 bp युग्मित-अंत अनुक्रमण के लिए योग्य पुस्तकालयों को लागू करें। कृपया पूरक फ़ाइल 1 देखें।
  3. फास्टक्यू फ़ाइलों को बीडब्ल्यूए v0.7.1318,19 के साथ मानव संदर्भ जीनोम (hg19 / GRCh37) में संरेखित करें। संरेखित फ़ाइलों (sam/bam स्वरूप फ़ाइलें) को samtools के साथ सॉर्ट करें, और फिर Picard का उपयोग करके डुप्लिकेट को ध्वजांकित करें. कृपया पूरक फ़ाइल 1 देखें।
  4. जीएटीके का उपयोग करें, स्थानीय रूप से रीड को फिर से संरेखित करें और आधार गुणों को फिर से कैलिब्रेट करें। कृपया पूरक फ़ाइल 1 देखें।
  5. मैपिंग आंकड़े उत्पन्न करें जिसमें BEDTools और इन-हाउस पर्ल / पायथन स्क्रिप्ट द्वारा रीकैलिब्रेट की गई फ़ाइलों से कवरेज और गहराई शामिल है।
  6. जीएटीके से हैप्लोटाइपकॉलर टूल के बहु-नमूना प्रसंस्करण मोड का उपयोग करके रीकैलिब्रेट बीएएम फाइलों से जीनोटाइप वेरिएंट (एसएनवी और इंडेल)।
  7. वेरिएंट कॉलिंग के झूठे सकारात्मक पहलुओं को कम करने के लिए वीक्यूएसआर (वेरिएंट क्वालिटी स्कोर रीकैलिब्रेशन) का उपयोग करें।
  8. एक्सोम एग्रीगेशन कंसोर्टियम (एक्सएसी) (http://exac.broadinstitute.org), एक्सोम सीक्वेंसिंग प्रोजेक्ट (ईएसपी) (https://esp.gs.washington.edu), और 1,000 जी (http://www.1000genomes.org) सहित कई डेटाबेस के खिलाफ एएनओवार सॉफ्टवेयर 21 का उपयोग करके एसएनवी और इंडेल को एनोटेट करें। एसीएमजी दिशानिर्देशों के अनुसार अनुक्रम वेरिएंट की रोगजनकता की व्याख्या करें।

4. सेंगर अनुक्रमण

  1. एबीआई 3500 सीक्वेंसर23 का उपयोग करके संभावित प्रेरक वेरिएंट की पुष्टि करने और परिवार में वेरिएंट अलगाव निर्धारित करने के लिए सेंगर अनुक्रमण करें।
  2. MYH7 जीन (NM_000257) में वेरिएंट के लिए प्राइमर अनुक्रम ों को निम्नानुसार डिज़ाइन करें: 5'-TTCAAACAGAGACCTGCAGG-3' और 5'- CGGACTTCTAGCGCCTT -3'।
  3. एक संस्करण की पुष्टि करें, परिवार के भीतर वेरिएंट अलगाव निर्धारित करने के लिए परिवार के सभी उपलब्ध सदस्यों को स्क्रीनकरें।

5. चूहों में C57BL/6N-MYH7em1 (G823E) दस्तक की पीढ़ी

  1. CRISPR/Cas9 प्रणाली का उपयोग C57BL/6N-Myh7em1 (G823E) नॉकिन चूहों को उत्पन्न करने के लिए करें। माउस Myh7 जीन (GenBank परिग्रहण संख्या: NM_001361607.1; Ensembl: ENSMUSG00000053093) माउस क्रोमोसोम 14 पर स्थित है और इसमें 41 एक्सॉन हैं। एटीजी एक्सॉन 4 में कोडन शुरू करता है और टीएजी एक्सॉन 41 में कोडन को रोकता है, और जी 823 ई एक्सॉन 23 पर स्थित है। लक्ष्य साइट के रूप में एक्सॉन 23 का चयन करें।
  2. जीआरएनए लक्ष्यीकरण वेक्टर और दाता ऑलिगो के अनुक्रम को डिजाइन करें (लक्ष्यीकरण अनुक्रम के साथ, दोनों तरफ संयुक्त 134 बीपी समरूप अनुक्रमों से घिरा हुआ)।
    1. एनसीबीआई वेबसाइट पर लॉग इन करें और दाईं ओर ब्लास्ट ऑनलाइन प्राइमर डिज़ाइन फ़ंक्शन पर क्लिक करें।
    2. प्राइमर डिजाइन करने के लिए पृष्ठ के निचले भाग में प्राइमर-ब्लास्ट फ़ंक्शन पर क्लिक करें।
    3. पीसीआर टेम्पलेट बॉक्स में MYH7 NCBI संदर्भ अनुक्रम संख्या NM_000257.4 पेस्ट करें।
    4. लक्ष्य टुकड़े (MYH7 cDNA एक्सॉन 23 और उसके आसन्न एक्सॉन) को बढ़ाएं ताकि एक्सॉन 21 (2392-2528) पर अपस्ट्रीम प्राइमर और एक्सॉन 25 (3205-3350) पर डाउनस्ट्रीम प्राइमर डिजाइन करें। सही रेंज बॉक्स में अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम प्राइमरों की एक्सॉन संख्या दर्ज करें।
    5. प्राइमरों के कई जोड़े स्वचालित रूप से उत्पन्न करने के लिए नीचे प्राइमर प्राप्त करें बटन पर क्लिक करें।
  3. जेडएफआईएन डेटाबेस में MYH7 जीन को इनपुट करें, दाता ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड में p.g823e (GGG से GAG) उत्परिवर्तन साइट और एक्सॉन 23 में मूक उत्परिवर्तन p.r819 (AGG से CGA) पेश करें। मूक उत्परिवर्तन होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत के बाद जीआरएनए द्वारा अनुक्रम के बंधन और पुन: काटने को रोकता है।
    1. सामान्य अनुक्रम के अनुसार जीआरएनए डिजाइन करें, दोनों सिरों पर अनुक्रम TAATACGACTATA- और -GTTTTAGAGCTA हैं। अनुक्रम का मध्य ऊपर उल्लिखित लक्ष्य साइट है।
  4. केआई माउस उत्पादन के लिए निषेचित अंडों में कैस 9 एमआरएनए, इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन और डोनर ऑलिगो द्वारा उत्पन्न जीआरएनए को सह-इंजेक्ट करें।
    1. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार डिज़ाइन किए गए जीआरएनए लक्ष्य को जीआरएनए में स्थानांतरित करने और प्रतिलेख की गतिविधि का पता लगाने के लिए कैस 9 / जीआरएनए लक्ष्य दक्षता पहचान किट का उपयोग करें (विशिष्ट पहचान विधियों के लिए वीके 007 किट निर्देश देखें)।
    2. ट्यूबों के तल तक समाधान एकत्र करने के लिए एक माइक्रोफ्यूज में टी 7 एआरसीए एमआरएनए किट घटकों, मिश्रण और पल्स-स्पिन को पिघलाएं। कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया को निम्नलिखित क्रम में इकट्ठा करें: 2x ARCA / NTP मिश्रण को 10 μL, 1 μg टेम्पलेट डीएनए, 2 μL T7 RNA पोलीमरेज़ मिश्रण, और न्यूक्लियस-मुक्त पानी को 20 μL तक।
    3. अच्छी तरह मिलाएं और एक माइक्रोफ्यूज में पल्स-स्पिन करें। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    4. डीएनए को DNase I के 2 μL जोड़कर हटा दें, अच्छी तरह मिलाएं, और एमआरएनए प्राप्त करने के लिए 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    5. सीरम गोनाडोट्रोपिन और मानव कोरियोनिक गोनाडोट्रोपिन का इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन लगभग 4 सप्ताह की उम्र में लगभग 5 यू प्रति माउस की खुराक पर 0.5 एमएल सिरिंज के साथ 48 घंटे के दो इंजेक्शन के बीच अंतराल के साथ पूर्व-तैयार सी 57बीएल /6 मादा चूहों में करें।
    6. खुराक के अठारह घंटे बाद, हार्मोन इंजेक्शन के बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा सी 57बीएल / 6 मादा चूहों और एक 8-12 सप्ताह के सी 57 बीएल / 6 पुरुष माउस का बलिदान करें। अंडे और शुक्राणु को अलग-अलग इकट्ठा करें।
    7. शुक्राणु कैपेसाइटेशन द्रव में कैपेसिटेटेड होता है। 3-4 घंटे के लिए इन विट्रो निषेचन के लिए अल्पकालिक अंडे की कोशिकाओं में तरल पदार्थ के किनारे पर शुक्राणु लें और छोड़ दें।
    8. सफलतापूर्वक स्थानांतरित जीआरएनए और कैस 9 एमआरएनए को RNase-मुक्त पानी के साथ 25 ng/μL और 50 ng/μL में पतला करें। माइक्रोइंजेक्शन द्वारा माउस निषेचित अंडों के साइटोप्लाज्म में पेश करें। मादा चूहों के बढ़े हुए डिंबवाहिनी में अच्छी स्थिति में निषेचित अंडे प्रत्यारोपण। लिगेटेड नर चूहों के साथ सह-पिंजरा।
  5. पीसीआर द्वारा पिल्ले का जीनोटाइप। निम्नलिखित पीसीआर स्थितियों का उपयोग करें: 3 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 35 चक्र, 35 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस और 35 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस। अनुक्रम विश्लेषण के साथ पालन करें।
    1. कैंची से 4 महीने के चूहों की पूंछ काटें और उन्हें 1.5 एमएल ईपी ट्यूब में रखें। एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में प्रति पूंछ टुकड़ा (2-5 मिमी) में 180 μL बफर GL, 20 μL प्रोटीनेज K, और 10 μL RNase A जोड़ें। सावधान रहें कि बहुत अधिक पूंछ न काटें।
    2. ट्यूब को रात भर 56 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    3. अशुद्धियों को दूर करने के लिए 2 मिनट के लिए 1,000 x g पर एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्पिन करें।
    4. पर्याप्त मिश्रण के साथ बफर जीबी के 200 μL और पूर्ण एथिल अल्कोहल के 200 μL जोड़ें।
    5. स्पिन कॉलम को एक संग्रह ट्यूब में रखें। नमूना को 2 मिनट के लिए 1,000 x g पर स्पिन और सेंट्रीफ्यूज पर लागू करें। प्रवाह के माध्यम से त्याग दें।
    6. स्पिन कॉलम में 500 μL बफर WA जोड़ें और 1 मिनट के लिए 1,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। प्रवाह के माध्यम से त्याग दें।
    7. स्पिन कॉलम में 700 μL बफर WB जोड़ें और 1 मिनट के लिए 1,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। प्रवाह के माध्यम से त्याग दें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि बफर डब्ल्यूबी को 100% इथेनॉल के साथ प्रीमिक्स किया गया है। बफर डब्ल्यूबी जोड़ते समय, अवशिष्ट नमक को धोने के लिए ट्यूब की दीवार में जोड़ें।
    8. चरण 5.5.7 दोहराएँ।
    9. स्पिन कॉलम को एक संग्रह ट्यूब में रखें और सेंट्रीफ्यूज को 2 मिनट के लिए 1,000 x g पर रखें।
    10. स्पिन कॉलम को एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में रखें। स्तंभ झिल्ली के केंद्र में 50-200 μL बाँझ पानी या क्षालन बफर जोड़ें और स्तंभ को 5 मिनट के लिए खड़े रहने दें।
      नोट: 65 डिग्री सेल्सियस तक निष्फल पानी या क्षालन बफर को गर्म करने से क्षालन की उपज बढ़ सकती है।
    11. डीएनए को अलग करने के लिए, कॉलम को 2 मिनट के लिए 1,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। डीएनए की उपज बढ़ाने के लिए, स्पिन कॉलम झिल्ली के केंद्र में स्टरलाइज़्ड पानी या क्षालन बफर के प्रवाह-थ्रू और / या 50-200 μL जोड़ें और कॉलम को 5 मिनट तक खड़े रहने दें। 2 मिनट के लिए 1,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
    12. वैद्युतकणसंचलन द्वारा व्युत्पन्न जीनोमिक डीएनए की मात्रा निर्धारित करें।

6. हृदय आकृति विज्ञान और कार्य का मूल्यांकन

नोट: सी 57बीएल / 6 एन-मायह 7ईएम 1 (जी 823 ई) नॉकिन चूहों के हृदय आकृति विज्ञान और कार्य का आकलन करने के लिए एम-मोड इकोकार्डियोग्राफी लागू करें।

  1. नॉकिन चूहों को संज्ञाहरण मशीन से जुड़े एक बंद ऐक्रेलिक बॉक्स में डालें और ऐक्रेलिक बॉक्स में आइसोफ्लुरेन (एकाग्रता: 3%) को प्रवाहित करने की अनुमति देने के लिए तीन-तरफ़ा इंटरफ़ेस को समायोजित करें। नॉकिन चूहों के स्वायत्त रूप से स्थानांतरित होना बंद करने के बाद, नॉकिन चूहों को हटा दें।
  2. नॉकिन चूहों को छोटे पशु संज्ञाहरण मशीन के जीवन निगरानी मंच पर सपाट रखें, और ऑक्सीजन (प्रवाह: 0.8 एल / मिनट) और आइसोफ्लुरेन (एकाग्रता: 3%) के साथ मिश्रित निरंतर साँस लेने वाले संज्ञाहरण। कॉर्निया को सूखने से रोकने के लिए एनेस्थेटाइज्ड चूहों पर आंख स्नेहक लागू करें।
  3. प्लेटफॉर्म पर क्षैतिज रूप से नॉकिन चूहों को ठीक करें। प्लेटफॉर्म को नॉकिन माउस पर 30 ° पुच्छल झुकाएं। डिपिलेटरी क्रीम का उपयोग करके दस्तक देने वाले माउस की पूर्ववर्ती छाती की दीवार पर बालों को हटा दें।
  4. जांच को जानवर के सिर के सामने टक्कर के साथ लंबवत रखें। फिर, जांच को लगभग 45 ° प्रतिघड़ी घुमाएं।
  5. पैरास्टर्नल लॉन्ग-एक्सिस व्यू में, पैरास्टर्नल शॉर्ट-एक्सिस व्यू का निरीक्षण करने के लिए प्रोब को 90 डिग्री क्लॉकवाइज घुमाएं। प्रोब को 90° घुमाने के बाद, सही स्लाइस प्राप्त करने के लिए वाई-अक्ष विस्थापन को समायोजित करें।
  6. हृदय की लंबी अक्ष छवि का निरीक्षण करें (चित्रा 1 सी), और फिर एम-मोड माप डेटा का चयन करें।
  7. चूहों के पैरास्टर्नल लॉन्ग-एक्सिस दृश्यों से अल्ट्रासाउंड डेटा प्राप्त करें (चित्रा 1)। हृदय गति (एचआर), बाएं वेंट्रिकुलर इजेक्शन अंश (एलवीईएफ), कार्डियक आउटपुट (सीओ), बाएं वेंट्रिकुलर एंड-डायस्टोलिक आयाम (एलवीडीडी), एलवीडी बाएं वेंट्रिकुलर एंड-सिस्टोलिक आयाम (एलवीएसडी), इंटरवेंट्रिकुलर सेप्टम (आईवीएस), और बाएं वेंट्रिकुलर पश्चवर्ती दीवार (एलवीपीडब्ल्यू) को मापा जाता है।
  8. माप के बाद, चूहों को ऑक्सीजन प्रदान करें, और स्वायत्त गतिविधि हासिल करने पर उन्हें अपने संबंधित पिंजरों में वापस रखें।

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Representative Results

परिवारों की नैदानिक प्रोफ़ाइल
एचसीएम की पारिवारिक वंशावली प्राप्त की गई थी और चित्र 2 में दिखाया गया है। सभी प्रलेखित परिवार के सदस्यों को नामांकन पर एचसीएम का निदान किया गया था।

परिवार में (चित्रा 2 ए), प्रोबैंड रोगी III-7 था, जिसे 46 वर्ष की आयु में एचसीएम और बाएं वेंट्रिकुलर बहिर्वाह पथ रुकावट (एलवीओटीओ) का निदान किया गया था और कार्डियक सर्जरी की गई थी। रोगी III-3 में मामूली एचसीएम था जिसे शल्य चिकित्सा उपचार की आवश्यकता नहीं थी। रोगी IV-3 में मामूली HCM भी था, जो उसके पिता, रोगी III-3 के समान था। रोगी II-5 को एचसीएम था और एलवीओटीओ के कारण 51 वर्ष की आयु में दोष की मरम्मत के लिए सर्जरी की गई थी। रोगी I-1 और रोगी II-2 की क्रमशः 57 और 46 वर्ष की आयु में हृदय दुर्घटनाओं के कारण मृत्यु हो गई। रोगी I-1 का चिकित्सा इतिहास अनुपलब्ध था। रोगी II-7 और रोगी III-9 को सांस की तकलीफ के साथ प्रस्तुत किया गया और एचसीएम का निदान किया गया।

एक्सोम अनुक्रम विश्लेषण और वेरिएंट का पृथक्करण
इस परिवार में, पांच व्यक्तियों के एक्सोम अनुक्रमण ने 125 बीपी की औसत पढ़ने की लंबाई के साथ अनुक्रमित रीडिंग के कुल 19,978,731 जोड़े का औसत उत्पन्न किया। कुल मिलाकर, 98.72% अनुक्रमित रीडिंग ने गुणवत्ता मूल्यांकन पारित किया और मानव संदर्भ जीनोम के 98.66% पर मैप किया गया। फ़िल्टरिंग के बाद भी, इन चार रोगियों द्वारा 42 से अधिक वेरिएंट (एकल न्यूक्लियोटाइड प्रतिस्थापन और इंडेल सहित) साझा किए गए थे। इनमें से 27 गलत समझ वाले एसएनवी थे, 15 को स्प्लिसिंग को बदलने की भविष्यवाणी की गई थी। अंत में, एसीएमजी रेटिंग दिशानिर्देशों के अनुसार, एक विषम c.G2468A; एमवाईएच 7 (NM_0002571) का पी.जी823ई संस्करण प्रोबैंड III-7 के साथ-साथ अन्य तीन रोगियों में भी देखा गया था।

एक रोगजनक उत्परिवर्तन की पहचान
सेंगर अनुक्रमण ने सभी रोगियों में एक ही MYH7 p.G823E संस्करण की पुष्टि की, लेकिन परिवारों और 174 नियंत्रणों में स्वस्थ व्यक्तियों में नहीं (चित्रा 2 बी)। विषमयुग्मित MYH7 p.G823E इस परिवार में पूरी तरह से सह-पृथक है। इस परिवार में, रोगी IV-3 जिन्होंने इस संस्करण को आश्रय दिया था, उन्हें यह रोगी III-3 से विरासत में मिला। मरीजों III-7 और III-8 में वही संस्करण था, जो उनके पिता से विरासत में मिला था। रोगी III-9 के लिए जानकारी अनुपलब्ध थी।

यह संस्करण, जिसे पहले एक छिटपुट रोगी24 द्वारा एचसीएम में वर्णित किया गया था, 1000 जी, ईएसपी 6500, एक्सएसी, एचजीएमडी, क्लिनवार डेटाबेस या नियंत्रण विषयों में रिपोर्ट नहीं किया गया है। MYH7 के गर्दन डोमेन क्षेत्र में कोडन 823 पर ग्लाइसिन अवशेष सभी उपलब्ध कशेरुक मायोसिन अनुक्रमों (चित्रा 2 सी) में अत्यधिक संरक्षित है। MYH7 एक ज्ञात HCM-प्रेरक जीन है और हृदय के विकास या संरचना / कार्य में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। एसीएमजी मानकों और दिशानिर्देशों के आधार पर, MYH7 p.G823E संस्करण को एक रोगजनक संस्करण (PVS1 + PS3 + PS4 + PM2) होने की भविष्यवाणी की गई थी। एक साथ लिया गया, ये परिणाम समर्थन करते हैं कि यह संस्करण हानिकारक है और इन परिवारों में एचसीएम के रोगजनन में योगदान देता है।

C57BL/6N-Myh7em1 (G823E) नॉकिन चूहों ने गंभीर कार्डियक हाइपरट्रॉफी विकसित की
MYH7 p.G823E के रोगजनन को और सत्यापित करने के लिए, हम चूहों में C57BL/6N-Myh7em1 (G823E) नॉकिन उत्पन्न करते हैं। C57BL/6N-MYH7em1 (G823E) नॉकिन चूहों ने जन्म के बाद उम्र पर निर्भर कार्डियक हाइपरट्रॉफी विकसित की (चित्रा 2 ए, बी)। इकोकार्डियोग्राफी से पता चला कि आईवीएस और एलवीपीडब्ल्यू ने सी 57बीएल / 6 एन-मायह 7ईएम 1 (जी 823 ई) नॉकिन चूहों में बढ़े हुए एचआर के साथ विकास किया (तालिका 1)। इन परिणामों को हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण (चित्रा 3) द्वारा भी मान्य किया गया था। जंगली प्रकार और विषम चूहों के बीच एलवीडीडी, एलवीडी, ईएफ, या सीओ में कोई स्पष्ट अंतर नहीं थे (तालिका 1)।

Figure 1
चित्र 1: अल्ट्रासाउंड डेटा अधिग्रहण। (A) जांच उरोस्थि की लंबी धुरी पर स्थित है। (बी) जांच उरोस्थि की छोटी धुरी पर स्थित है। (सी) उरोस्थि के लंबे अक्ष दृश्य की एम-मोड अल्ट्रासाउंड छवि। पीला तीर इंटरवेंट्रिकुलर सेप्टम के स्थान को इंगित करता है। लाल तीर फ्लोटिंग वाल्व को इंगित करता है। (डी) उरोस्थि के लघु-अक्ष दृश्य की एम-मोड अल्ट्रासाउंड छवि। पीला तीर पूर्ववर्ती पैपिलरी मांसपेशी के स्थान को इंगित करता है, और नीचे का उभार पीछे की पैपिलरी मांसपेशी है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: विषमयुग्मी MYH7 G823E संस्करण को ले जाने वाला बड़ा परिवार। (A) प्रोबैंड को एक तीर द्वारा चिह्नित किया गया है। पूर्ण और खुले घेरे और वर्ग क्रमशः प्रभावित और सामान्य व्यक्तियों को इंगित करते हैं। (ख) एमवायएच7 में जी823ई वैरिएंट की पुष्टि सेंगर अनुक्रमण द्वारा की गई है। (ग) विभिन्न प्रजातियों में MYH7 G823E साइट का संरक्षण। पीला तीर विभिन्न प्रजातियों के अमीनो एसिड अनुक्रम में जी 823 ई की साइट का प्रतिनिधित्व करता है, जो अत्यधिक संरक्षित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: मायोकार्डियल ऊतक के पैथोलॉजिकल परिवर्तन। (A) मायोकार्डियल फाइबर को व्यवस्थित तरीके से व्यवस्थित किया जाता है, और प्रत्येक भाग के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं होता है। (B) वेंट्रिकुलर मांसपेशी फाइबर हाइपरट्रॉफी, अव्यवस्थित व्यवस्था, और घाव मुख्य रूप से बाएं वेंट्रिकल और इंटरवेंट्रिकुलर सेप्टम की पीछे की दीवार में केंद्रित होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

C57BL/6N-Myh7em1 (G823E) चूहों के समूह में दस्तक नियंत्रण समूह
(n = 4) (n = 6)
HR (/min) 451.25 ± 25.786 413.83 ± 12.77 P = 0.015
LVDD (mm) 4.12 ± 0.33 3.95 ± 0.20 P = 0.330
एलवीडी (मिमी) 2.95 ± 0.44 2.85 ± 0.20 P = 0.626
EF(%) 55.02 ± 9.52 54.31 ± 5.11 P = 0.881
सीओ (एमएल) 18.46 ± 3.05 15.30 ± 2.39 P = 0.102
आईवीएस (मिमी) 1.13 ± 0.20 0.67 ± 0.07 P = 0.001
LVPW (mm) 1.40 ± 0.60 0.70 ± 0.06 P = 0.000

तालिका 1: p.G823E और जंगली प्रकार के लिए आकृति विज्ञान और कार्य विश्लेषण। एसपीएसएस का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया था। निरंतर चर को औसत ± मानक विचलन (एसडी) के रूप में व्यक्त किया जाता है। निरंतर चर के लिए छात्र के टी या विलकॉक्सन रैंक योग परीक्षण। 0.05 से नीचे पी-मान सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था।

पूरक फ़ाइल 1. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस अध्ययन में, हम एचसीएम के साथ एक चीनी हान परिवारों का वर्णन करते हैं। जेनेटिक्स विश्लेषण से पता चला है कि एक विषम एमवाईएच 6 उत्परिवर्तन पी.जी.823 ई ऑटोसोमल प्रमुख वंशानुक्रम वाले परिवार के सदस्यों में बीमारी के साथ सह-पृथक होता है। जी 823 ई उत्परिवर्तन की रोगजनकता को मान्य करने और अंतर्निहित तंत्र पर चर्चा करने के लिए, हमने CRISPR / Cas9-मध्यस्थता जीनोम इंजीनियरिंग द्वारा माउस Myh7 लोकस पर G823E के साथ एक C57BL / 6N माउस मॉडल बनाया।

सी 57बीएल / 6 एन-मायह 7ईएम 1 (जी 823 ई) नॉकिन चूहों की फेनोटाइपिक विशेषताओं का मूल्यांकन इकोकार्डियोग्राफी द्वारा किया गया था। नियंत्रण की तुलना में सी57बीएल/6एन-माय7ईएम1 (जी823ई) नॉकिन चूहों में मल्टीपल ट्रेबेकुलेशन और गैर-कॉम्पैक्ट से कॉम्पैक्ट मायोकार्डियल परत का उच्च अनुपात पाया गया। ट्रांसजेनिक चूहों ने एलवीपीडब्ल्यू और आईवीएस हाइपरट्रॉफी और एचआर में वृद्धि भी दिखाई। हालांकि, दिल के कार्य ने दो समूहों के बीच कोई महत्वपूर्ण बदलाव नहीं दिखाया। इन परिणामों ने सुझाव दिया कि एक बढ़ा हुआ एचआर कार्डियक रीमॉडेलिंग के दौरान रखरखाव वेंट्रिकल फ़ंक्शन पर प्रतिपूरक प्रभाव प्रदर्शित कर सकता है। हृदय की आकृति विज्ञान और कार्य का निरीक्षण और विश्लेषण करने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है।

मायोसिन -7 (MYH7) मायोकार्डियल सरकोमेरिक संरचनात्मक प्रोटीन के परिवार से संबंधित है। MYH7 जीन द्वारा एन्कोड किया गया MYH7 (14q11.2; ओआईएम: 160760), जो 1990 में एचसीएम से जुड़े पहले रोगजनक जीन में पाया जाता है। आज तक, MYH7 जीन में 300 से अधिक वेरिएंट एचसीएम25,26 से जुड़े हुए हैं। हालांकि, अधिकांश भिन्नताओं की रोगजनकता भ्रामक बनी हुई है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने मॉडल चूहों को सफलतापूर्वक बनाया। मॉडल माउस की योजना बनाते और डिजाइन करते समय, विचाराधीन तीन मुख्य मुद्दे हैं। सबसे पहले, माउस MYH7 प्रोटीन का एमिनो एसिड अनुक्रम मानव के साथ अत्यधिक समरूप है। दूसरा, MYH7 वेंट्रिकल्स में अत्यधिक व्यक्त किया जाता है, साथ ही मनुष्यों में MYH7 भी। MYH7 में कोडन 823 पर ग्लाइसिन अवशेष सभी उपलब्ध मायोसिन अनुक्रमों में अत्यधिक संरक्षित है।

MYH7 में एन-टर्मिनस पर एक संरक्षित हेड मोटर डोमेन होता है, जो एक्टिन को बांधता है और इसमें एक्टिन-सक्रिय Mg होता है। एटीपीस गतिविधि और एक गर्दन क्षेत्र, साथ ही एक मायोसिन पूंछ, जिसमें सी-टर्मिनस पर एक कुंडलित-कॉइल (सीसी) क्षेत्र होता है। MYH7 के गर्दन डोमेन क्षेत्र में कोडन 823 पर ग्लाइसिन अवशेष बताते हैं कि यह भिन्नता संकुचन27,28,29,30 में लीवर आर्म रोटेशन पर प्रभाव डाल सकती है।

डब्ल्यूईएस मुख्य रूप से जीन के एक्सॉन पर केंद्रित है, जो कुल जीनोम डीएनए के केवल 1.5% 8 के लिए जिम्मेदार है। हालांकि, पहचाने गए अधिकांश मानव आनुवंशिक रोग एक्सॉन31 से संबंधित हैं। यह डब्ल्यूईएस को व्यापक रूप से मान्यता प्राप्त और नैदानिक अभ्यास में लागू करता है। डब्ल्यूईएस के व्यापक अनुप्रयोग के साथ कुछ नैतिक मुद्दे हैं। इस तरह की मानव आनुवंशिक बीमारी के अध्ययन में अक्सर सीमा पार चर्चा शामिल होती है। यद्यपि शोधकर्ता जितना संभव हो उतना व्यक्तिगत रूप से पहचान योग्य जानकारी को हटाने की कोशिश करते हैं, डीएनए में निहित विशाल जानकारी अभी भी शोध व्यक्तियों और यहां तक कि उनके परिवारों को फिर से पहचान सकती है। केवल मानकीकृत सूचना विनिमय उपाय डब्ल्यूईएस के तर्कसंगत अनुप्रयोग को सुनिश्चित कर सकते हैं। भविष्य में, डब्ल्यूईएस विशिष्ट जीन उत्परिवर्तन और कई बीमारियों के लिए व्यक्तिगत निदान और उपचार उपायों के लिए चिकित्सा रणनीतियों के लिए बहुत महत्वपूर्ण है।

संक्षेप में, हमने डब्ल्यूईएस का उपयोग करके एचसीएम के साथ एक बड़े चीनी हान परिवार में एक MYH7 विषम संस्करण, p.G823E की पहचान की। C57BL/6N-Myh7em1 (G823E) नॉकिन चूहों में मोटे आईवीएस और एलवीपीडब्ल्यू पाए गए, और जंगली प्रकार के चूहों की तुलना में तेज एचआर था। पीजी 823 ई संस्करण लीवर आर्म रोटेशन को खराब कर सकता है, यह सुझाव देता है कि यह उत्परिवर्तन पारिवारिक एचसीएम में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। हमारा काम एचसीएम से जुड़े एमवाईएच 7 जीन के उत्परिवर्तन स्पेक्ट्रम पर जानकारी को विस्तृत करता है और प्रभावित परिवारों के उचित निदान और आनुवंशिक परामर्श में बेहतर स्पष्टता प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई वित्तीय टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को गुआंग्डोंग प्रांत (ए 2022363) की चिकित्सा अनुसंधान निधि परियोजना और गुआंग्डोंग कमेटी ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी, चीन (अनुदान संख्या 2022) की प्रमुख परियोजना द्वारा समर्थित किया गया था।

हम इस पांडुलिपि की तैयारी के दौरान मदद के लिए मैरीलैंड विश्वविद्यालय, कॉलेज पार्क के किंगजियान चेन को धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5×TBE Shanghai Sangon
2× Taq Master Mix (Dye Plus) Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd.
Agarose Regu
Anesthesia machine for small animals Reward Life Technology Co., Ltd. R500
BEDTools 2.16.1
Cas9 in vitro digestion method to detect gRNA target efficiency kit Viewsolid Biotechnology Co., Ltd. VK007
DNA Marker Thermo Fisher Scientific
DNA stabilizer Shanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd. DNAstable LD prevent DNA degradation
Electric paraffin microtome Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. HS-S7220-B
GATK v3.5
Gentra Puregene blood kit Santa Clara
Glass slide, coverslip Jiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd.
Hematoxylin staining solution, Eosin staining solution Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. C0107-500ml, C0109
HiSeq X-ten platform Illumina perform sequencing on the captured libraries
Injection of chorionic gonadotropin Livzon Pharmaceutical Group Inc.
Injection of pregnant mare serum gonadotropin Livzon Pharmaceutical Group Inc.
Isoflurane Local suppliers inhalation anesthesia
Microinjection microscope Nikon ECLIPSE Ts2
NanoDrop Thermo Fisher Scientific 2000
Paraffin Embedding Machine Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. HS-B7126-B
Picard (2.2.4) 20
Proteinase K Merck KGaA
samtools 1.3
Sequencer Applied Biosystems ABI 3500
Stereomicroscope Nikon SMZ745T
SureSelect Human All Exon V6 Agilent Technology Co., Ltd. exome probe
T7 ARCA mRNA Kit New England BioLabs, Inc. NEB-E2065S
Temperature box BINDER GmbH KBF-S Solid.Line
Trizma Hydrochloride Solution Sigma, Merck KGaA No. T2663
Veterinary ultrasound system Royal Philips CX50

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References

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आनुवंशिकी अंक 186
माउस मॉडल का उपयोग करके पारिवारिक हाइपरट्रॉफिक कार्डियोमायोपैथी में MYH7 उत्परिवर्तन Gly823Glu के रोगजनन की जांच करना
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