Summary
Op basis van de familiale erfelijke cardiomyopathiefamilie die in ons klinische werk werd aangetroffen, creëerden we een C57BL / 6N-muismodel met een puntmutatie (G823E) bij de MYH7-locus van de muis via CRISPR / Cas9-gemedieerde genoomtechnologie om deze mutatie te verifiëren.
Abstract
Familiaire hypertrofische cardiomyopathie (HCM, OMIM: 613690) is de meest voorkomende cardiomyopathie in China. De onderliggende genetische etiologie van HCM blijft echter ongrijpbaar.
We identificeerden eerder een myosine zware keten 7 (MYH7) gen heterozygote variant, NM_000257.4: c.G2468A (p.G823E), in een grote Chinese Han-familie met HCM. In deze familie cosegregaat variant G823E met een autosomaal dominante aandoening. Deze variant bevindt zich in het hefboomarmdomein van het nekgebied van het MYH7-eiwit en is sterk geconserveerd onder homologe myosines en soorten. Om de pathogeniciteit van de G823E-variant te verifiëren, produceerden we een C57BL/6N-muismodel met een puntmutatie (G823E) bij de MYH7-locus van de muis met CRISPR/Cas9-gemedieerde genoomtechnologie. We ontwierpen gRNA-targetingvectoren en donoroligonucleotiden (met targetingsequenties geflankeerd door 134 bp homologie). De p.G823E (GGG naar GAG) plaats in het donor oligonucleotide werd geïntroduceerd in exon 23 van MYH7 door homologie-gerichte reparatie. Een gedempte p.R819 (AGG naar CGA) werd ook ingebracht om gRNA-binding en hersplitsing van de sequentie na homologie-gerichte reparatie te voorkomen. Echocardiografie onthulde hypertrofie van de linkerventrikel achterste wand (LVPW) met systole bij MYH7 G823E/- muizen op de leeftijd van 2 maanden. Deze resultaten werden eveneens gevalideerd door histologische analyse (figuur 3).
Deze resultaten tonen aan dat de G823E-variant een belangrijke rol speelt in de pathogenese van HCM. Onze bevindingen verrijken het spectrum van MYH7-varianten gekoppeld aan familiale HCM en kunnen richtlijnen bieden voor genetische counseling en prenatale diagnose in deze Chinese familie.
Introduction
Hypertrofische cardiomyopathie (HCM, OMIM: 613690) is de meest voorkomende cardiomyopathie in China, met een geschatte incidentie van 0,2%, die 150.000 mensen 1,2 treft.
Het pathologische anatomische kenmerk dat HCM kenmerkt, is asymmetrische ventriculaire hypertrofie, waarbij vaak het ventriculaire uitstroomkanaal en / of interventriculair septum3 betrokken is. De klinische manifestatie is inspanningsdyspneu, vermoeidheid en pijn op de borst. Het individuele fenotype van HCM heeft variabiliteit variërend van klinisch verraderlijk tot ernstig hartfalen. Patiënten met HCM hebben medische behandeling, harttransplantatie, levensondersteunende apparatuur en multidisciplinaire follow-up nodig4.
In de afgelopen eeuw heeft PCR-technologie de manier veranderd waarop we DNA5 bestuderen. Een DNA-sequencingmethode voor klinische diagnose werd ontdekt door Sanger en collega's6. De Sanger-techniek werd vervolgens toegepast op het Human Genome Project, maar deze aanpak was kostbaar en tijdrovend7. De komst van whole-genome sequencing (WGS) bracht inzichten in menselijke genetische ziekten naar nieuwe hoogten, maar het bleef onbetaalbaar in termen van kosten. Whole-exome sequencing (WES) technologie wordt al lang gebruikt om kiembaanvarianten8 te detecteren en is succesvol geweest in het identificeren van somatische drivermutaties in het exoom van verschillende kankers9. De detectie van DNA-exonen of coderende regio's door WES kan worden gebruikt om pathogene varianten in de meeste Mendeliaanse ziekten te onthullen. Vandaag de dag, met de dalende kosten van sequencing, wordt verwacht dat WGS een belangrijk hulpmiddel zal worden in genomica-onderzoek en op grote schaal kan worden gebruikt bij de detectie van pathogene varianten in het genoom.
WES-technologie is ook gebruikt bij erfelijke cardiomyopathie om pathogene varianten te identificeren om de etiologie verder op te helderen. Opkomend bewijs heeft aangetoond dat genen die sarcomeer structurele eiwitgenmutaties coderen, zoals MYH710, MYH611, MYBPC312, MYL213, MYL314, TNNT215, TNNI316, TNNC117 en TPM118 verantwoordelijk zijn voor de genetische etiologie van HCM. Bewustzijn van pathogene varianten in zeldzame ziekteverwekkende genen (bijv. obscurine, cytoskeletale calmoduline en titine-interacterende RhoGEF (OBSCN, OMIM: 608616)19, werkende alfa 2 (ACTN2, OMIM: 102573)20, en cysteïne en glycinerijk eiwit 3 (CSRP3, OMIM: 600824)21) is ook in verband gebracht met HCM. Huidige genetische studies hebben meerdere verschillende pathogene varianten in het sarcomerische eiwitgen geïdentificeerd bij ongeveer 40% -60% van de HCM-patiënten, en genetische tests bij HCM-patiënten onthulden dat de meeste pathogene varianten voorkomen in de myosine-zware keten (MYH7) en myosine-bindend eiwit C (MYBPC3). De genetische basis voor HCM blijft echter ongrijpbaar. Het onderzoeken van de pathogeniciteit van deze variaties die ten grondslag liggen aan de menselijke HCM-patiënten blijft een grote uitdaging22.
In deze studie rapporteren we een pathogene variant in MYH7 in een Chinese Han-familie met HCM door WES. Om de pathogeniciteit van deze variant te verifiëren, hebben we een C57BL/6N-Myh7em1(G823E) knockin muizen vastgesteld met behulp van het CRISPR/Cas9 systeem. We bespreken ook plausibele mechanismen van deze variant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De geschiedenissen van de families werden verkregen door de familieleden te interviewen. De studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van het Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine (nr. 2019074). Van alle familieleden werd geïnformeerde schriftelijke toestemming verkregen. Alle dieren worden behandeld in overeenstemming met de ethische richtlijnen van het Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine (Guangzhou, China).
1. Studievakken
OPMERKING: De proband III-3 heeft in juli 2019 medisch advies ingewonnen bij de afdeling Cardiovasculaire Chirurgie van het Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine.
- Verkrijg een gedetailleerde medische familiegeschiedenis van de proband. Breng alle familieleden van de proband op de hoogte en bel ze. Alle familieleden hebben een nauwgezet lichamelijk onderzoek ondergaan.
- Voer een systematische review uit van alle klinische gegevens, inclusief medische dossiers, ECG's, echocardiogrammen en hartkatheterisatierapporten.
- Herbevestiging van cardiale fenotypes bij alle patiënten tijdens interventie of operatie.
- Selecteer in totaal 174 op populatie gebaseerde gezonde controles uit de lokale database. Verzamel ongeveer 4,0 ml perifeer veneus bloed van elke patiënt.
2. DNA-extractie
OPMERKING: DNA wordt geëxtraheerd met een commerciële bloedkit volgens de instructies van de fabrikant.
- Lyse bloedcellen met een anionisch reinigingsmiddel in de aanwezigheid van een DNA-stabilisator volgens het protocol van de fabrikant.
- Voeg 10 μL RNase A-oplossing toe aan het cellysaat en meng door de buis 25 keer om te keren. Incubeer bij 37 °C gedurende 15 min tot 1 uur.
- Verwijder eiwitten door zoutprecipitatie. Gebruik eiwitprecipitatieoplossing (0,25 mg runderserumalbumine opgelost in 25 ml gedestilleerd water) en 100% isopropanol om eiwitten neer te slaan. Gebruik vervolgens 200 μL 70% ethanol en voer centrifugerend uit bij 12.000 x g/min bij 4 °C gedurende 15 minuten om de DNA-pellet te wassen.
- Herstel het genomisch DNA door precipitatie met 500 μL 70% ethanol. Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 30 s. Aspirateer en los de pellet vervolgens op in een hydratatieoplossing (1 mM EDTA, 10 mM Tris· Cl, pH 7,5).
- Gebruik een spectrofotometer (bijvoorbeeld NanoDrop 2000) om de zuiverheid te bepalen. Gezuiverd DNA heeft meestal een A260 / A280-verhouding tussen 1,7 en 1,9 en is tot 200 kb groot.
- Bewaar het DNA voor een lange termijn bij 2-8, -20 of -80 °C.
3. Whole exome sequencing en variant analyse
OPMERKING: Om systematisch te zoeken naar ziekteverwekkende genmutaties, werd exome sequencing uitgevoerd bij getroffen personen (II-5, II-7, III-3, III-7, III-8, III-9 en IV-3) en niet-getroffen personen (III-2, III-5, IV-4).
- Gebruik de exoomsonde volgens de instructies van de fabrikant om de exoomvangst uit te voeren.
- Pas de gekwalificeerde bibliotheken toe op 2 × 150 bp paired-end sequencing op het HiSeq X-ten platform. Zie aanvullend dossier 1.
- Lijn FASTQ-bestanden uit op het menselijk referentiegenoom (hg19/GRCh37) met BWA v0.7.1318,19. Sorteer de uitgelijnde bestanden (sam/bam-bestanden) met samtools en markeer vervolgens duplicaten met Picard. Zie aanvullend dossier 1.
- Gebruik GATK, pas de leeswaarden lokaal opnieuw uit en kalibreer de basiskwaliteiten opnieuw. Zie aanvullend dossier 1.
- Genereer kaartstatistieken die dekking en diepte bevatten van opnieuw gekalibreerde bestanden door BEDTools en interne perl / python-scripts.
- Genotypevarianten (SNV's en indels) van opnieuw gekalibreerde BAM-bestanden met behulp van de multi-sample verwerkingsmodus van de HaplotypeCaller-tool van GATK.
- Gebruik VQSR (variant quality score recalibration) om valse positieven van variantaanroepen te verminderen.
- Annoteer SNV's en indels met ANNOVAR-software21 tegen meerdere databases, waaronder het Exome Aggregation Consortium (ExAC) (http://exac.broadinstitute.org), het Exome Sequencing Project (ESP) (https://esp.gs.washington.edu) en 1.000 G (http://www.1000genomes.org). Interpreteer de pathogeniciteit van de sequentievarianten volgens de ACMG-richtlijnen.
4. Sanger-sequencing
- Voer Sanger-sequencing uit om mogelijke oorzakelijke varianten te bevestigen en variantscheiding in de familie te bepalen met behulp van een ABI 3500 sequencer23.
- Ontwerp primersequenties voor de variant in het MYH7-gen (NM_000257) als volgt: 5'-TTCAAACACAGAGACCTGCAGG-3' en 5'- CGGACTTCTCTAGCGCCTCTT -3'.
- Bevestig een variant, screen alle beschikbare gezinsleden om variantsegregatie binnen het gezinte bepalen 23.
5. Generatie van C57BL/6N-MYH7em1 (G823E) knockin muizen
- Gebruik het CRISPR/Cas9-systeem om C57BL/6N-Myh7em1(G823E) knockin muizen te genereren. Het Myh7-gen van de muis (GenBank-toetredingsnummer: NM_001361607.1; Ensembl: ENSMUSG00000053093) bevindt zich op muischromosoom 14 en heeft 41 exonen. Het ATG startcodon in exon 4 en TAG stop codon in exon 41, en de G823E bevindt zich op exon 23. Selecteer exon 23 als doelsite.
- Ontwerp de sequentie van gRNA-targetingvector en donor-oligo (met targetingsequentie, geflankeerd door 134 bp homologe sequenties gecombineerd aan beide zijden).
- Log in op de NCBI-website en klik op de BLAST online primer design functie aan de rechterkant.
- Klik op de Primer-BLAST functie onderaan de pagina om primers te ontwerpen.
- Plak het MYH7 NCBI-referentievolgnummer NM_000257.4 in het vak PCR-sjabloon.
- Versterk het doelfragment (MYH7 cDNA exon 23 en de aangrenzende exonen) dus ontwerp de upstream primer op exon 21 (2392-2528) en de downstream primer op exon 25 (3205-3350). Voer het exon-nummer van de upstream- en downstream-primers in het juiste bereikvak in.
- Klik onderaan op de knop Primers ophalen om automatisch meerdere paren primers te genereren.
- Voer het MYH7-gen in de ZFIN-database in, introduceer de p.g823e (GGG naar GAG) mutatieplaats in het donoroligonucleotide en de stille mutatie p.r819 (AGG naar CGA) in exon 23. De stille mutatie voorkomt het binden en opnieuw snijden van de sequentie door gRNA na homologie-gerichte reparatie.
- Ontwerp gRNA volgens de algemene sequentie, de sequenties aan beide uiteinden zijn TAATACGACTCACTATA- en -GTTTTAGAGCTA. Het midden van de reeks is de hierboven genoemde doellocatie.
- Co-injecteer Cas9 mRNA, gRNA gegenereerd door in vitro transcriptie en donor oligo in bevruchte eieren voor de productie van KI-muizen.
- Gebruik de Cas9/gRNA-doelefficiëntiedetectiekit om het ontworpen gRNA-doelwit in vitro in gRNA te transcriberen en de activiteit van het transcript te detecteren (zie de VK007-kitinstructies voor specifieke detectiemethoden) volgens het protocol van de fabrikant.
- Ontdooi de componenten van de T7 ARCA-mRNA-kit, meng en pulsspin in een microfuge om oplossingen voor de bodem van de buizen te verzamelen. Monteer de reactie bij kamertemperatuur in de volgende volgorde: 2x ARCA/NTP-mix tot 10 μL, 1 μg sjabloon-DNA, 2 μL T7 RNA-polymerasemengsel en nucleasevrij water tot 20 μL.
- Meng grondig en pulseer in een microfuge. Incubeer bij 37 °C gedurende 30 min.
- Verwijder het sjabloon-DNA door 2 μL DNase I toe te voegen, meng goed en incubeer bij 37 °C gedurende 15 minuten om mRNA te verkrijgen.
- Intraperitoneale injectie van serumgonadotrofine en humaan choriongonadotrofine uitvoeren in vooraf bereide C57BL/6 vrouwelijke muizen op ongeveer 4 weken oud met een spuit van 0,5 ml in een dosis van ongeveer 5 E per muis met een interval tussen de twee injecties van 48 uur.
- Achttien uur na toediening offeren C57BL/6 vrouwelijke muizen en één 8-12 weken oude C57BL/6 mannelijke muis op door cervicale dislocatie na hormooninjectie. Verzamel de eieren en het sperma afzonderlijk.
- Het sperma wordt gecapaciteerd in de capacitatievloeistof. Neem en laat het sperma aan de rand van de vloeistof in de kortlevende eicellen vallen voor in-vitrofertilisatie gedurende 3-4 uur.
- Verdun het succesvol getranscribeerde gRNA en Cas9 mRNA in vitro met RNase-vrij water tot 25 ng/μL en 50 ng/μL. Breng in het cytoplasma van bevruchte eicellen van muizen door micro-injectie. Transplanteer bevruchte eieren in goede staat in de vergrote eileider van de vrouwelijke muizen. Co-kooi met geligeerde mannelijke muizen.
- Genotypeer de pups door PCR. Gebruik de volgende PCR-omstandigheden: 94 °C gedurende 3 minuten, 35 cycli van 94 °C gedurende 30 s, 60 °C gedurende 35 s en 72 °C gedurende 35 s; 72 °C gedurende 5 min. Volg met sequentieanalyse.
- Knip de staarten van 4 maanden oude muizen met een schaar en plaats ze in een EP-buis van 1,5 ml. Voeg 180 μL buffer GL, 20 μL proteïnase K en 10 μl RNase A per staartstuk (2-5 mm) toe in een microcentrifugebuis. Pas op dat je niet te veel staart snijdt.
- Incubeer de buis bij 56 °C 's nachts.
- Draai in een microcentrifugebuis op 1.000 x g gedurende 2 minuten om onzuiverheden te verwijderen.
- Voeg 200 μL Buffer GB en 200 μL absolute ethylalcohol toe met voldoende menging.
- Plaats de spinkolom in een opvangbuis. Breng het monster aan op de spin en centrifugeer op 1.000 x g gedurende 2 min. Gooi de doorstroom weg.
- Voeg 500 μL Buffer WA toe aan de spinkolom en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 1.000 x g . Gooi de doorstroom weg.
- Voeg 700 μL buffer WB toe aan de spinkolom en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 1.000 x g . Gooi de doorstroom weg.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de Buffer WB is voorgemengd met 100% ethanol. Voeg bij het toevoegen van Buffer WB toe aan de buiswand om het resterende zout af te wassen. - Herhaal stap 5.5.7.
- Plaats de spinkolom in een opvangbuis en centrifugeer gedurende 2 minuten op 1.000 x g .
- Plaats de spinkolom in een nieuwe buis van 1,5 ml. Voeg 50-200 μL gesteriliseerd water of elutiebuffer toe aan het midden van het kolommembraan en laat de kolom 5 minuten staan.
OPMERKING: Verhitting van gesteriliseerd water of elutiebuffer tot 65 °C kan de opbrengst van de elutie verhogen. - Om DNA te elueren, centrifugeer je de kolom op 1.000 x g gedurende 2 minuten. Om de opbrengst van DNA te verhogen, voegt u de doorstroom en/of 50-200 μL gesteriliseerd water of de elutiebuffer toe aan het midden van het membraan van de spinkolom en laat u de kolom 5 minuten staan. Centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 2 min.
- Kwantificeer het geëlueerde genomische DNA door elektroforese.
6. Evaluatie van de cardiale morfologie en functie
OPMERKING: Pas M-mode echocardiografie toe om de morfologie en functie van C57BL/6N-Myh7em1(G823E) knockin muizen te beoordelen.
- Plaats de knockin muizen in een gesloten acryldoos die is aangesloten op het anesthesieapparaat en pas de drieweginterface aan zodat isofluraan (concentratie: 3%) in de acryldoos kan stromen. Nadat de knockin-muizen ophouden autonoom te bewegen, verwijdert u de knockin-muizen.
- Plaats de knockin muizen plat op het levensbewakingsplatform van het anesthesieapparaat voor kleine dieren en continue inhalatie-anesthesie gemengd met zuurstof (stroom: 0,8 l / min) en isofluraan (concentratie: 3%). Breng oogsmeermiddel aan op de verdoofde muizen om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen.
- Bevestig de knockin muizen horizontaal op het platform. Kantel het platform 30° caudaal naar de knockin muis. Verwijder het haar op de voorste borstwand van de kloppende muis met een ontharingscrème.
- Plaats de sonde verticaal met de bult naar het hoofd van het dier gericht. Draai de sonde vervolgens tegen de klok in, ongeveer 45°.
- Draai in de parasternale lange-asweergave de sonde 90° met de klok mee om de parasternale korte-asweergave te observeren. Nadat u de sonde 90° hebt gedraaid, past u de verplaatsing van de y-as aan om het juiste segment te krijgen.
- Bekijk de afbeelding met de lange as van het hart (figuur 1C) en selecteer vervolgens M-modus meetgegevens.
- Verkrijg echografiegegevens van parasternale lange-asweergaven van muizen (figuur 1). Hartslag (HR), linkerventrikel ejectiefractie (LVEF), cardiale output (CO), linkerventrikel end-diastolische dimensie (LVDd), LVD's linkerventrikel end-systolische dimensie (LVSd), interventriculair septum (IVS) en linkerventrikel achterwand (LVPW) worden gemeten.
- Geef de muizen na de meting zuurstof en plaats ze terug in hun respectievelijke kooien wanneer ze autonome activiteit herwinnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Klinisch profiel van de families
De familie stambomen van HCM werden verkregen en zijn weergegeven in figuur 2. Alle gedocumenteerde familieleden werden gediagnosticeerd met HCM bij inschrijving.
In de familie (figuur 2A) was de proband patiënt III-7, die op 46-jarige leeftijd werd gediagnosticeerd met HCM en linkerventrikeluitstroomkanaalobstructie (LVOTO) en een hartoperatie onderging. Patiënt III-3 had een lichte HCM die geen chirurgische behandeling vereiste. Patiënt IV-3 had ook een lichte HCM, die vergelijkbaar was met zijn vader, patiënt III-3. Patiënt II-5 had HCM en onderging op 51-jarige leeftijd een operatie om het defect te herstellen als gevolg van LVOTO. Patiënt I-1 en patiënt II-2 overleden als gevolg van hartongevallen op respectievelijk 57 en 46 jaar oud. De medische geschiedenis van patiënt I-1 was niet beschikbaar. Patiënt II-7 en patiënt III-9 presenteerden zich met kortademigheid en werden gediagnosticeerd met HCM.
Exome sequentie analyse en segregatie van varianten
In deze familie genereerde exoomsequencing van de vijf individuen een gemiddelde van in totaal 19.978.731 paren gesequencede reads met een gemiddelde leeslengte van 125 bp. In totaal slaagde 98,72% van de gesequencede reads voor de kwaliteitsbeoordeling en werden ze in kaart gebracht op 98,66% van het menselijke referentiegenoom. Zelfs na filtering werden meer dan 42 varianten (waaronder enkelvoudige nucleotidesubstituties en indels) gedeeld door deze vier patiënten. Hiervan waren 27 missense SNV's, 15 werden voorspeld om splicing te veranderen. Tot slot, volgens acmg rating richtlijnen, een heterozygote c.G2468A; p.G823E variant van MYH7 (NM_0002571) werd waargenomen bij proband III-7 en de andere drie patiënten.
Identificatie van een pathogene mutatie
Sanger-sequencing bevestigde dezelfde MYH7 p.G823E-variant bij alle patiënten, maar niet bij de gezonde personen in de families en 174 controles (figuur 2B). De heterozygote MYH7 p.G823E is volledig co-segreged in deze familie. In deze familie erfden patiënten IV-3 die deze variant koesterden deze van patiënt III-3. Patiënten III-7 en III-8 droegen dezelfde variant, die van hun vader was geërfd. De informatie voor patiënt III-9 was niet beschikbaar.
Deze variant, eerder beschreven in HCM door een sporadische patiënt24, is niet gemeld in de 1000 G, ESP6500, ExAC, HGMD, ClinVar databases of controlepersonen. Het glycineresidu bij codon 823 in het nekdomeingebied van MYH7 is sterk geconserveerd in alle beschikbare gewervelde myosinesequenties (figuur 2C). MYH7 is een bekend HCM-oorzakelijk gen en speelt een belangrijke rol bij de cardiale ontwikkeling of structuur/functie. Op basis van ACMG-normen en -richtlijnen werd voorspeld dat de MYH7 p.G823E-variant een pathogene variant zou zijn (PVS1 + PS3 + PS4 + PM2). Samen ondersteunen deze resultaten dat deze variant schadelijk is en bijdraagt aan de pathogenese van HCM in deze families.
C57BL/6N-Myh7em1(G823E) knockin muizen ontwikkelden ernstige cardiale hypertrofie
Om de pathogenese van MYH7 p.G823E verder te verifiëren, genereren we C57BL/6N-Myh7em1(G823E) knockin muizen. C57BL/6N-MYH7em1(G823E) knockin muizen ontwikkelden een leeftijdsafhankelijke cardiale hypertrofie na de geboorte (figuur 2A,B). Echocardiografie toonde aan dat IVS en LVPW zich ontwikkelden met verhoogde HR bij C57BL/6N-Myh7em1(G823E) knockin muizen (tabel 1). Deze resultaten werden eveneens gevalideerd door histologische analyse (figuur 3). Er waren geen duidelijke verschillen in LVDd, LVD's, EF of CO tussen wildtype en heterozygote muizen (tabel 1).
Figuur 1: Ultrasone data-acquisitie. (A) De sonde bevindt zich op de lange as van het borstbeen. (B) De sonde bevindt zich op de korte as van het borstbeen. (C) M-modus echografiebeeld van het zicht op de lange as van het borstbeen. De gele pijl geeft de locatie van het interventriculaire septum aan. De rode pijl geeft de zwevende klep aan. (D) M-modus echografiebeeld van het kortasbeeld van het borstbeen. De gele pijl geeft de locatie van de voorste papillaire spier aan en de uitstulping eronder is de achterste papillaire spier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: De grote familie met de heterozygote MYH7 G823E variant. (A) De proband wordt gemarkeerd door een pijl. Volledige en open cirkels en vierkanten geven respectievelijk getroffen en normale individuen aan. (B) De G823E-variant in MYH7 bevestigd door Sanger-sequencing. C) Instandhouding van het MYH7 G823E-gebied bij verschillende soorten. De gele pijl vertegenwoordigt de site van G823E in de aminozuurvolgorde van verschillende soorten, die sterk geconserveerd is. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Pathologische veranderingen van myocardine weefsel. (A) Myocardiale vezels zijn op een ordelijke manier gerangschikt en er is geen significant verschil tussen elk deel. (B) Ventriculaire spiervezelhypertrofie, ongeordende opstelling en laesies zijn voornamelijk geconcentreerd in de achterste wand van de linker ventrikel en het interventriculaire septum. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| C57BL/6N-Myh7em1(G823E) knockin muizen groep | Controlegroep | ||
| (n=4) | (n=6) | ||
| HR (/min) | 451,25 ± 25,786 | 413,83 ± 12,77 | P = 0,015 |
| LVDD (mm) | 4,12 ± 0,33 | 3,95 ± 0,20 | P = 0,330 |
| LVD's (mm) | 2,95 ± 0,44 | 2,85 ± 0,20 | P = 0,626 |
| EF(%) | 55,02 ± 9,52 | 54,31 ± 5,11 | P = 0,881 |
| CO (ml) | 18,46 ± 3,05 | 15.30 ± 2.39 | P = 0,102 |
| IVS (mm) | 1,13 ± 0,20 | 0,67 ± 0,07 | P = 0,001 |
| LVPW (mm) | 1,40 ± 0,60 | 0,70 ± 0,06 | P = 0,000 |
Tabel 1: Morfologie en functieanalyse voor p.G823E en wild type. Gegevens werden geanalyseerd met behulp van SPSS. Continue variabelen worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). De Student's t of Wilcoxon rangschikken somtests voor continue variabelen. P-waarden onder 0,05 werden als statistisch significant beschouwd.
Aanvullend dossier 1. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie beschrijven we één Chinese Han-familie met HCM. Genetische analyse onthulde dat een heterozygote MYH6-mutatie p.G823E co-segregeert met de ziekte bij familieleden met autosomaal dominante overerving. Om de pathogeniciteit van de G823E-mutatie te valideren en de onderliggende mechanismen te bespreken, hebben we een C57BL/6N-muismodel gemaakt met G823E at mouse Myh7-locus door CRISPR/Cas9-gemedieerde genome engineering.
Fenotypische kenmerken van C57BL/6N-Myh7em1(G823E) knockin muizen werden geëvalueerd door echocardiografie. Meervoudige trabeculatie en een hogere verhouding van niet-verdichte tot verdichte myocardiale laag werden gevonden in de C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E) knockin muizen in vergelijking met de controles. De transgene muizen vertoonden ook LVPW- en IVS-hypertrofie en een toename van HR. De functie van het hart vertoonde echter geen significante verandering tussen de twee groepen. Deze resultaten suggereerden dat een verhoogde HR een compenserend effect kan vertonen op de onderhoudskamerfunctie tijdens hartremodellering. Verdere studies zijn nodig om de morfologie en functie van het hart te observeren en te analyseren.
Myosine-7 (MYH7) behoort tot de familie van myocardiale sarcoomstructurele eiwitten. MYH7 gecodeerd door het MYH7-gen (14q11.2; OMIM: 160760), dat wordt gevonden in het eerste pathogene gen geassocieerd met HCM in 1990. Tot op heden zijn meer dan 300 varianten in het MYH7-gen geassocieerd met HCM25,26. De pathogeniciteit van de overgrote meerderheid van de variatie blijft echter ongrijpbaar. Met behulp van dit protocol hebben we de modelmuizen met succes gemaakt. Bij het plannen en ontwerpen van de modelmuis zijn er drie belangrijke aandachtspunten. Ten eerste is de aminozuurvolgorde van het MYH7-eiwit van de muis zeer homoloog bij de mens. Ten tweede komt MYH7 sterk tot expressie in ventrikels, evenals MYH7 bij mensen. Het glycineresidu bij codon 823 in de MYH7 is sterk geconserveerd in alle beschikbare myosinesequenties.
MYH7 bevat een geconserveerd hoofdmotordomein op het N-eindpunt, dat actine bindt en actine-geactiveerde Mg· ATPase-activiteit en een nekgebied, evenals een myosinestaart, die een coiled-coil (CC) -gebied bevat op de C-terminus. Het glycineresidu bij codon 823 in het nekdomeingebied van MYH7 suggereert dat deze variatie van invloed kan zijn op de rotatie van de hefboomarm in contractie 27,28,29,30.
WES richt zich vooral op de exonen van genen, die slechts 1,5%8 van het totale genoom-DNA uitmaken. De meeste menselijke genetische ziekten die zijn geïdentificeerd, zijn echter gerelateerd aan exonen31. Dit maakt WES breed erkend en toegepast in de klinische praktijk. Er zijn bepaalde ethische kwesties met de wijdverbreide toepassing van WES. De studie van dit soort menselijke genetische ziekten gaat vaak gepaard met grensoverschrijdende discussies. Hoewel onderzoekers proberen om persoonlijk identificeerbare informatie zoveel mogelijk te verwijderen, kan de enorme informatie in het DNA nog steeds de onderzoekspersonen en zelfs hun families opnieuw identificeren. Alleen gestandaardiseerde maatregelen voor informatie-uitwisseling kunnen de rationele toepassing van WES garanderen. In de toekomst is WES van groot belang voor medische strategieën voor specifieke genmutaties en geïndividualiseerde diagnose- en behandelingsmaatregelen voor meerdere ziekten.
Samenvattend identificeerden we een MYH7 heterozygote variant, p.G823E, in een grote Chinese Han-familie met HCM met behulp van WES. De C57BL/6N-Myh7em1(G823E) knockin muizen bleken dikkere IVS en LVPW te hebben, en snellere HR dan wild-type muizen. De p.G823E-variant kan de rotatie van de hefboomarm aantasten, wat suggereert dat deze mutatie een belangrijke rol speelt bij familiale HCM. Ons werk verbreedt de informatie over het mutatiespectrum van het MYH7-gen geassocieerd met HCM en biedt meer duidelijkheid over de juiste diagnose en erfelijkheidsadvies van getroffen families.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen financiële belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Medical Research Fund-project van de provincie Guangdong (A2022363) en het grote project van het Guangdong Committee of Science and Technology, China (subsidie nr.2022).
We willen Qingjian Chen van de Universiteit van Maryland, College Park bedanken voor de hulp bij de voorbereiding van dit manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5×TBE | Shanghai Sangon | ||
| 2× Taq Master Mix (Dye Plus) | Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Agarose | Regu | ||
| Anesthesia machine for small animals | Reward Life Technology Co., Ltd. | R500 | |
| BEDTools | 2.16.1 | ||
| Cas9 in vitro digestion method to detect gRNA target efficiency kit | Viewsolid Biotechnology Co., Ltd. | VK007 | |
| DNA Marker | Thermo Fisher Scientific | ||
| DNA stabilizer | Shanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd. | DNAstable LD | prevent DNA degradation |
| Electric paraffin microtome | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-S7220-B | |
| GATK | v3.5 | ||
| Gentra Puregene blood kit | Santa Clara | ||
| Glass slide, coverslip | Jiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Hematoxylin staining solution, Eosin staining solution | Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. | C0107-500ml, C0109 | |
| HiSeq X-ten platform | Illumina | perform sequencing on the captured libraries | |
| Injection of chorionic gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Injection of pregnant mare serum gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Isoflurane | Local suppliers | inhalation anesthesia | |
| Microinjection microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000 | |
| Paraffin Embedding Machine | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-B7126-B | |
| Picard | (2.2.4) 20 | ||
| Proteinase K | Merck KGaA | ||
| samtools | 1.3 | ||
| Sequencer | Applied Biosystems | ABI 3500 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ745T | |
| SureSelect Human All Exon V6 | Agilent Technology Co., Ltd. | exome probe | |
| T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs, Inc. | NEB-E2065S | |
| Temperature box | BINDER GmbH | KBF-S Solid.Line | |
| Trizma Hydrochloride Solution | Sigma, Merck KGaA | No. T2663 | |
| Veterinary ultrasound system | Royal Philips | CX50 |
References
- Toepfer, C. N., et al. Myosin sequestration regulates sarcomere function, cardiomyocyte energetics, and metabolism, informing the pathogenesis of hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 141 (10), 828-842 (2020).
- Writing Committee Members et al. 2020 AHA/ACC guideline for the diagnosis and treatment of patients with hypertrophic cardiomyopathy: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Joint Committee on Clinical Practice Guidelines. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 162 (1), 23-106 (2021).
- Elliott, P., McKenna, W. J.
- Maron, B. J., Maron, M. S.
- Inoue, T., Orgel, L. E. A nonenzymatic RNA polymerase model. Science. 219 (4586), 859-862 (1983).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Sachidanandam, R., et al. A map of human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms. Nature. 409 (6822), 928-933 (2001).
- Ng, S. B., et al. Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes. Nature. 461 (7261), 272-276 (2009).
- Wong, K. M., Hudson, T. J., McPherson, J. D. Unraveling the genetics of cancer: genome sequencing and beyond. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 12, 407-430 (2011).
- Mattivi, C. L., et al. Clinical utility of a phenotype-enhanced MYH7-specific variant classification framework in hypertrophic cardiomyopathy genetic testing. Circulation. Genomic and Precision Medicine. 13 (5), 453-459 (2020).
- Jiang, J., Wakimoto, H., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Allele-specific silencing of mutant Myh6 transcripts in mice suppresses hypertrophic cardiomyopathy. Science. 342 (6154), New York, N.Y. 111-114 (2013).
- Hayashi, T., et al. Genetic background of Japanese patients with pediatric hypertrophic and restrictive cardiomyopathy. Journal of Human Genetics. 63 (9), 989-996 (2018).
- Gil, W. S., Ávila Vidal, L. A., Vásquez Salguero, M. A., Cajiao, M. B., Peña, C. V. Genetic variant affecting the myosin light chain 2 related to familial hypertrophic cardiomyopathy. Intractable & Rare Diseases Research. 9 (4), 229-232 (2020).
- Berge, K. E., Leren, T. P.
- McNamara, J. W., Schuckman, M., Becker, R. C., Sadayappan, S. A novel homozygous intronic variant in TNNT2 associates with feline cardiomyopathy. Frontiers in Physiology. 11, 608473 (2020).
- Wang, W., et al. Comparative transcriptome analysis of atrial septal defect identifies dysregulated genes during heart septum morphogenesis. Gene. 575, 303-312 (2016).
- Andersen, P. S., et al. Diagnostic yield, interpretation, and clinical utility of mutation screening of sarcomere encoding genes in Danish hypertrophic cardiomyopathy patients and relatives. Human Mutations. 30 (3), 363-370 (2009).
- Nakashima, Y., et al. Lifelong clinical impact of the presence of sarcomere gene mutation in Japanese patients with hypertrophic cardiomyopathy. Circulation Journal. 84 (10), 1846-1853 (2020).
- Hu, L. R., Kontrogianni-Konstantopoulos, A. Proteomic analysis of myocardia containing the Obscurin R4344Q mutation linked to hypertrophic cardiomyopathy. Frontiers in Physiology. 11, 478 (2020).
- Girolami, F., et al. Novel alpha-actinin 2 variant associated with familial hypertrophic cardiomyopathy and juvenile atrial arrhythmias: a massively parallel sequencing study. Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (6), 741-750 (2014).
- Salazar-Mendiguchia, J., et al. The p.(Cys150Tyr) variant in CSRP3 is associated with late-onset hypertrophic cardiomyopathy in heterozygous individuals. European Journal of Medical Genetics. 63 (12), 104079 (2020).
- Teekakirikul, P., Zhu, W., Huang, H. C., Fung, E. Hypertrophic cardiomyopathy: An overview of genetics and management. Biomolecules. 9 (12), 878 (2019).
- Crossley, B. M., et al. Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).
- Song, L., et al. Mutations profile in Chinese patients with hypertrophic cardiomyopathy. Clinica Chimica Acta. 351 (1-2), 209-216 (2005).
- Marian, A. J., Braunwald, E. Hypertrophic cardiomyopathy: Genetics, pathogenesis, clinical manifestations, diagnosis, and therapy. Circulation Research. 121 (7), 749-770 (2017).
- Cann, F., et al. Phenotype-driven molecular autopsy for sudden cardiac death. Clinical Genetics. 91 (1), 22-29 (2017).
- Lafreniere-Roula, M., et al. Family screening for hypertrophic cardiomyopathy: Is it time to change practice guidelines. European Heart Journal. 40 (45), 3672-3681 (2019).
- Winkelmann, D. A., Forgacs, E., Miller, M. T., Stock, A. M. Structural basis for drug-induced allosteric changes to human beta-cardiac myosin motor activity. Nature Communications. 6, 7974 (2015).
- García-Giustiniani, D., et al. Phenotype and prognostic correlations of the converter region mutations affecting the β myosin heavy chain. Heart (British Cardiac Society). 101 (13), 1047-1053 (2015).
- Moore, J. R., Leinwand, L., Warshaw, D. M. Understanding cardiomyopathy phenotypes based on the functional impact of mutations in the myosin motor. Circulation Research. 111 (3), 375-385 (2012).
- Majewski, J., Schwartzentruber, J., Lalonde, E., Montpetit, A., Jabado, N. What can exome sequencing do for you. Journal of Medical Genetics. 48 (9), 580-589 (2011).
