Summary
基于我们临床工作中发现的家族性遗传性心肌病家族，我们通过CRISPR / Cas9介导的基因组工程在小鼠MYH7位点创建了一个具有点突变（G823E）的C57BL / 6N小鼠模型来验证该突变。
Abstract
家族性肥厚型心肌病（HCM，OMIM：613690）是中国最常见的心肌病。然而，HCM的潜在遗传病因仍然难以捉摸。
我们之前在一个患有HCM的大型中国汉族家族中发现了肌球蛋白重链7（MYH7）基因杂合变体NM_000257.4：c.G2468A（p.G823E）。在该家族中，变异型 G823E 与常染色体显性遗传病共存。该变体位于MYH7蛋白颈部区域的杠杆臂结构域，并且在同源肌球蛋白和物种中高度保守。为了验证G823E变体的致病性，我们用CRISPR / Cas9介导的基因组工程制作了一个C57BL / 6N小鼠模型，该模型在小鼠MYH7位点具有点突变（G823E）。我们设计了gRNA靶向载体和供体寡核苷酸（靶向序列两侧有134 bp的同源性）。供体寡核苷酸中的p.G823E（GGG至GAG）位点通过同源定向修复引入MYH7的外显子23中。还插入了沉默的p.R819（AGG至CGA），以防止同源定向修复后gRNA结合和序列的重新切割。超声心动图显示 MYH7 G823E/- 小鼠在 2 个月龄时左心室后壁 （LVPW） 肥大伴收缩。这些结果同样通过组织学分析得到验证（图3）。
这些结果表明，G823E变异株在HCM的发病机制中起着重要作用。我们的研究结果丰富了与家族性HCM相关的MYH7变异谱，可为该中国家庭的遗传咨询和产前诊断提供指导。
Introduction
肥厚型心肌病（HCM，OMIM：613690）是中国最常见的心肌病，估计发病率为0.2%，影响15万人1，2。
HCM 的病理解剖学特征是不对称性心室肥厚，通常累及心室流出道和/或室间隔3。临床表现为劳力性呼吸困难、乏力和胸痛。HCM 的个体表型具有从临床隐匿到严重心力衰竭的变异性。HCM 患者需要药物治疗、心脏移植、生命支持设备和多学科随访4.
在过去的一个世纪里，PCR技术改变了我们研究DNA的方式5。Sanger及其同事发现了一种用于临床诊断的DNA测序方法6。桑格技术随后被应用于人类基因组计划，但这种方法既昂贵又耗时7。全基因组测序（WGS）的出现将人类遗传疾病的见解带到了新的高度，但在成本方面仍然令人望而却步。全外显子组测序（WES）技术长期以来一直用于检测种系变异8 ，并已成功鉴定各种癌症外显子组中的体细胞驱动突变9。通过WES检测DNA外显子或编码区可用于揭示大多数孟德尔疾病的致病变异。如今，随着测序成本的降低，WGS有望成为基因组学研究的重要工具，并可广泛应用于基因组中致病变异的检测。
WES 技术也已用于遗传性心肌病，以识别致病变异，以进一步阐明病因。新出现的证据表明，编码肌节结构蛋白基因突变的基因，如MYH7 10、MYH6 11、MYBPC3 12、MYL2 13、MYL3 14、TNNT215、TNNI3 16、TNNC1 17和TPM1 18是HCM遗传病因的原因。对罕见致病基因（例如，暗摜葒素、细胞骨架钙调蛋白和Titin相互作用的RhoGEF（OBSCN，OMIM：608616）19、作用α2（ACTN2，OMIM：102573）20以及半胱氨酸和甘氨酸丰富蛋白3（CSRP3，OMIM：600824）21））中致病变异的认识也与HCM有关。目前的遗传学研究已经在大约40%-60%的HCM患者中确定了肉瘤蛋白基因中多种不同的致病变异，HCM患者的基因检测显示，大多数致病变异发生在肌球蛋白重链（MYH7）和肌球蛋白结合蛋白C（MYBPC3）中。然而，HCM的遗传基础仍然难以捉摸。探索人类HCM患者背后的这些变异的致病性仍然是一个主要挑战22。
在这项研究中，我们报告了WES在中国汉族HCM家族中MYH7的致病变异。为了验证该变体的致病性，我们使用CRISPR / Cas9系统建立了C57BL / 6N-Myh7em1（G823E） 敲入小鼠。我们还讨论了这种变体的合理机制。
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Protocol
这些家庭的历史是通过与家庭成员面谈获得的。该研究获得广东省中医院伦理委员会（第2019074号）批准。已获得所有家庭成员的知情书面同意。所有动物均按照广东省中医院（中国广州）的道德准则进行治疗。
1. 研究对象
注：先证者III-3于2019年7月到广东省中医院心血管外科就医。
- 获取先证者的详细家族病史。通知并呼叫先证者的所有家庭成员。所有家庭成员都经过了细致的体检。
- 对所有临床数据进行系统审查，包括病历、心电图、超声心动图和心导管检查报告。
- 在干预或手术期间再次确认所有患者的心脏表型。
- 从本地数据库中总共选择 174 个基于人群的健康对照。从每位患者收集约 4.0 mL 外周静脉血。
2. 脱氧核糖核酸提取
注意：DNA是根据制造商的说明使用商业血液试剂盒提取的。
- 按照制造商的方案，在DNA稳定剂存在下用阴离子洗涤剂裂解血细胞。
- 向细胞裂解物中加入 10 μL RNase A 溶液，并通过倒置试管混合 25 次。在37°C孵育15分钟至1小时。
- 通过盐沉淀去除蛋白质。使用蛋白质沉淀溶液（0.25 mg牛血清白蛋白溶解在25 mL蒸馏水中）和100%异丙醇沉淀蛋白质。然后，使用 200 μL 70% 乙醇并在 4 °C 下以 12，000 x g/min 离心 15 分钟以洗涤 DNA 沉淀。
- 用 500 μL 70% 乙醇沉淀回收基因组 DNA。以 12，000 x g 离心 30 秒。吸出沉淀，然后将沉淀溶解在水合溶液中（1 mM EDTA，10 mM Tris·氯，酸7.5）。
- 使用分光光度计（例如，NanoDrop 2000）测定纯度。纯化的 DNA 通常具有 1.7 和 1.9 之间的 A260/A280 比率，大小高达 200 kb。
- 将DNA长期储存在2-8、-20或-80°C。
3. 全外显子组测序与变异分析
注意：为了系统地搜索致病基因突变，在受影响的个体（II-5，II-7，III-3，III-7，III-8，III-9和IV-3）和未受影响的个体（III-2，III-5，IV-4）中进行外显子组测序。
- 根据制造商的说明使用外显子组探针进行外显子组捕获。
- 将合格的文库应用于HiSeq X-ten平台上的2×150 bp配对末端测序。请参阅 补充文件 1。
- 将 FASTQ 文件与人类参考基因组 （hg19/GRCh37） 与 BWA v0.7.1318，19 对齐。使用 samtools 对对齐的文件（sam/bam 格式文件）进行排序，然后使用 Picard 标记重复项。请参阅 补充文件 1。
- 使用 GATK，在本地重新对齐读数并重新校准基本质量。请参阅 补充文件 1。
- 生成映射统计信息，包括通过 BEDTools 和内部 perl/python 脚本重新校准的文件的覆盖范围和深度。
- 来自使用 GATK 单倍型调用者工具的多样本处理模式重新校准的 BAM 文件中的基因型变异（SNV 和插入缺失）。
- 使用 VQSR（变体质量分数重新校准）来减少变体调用的误报。
- 使用ANNOVAR软件21针对多个数据库（包括外显子组聚集联盟（ExAC）（http://exac.broadinstitute.org），外显子组测序项目（ESP）（https://esp.gs.washington.edu）和1，000 G（http://www.1000genomes.org））对SNV和插入缺失进行注释。根据 ACMG 指南解释序列变异的致病性。
4. 桑格测序
- 使用 ABI 3500 测序仪23 执行 Sanger 测序以确认潜在的致病变异并确定家族中的变异分离。
- 设计MYH7基因变异的引物序列（NM_000257）如下：5'-TTCAAACAGAGACCTGCAGG-3'和5'-CGGACTTCTCTAGCGCCTCTT-3'。
- 确认变体，筛选所有可用的家族成员以确定家族内的变体分离23.
5. C57BL/6N-MYH7em1（G823E） 敲入小鼠的产生
- 使用CRISPR / Cas9系统生成C57BL / 6N-Myh7em1（G823E） 敲入小鼠。小鼠 Myh7 基因（基因库入藏号：NM_001361607.1;Ensembl：ENSMUSG00000053093）位于小鼠14号染色体上，有41个外显子。ATG起始密码子在外显子4和TAG停止密码子在外显子41，G823E位于外显子23。选择外显子 23 作为目标位点。
- 设计gRNA靶向载体和供体寡核苷酸的序列（使用靶向序列，两侧由134 bp同源序列组合）。
- 登录NCBI网站，点击右侧的 BLAST在线引物设计 功能。
- 单击页面底部的 引物BLAST 功能以设计引物。
- 将 MYH7 NCBI 参考序列号 NM_000257.4 粘贴到 PCR 模板框中。
- 扩增靶片段（MYH7 cDNA 外显子 23 及其相邻外显子），因此在外显子 21 （2392-2528） 上设计上游引物，在外显子 25 （3205-3350） 上设计下游引物。在正确的范围框中输入上游和下游引物的外显子编号。
- 单击底部的 获取引物 按钮以自动生成多对引物。
- 将MYH7基因输入ZFIN数据库，将供体寡核苷酸中的p.g823e（GGG至GAG）突变位点和沉默突变p.r819（AGG至CGA）引入外显子23。沉默突变阻止了同源定向修复后gRNA对序列的结合和重新切割。
- 根据一般序列设计gRNA，两端的序列是TAATACGACTCACTATA和-GTTTTAGAGCTA。序列的中间是上面提到的目标站点。
- 将Cas9 mRNA，体 外 转录和供体寡核苷酸产生的gRNA共同注射到受精卵中，用于KI小鼠生产。
- 使用Cas9/gRNA靶标效率检测试剂盒将设计的gRNA靶标转录为体 外 gRNA，并根据制造商的方案检测转录本的活性（具体检测方法参见VK007试剂盒说明）。
- 解冻T7 ARCA mRNA试剂盒组分，混合并在微量离心机中脉冲旋转，以将溶液收集到管底部。在室温下按以下顺序组装反应：2x ARCA/NTP 混合物至 10 μL、1 μg 模板 DNA、2 μL T7 RNA 聚合酶混合物，以及无核酸酶水至 20 μL。
- 充分混合并在微量离心机中脉冲旋转。在37°C孵育30分钟。
- 通过加入 2 μL DNase I 去除模板 DNA，充分混合，并在 37 °C 下孵育 15 分钟以获得 mRNA。
- 在约4周龄时用0.5mL注射器将血清促性腺激素和人绒毛膜促性腺激素腹膜内注射到预先制备的C57BL / 6雌性小鼠中，每只小鼠的剂量约为5U，两次注射之间的间隔为48小时。
- 给药后18小时，注射激素后颈脱位处死C57BL/6雌性小鼠和1只8-12周龄C57BL/6雄性小鼠。分别收集卵子和精子。
- 精子在获能液中被加能。将液体边缘的精子放入短寿命卵细胞中进行体 外 受精3-4小时。
- 用无RNase的水在 体外将 成功转录的gRNA和Cas9 mRNA稀释至25ng / μL和50 ng / μL。 通过显微注射引入小鼠受精卵的细胞质中。将状况良好的受精卵移植到雌性小鼠扩大的输卵管中。与结扎的雄性小鼠共笼。
- 通过PCR对幼崽进行基因分型。使用以下PCR条件：94°C3分钟，35个循环，94°C30秒，60°C35秒，72°C35秒;72°C5分钟。然后进行序列分析。
- 用剪刀剪下4个月大的小鼠的尾巴，并将它们放入1.5mL EP管中。在微量离心管中，每片尾片（2-5 mm）加入 180 μL 缓冲液 GL、20 μL 蛋白酶 K 和 10 μL RNase A。注意不要剪掉太多的尾巴。
- 将试管在56°C孵育过夜。
- 在微量离心管中以1，000× g 旋转2分钟以除去杂质。
- 加入 200 μL 缓冲液 GB 和 200 μL 无水乙醇，充分混合。
- 将离心柱放入收集管中。将样品施加到旋转中并以1，000× g 离心2分钟。丢弃流出物。
- 向离心柱中加入 500 μL 缓冲液 WA，并以 1，000 x g 离心 1 分钟。丢弃流出物。
- 向离心柱中加入 700 μL 缓冲液 WB，并以 1，000 x g 离心 1 分钟。丢弃流出物。
注意：确保缓冲液WB已与100%乙醇预混合。添加缓冲液WB时，添加到管壁以洗去残留的盐。 - 重复步骤 5.5.7。
- 将离心柱放入收集管中，并以1，000× g 离心2分钟。
- 将离心柱放入新的 1.5 mL 管中。在柱膜中心加入50-200μL灭菌水或洗脱缓冲液，让柱静置5分钟。
注意：将灭菌水或洗脱缓冲液加热至65°C可提高洗脱率。 - 要洗脱DNA，请将色谱柱以1，000 x g 离心2分钟。为了提高DNA的产量，将流通和/或50-200μL灭菌水或洗脱缓冲液添加到离心柱膜的中心，让柱静置5分钟。以1，000 x g 离心2分钟。
- 通过电泳定量洗脱的基因组DNA。
6.心脏形态和功能的评估
注意：应用M型超声心动图评估C57BL / 6N-Myh7em1（G823E） 敲入小鼠的心脏形态和功能。
- 将敲入小鼠放入连接到麻醉机的封闭亚克力盒中，并调整三通接口，使异氟醚（浓度：3%）流入丙烯酸盒中。在敲入小鼠停止自主移动后，移除敲入小鼠。
- 将敲入小鼠平放在小动物麻醉机的生命监测平台上，连续吸入麻醉混合氧气（流量：0.8L/min）和异氟烷（浓度：3%）。在麻醉小鼠上涂抹眼睛润滑剂以防止角膜干燥。
- 将敲入鼠标水平固定在平台上。将平台尾部倾斜 30° 到敲入鼠标。使用脱毛膏去除敲击小鼠前胸壁上的毛发。
- 垂直放置探头，凸起朝向动物的头部。然后，将探头逆时针旋转约 45°。
- 在胸骨旁长轴视图中，顺时针旋转探头 90° 以观察胸骨旁短轴视图。将探头旋转 90° 后，调整 y 轴位移以获得正确的切片。
- 观察心脏的长轴图像（图1C），然后选择M模式测量数据。
- 从小鼠的胸骨旁长轴视图获取超声数据（图1）。测量心率 （HR）、左心室射血分数 （LVEF）、心输出量 （CO）、左心室舒张末期尺寸 （LVDd）、LVD 左心室收缩末期尺寸 （LVSd）、室间隔 （IVS） 和左心室后壁 （LVPW）。
- 测量后，为小鼠提供氧气，并在它们恢复自主活动时将它们放回各自的笼子中。
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Representative Results
家庭的临床概况
获得了HCM的家族谱系，如图 2所示。所有记录在案的家庭成员在入组时均被诊断为HCM。
在家庭中（图2A），先证者是患者III-7，他在46岁时被诊断出患有HCM和左心室流出道梗阻（LVOTO），并接受了心脏手术。患者III-3患有不需要手术治疗的轻微HCM。患者IV-3也有轻微的HCM，这与他的父亲患者III-3相似。患者II-5患有HCM，并在51岁时接受了手术以修复由于LVOTO而导致的缺陷。患者I-1和患者II-2分别在57岁和46岁时死于心脏事故。患者I-1的病史不可用。患者II-7和患者III-9出现呼吸短促，并被诊断为HCM。
外显子组序列分析和变异分离
在这个家族中，五个个体的外显子组测序平均产生了总共19，978，731对测序的读数，平均读取长度为125 bp。总体而言，98.72%的测序读数通过了质量评估，并映射到98.66%的人类参考基因组。即使在过滤后，这四名患者也共享超过42种变体（包括单核苷酸取代和插入缺失）。其中，27个是误义SNV，15个被预测会改变剪接。最后，根据ACMG评级指南，杂合c.G2468A;在先证者III-7以及其他三名患者中观察到MYH7（NM_0002571）的p.G823E变体。
识别致病突变
Sanger测序在所有患者中证实了相同的MYH7 p.G823E变异，但在家庭和174个对照中的健康个体中没有（图2B）。杂合子MYH7 p.G823E在该家族中完全共分离。在这个家庭中，携带这种变异的IV-3患者从患者III-3继承了它。患者III-7和III-8携带相同的变体，这是从他们的父亲那里遗传的。患者III-9的信息不可用。
这种变异以前由散发患者24 在 HCM 中描述，尚未在 1000 G、ESP6500、ExAC、HGMD、ClinVar 数据库或对照受试者中报告。MYH7颈部结构域区域密码子823处的甘氨酸残基在所有可用的脊椎动物肌球蛋白序列中高度保守（图2C）。MYH7是一种已知的HCM致病基因，在心脏发育或结构/功能中起重要作用。根据ACMG标准和指南，MYH7 p.G823E变体被预测为致病变体（PVS1 + PS3 + PS4 + PM2）。综上所述，这些结果支持这种变异是有害的，并有助于这些家族中HCM的发病机制。
C57BL/6N-Myh7em1（G823E） 敲入小鼠出现严重心脏肥大
为了进一步验证MYH7 p.G823E的发病机制，我们生成了C57BL / 6N-Myh7em1（G823E） 敲入小鼠。C57BL / 6N-MYH7em1（G823E） 敲入小鼠在出生后出现年龄依赖性心脏肥大（图2A，B）。超声心动图显示，IVS和LVPW在C57BL / 6N-Myh7em1（G823E） 敲入小鼠中随着HR的增加而发展（表1）。这些结果同样通过组织学分析得到验证（图3）。野生型和杂合子小鼠的LVDd、LVD、EF或CO没有明显差异（表1）。
图1：超声数据采集 。 （A）探头位于胸骨的长轴上。（B）探头位于胸骨的短轴上。（C）胸骨长轴视图的M型超声图像。黄色箭头表示室间隔的位置。红色箭头表示浮动阀。（D）胸骨短轴视图的M型超声图像。黄色箭头表示前肌的位置，下方的凸起是后肌。 请点击此处查看此图的大图。
图2：携带杂合子MYH7 G823E变体的大家族 。 （A）先证者用箭头标记。完整和开放的圆圈和正方形分别表示受影响的个体和正常个体。（B）通过桑格测序确认的MYH7中的G823E变体。（C） 保护不同物种的MYH7 G823E遗址。黄色箭头代表G823E在不同物种氨基酸序列中的位点，高度保守。 请点击此处查看此图的大图。
图3：心肌组织的病理变化 。 （一）心肌纤维排列有序，各部位无明显差异。 （二）心室肌纤维肥大、排列紊乱、病变主要集中在左心室后壁和室间隔。 请点击此处查看此图的大图。
| C57BL/6N-Myh7em1（G823E）敲入小鼠组 | 控制组 | ||
| （n=4） | （n=6） | ||
| 心率（/分钟） | 451.25±25.786 | 413.83 ± 12.77 | P = 0.015 |
| LVDd（毫米） | 4.12 ± 0.33 | 3.95 ± 0.20 | P = 0.330 |
| LVD （毫米） | 2.95 ± 0.44 | 2.85 ± 0.20 | P = 0.626 |
| EF（%） | 55.02 ± 9.52 | 54.31 ± 5.11 | P = 0.881 |
| 一氧化碳（毫升） | 18.46 ± 3.05 | 15.30 ± 2.39 | P = 0.102 |
| 静脉注射（毫米） | 1.13 ± 0.20 | 0.67 ± 0.07 | P = 0.001 |
| LVPW （毫米） | 1.40 ± 0.60 | 0.70 ± 0.06 | P = 0.000 |
表1：p.G823E和野生型的形态和功能分析。 使用SPSS分析数据。连续变量表示为平均值±标准差 （SD）。学生的t或Wilcoxon秩和连续变量检验。P 值低于 0.05 被认为具有统计学意义。
补充文件 1.请点击此处下载此文件。
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Discussion
在这项研究中，我们描述了一个患有HCM的中国汉族家庭。遗传学分析显示，杂合子MYH6突变p.G823E与常染色体显性遗传家族成员中的疾病共同分离。为了验证G823E突变的致病性并讨论其潜在机制，我们通过CRISPR / Cas9介导的基因组工程在小鼠Myh7位点上创建了具有G823E的C57BL / 6N小鼠模型。
采用超声心动图评价C57BL/6N-Myh7em1（G823E） 敲入小鼠的表型特征。与对照组相比，在C57BL / 6N-Myh7em1（G823E） 敲入小鼠中发现了多个小梁和更高的非致密心肌层与致密心肌层的比例。转基因小鼠也表现出LVPW和IVS肥大以及HR增加。但两组心脏功能无明显变化。这些结果表明，在心脏重塑过程中，HR增加可能对维持心室功能表现出代偿作用。需要进一步的研究来观察和分析心脏的形态和功能。
肌球蛋白-7（MYH7）属于心肌肌结构蛋白家族。由MYH7基因编码的MYH7（14q11.2;OMIM：160760），这是在1990年与HCM相关的第一个致病基因中发现的。迄今为止，MYH7基因的300多个变异与HCM25，26相关。然而，绝大多数变异的致病性仍然难以捉摸。使用该协议，我们成功地创建了模型小鼠。在规划和设计模型鼠标时，需要考虑三个主要问题。首先，小鼠MYH7蛋白的氨基酸序列与人类高度同源。其次，MYH7在心室中高表达， MYH7 在人类中高表达。MYH7中密码子823处的甘氨酸残基在所有可用的肌球蛋白序列中高度保守。
MYH7在N末端包含一个保守的头部运动结构域，该结构域结合肌动蛋白并具有肌动蛋白激活的Mg·ATP酶活性和颈部区域，以及肌球蛋白尾巴，其在C末端包含一个线圈（CC）区域。MYH7颈部结构域区域密码子823处的甘氨酸残基表明，这种变化可能会影响收缩时的杠杆臂旋转27，28，29，30。
WES主要关注基因的外显子，仅占全基因组DNA的1.5%8 。然而，大多数已确定的人类遗传疾病都与外显子31有关。这使得WES在临床实践中得到广泛认可和应用。WES的广泛应用存在某些道德问题。对这种人类遗传病的研究往往涉及跨境讨论。尽管研究人员试图尽可能删除个人身份信息，但DNA中包含的大量信息仍然可以重新识别研究个体，甚至他们的家人。只有标准化的信息交换措施才能保证饮水系统得到合理应用。未来，WES对于特定基因突变的医疗策略和多种疾病的个体化诊疗措施具有重要意义。
总之，我们使用WES在具有HCM的大型中国汉族家族中鉴定出MYH7杂合变体p.G823E。发现C57BL / 6N-Myh7em1（G823E） 敲入小鼠具有比野生型小鼠更厚的IVS和LVPW，以及更快的HR。p.G823E 变异可能损害杠杆臂旋转，提示该突变在家族性 HCM 中起重要作用。我们的工作拓宽了与HCM相关的MYH7基因突变谱的信息，并为受影响家庭的适当诊断和遗传咨询提供了更好的清晰度。
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Disclosures
作者没有需要声明的财务利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了广东省医学研究基金项目（A2022363）和中国广东省科学技术委员会重大项目（批准号：2022）的支持。
我们要感谢马里兰大学帕克分校的陈青健在准备这份手稿期间提供的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5×TBE | Shanghai Sangon | ||
| 2× Taq Master Mix (Dye Plus) | Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Agarose | Regu | ||
| Anesthesia machine for small animals | Reward Life Technology Co., Ltd. | R500 | |
| BEDTools | 2.16.1 | ||
| Cas9 in vitro digestion method to detect gRNA target efficiency kit | Viewsolid Biotechnology Co., Ltd. | VK007 | |
| DNA Marker | Thermo Fisher Scientific | ||
| DNA stabilizer | Shanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd. | DNAstable LD | prevent DNA degradation |
| Electric paraffin microtome | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-S7220-B | |
| GATK | v3.5 | ||
| Gentra Puregene blood kit | Santa Clara | ||
| Glass slide, coverslip | Jiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Hematoxylin staining solution, Eosin staining solution | Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. | C0107-500ml, C0109 | |
| HiSeq X-ten platform | Illumina | perform sequencing on the captured libraries | |
| Injection of chorionic gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Injection of pregnant mare serum gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Isoflurane | Local suppliers | inhalation anesthesia | |
| Microinjection microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000 | |
| Paraffin Embedding Machine | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-B7126-B | |
| Picard | (2.2.4) 20 | ||
| Proteinase K | Merck KGaA | ||
| samtools | 1.3 | ||
| Sequencer | Applied Biosystems | ABI 3500 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ745T | |
| SureSelect Human All Exon V6 | Agilent Technology Co., Ltd. | exome probe | |
| T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs, Inc. | NEB-E2065S | |
| Temperature box | BINDER GmbH | KBF-S Solid.Line | |
| Trizma Hydrochloride Solution | Sigma, Merck KGaA | No. T2663 | |
| Veterinary ultrasound system | Royal Philips | CX50 |
References
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