Summary
Com base na família de cardiomiopatia hereditária familiar encontrada em nosso trabalho clínico, criamos um modelo de camundongo C57BL / 6N com uma mutação pontual (G823E) no locus MYH7 do camundongo através da engenharia genômica mediada por CRISPR / Cas9 para verificar essa mutação.
Abstract
A cardiomiopatia hipertrófica familiar (CMH, OMIM: 613690) é a cardiomiopatia mais comum na China. No entanto, a etiologia genética subjacente da CMH permanece indescritível.
Identificamos anteriormente uma variante heterozigótica do gene da cadeia pesada 7 da miosina (MYH7), NM_000257.4: c.G2468A (p.G823E), em uma grande família Han chinesa com CMH. Nesta família, a variante G823E cosegrega com um distúrbio autossômico dominante. Esta variante está localizada no domínio do braço de alavanca da região do pescoço da proteína MYH7 e é altamente conservada entre miosinas homólogas e espécies. Para verificar a patogenicidade da variante G823E, produzimos um modelo de camundongo C57BL/6N com uma mutação pontual (G823E) no locus MYH7 do camundongo com engenharia genômica mediada por CRISPR/Cas9. Projetamos vetores de gRNA direcionados e oligonucleotídeos doadores (com sequências de segmentação ladeadas por 134 pb de homologia). O sítio p.G823E (GGG a GAG) no oligonucleotídeo doador foi introduzido no éxon 23 do MYH7 por reparo direcionado por homologia. Um p.R819 silenciado (AGG para CGA) também foi inserido para evitar a ligação do gRNA e a reclivagem da sequência após o reparo direcionado por homologia. O ecocardiograma revelou hipertrofia da parede posterior do ventrículo esquerdo (PCVE) com sístole em camundongos MYH7 G823E/- aos 2 meses de idade. Esses resultados também foram validados por análise histológica (Figura 3).
Estes resultados demonstram que a variante G823E desempenha um papel importante na patogênese da CMH. Nossos achados enriquecem o espectro de variantes do MYH7 ligadas à CMH familiar e podem fornecer orientação para aconselhamento genético e diagnóstico pré-natal nesta família chinesa.
Introduction
A cardiomiopatia hipertrófica (CMH, OMIM: 613690) é a cardiomiopatia mais comum na China, com incidência estimada em 0,2%, acometendo 150.000 pessoas 1,2.
A característica anatômica patológica que caracteriza a CMH é a hipertrofia ventricular assimétrica, que frequentemente envolve a via de saída ventricular e/ou septo interventricular3. A manifestação clínica é dispneia ao esforço, fadiga e dor torácica. O fenótipo individual da CMH tem variabilidade que varia de clinicamente insidiosa a insuficiência cardíaca grave. Pacientes com CMH necessitam de tratamento médico, transplante cardíaco, equipamentos de suporte à vida e acompanhamento multidisciplinar4.
No século passado, a tecnologia de PCR mudou a maneira como estudamos o DNA5. Um método de sequenciamento de DNA para diagnóstico clínico foi descoberto por Sanger e colegas6. A técnica de Sanger foi posteriormente aplicada ao Projeto Genoma Humano, mas essa abordagem foi dispendiosa e demorada7. O advento do sequenciamento do genoma completo (WGS) trouxe insights sobre doenças genéticas humanas a novos patamares, mas permaneceu proibitivo em termos de custo. A tecnologia de sequenciamento de exoma completo (WES) tem sido usada há muito tempo para detectar variantes da linha germinativa8 e tem sido bem-sucedida na identificação de mutações de drivers somáticos no exoma de vários tipos de câncer9. A detecção de éxons de DNA ou regiões codificadoras por WES pode ser usada para revelar variantes patogênicas na maioria das doenças mendelianas. Hoje, com a diminuição do custo do sequenciamento, espera-se que o WGS se torne uma ferramenta importante na pesquisa genômica e possa ser amplamente utilizado na detecção de variantes patogênicas no genoma.
A tecnologia WES também tem sido usada na cardiomiopatia hereditária para identificar variantes patogênicas para elucidar ainda mais a etiologia. Evidências emergentes implicaram que genes que codificam mutações genéticas de proteínas estruturais do sarcômero, como MYH7 10, MYH611, MYBPC3 12, MYL2 13, MYL314, TNNT2 15, TNNI3 16, TNNC1 17 eTPM1 18 são responsáveis pela etiologia genética da CMH. O conhecimento de variantes patogênicas em genes causadores de doenças raras (por exemplo, obscurina, calmodulina citoesquelética e RhoGEF (OBSCN, OMIM: 608616)19, agindo alfa 2 (ACTN2, OMIM: 102573)20 e proteína rica em cisteína e glicina 3 (CSRP3, OMIM: 600824)21) também tem sido associada à CMH. Estudos genéticos atuais identificaram múltiplas variantes patogênicas distintas no gene da proteína sarcomérica em aproximadamente 40%-60% dos pacientes com CMH, e testes genéticos em pacientes com CMH revelaram que a maioria das variantes patogênicas ocorre na cadeia pesada da miosina (MYH7) e na proteína C de ligação à miosina (MYBPC3). No entanto, a base genética para a CMH permanece indescritível. Explorar a patogenicidade dessas variações subjacentes aos pacientes humanos com CMH continua sendo um grande desafio22.
Neste estudo, relatamos uma variante patogênica no MYH7 em uma família Han chinesa com CMH por WES. Para verificar a patogenicidade dessa variante, estabelecemos um camundongo knockin C57BL/6N-Myh7em1(G823E) utilizando o sistema CRISPR/Cas9. Também discutimos mecanismos plausíveis dessa variante.
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Protocol
As histórias das famílias foram obtidas por meio de entrevistas com os familiares. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Provincial de Medicina Chinesa de Guangdong (No. 2019074). O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os membros da família. Todos os animais são tratados de acordo com as diretrizes éticas do Hospital Provincial de Medicina Chinesa de Guangdong (Guangzhou, China).
1. Sujeitos do estudo
NOTA: O probando III-3 procurou aconselhamento médico no Departamento de Cirurgia Cardiovascular do Hospital Provincial de Medicina Chinesa de Guangdong em julho de 2019.
- Obtenha uma história médica familiar detalhada do probando. Notifique e ligue para todos os membros da família do probando. Todos os membros da família foram submetidos a exames físicos meticulosos.
- Realizar uma revisão sistemática de todos os dados clínicos, incluindo registros médicos, ECGs, ecocardiogramas e relatórios de cateterismo cardíaco.
- Reconfirmar fenótipos cardíacos em todos os pacientes durante a intervenção ou cirurgia.
- Selecione um total de 174 controles saudáveis de base populacional do banco de dados local. Coletar aproximadamente 4,0 mL de sangue venoso periférico de cada paciente.
2. Extração de DNA
NOTA: O ADN é extraído com um kit de sangue comercial de acordo com as instruções do fabricante.
- Lise as células sanguíneas com um detergente aniônico na presença de um estabilizador de DNA seguindo o protocolo do fabricante.
- Adicionar 10 μL de solução de RNase A ao lisado celular e misturar invertendo o tubo 25 vezes. Incubar a 37 °C durante 15 min a 1 h.
- Remova as proteínas por precipitação de sal. Use solução de precipitação proteica (0,25 mg de albumina sérica bovina dissolvida em 25 mL de água destilada) e isopropanol a 100% para precipitar proteínas. Em seguida, use 200 μL de etanol a 70% e realize a centrifugação a 12.000 x g/min a 4 °C por 15 min para lavar o pellet de DNA.
- Recuperar o DNA genômico por precipitação com 500 μL de etanol a 70%. Centrífuga a 12.000 x g por 30 s. Aspirar e depois dissolver o pellet em solução de hidratação (1 mM EDTA, 10 mM Tris· Cl, pH 7,5).
- Use um espectrofotômetro (por exemplo, NanoDrop 2000) para determinar a pureza. O DNA purificado normalmente tem uma relação A260/A280 entre 1,7 e 1,9 e tem até 200 kb de tamanho.
- Armazene o DNA por um longo prazo a 2-8, -20 ou -80 °C.
3. Sequenciamento completo do exoma e análise de variantes
NOTA: Para procurar sistematicamente mutações genéticas causadoras de doenças, foi realizado o sequenciamento do exoma em indivíduos afetados (II-5, II-7, III-3, III-7, III-8, III-9 e IV-3) e indivíduos não afetados (III-2, III-5, IV-4).
- Use a sonda de exoma de acordo com as instruções do fabricante para realizar a captura do exoma.
- Aplique as bibliotecas qualificadas a 2 × sequenciamento de extremidade emparelhada de 150 pb na plataforma HiSeq X-ten. Consulte o Arquivo Suplementar 1.
- Alinhe os arquivos FASTQ ao genoma humano de referência (hg19/GRCh37) com BWA v0.7.1318,19. Classifique os arquivos alinhados (arquivos de formato sam/bam) com samtools e sinalize duplicatas usando Picard. Consulte o Arquivo Suplementar 1.
- Use o GATK, realinhe as leituras localmente e recalibre as qualidades básicas. Consulte o Arquivo Suplementar 1.
- Gere estatísticas de mapeamento que incluam cobertura e profundidade de arquivos recalibrados por BEDTools e scripts perl/python internos.
- Variantes de genótipo (SNVs e indels) de arquivos BAM recalibrados usando o modo de processamento de várias amostras da ferramenta HaplotypeCaller do GATK.
- Use VQSR (recalibração do índice de qualidade variante) para reduzir os falsos positivos da chamada variante.
- Anote SNVs e indels usando o software ANNOVAR21 em vários bancos de dados, incluindo o Exome Aggregation Consortium (ExAC) (http://exac.broadinstitute.org), o Exome Sequencing Project (ESP) (https://esp.gs.washington.edu) e 1.000 G (http://www.1000genomes.org). Interpretar a patogenicidade das variantes de sequência de acordo com as diretrizes do ACMG.
4. Sequenciamento de Sanger
- Realizar o sequenciamento de Sanger para confirmar possíveis variantes causativas e determinar a segregação de variantes na família usando um sequenciador ABI 350023.
- Projetar sequências de iniciadores para a variante no gene MYH7 (NM_000257) da seguinte forma: 5'-TTCAAACACAGAGACCTGCAGG-3' e 5'- CGGACTTCTCTAGCGCCTCTT -3'.
- Confirme uma variante, filtre todos os membros da família disponíveis para determinar a segregação da variante dentro da família23.
5. Geração de ratos knockin C57BL/6N-MYH7em1 (G823E)
- Use o sistema CRISPR/Cas9 para gerar camundongos knockin C57BL/6N-Myh7em1(G823E ). O gene Myh7 do rato (número de adesão do GenBank: NM_001361607.1; Ensembl: ENSMUSG00000053093) está localizado no cromossomo 14 do rato e tem 41 éxons. O códon de início ATG no éxon 4 e o códon de parada TAG no éxon 41, e o G823E está localizado no éxon 23. Selecione o éxon 23 como o site de destino.
- Projetar a sequência do vetor de direcionamento de gRNA e do oligo doador (com sequência de segmentação, ladeada por sequências homólogas de 134 pb combinadas em ambos os lados).
- Faça login no site do NCBI e clique na função de design de primer online BLAST à direita.
- Clique na função Primer-BLAST na parte inferior da página para criar iniciadores.
- Cole o número de sequência de referência NCBI MYH7 NM_000257.4 na caixa de modelo de PCR.
- Amplifice o fragmento alvo (MYH7 cDNA exon 23 e seus éxons adjacentes) de modo a projetar o primer a montante no éxon 21 (2392-2528) e o primer a jusante no éxon 25 (3205-3350). Insira o número do éxon dos primers a montante e a jusante na caixa de intervalo correta.
- Clique no botão Obter Primers na parte inferior para gerar automaticamente vários pares de primers.
- Insira o gene MYH7 no banco de dados ZFIN, introduza o local de mutação p.g823e (GGG para GAG) no oligonucleotídeo do doador e a mutação silenciosa p.r819 (AGG para CGA) no éxon 23. A mutação silenciosa impede a ligação e o recorte da sequência pelo gRNA após o reparo direcionado por homologia.
- Projete o gRNA de acordo com a sequência geral, as sequências em ambas as extremidades são TAATACGACTCACTATA- e -GTTTTAGAGCTA. O meio da sequência é o site de destino mencionado acima.
- Co-injetar mRNA Cas9, gRNA gerado por transcrição in vitro e oligo doador em óvulos fertilizados para produção de camundongos KI.
- Use o kit de detecção de eficiência de alvo Cas9/gRNA para transcrever o alvo de gRNA projetado em gRNA in vitro e detectar a atividade do transcrito (consulte as instruções do kit VK007 para métodos de detecção específicos) de acordo com o protocolo do fabricante.
- Descongele os componentes do kit de mRNA T7 ARCA, misture e gire o pulso em uma microfuga para coletar soluções para o fundo dos tubos. Monte a reação à temperatura ambiente na seguinte ordem: 2x mistura ARCA/NTP a 10 μL, 1 μg de DNA modelo, 2 μL de mistura de RNA polimerase T7 e água livre de nuclease a 20 μL.
- Misture bem e pulse-spin em um microfuge. Incubar a 37 °C durante 30 min.
- Remova o DNA molde adicionando 2 μL de DNase I, misture bem e incube a 37 °C por 15 min para obter mRNA.
- Realizar injeção intraperitoneal de gonadotrofina sérica e gonadotrofina coriônica humana em camundongos fêmeas C57BL/6 pré-preparados com cerca de 4 semanas de idade com uma seringa de 0,5 mL na dose de aproximadamente 5 U por camundongo com um intervalo entre as duas injeções de 48 h.
- Dezoito horas após a administração, sacrificar camundongos fêmeas C57BL/6 e um camundongo macho C57BL/6 de 8-12 semanas de idade por luxação cervical após injeção hormonal. Colete os óvulos e espermatozoides separadamente.
- O esperma é capacitado no fluido de capacitação. Pegue e solte o espermatozoide na borda do fluido nos óvulos de curta duração para fertilização in vitro por 3-4 h.
- Diluir o gRNA e o mRNA Cas9 transcritos com sucesso in vitro com água livre de RNase para 25 ng/μL e 50 ng/μL. Introduzir no citoplasma de ovos fertilizados de camundongos por microinjeção. Transplante de ovos fertilizados em boas condições para o oviduto aumentado das fêmeas de camundongos. Co-gaiola com ratos machos ligados.
- Genótipo dos filhotes por PCR. Utilizar as seguintes condições de PCR: 94 °C durante 3 min, 35 ciclos de 94 °C durante 30 s, 60 °C durante 35 s e 72 °C durante 35 s; 72 °C durante 5 min. Siga com a análise de sequência.
- Corte as caudas de ratos de 4 meses de idade com uma tesoura e coloque-as em um tubo EP de 1,5 mL. Adicionar 180 μL de tampão GL, 20 μL de proteinase K e 10 μL de RNase A por peça de cauda (2-5 mm) em um tubo de microcentrífuga. Tenha cuidado para não cortar muito rabo.
- Incubar o tubo a 56 °C durante a noite.
- Gire em um tubo de microcentrífuga a 1.000 x g por 2 min para remover as impurezas.
- Adicionar 200 μL de Buffer GB e 200 μL de álcool etílico absoluto com mistura suficiente.
- Coloque a coluna de rotação em um tubo de coleta. Aplicar a amostra no spin e na centrífuga a 1.000 x g durante 2 minutos. Descarte o fluxo.
- Adicionar 500 μL de Buffer WA à coluna de rotação e centrifugar a 1.000 x g durante 1 min. Descarte o fluxo.
- Adicionar 700 μL de Buffer WB à coluna de rotação e centrifugar a 1.000 x g durante 1 min. Descarte o fluxo.
NOTA: Certifique-se de que o buffer WB foi pré-misturado com etanol a 100%. Ao adicionar Buffer WB, adicione à parede do tubo para lavar o sal residual. - Repita a etapa 5.5.7.
- Coloque a coluna de rotação em um tubo de coleta e centrifugar a 1.000 x g por 2 min.
- Coloque a coluna de rotação em um novo tubo de 1,5 mL. Adicione 50-200 μL de água esterilizada ou tampão de eluição ao centro da membrana da coluna e deixe a coluna repousar por 5 min.
NOTA: O aquecimento de água esterilizada ou tampão de eluição até 65 °C pode aumentar o rendimento da eluição. - Para eluír o DNA, centrifugar a coluna a 1.000 x g por 2 min. Para aumentar o rendimento de DNA, adicione o fluxo através e / ou 50-200 μL de água esterilizada ou tampão de eluição ao centro da membrana da coluna de spin e deixe a coluna repousar por 5 min. Centrífuga a 1.000 x g por 2 min.
- Quantificar o DNA genômico eluído por eletroforese.
6. Avaliação da morfologia e função cardíaca
NOTA: Aplicar ecocardiografia em modo M para avaliar a morfologia cardíaca e a função de camundongos knockin C57BL/6N-Myh7em1(G823E ).
- Coloque os ratos knockin em uma caixa de acrílico fechada conectada à máquina de anestesia e ajuste a interface de três vias para permitir que o isoflurano (concentração: 3%) flua para a caixa de acrílico. Depois que os ratos knockin pararem de se mover de forma autônoma, remova os ratos knockin.
- Coloque os camundongos knockin na plataforma de monitoramento da vida útil da máquina de anestesia de pequenos animais e a anestesia inalatória contínua misturada com oxigênio (fluxo: 0,8 L/min) e isoflurano (concentração: 3%). Aplique lubrificante ocular nos ratos anestesiados para evitar a secagem da córnea.
- Fixe os mouses knockin horizontalmente na plataforma. Incline a plataforma 30° caudal para o rato knockin. Remova o cabelo na parede torácica anterior do rato que bate usando um creme depilatório.
- Posicione a sonda verticalmente com a protuberância voltada para a cabeça do animal. Em seguida, gire a sonda no sentido anti-horário, aproximadamente 45°.
- Na visão paraesternal de eixo longo, gire a sonda 90° no sentido horário para observar a visão paraesternal de eixo curto. Depois de girar a sonda 90°, ajuste o deslocamento do eixo y para obter a fatia correta.
- Observe a imagem de eixo longo do coração (Figura 1C) e selecione os dados de medição do modo M.
- Adquirir dados de ultrassonografia de vistas paraesternais de eixo longo de camundongos (Figura 1). A frequência cardíaca (FC), a fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE), o débito cardíaco (CO), a dimensão diastólica final do ventrículo esquerdo (DSVE), a dimensão diastólica final do ventrículo esquerdo (DSVE), o septo interventricular (IVS) e a parede posterior do ventrículo esquerdo (PCVE) são medidos.
- Após a medição, forneça oxigênio aos ratos e coloque-os de volta em suas respectivas gaiolas quando recuperarem a atividade autônoma.
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Representative Results
Perfil clínico das famílias
Os pedigrees familiares da CMH foram obtidos e são apresentados na Figura 2. Todos os membros da família documentados foram diagnosticados com CMH no momento da inscrição.
Na família (Figura 2A), o probando foi o paciente III-7, que foi diagnosticado com CMH e obstrução da via de saída do ventrículo esquerdo (VOTO) aos 46 anos e submetido a cirurgia cardíaca. O paciente III-3 tinha CMH menor que não necessitou de tratamento cirúrgico. O paciente IV-3 também tinha CMH menor, que era semelhante ao seu pai, o paciente III-3. O paciente II-5 era portador de CMH e foi submetido à cirurgia para correção do defeito aos 51 anos de idade devido à OVVE. O paciente I-1 e o paciente II-2 faleceram devido a acidentes cardíacos aos 57 e 46 anos de idade, respectivamente. A história médica do paciente I-1 não estava disponível. O paciente II-7 e o paciente III-9 apresentaram dispneia e foram diagnosticados com CMH.
Análise da sequência do exoma e segregação de variantes
Nessa família, o sequenciamento do exoma dos cinco indivíduos gerou uma média de um total de 19.978.731 pares de leituras sequenciadas com um comprimento médio de leitura de 125 pb. No total, 98,72% das leituras sequenciadas passaram na avaliação de qualidade e foram mapeadas para 98,66% do genoma humano de referência. Mesmo após a filtragem, mais de 42 variantes (incluindo substituições de nucleotídeos únicos e indels) foram compartilhadas por esses quatro pacientes. Destes, 27 eram SNVs incorretos, 15 foram previstos para alterar o splicing. Finalmente, de acordo com as diretrizes de classificação ACMG, um c.G2468A heterozigoto; A variante p.G823E do MYH7 (NM_0002571) foi observada no probando III-7, bem como nos outros três pacientes.
Identificação de uma mutação patogénica
O sequenciamento de Sanger confirmou a mesma variante MYH7 p.G823E em todos os pacientes, mas não nos indivíduos saudáveis das famílias e 174 controles (Figura 2B). O heterozigoto MYH7 p.G823E completamente co-segregado nesta família. Nesta família, os pacientes IV-3 que abrigavam essa variante a herdaram do paciente III-3. Os pacientes III-7 e III-8 carregavam a mesma variante, que foi herdada de seu pai. As informações para o paciente III-9 não estavam disponíveis.
Esta variante, previamente descrita na CMH por um paciente esporádico24, não foi relatada nas bases de dados 1000 G, ESP6500, ExAC, HGMD, ClinVar ou indivíduos controle. O resíduo de glicina no códon 823 na região do domínio cervical de MYH7 é altamente conservado em todas as sequências de miosina de vertebrados disponíveis (Figura 2C). O MYH7 é um gene causador de CMH conhecido e desempenha um papel importante no desenvolvimento cardíaco ou na estrutura/função. Com base nos padrões e diretrizes do ACMG, a variante MYH7 p.G823E foi prevista como uma variante patogênica (PVS1 + PS3 + PS4 + PM2). Tomados em conjunto, esses resultados sustentam que essa variante é prejudicial e contribui para a patogênese da CMH nessas famílias.
Camundongos knockin C57BL/6N-Myh7em1(G823E) desenvolveram hipertrofia cardíaca grave
Para verificar ainda mais a patogênese do MYH7 p.G823E, geramos camundongos knockin C57BL/6N-Myh7em1(G823E). Os camundongos knockin C57BL/6N-MYH7em1(G823E) desenvolveram hipertrofia cardíaca dependente da idade após o nascimento (Figura 2A,B). A ecocardiografia revelou que a SIV e a PVVE se desenvolveram com aumento da FC em camundongos knockin C57BL/6N-Myh7em1(G823E) (Tabela 1). Esses resultados também foram validados por análise histológica (Figura 3). Não houve diferenças óbvias em DDVE, DDVE, FE ou CO entre camundongos do tipo selvagem e heterozigotos (Tabela 1).
Figura 1: Aquisição de dados de ultrassom . (A) A sonda está localizada no eixo longo do esterno. (B) A sonda está localizada no eixo curto do esterno. (C) Imagem ultrassonográfica em modo M da visão de eixo longo do esterno. A seta amarela indica a localização do septo interventricular. A seta vermelha indica a válvula flutuante. (D) Imagem ultrassonográfica em modo M da visão de eixo curto do esterno. A seta amarela indica a localização do músculo papilar anterior, e a protuberância abaixo é o músculo papilar posterior. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A grande família portadora da variante heterozigótica MYH7 G823E . (A) O probando é marcado por uma seta. Círculos e quadrados cheios e abertos indicam indivíduos afetados e normais, respectivamente. (B) A variante G823E no MYH7 confirmada pelo sequenciamento de Sanger. (C) Conservação do sítio MYH7 G823E em diferentes espécies. A seta amarela representa o local de G823E na sequência de aminoácidos de diferentes espécies, que é altamente conservada. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Alterações patológicas do tecido miocárdico. (A) As fibras miocárdicas estão dispostas de forma ordenada, não havendo diferença significativa entre cada parte. (B) A hipertrofia das fibras musculares ventriculares, o arranjo desordenado e as lesões concentram-se principalmente na parede posterior do ventrículo esquerdo e no septo interventricular. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| C57BL/6N-Myh7em1 (G823E) grupo de camundongos knockin | Grupo controle | ||
| (n=4) | (n=6) | ||
| FC (/min) | 451,25 ± 25,786 | 413,83 ± 12,77 | P = 0,015 |
| LVDd (milímetro) | 4,12 ± 0,33 | 3,95 ± 0,20 | P = 0,330 |
| LVDs (milímetro) | 2,95 ± 0,44 | 2,85 ± 0,20 | P = 0,626 |
| FE(%) | 55,02 ± 9,52 | 54,31 ± 5,11 | P = 0,881 |
| CO (mL) | 18,46 ± 3,05 | 15,30 ± 2,39 | P = 0,102 |
| IVS (milímetro) | 1,13 ± 0,20 | 0,67 ± 0,07 | P = 0,001 |
| LVPW (milímetro) | 1,40 ± 0,60 | 0,70 ± 0,06 | P = 0,000 |
Tabela 1: Morfologia e análise de função para p.G823E e tipo selvagem. Os dados foram analisados por meio do programa SPSS. As variáveis contínuas são expressas como média ± desvio padrão (DP). Os testes de soma de postos t de Student ou Wilcoxon para variáveis contínuas. Valores de p abaixo de 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.
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Discussion
Neste estudo, descrevemos uma família Han chinesa com CMH. A análise genética revelou que uma mutação heterozigótica MYH6 p.G823E co-segrega com a doença em membros da família com herança autossômica dominante. Para validar a patogenicidade da mutação G823E e discutir os mecanismos subjacentes, criamos um modelo de camundongo C57BL/6N com G823E no locus Myh7 do camundongo por engenharia genômica mediada por CRISPR/Cas9.
As características fenotípicas de camundongos knockin C57BL/6N-Myh7em1(G823E) foram avaliadas por ecocardiografia. Trabeculação múltipla e maior proporção de camada miocárdica não compactada para compactada foram encontradas nos camundongos knockin C57BL/6N-Myh7em1(G823E) em comparação com os controles. Os camundongos transgênicos também apresentaram hipertrofia LVPW e IVS e aumento da FC. No entanto, a função do coração não mostrou alteração significativa entre os dois grupos. Esses resultados sugeriram que uma FC aumentada pode apresentar um efeito compensatório na função do ventrículo de manutenção durante o remodelamento cardíaco. Mais estudos são necessários para observar e analisar a morfologia e a função do coração.
A miosina-7 (MYH7) pertence à família das proteínas estruturais sarcômeras miocárdicas. MYH7 codificado pelo gene MYH7 (14q11.2; OMIM: 160760), que é encontrado no primeiro gene patogênico associado à CMH em 1990. Até o momento, mais de 300 variantes no gene MYH7 foram associadas à CMH25,26. No entanto, a patogenicidade da grande maioria da variação permanece indescritível. Usando esse protocolo, criamos os mouses modelo com êxito. Ao planejar e projetar o modelo de mouse, há três questões principais em consideração. Primeiro, a sequência de aminoácidos da proteína MYH7 do rato é altamente homóloga com o ser humano. Em segundo lugar, o MYH7 é altamente expresso nos ventrículos, bem como o MYH7 em humanos. O resíduo de glicina no códon 823 no MYH7 é altamente conservado em todas as sequências de miosina disponíveis.
MYH7 contém um domínio motor da cabeça conservado no N-terminal, que se liga à actina e tem Mg ativado por actina· Atividade da ATPase e uma região do pescoço, bem como uma cauda de miosina, que contém uma região de bobina enrolada (CC) no terminal C. O resíduo de glicina no códon 823 na região do domínio cervical de MYH7 sugere que essa variação pode impactar na rotação do braço de alavanca na contração27,28,29,30.
O WES se concentra principalmente nos éxons dos genes, que representam apenas 1,5%8 do DNA total do genoma. No entanto, a maioria das doenças genéticas humanas identificadas está relacionada aos éxons31. Isso faz com que o WES seja amplamente reconhecido e aplicado na prática clínica. Existem certas questões éticas com a aplicação generalizada do WES. O estudo deste tipo de doença genética humana envolve frequentemente discussões transfronteiriças. Embora os pesquisadores tentem remover informações pessoalmente identificáveis, tanto quanto possível, a enorme informação contida no DNA ainda pode re-identificar os indivíduos da pesquisa, e até mesmo suas famílias. Só medidas normalizadas de intercâmbio de informações podem assegurar a aplicação racional do WES. No futuro, o WES é de grande importância para estratégias médicas para mutações genéticas específicas e medidas individualizadas de diagnóstico e tratamento para múltiplas doenças.
Em resumo, identificamos uma variante heterozigótica do MYH7, p.G823E, em uma grande família Han chinesa com CMH usando WES. Os camundongos knockin C57BL/6N-Myh7em1(G823E) apresentaram IVS e LVPW mais espessos e FC mais rápida do que os camundongos do tipo selvagem. A variante p.G823E pode prejudicar a rotação do braço de alavanca, sugerindo que esta mutação desempenha um papel importante na CMH familiar. Nosso trabalho amplia as informações sobre o espectro de mutação do gene MYH7 associado à CMH e fornece melhor clareza sobre o diagnóstico apropriado e o aconselhamento genético das famílias afetadas.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse financeiros a declarar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo projeto do Fundo de Pesquisa Médica da Província de Guangdong (A2022363) e pelo grande projeto do Comitê de Ciência e Tecnologia de Guangdong, China (subvenção no.2022).
Gostaríamos de agradecer a Qingjian Chen, da Universidade de Maryland, College Park, pela ajuda durante a preparação deste manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5×TBE | Shanghai Sangon | ||
| 2× Taq Master Mix (Dye Plus) | Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Agarose | Regu | ||
| Anesthesia machine for small animals | Reward Life Technology Co., Ltd. | R500 | |
| BEDTools | 2.16.1 | ||
| Cas9 in vitro digestion method to detect gRNA target efficiency kit | Viewsolid Biotechnology Co., Ltd. | VK007 | |
| DNA Marker | Thermo Fisher Scientific | ||
| DNA stabilizer | Shanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd. | DNAstable LD | prevent DNA degradation |
| Electric paraffin microtome | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-S7220-B | |
| GATK | v3.5 | ||
| Gentra Puregene blood kit | Santa Clara | ||
| Glass slide, coverslip | Jiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Hematoxylin staining solution, Eosin staining solution | Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. | C0107-500ml, C0109 | |
| HiSeq X-ten platform | Illumina | perform sequencing on the captured libraries | |
| Injection of chorionic gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Injection of pregnant mare serum gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Isoflurane | Local suppliers | inhalation anesthesia | |
| Microinjection microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000 | |
| Paraffin Embedding Machine | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-B7126-B | |
| Picard | (2.2.4) 20 | ||
| Proteinase K | Merck KGaA | ||
| samtools | 1.3 | ||
| Sequencer | Applied Biosystems | ABI 3500 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ745T | |
| SureSelect Human All Exon V6 | Agilent Technology Co., Ltd. | exome probe | |
| T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs, Inc. | NEB-E2065S | |
| Temperature box | BINDER GmbH | KBF-S Solid.Line | |
| Trizma Hydrochloride Solution | Sigma, Merck KGaA | No. T2663 | |
| Veterinary ultrasound system | Royal Philips | CX50 |
References
- Toepfer, C. N., et al. Myosin sequestration regulates sarcomere function, cardiomyocyte energetics, and metabolism, informing the pathogenesis of hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 141 (10), 828-842 (2020).
- Writing Committee Members et al. 2020 AHA/ACC guideline for the diagnosis and treatment of patients with hypertrophic cardiomyopathy: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Joint Committee on Clinical Practice Guidelines. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 162 (1), 23-106 (2021).
- Elliott, P., McKenna, W. J.
- Maron, B. J., Maron, M. S.
- Inoue, T., Orgel, L. E. A nonenzymatic RNA polymerase model. Science. 219 (4586), 859-862 (1983).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Sachidanandam, R., et al. A map of human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms. Nature. 409 (6822), 928-933 (2001).
- Ng, S. B., et al. Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes. Nature. 461 (7261), 272-276 (2009).
- Wong, K. M., Hudson, T. J., McPherson, J. D. Unraveling the genetics of cancer: genome sequencing and beyond. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 12, 407-430 (2011).
- Mattivi, C. L., et al. Clinical utility of a phenotype-enhanced MYH7-specific variant classification framework in hypertrophic cardiomyopathy genetic testing. Circulation. Genomic and Precision Medicine. 13 (5), 453-459 (2020).
- Jiang, J., Wakimoto, H., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Allele-specific silencing of mutant Myh6 transcripts in mice suppresses hypertrophic cardiomyopathy. Science. 342 (6154), New York, N.Y. 111-114 (2013).
- Hayashi, T., et al. Genetic background of Japanese patients with pediatric hypertrophic and restrictive cardiomyopathy. Journal of Human Genetics. 63 (9), 989-996 (2018).
- Gil, W. S., Ávila Vidal, L. A., Vásquez Salguero, M. A., Cajiao, M. B., Peña, C. V. Genetic variant affecting the myosin light chain 2 related to familial hypertrophic cardiomyopathy. Intractable & Rare Diseases Research. 9 (4), 229-232 (2020).
- Berge, K. E., Leren, T. P.
- McNamara, J. W., Schuckman, M., Becker, R. C., Sadayappan, S. A novel homozygous intronic variant in TNNT2 associates with feline cardiomyopathy. Frontiers in Physiology. 11, 608473 (2020).
- Wang, W., et al. Comparative transcriptome analysis of atrial septal defect identifies dysregulated genes during heart septum morphogenesis. Gene. 575, 303-312 (2016).
- Andersen, P. S., et al. Diagnostic yield, interpretation, and clinical utility of mutation screening of sarcomere encoding genes in Danish hypertrophic cardiomyopathy patients and relatives. Human Mutations. 30 (3), 363-370 (2009).
- Nakashima, Y., et al. Lifelong clinical impact of the presence of sarcomere gene mutation in Japanese patients with hypertrophic cardiomyopathy. Circulation Journal. 84 (10), 1846-1853 (2020).
- Hu, L. R., Kontrogianni-Konstantopoulos, A. Proteomic analysis of myocardia containing the Obscurin R4344Q mutation linked to hypertrophic cardiomyopathy. Frontiers in Physiology. 11, 478 (2020).
- Girolami, F., et al. Novel alpha-actinin 2 variant associated with familial hypertrophic cardiomyopathy and juvenile atrial arrhythmias: a massively parallel sequencing study. Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (6), 741-750 (2014).
- Salazar-Mendiguchia, J., et al. The p.(Cys150Tyr) variant in CSRP3 is associated with late-onset hypertrophic cardiomyopathy in heterozygous individuals. European Journal of Medical Genetics. 63 (12), 104079 (2020).
- Teekakirikul, P., Zhu, W., Huang, H. C., Fung, E. Hypertrophic cardiomyopathy: An overview of genetics and management. Biomolecules. 9 (12), 878 (2019).
- Crossley, B. M., et al. Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).
- Song, L., et al. Mutations profile in Chinese patients with hypertrophic cardiomyopathy. Clinica Chimica Acta. 351 (1-2), 209-216 (2005).
- Marian, A. J., Braunwald, E. Hypertrophic cardiomyopathy: Genetics, pathogenesis, clinical manifestations, diagnosis, and therapy. Circulation Research. 121 (7), 749-770 (2017).
- Cann, F., et al. Phenotype-driven molecular autopsy for sudden cardiac death. Clinical Genetics. 91 (1), 22-29 (2017).
- Lafreniere-Roula, M., et al. Family screening for hypertrophic cardiomyopathy: Is it time to change practice guidelines. European Heart Journal. 40 (45), 3672-3681 (2019).
- Winkelmann, D. A., Forgacs, E., Miller, M. T., Stock, A. M. Structural basis for drug-induced allosteric changes to human beta-cardiac myosin motor activity. Nature Communications. 6, 7974 (2015).
- García-Giustiniani, D., et al. Phenotype and prognostic correlations of the converter region mutations affecting the β myosin heavy chain. Heart (British Cardiac Society). 101 (13), 1047-1053 (2015).
- Moore, J. R., Leinwand, L., Warshaw, D. M. Understanding cardiomyopathy phenotypes based on the functional impact of mutations in the myosin motor. Circulation Research. 111 (3), 375-385 (2012).
- Majewski, J., Schwartzentruber, J., Lalonde, E., Montpetit, A., Jabado, N. What can exome sequencing do for you. Journal of Medical Genetics. 48 (9), 580-589 (2011).
