Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Undersøgelse af patogenesen af MYH7-mutationen Gly823Glu i familiær hypertrofisk kardiomyopati ved hjælp af en musemodel

Published: August 8, 2022 doi: 10.3791/63949
Automatic Translation
*1,2, *3, 4, 4, 1,2, 1,2, 1,2, 2,5, 4, 1,2
1Department of Cardiovascular Surgery, Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, 2The Second Clinical College of Guangzhou University of Chinese Medicine, 3Department of Cardiovascular Surgery, The First Affiliated Hospital, Jinan University, 4Guangdong Provincial Key Laboratory of Laboratory Animals, Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute, 5Department of Anesthesiology, Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Baseret på den familiære arvelige kardiomyopatifamilie, der findes i vores kliniske arbejde, skabte vi en C57BL/6N-musemodel med en punktmutation (G823E) ved musen MYH7-locus gennem CRISPR/Cas9-medieret genomteknik for at verificere denne mutation.

Abstract

Familiær hypertrofisk kardiomyopati (HCM, OMIM: 613690) er den mest almindelige kardiomyopati i Kina. Den underliggende genetiske ætiologi af HCM forbliver imidlertid undvigende.

Vi har tidligere identificeret en myosin tung kæde 7 (MYH7) gen heterozygot variant, NM_000257.4: c.G2468A (p.G823E), i en stor kinesisk Han-familie med HCM. I denne familie cosegregerer variant G823E med en autosomal dominerende lidelse. Denne variant er placeret i håndtagsarmdomænet i halsområdet af MYH7-proteinet og er stærkt bevaret blandt homologe myosiner og arter. For at verificere patogeniciteten af G823E-varianten producerede vi en C57BL/6N-musemodel med en punktmutation (G823E) ved musens MYH7-locus med CRISPR/Cas9-medieret genomteknik. Vi designede gRNA-målretningsvektorer og donoroligonukleotider (med målretningssekvenser flankeret af 134 bp homologi). P.G823E (GGG til GAG) -stedet i donoroligonukleotid blev introduceret i exon 23 af MYH7 ved homologi-rettet reparation. En tavs p.R819 (AGG til CGA) blev også indsat for at forhindre gRNA-binding og genspaltning af sekvensen efter homologi-rettet reparation. Ekkokardiografi afslørede venstre ventrikulær posterior væg (LVPW) hypertrofi med systole i MYH7 G823E / - mus ved 2 måneders alder. Disse resultater blev ligeledes valideret ved histologisk analyse (figur 3).

Disse resultater viser, at G823E-varianten spiller en vigtig rolle i patogenesen af HCM. Vores resultater beriger spektret af MYH7-varianter forbundet med familiær HCM og kan give vejledning til genetisk rådgivning og prænatal diagnose i denne kinesiske familie.

Introduction

Hypertrofisk kardiomyopati (HCM, OMIM: 613690) er den mest almindelige kardiomyopati i Kina med en anslået forekomst på 0,2%, der påvirker 150.000 mennesker 1,2.

Det patologiske anatomiske træk, der karakteriserer HCM, er asymmetrisk ventrikulær hypertrofi, som ofte involverer ventrikulær udstrømningskanal og / eller interventrikulær septum3. Den kliniske manifestation er anstrengende dyspnø, træthed og brystsmerter. Den enkelte fænotype af HCM har variabilitet lige fra klinisk snigende til svær hjertesvigt. Patienter med HCM kræver medicinsk behandling, hjertetransplantation, livsstøtteudstyr og tværfaglig opfølgning4.

I det sidste århundrede har PCR-teknologi ændret den måde, vi studerer DNA5 på. En DNA-sekventeringsmetode til klinisk diagnose blev opdaget af Sanger og kolleger6. Sanger-teknikken blev efterfølgende anvendt på Human Genome Project, men denne tilgang var dyr og tidskrævende7. Fremkomsten af helgenomsekventering (WGS) bragte indsigt i menneskelig genetisk sygdom til nye højder, men det forblev uoverkommeligt med hensyn til omkostninger. Whole-exome sekventering (WES) teknologi har længe været brugt til at detektere kimlinje varianter8 og har haft succes med at identificere somatiske drivermutationer i exome af forskellige kræftformer9. Påvisning af DNA-exoner eller kodende regioner af WES kan bruges til at afsløre patogene varianter i de fleste mendelske sygdomme. I dag, med de faldende omkostninger ved sekventering, forventes WGS at blive et vigtigt redskab i genomforskning og kan i vid udstrækning anvendes til påvisning af patogene varianter i genomet.

WES-teknologi er også blevet brugt i arvelig kardiomyopati til at identificere patogene varianter for yderligere at belyse ætiologien. Nye beviser har antydet, at gener, der koder for sarcomere strukturelle proteingenmutationer, såsom MYH7 10, MYH6 11, MYBPC3 12, MYL2 13, MYL3 14, TNNT215, TNNI3 16, TNNC1 17 ogTPM1 18 er ansvarlige for HCM's genetiske ætiologi. Bevidsthed om patogene varianter i sjældne sygdomsfremkaldende gener (f.eks. obscurin, cytoskeletal calmodulin og titin-interagerende RhoGEF (OBSCN, OMIM: 608616)19, virkende alfa 2 (ACTN2, OMIM: 102573)20 og cystein- og glycinrigt protein 3 (CSRP3, OMIM: 600824)21) har også været forbundet med HCM. Nuværende genetiske undersøgelser har identificeret flere forskellige patogene varianter i det sarkomeriske proteingen hos ca. 40% -60% af HCM-patienter, og genetisk test hos HCM-patienter afslørede, at de fleste patogene varianter forekommer i myosin tunge kæde (MYH7) og myosinbindende protein C (MYBPC3). Det genetiske grundlag for HCM er dog fortsat uklart. At undersøge patogeniciteten af disse variationer, der ligger til grund for de menneskelige HCM-patienter, er fortsat en stor udfordring22.

I denne undersøgelse rapporterer vi en patogen variant i MYH7 i en kinesisk Han-familie med HCM af WES. For at verificere patogeniciteten af denne variant etablerede vi en C57BL/6N-Myh7em1(G823E) knockinmus ved hjælp af CRISPR/Cas9-systemet. Vi diskuterer også plausible mekanismer af denne variant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Familiernes historier blev opnået ved at interviewe familiemedlemmerne. Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité på Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine (nr. 2019074). Der blev indhentet informeret skriftligt samtykke fra alle familiemedlemmer. Alle dyrene behandles i overensstemmelse med de etiske retningslinjer fra Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine (Guangzhou, Kina).

1. Studiefag

BEMÆRK: Proband III-3 søgte lægehjælp i afdelingen for kardiovaskulær kirurgi på Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine i juli 2019.

  1. Få detaljeret familiemedicinsk historie af probandet. Underret og ring til alle familiemedlemmer til probandet. Alle familiemedlemmer har gennemgået omhyggelige fysiske undersøgelser.
    1. Udfør en systematisk gennemgang af alle kliniske data, herunder medicinske journaler, EKG'er, ekkokardiogrammer og hjertekateteriseringsrapporter.
    2. Genbekræfte hjertefænotyper hos alle patienter under intervention eller operation.
  2. Vælg i alt 174 befolkningsbaserede sunde kontroller fra den lokale database. Saml ca. 4,0 ml perifert venøst blod fra hver patient.

2. DNA-ekstraktion

BEMÆRK: DNA ekstraheres med et kommercielt blodsæt i henhold til producentens anvisninger.

  1. Lys blodlegemer med et anionisk vaskemiddel i nærværelse af en DNA-stabilisator efter producentens protokol.
  2. Der tilsættes 10 μL RNase A-opløsning til cellelysatet og blandes ved at vende røret 25 gange. Inkuberes ved 37 °C i 15 minutter til 1 time.
  3. Fjern proteiner ved saltudfældning. Brug proteinudfældningsopløsning (0,25 mg bovin serumalbumin opløst i 25 ml destilleret vand) og 100% isopropanol til udfældning af proteiner. Brug derefter 200 μL 70% ethanol og udfør centrifugering ved 12.000 x g/min ved 4 °C i 15 minutter for at vaske DNA-pelleten.
  4. Gendan det genomiske DNA ved udfældning med 500 μL 70% ethanol. Centrifuge ved 12.000 x g i 30 s. Aspirer og opløs derefter pelleten i hydreringsopløsning (1 mM EDTA, 10 mM Tris· Cl, pH 7,5).
  5. Brug et spektrofotometer (f.eks. NanoDrop 2000) til at bestemme renhed. Renset DNA har typisk et A260/A280-forhold mellem 1,7 og 1,9 og er op til 200 kb i størrelse.
  6. Opbevar DNA'et på lang sigt ved 2-8, -20 eller -80 °C.

3. Hele exome-sekventering og variantanalyse

BEMÆRK: For systematisk at søge efter sygdomsfremkaldende genmutationer blev exomesekventering hos berørte individer (II-5, II-7, III-3, III-7, III-8, III-9 og IV-3) og upåvirkede individer (III-2, III-5, IV-4) udført.

  1. Brug exome-sonde i henhold til producentens anvisninger til at udføre exome-optagelsen.
  2. Anvend de kvalificerede biblioteker til 2 × 150 bp parret sekvensering på HiSeq X-ten-platformen. Se supplerende sagsfremstilling 1.
  3. Juster FASTQ-filer til det menneskelige referencegenom (hg19/GRCh37) med BWA v0.7.1318,19. Sorter de justerede filer (sam/bam-formatfiler) med samtools, og markér derefter dubletter ved hjælp af Picard. Se supplerende sagsfremstilling 1.
  4. Brug GATK, juster læsninger lokalt og kalibrer basiskvaliteter. Se supplerende sagsfremstilling 1.
  5. Generer kortlægningsstatistikker, der inkluderer dækning og dybde fra rekalibrerede filer af BEDTools og interne perl / python-scripts.
  6. Genotypevarianter (SNV'er og indels) fra rekalibrerede BAM-filer ved hjælp af multi-sample-behandlingstilstanden i HaplotypeCaller-værktøjet fra GATK.
  7. Brug VQSR (rekalibrering af variantkvalitetsscore) til at reducere falske positiver af variantopkald.
  8. Anmærk SNV'er og indels ved hjælp af ANNOVAR-software21 mod flere databaser, herunder Exome Aggregation Consortium (ExAC) (http://exac.broadinstitute.org), Exome Sequencing Project (ESP) (https://esp.gs.washington.edu) og 1.000 G (http://www.1000genomes.org). Fortolke patogeniciteten af sekvensvarianterne i henhold til ACMG-retningslinjerne.

4. Sanger sekventering

  1. Udfør Sanger-sekventering for at bekræfte potentielle årsagsvarianter og bestemme variantadskillelse i familien ved hjælp af en ABI 3500 sequencer23.
  2. Design primersekvenser for varianten i MYH7-genet (NM_000257) som følger: 5'-TTCAACACAGAGACCTGCAGG-3' og 5'- CGGACTTCTCTAGCGCCTCTT -3'.
  3. Bekræft en variant, screene alle tilgængelige familiemedlemmer for at bestemme variantadskillelse inden for familien23.

5. Generation af C57BL/6N-MYH7em1(G823E) knockinmus

  1. Brug CRISPR/Cas9-systemet til at generere C57BL/6N-Myh7em1(G823E) knockin-mus. Musen Myh7 genet (GenBank tiltrædelsesnummer: NM_001361607.1; Ensembl: ENSMUSG00000053093) er placeret på musekromosom 14 og har 41 exons. ATG starter codon i exon 4 og TAG stop codon i exon 41, og G823E er placeret på exon 23. Vælg exon 23 som målsted.
  2. Design sekvensen af gRNA-målretningsvektor og donoroligo (med målretningssekvens, flankeret af 134 bp homologe sekvenser kombineret på begge sider).
    1. Log ind på NCBI-webstedet, og klik på BLAST online primerdesignfunktionen til højre.
    2. Klik på Primer-BLAST-funktionen nederst på siden for at designe primere.
    3. Indsæt MYH7 NCBI-referencesekvensnummeret NM_000257.4 i feltet PCR-skabelon.
    4. Forstærk målfragmentet (MYH7 cDNA exon 23 og dets tilstødende exons), og design opstrøms primeren på exon 21 (2392-2528) og nedstrøms primeren på exon 25 (3205-3350). Indtast exonnummeret på opstrøms og nedstrøms primere i feltet til højre.
    5. Klik på knappen Hent primere nederst for automatisk at generere flere par primere.
  3. Indtast MYH7-genet i ZFIN-databasen, introducer mutationsstedet p.g823e (GGG til GAG) i donoroligonukleotid og den tavse mutation p.r819 (AGG til CGA) i exon 23. Den tavse mutation forhindrer binding og genskæring af sekvensen ved gRNA efter homologi-rettet reparation.
    1. Design gRNA i henhold til den generelle sekvens er sekvenserne i begge ender TAATACGACTCACTATA- og -GTTTTAGAGCTA. Midten af sekvensen er målstedet nævnt ovenfor.
  4. Co-injicer Cas9 mRNA, gRNA genereret af in vitro transkription og donor oligo i befrugtede æg til KI museproduktion.
    1. Brug Cas9/gRNA-måleffektivitetsdetekteringssættet til at transskribere det designede gRNA-mål til gRNA in vitro og detektere transkriptets aktivitet (se VK007-kitinstruktionerne for specifikke detektionsmetoder) i henhold til producentens protokol.
    2. Optø T7 ARCA mRNA-kitkomponenterne, bland og pulsspin i en mikrofuge for at indsamle opløsninger til bunden af rørene. Reaktionen samles ved stuetemperatur i følgende rækkefølge: 2x ARCA/NTP-blanding til 10 μL, 1 μg skabelon-DNA, 2 μL T7 RNA-polymeraseblanding og nukleasefrit vand til 20 μL.
    3. Bland grundigt og puls-spin i en mikrofuge. Inkuberes ved 37 °C i 30 min.
    4. Fjern skabelon-DNA'et ved at tilføje 2 μL DNase I, bland godt og inkuber ved 37 °C i 15 minutter for at opnå mRNA.
    5. Intraperitoneal injektion af serumgonadotropin og humant choriongonadotropin i præfabrikerede C57BL/6-hunmus, når de er ca. 4 uger gamle, med en sprøjte på 0,5 ml i en dosis på ca. 5 U pr. mus med et interval mellem de to injektioner på 48 timer.
    6. Atten timer efter dosering ofres C57BL/6 hunmus og en 8-12 uger gammel C57BL/6 hanmus ved cervikal dislokation efter hormoninjektion. Saml æg og sæd separat.
    7. Sædcellerne kapaceres i kapacitaseringsvæsken. Tag og slip sædcellerne ved kanten af væsken i de kortvarige ægceller til in vitro-befrugtning i 3-4 timer.
    8. Fortynd det vellykket transskriberede gRNA og Cas9 mRNA in vitro med RNase-frit vand til 25 ng / μL og 50 ng / μL. Indfør i cytoplasmaet af musebefrugtede æg ved mikroinjektion. Transplanter befrugtede æg i god stand i den forstørrede ovidukt af de kvindelige mus. Co-bur med ligerede hanmus.
  5. Genotype hvalpene ved PCR. Brug følgende PCR-betingelser: 94 °C i 3 minutter, 35 cyklusser på 94 °C i 30 s, 60 °C i 35 s og 72 °C i 35 s; 72 °C i 5 min. Følg med sekvensanalyse.
    1. Klip halerne af 4 måneder gamle mus med en saks og læg dem i 1,5 ml EP-rør. Der tilsættes 180 μL bufferGL, 20 μL proteinase K og 10 μL RNase A pr. halestykke (2-5 mm) i et mikrocentrifugerør. Pas på ikke at skære for meget hale.
    2. Røret inkuberes ved 56 °C natten over.
    3. Centrifugerør centrifuger i et mikrocentrifugerør ved 1.000 x g i 2 minutter for at fjerne urenheder.
    4. Der tilsættes 200 μL buffer GB og 200 μL absolut ethylalkohol med tilstrækkelig blanding.
    5. Placer spinkolonnen i et opsamlingsrør. Prøven påføres centrifugeringen og centrifugeres ved 1.000 x g i 2 min. Kassér gennemstrømningen.
    6. Der tilsættes 500 μL buffer-WA til centrifugeringskolonnen og centrifugeres ved 1.000 x g i 1 min. Kassér gennemstrømningen.
    7. Der tilsættes 700 μL buffer WB til centrifugekolonnen og centrifugeres ved 1.000 x g i 1 min. Kassér gennemstrømningen.
      BEMÆRK: Sørg for, at buffer WB er forblandet med 100% ethanol. Når du tilføjer buffer WB, tilsættes til rørvæggen for at vaske restsaltet af.
    8. Gentag trin 5.5.7.
    9. Centrifugeringen anbringes i et opsamlingsrør, og centrifugeres ved 1.000 x g i 2 min.
    10. Placer centrifugeringssøjlen i et nyt 1,5 ml rør. Tilsæt 50-200 μL steriliseret vand eller elueringsbuffer til midten af søjlemembranen og lad søjlen stå i 5 min.
      BEMÆRK: Opvarmning af steriliseret vand eller elueringsbuffer op til 65 °C kan øge udbyttet af eluering.
    11. For at fortynde DNA centrifugeres søjlen ved 1.000 x g i 2 minutter. For at øge udbyttet af DNA tilsættes gennemstrømningen og/eller 50-200 μL steriliseret vand eller elueringsbuffer til midten af centrifugeringssøjlemembranen og lad søjlen stå i 5 min. Centrifuge ved 1.000 x g i 2 min.
    12. Kvantificer det eluerede genomiske DNA ved elektroforese.

6. Evaluering af hjertemorfologi og funktion

BEMÆRK: Anvend M-mode ekkokardiografi til vurdering af hjertemorfologi og funktion af C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E) knockin mus.

  1. Sæt knockinmusene i en lukket akrylkasse, der er forbundet med anæstesimaskinen, og juster trevejsgrænsefladen, så isofluran (koncentration: 3%) kan strømme ind i akrylkassen. Når knockinmusene ophører med at bevæge sig autonomt, skal du fjerne knockinmusene.
  2. Placer knockinmusene fladt på overlevelsesovervågningsplatformen for smådyrsanæstesimaskinen og kontinuerlig inhalationsbedøvelse blandet med ilt (flow: 0,8 l / min) og isofluran (koncentration: 3%). Påfør øjensmøremiddel på de bedøvede mus for at forhindre tørring af hornhinden.
  3. Fastgør knockinmusene vandret på platformen. Vip platformen 30° kaudal til knockinmusen. Fjern hår på den forreste brystvæg på den bankende mus ved hjælp af en hårfjerningscreme.
  4. Placer sonden lodret med bumpen vendt mod dyrets hoved. Drej derefter sonden mod uret, ca. 45 °.
  5. I den parasternale langaksevisning skal du dreje sonden 90° med uret for at observere den parasternale kortaksevisning. Når sonden er drejet 90°, skal du justere y-aksens forskydning for at få den korrekte skive.
  6. Overhold billedet af hjertets langakse (figur 1C), og vælg derefter M-tilstandsmåledata.
  7. Få ultralydsdata fra parasternale langaksebilleder af mus (figur 1). Puls (HR), venstre ventrikulær udstødningsfraktion (LVEF), hjerteudgang (CO), venstre ventrikulær endediastolisk dimension (LVDd), LVD'er venstre ventrikulær endesystolisk dimension (LVSd), interventrikulær septum (IVS) og venstre ventrikulær bagvæg (LVPW) måles.
  8. Efter målingen skal du give musene ilt og placere dem tilbage i deres respektive bure, når de genvinder autonom aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Familiernes kliniske profil
HCM's stamtavler blev opnået og er vist i figur 2. Alle de dokumenterede familiemedlemmer blev diagnosticeret med HCM ved tilmelding.

I familien (figur 2A) var probanden patient III-7, der blev diagnosticeret med HCM og forlod ventrikulær udstrømningskanalobstruktion (LVOTO) ved 46 år og gennemgik hjertekirurgi. Patient III-3 havde mindre HCM, der ikke krævede kirurgisk behandling. Patient IV-3 havde også mindre HCM, som lignede hans far, patient III-3. Patient II-5 havde HCM og gennemgik operation for at reparere defekten i en alder af 51 år på grund af LVOTO. Patient I-1 og patient II-2 døde på grund af hjerteulykker ved henholdsvis 57 og 46 år. Patient I-1's sygehistorie var ikke tilgængelig. Patient II-7 og patient III-9 præsenterede åndenød og blev diagnosticeret med HCM.

Exom-sekvensanalyse og adskillelse af varianter
I denne familie genererede exome-sekventering af de fem individer et gennemsnit på i alt 19.978.731 par sekventerede læsninger med en gennemsnitlig læselængde på 125 bp. I alt bestod 98,72% af sekventerede læsninger kvalitetsvurderingen og blev kortlagt til 98,66% af det menneskelige referencegenom. Selv efter filtrering blev mere end 42 varianter (herunder enkeltnukleotidsubstitutioner og indels) delt af disse fire patienter. Af disse var 27 misfornuftige SNV'er, 15 blev forudsagt at ændre splejsning. Endelig er der i henhold til ACMG's retningslinjer en heterozygot c.G2468A; p.G823E-variant af MYH7 (NM_0002571) blev observeret i proband III-7 såvel som de tre andre patienter.

Identifikation af en patogen mutation
Sanger-sekventering bekræftede den samme MYH7 p.G823E-variant hos alle patienter, men ikke hos de raske individer i familierne og 174 kontroller (figur 2B). Den heterozygote MYH7 p.G823E var fuldstændig adskilt i denne familie. I denne familie arvede patienter IV-3, der havde denne variant, den fra patient III-3. Patienterne III-7 og III-8 bar den samme variant, som blev arvet fra deres far. Oplysningerne for patient III-9 var ikke tilgængelige.

Denne variant, der tidligere er beskrevet i HCM af en sporadisk patient24, er ikke blevet rapporteret i databaserne 1000 G, ESP6500, ExAC, HGMD, ClinVar eller kontrolpersoner. Glycinresten ved codon 823 i halsdomæneområdet i MYH7 er stærkt konserveret i alle tilgængelige hvirveldyrmyosinsekvenser (figur 2C). MYH7 er et kendt HCM-forårsagende gen og spiller en vigtig rolle i hjertets udvikling eller struktur/funktion. Baseret på ACMG-standarder og retningslinjer blev MYH7 p.G823E-varianten forudsagt at være en patogen variant (PVS1 + PS3 + PS4 + PM2). Samlet set understøtter disse resultater, at denne variant er skadelig og bidrager til patogenesen af HCM i disse familier.

C57BL/6N-Myh7em1(G823E) knockinmus udviklede svær hjertehypertrofi
For yderligere at verificere patogenesen af MYH7 p.G823E genererer vi C57BL/6N-Myh7em1(G823E) knockinmus. C57BL/6N-MYH7em1(G823E) knockinmus udviklede en aldersafhængig hjertehypertrofi efter fødslen (figur 2A,B). Ekkokardiografi afslørede, at IVS og LVPW udviklede sig med øget HR i C57BL/6N-Myh7em1(G823E) knockinmus (tabel 1). Disse resultater blev ligeledes valideret ved histologisk analyse (figur 3). Der var ingen åbenlyse forskelle i LVDd, LVD'er, EF eller CO mellem vildtype og heterozygote mus (tabel 1).

Figure 1
Figur 1: Ultralyd dataindsamling . (A) Sonden er placeret på brystbenets lange akse. (B) Sonden er placeret på brystbenets korte akse. (C) M-mode ultralydsbillede af brystbenets langaksebillede. Den gule pil angiver placeringen af interventrikulær septum. Den røde pil angiver den flydende ventil. (D) M-mode ultralydsbillede af brystbenets kortaksede billede. Den gule pil angiver placeringen af den forreste papillærmuskel, og bulen nedenfor er den bageste papillærmuskel. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Den store familie, der bærer den heterozygote MYH7 G823E-variant . (A) Pronden er markeret med en pil. Fulde og åbne cirkler og firkanter angiver henholdsvis berørte og normale individer. (B) G823E-varianten i MYH7 bekræftet af Sanger-sekventering. C) Bevaring af lokaliteten MYH7 G823E i forskellige arter. Den gule pil repræsenterer stedet for G823E i aminosyresekvensen af forskellige arter, som er meget bevaret. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Patologiske ændringer af myokardievæv . (A) Myokardiefibre er arrangeret på en ordnet måde, og der er ingen signifikant forskel mellem hver del. (B) Ventrikulær muskelfiberhypertrofi, uordnet arrangement og læsioner er hovedsageligt koncentreret i den bageste væg i venstre ventrikel og interventrikulær septum. Klik her for at se en større version af denne figur.

C57BL/6N-Myh7em1(G823E) knockin mus gruppe Kontrolgruppe
(n=4) (n=6)
HR (/min) 451,25 ± 25,786 413,83 ± 12,77 P = 0,015
LVDd (mm) 4.12 ± 0,33 3,95 ± 0,20 P = 0,330
LVD'er (mm) 2,95 ± 0,44 2,85 ± 0,20 P = 0,626
EF(%) 55.02 ± 9.52 54.31 ± 5.11 P = 0,881
CO (ml) 18.46 ± 3.05 15.30 ± 2.39 P = 0,102
IVS (mm) 1.13 ± 0,20 0,67 ± 0,07 P = 0,001
LVPW (mm) 1.40 ± 0,60 0,70 ± 0,06 P = 0,000

Tabel 1: Morfologi og funktionsanalyse for p.G823E og vildtype. Data blev analyseret ved hjælp af SPSS. Kontinuerlige variabler udtrykkes som gennemsnit ± standardafvigelse (SD). Studentens t eller Wilcoxon rang sum test for kontinuerlige variabler. P-værdier under 0,05 blev betragtet som statistisk signifikante.

Supplerende fil 1. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne undersøgelse beskriver vi en kinesisk Han-familie med HCM. Genetikanalyse afslørede, at en heterozygot MYH6-mutation p.G823E co-segregerer med sygdommen hos familiemedlemmer med autosomal dominerende arv. For at validere patogeniciteten af G823E-mutationen og diskutere de underliggende mekanismer skabte vi en C57BL/6N-musemodel med G823E ved mus Myh7-locus ved CRISPR/Cas9-medieret genomteknik.

Fænotypiske egenskaber ved C57BL/6N-Myh7em1(G823E) knockinmus blev evalueret ved ekkokardiografi. Multipel trabeculation og et højere forhold mellem ikke-komprimeret og komprimeret myokardielag blev fundet i C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E) knockinmus sammenlignet med kontrollerne. De transgene mus viste også LVPW og IVS hypertrofi og en stigning i HR. Hjertets funktion viste imidlertid ingen signifikant ændring mellem de to grupper. Disse resultater antydede, at en øget HR kan udvise en kompenserende effekt på vedligeholdelsesventrikelfunktionen under hjerteombygning. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at observere og analysere hjertets morfologi og funktion.

Myosin-7 (MYH7) tilhører familien af myokardiesarkoeriske strukturelle proteiner. MYH7 kodet af MYH7-genet (14q11.2; OMIM: 160760), som findes i det første patogene gen forbundet med HCM i 1990. Til dato har mere end 300 varianter i MYH7-genet været forbundet med HCM25,26. Imidlertid forbliver patogeniciteten af langt størstedelen af variationen undvigende. Ved hjælp af denne protokol skabte vi modelmusene med succes. Når du planlægger og designer modelmusen, er der tre hovedproblemer under overvejelse. For det første er aminosyresekvensen af musens MYH7-protein meget homolog med mennesker. For det andet udtrykkes MYH7 stærkt i ventrikler såvel som MYH7 hos mennesker. Glycinresten ved codon 823 i MYH7 er stærkt konserveret i alle tilgængelige myosinsekvenser.

MYH7 indeholder et konserveret hovedmotordomæne ved N-terminalen, som binder actin og har actinaktiveret Mg· ATPaseaktivitet og en halsregion samt en myosinhale, der indeholder en coiled-coil (CC) region ved C-terminalen. Glycinresten ved codon 823 i halsdomæneområdet i MYH7 antyder, at denne variation kan påvirke håndtagsarmrotation i sammentrækning27,28,29,30.

WES fokuserer hovedsageligt på exoner af gener, som kun tegner sig for 1,5%8 af det samlede genom-DNA. Imidlertid er de fleste af de humane genetiske sygdomme, der er blevet identificeret, relateret til exons31. Dette gør WES bredt anerkendt og anvendt i klinisk praksis. Der er visse etiske problemer med den udbredte anvendelse af WES. Undersøgelsen af denne form for human genetisk sygdom involverer ofte grænseoverskridende diskussioner. Selvom forskere forsøger at fjerne personligt identificerbare oplysninger så meget som muligt, kan de enorme oplysninger indeholdt i DNA stadig genidentificere forskningspersonerne og endda deres familier. Kun standardiserede foranstaltninger til udveksling af oplysninger kan sikre en rationel anvendelse af WES. I fremtiden er WES af stor betydning for medicinske strategier for specifikke genmutationer og individualiserede diagnose- og behandlingsforanstaltninger for flere sygdomme.

Sammenfattende identificerede vi en MYH7 heterozygot variant, s.G823E, i en stor kinesisk Han-familie med HCM ved hjælp af WES. C57BL/6N-Myh7em1(G823E) knockin-musene viste sig at have tykkere IVS og LVPW og hurtigere HR end vildtypemus. P.G823E-varianten kan forringe håndtagets armrotation, hvilket tyder på, at denne mutation spiller en vigtig rolle i familiær HCM. Vores arbejde udvider informationen om mutationsspektret af MYH7-genet forbundet med HCM og giver bedre klarhed over den passende diagnose og genetiske rådgivning af berørte familier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen økonomiske interessekonflikter at erklære.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Medical Research Fund-projektet i Guangdong-provinsen (A2022363) og det store projekt fra Guangdong-udvalget for videnskab og teknologi, Kina (bevilling nr. 2022).

Vi vil gerne takke Qingjian Chen fra University of Maryland, College Park for hjælpen under udarbejdelsen af dette manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5×TBE Shanghai Sangon
2× Taq Master Mix (Dye Plus) Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd.
Agarose Regu
Anesthesia machine for small animals Reward Life Technology Co., Ltd. R500
BEDTools 2.16.1
Cas9 in vitro digestion method to detect gRNA target efficiency kit Viewsolid Biotechnology Co., Ltd. VK007
DNA Marker Thermo Fisher Scientific
DNA stabilizer Shanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd. DNAstable LD prevent DNA degradation
Electric paraffin microtome Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. HS-S7220-B
GATK v3.5
Gentra Puregene blood kit Santa Clara
Glass slide, coverslip Jiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd.
Hematoxylin staining solution, Eosin staining solution Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. C0107-500ml, C0109
HiSeq X-ten platform Illumina perform sequencing on the captured libraries
Injection of chorionic gonadotropin Livzon Pharmaceutical Group Inc.
Injection of pregnant mare serum gonadotropin Livzon Pharmaceutical Group Inc.
Isoflurane Local suppliers inhalation anesthesia
Microinjection microscope Nikon ECLIPSE Ts2
NanoDrop Thermo Fisher Scientific 2000
Paraffin Embedding Machine Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. HS-B7126-B
Picard (2.2.4) 20
Proteinase K Merck KGaA
samtools 1.3
Sequencer Applied Biosystems ABI 3500
Stereomicroscope Nikon SMZ745T
SureSelect Human All Exon V6 Agilent Technology Co., Ltd. exome probe
T7 ARCA mRNA Kit New England BioLabs, Inc. NEB-E2065S
Temperature box BINDER GmbH KBF-S Solid.Line
Trizma Hydrochloride Solution Sigma, Merck KGaA No. T2663
Veterinary ultrasound system Royal Philips CX50

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Toepfer, C. N., et al. Myosin sequestration regulates sarcomere function, cardiomyocyte energetics, and metabolism, informing the pathogenesis of hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 141 (10), 828-842 (2020).
  2. Writing Committee Members et al. 2020 AHA/ACC guideline for the diagnosis and treatment of patients with hypertrophic cardiomyopathy: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Joint Committee on Clinical Practice Guidelines. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 162 (1), 23-106 (2021).
  3. Elliott, P., McKenna, W. J. Hypertrophic cardiomyopathy. Lancet. 363 (9424), 1881-1891 (2004).
  4. Maron, B. J., Maron, M. S. Hypertrophic cardiomyopathy. Lancet. 381 (9862), 242-255 (2013).
  5. Inoue, T., Orgel, L. E. A nonenzymatic RNA polymerase model. Science. 219 (4586), 859-862 (1983).
  6. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  7. Sachidanandam, R., et al. A map of human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms. Nature. 409 (6822), 928-933 (2001).
  8. Ng, S. B., et al. Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes. Nature. 461 (7261), 272-276 (2009).
  9. Wong, K. M., Hudson, T. J., McPherson, J. D. Unraveling the genetics of cancer: genome sequencing and beyond. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 12, 407-430 (2011).
  10. Mattivi, C. L., et al. Clinical utility of a phenotype-enhanced MYH7-specific variant classification framework in hypertrophic cardiomyopathy genetic testing. Circulation. Genomic and Precision Medicine. 13 (5), 453-459 (2020).
  11. Jiang, J., Wakimoto, H., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Allele-specific silencing of mutant Myh6 transcripts in mice suppresses hypertrophic cardiomyopathy. Science. 342 (6154), New York, N.Y. 111-114 (2013).
  12. Hayashi, T., et al. Genetic background of Japanese patients with pediatric hypertrophic and restrictive cardiomyopathy. Journal of Human Genetics. 63 (9), 989-996 (2018).
  13. Gil, W. S., Ávila Vidal, L. A., Vásquez Salguero, M. A., Cajiao, M. B., Peña, C. V. Genetic variant affecting the myosin light chain 2 related to familial hypertrophic cardiomyopathy. Intractable & Rare Diseases Research. 9 (4), 229-232 (2020).
  14. Berge, K. E., Leren, T. P. Genetics of hypertrophic cardiomyopathy in Norway. Clinical Genetics. 86 (4), 355-360 (2014).
  15. McNamara, J. W., Schuckman, M., Becker, R. C., Sadayappan, S. A novel homozygous intronic variant in TNNT2 associates with feline cardiomyopathy. Frontiers in Physiology. 11, 608473 (2020).
  16. Wang, W., et al. Comparative transcriptome analysis of atrial septal defect identifies dysregulated genes during heart septum morphogenesis. Gene. 575, 303-312 (2016).
  17. Andersen, P. S., et al. Diagnostic yield, interpretation, and clinical utility of mutation screening of sarcomere encoding genes in Danish hypertrophic cardiomyopathy patients and relatives. Human Mutations. 30 (3), 363-370 (2009).
  18. Nakashima, Y., et al. Lifelong clinical impact of the presence of sarcomere gene mutation in Japanese patients with hypertrophic cardiomyopathy. Circulation Journal. 84 (10), 1846-1853 (2020).
  19. Hu, L. R., Kontrogianni-Konstantopoulos, A. Proteomic analysis of myocardia containing the Obscurin R4344Q mutation linked to hypertrophic cardiomyopathy. Frontiers in Physiology. 11, 478 (2020).
  20. Girolami, F., et al. Novel alpha-actinin 2 variant associated with familial hypertrophic cardiomyopathy and juvenile atrial arrhythmias: a massively parallel sequencing study. Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (6), 741-750 (2014).
  21. Salazar-Mendiguchia, J., et al. The p.(Cys150Tyr) variant in CSRP3 is associated with late-onset hypertrophic cardiomyopathy in heterozygous individuals. European Journal of Medical Genetics. 63 (12), 104079 (2020).
  22. Teekakirikul, P., Zhu, W., Huang, H. C., Fung, E. Hypertrophic cardiomyopathy: An overview of genetics and management. Biomolecules. 9 (12), 878 (2019).
  23. Crossley, B. M., et al. Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).
  24. Song, L., et al. Mutations profile in Chinese patients with hypertrophic cardiomyopathy. Clinica Chimica Acta. 351 (1-2), 209-216 (2005).
  25. Marian, A. J., Braunwald, E. Hypertrophic cardiomyopathy: Genetics, pathogenesis, clinical manifestations, diagnosis, and therapy. Circulation Research. 121 (7), 749-770 (2017).
  26. Cann, F., et al. Phenotype-driven molecular autopsy for sudden cardiac death. Clinical Genetics. 91 (1), 22-29 (2017).
  27. Lafreniere-Roula, M., et al. Family screening for hypertrophic cardiomyopathy: Is it time to change practice guidelines. European Heart Journal. 40 (45), 3672-3681 (2019).
  28. Winkelmann, D. A., Forgacs, E., Miller, M. T., Stock, A. M. Structural basis for drug-induced allosteric changes to human beta-cardiac myosin motor activity. Nature Communications. 6, 7974 (2015).
  29. García-Giustiniani, D., et al. Phenotype and prognostic correlations of the converter region mutations affecting the β myosin heavy chain. Heart (British Cardiac Society). 101 (13), 1047-1053 (2015).
  30. Moore, J. R., Leinwand, L., Warshaw, D. M. Understanding cardiomyopathy phenotypes based on the functional impact of mutations in the myosin motor. Circulation Research. 111 (3), 375-385 (2012).
  31. Majewski, J., Schwartzentruber, J., Lalonde, E., Montpetit, A., Jabado, N. What can exome sequencing do for you. Journal of Medical Genetics. 48 (9), 580-589 (2011).

Tags

Genetik udgave 186
Undersøgelse af patogenesen af MYH7-mutationen Gly823Glu i familiær hypertrofisk kardiomyopati ved hjælp af en musemodel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xia, Y., Hu, J., Li, X., Zheng, S.,… More

Xia, Y., Hu, J., Li, X., Zheng, S., Wang, G., Tan, S., Zou, Z., Ling, Q., Yang, F., Fan, X. Investigating the Pathogenesis of MYH7 Mutation Gly823Glu in Familial Hypertrophic Cardiomyopathy using a Mouse Model. J. Vis. Exp. (186), e63949, doi:10.3791/63949 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter