Summary
استنادا إلى عائلة اعتلال عضلة القلب الوراثي العائلي الموجودة في عملنا السريري ، أنشأنا نموذج فأر C57BL / 6N مع طفرة نقطية (G823E) في موضع الفأر MYH7 من خلال هندسة الجينوم بوساطة CRISPR / Cas9 للتحقق من هذه الطفرة.
Abstract
اعتلال عضلة القلب الضخامي العائلي (HCM ، OMIM: 613690) هو اعتلال عضلة القلب الأكثر شيوعا في الصين. ومع ذلك ، فإن المسببات الوراثية الأساسية ل HCM لا تزال بعيدة المنال.
لقد حددنا سابقا متغير جين متغاير الزيجوت ذو سلسلة الميوسين الثقيلة 7 (MYH7) ، NM_000257.4: c.G2468A (p.G823E) ، في عائلة هان صينية كبيرة مع HCM. في هذه العائلة ، يفصل المتغير G823E مع اضطراب صبغي جسدي سائد. يقع هذا البديل في مجال ذراع الرافعة في منطقة الرقبة لبروتين MYH7 ويتم حفظه بشكل كبير بين الميوسين والأنواع المتماثلة. للتحقق من إمراضية متغير G823E ، أنتجنا نموذج ماوس C57BL / 6N مع طفرة نقطية (G823E) في موضع الفأر MYH7 مع هندسة الجينوم بوساطة CRISPR / Cas9. لقد صممنا gRNA التي تستهدف النواقل وقليل النيوكليوتيدات المانحة (مع تسلسل استهداف محاط ب 134 نقطة أساس من التماثل). تم إدخال موقع p.G823E (GGG إلى GAG) في قليل النوكليوتيد المانح في إكسون 23 من MYH7 عن طريق الإصلاح الموجه بالتماثل. كما تم إدخال p.R819 صامت (AGG إلى CGA) لمنع ارتباط gRNA وإعادة انشقاق التسلسل بعد الإصلاح الموجه بالتماثل. كشف تخطيط صدى القلب عن تضخم جدار البطين الخلفي الأيسر (LVPW) مع الانقباض في الفئران MYH7 G823E / - في عمر شهرين. تم التحقق من صحة هذه النتائج أيضا من خلال التحليل النسيجي (الشكل 3).
توضح هذه النتائج أن متغير G823E يلعب دورا مهما في التسبب في HCM. تثري النتائج التي توصلنا إليها طيف متغيرات MYH7 المرتبطة ب HCM العائلي وقد توفر إرشادات للاستشارة الوراثية والتشخيص قبل الولادة في هذه العائلة الصينية.
Introduction
اعتلال عضلة القلب الضخامي (HCM ، OMIM: 613690) هو اعتلال عضلة القلب الأكثر شيوعا في الصين ، حيث يقدر حدوثه بنسبة 0.2٪ ، مما يؤثر على 150,000 شخص 1,2.
السمة التشريحية المرضية التي تميز HCM هي تضخم البطين غير المتماثل ، والذي غالبا ما ينطوي على مجرى تدفق البطين و / أو الحاجز بين البطينين3. المظهر السريري هو ضيق التنفس المجهد ، والتعب ، وألم في الصدر. النمط الظاهري الفردي ل HCM له تباين يتراوح من غدرا سريريا إلى قصور القلب الحاد. يحتاج المرضى الذين يعانون من HCM إلى علاج طبي وزرع قلب ومعدات دعم الحياة ومتابعة متعددة التخصصات4.
في القرن الماضي ، غيرت تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الطريقة التي ندرس بها الحمض النووي5. تم اكتشاف طريقة تسلسل الحمض النووي للتشخيص السريري من قبل سانجر وزملائه6. تم تطبيق تقنية سانجر لاحقا على مشروع الجينوم البشري ، لكن هذا النهج كان مكلفا ويستغرق وقتا طويلا7. أدى ظهور تسلسل الجينوم الكامل (WGS) إلى رفع نظرة ثاقبة للأمراض الوراثية البشرية إلى آفاق جديدة ، لكنه ظل باهظا من حيث التكلفة. تستخدم تقنية تسلسل الإكسوم الكامل (WES) منذ فترة طويلة للكشف عن متغيرات الخط الجرثومي8 ونجحت في تحديد طفرات المحرك الجسدي في إكسوم السرطانات المختلفة9. يمكن استخدام الكشف عن إكسونات الحمض النووي أو مناطق الترميز بواسطة WES للكشف عن المتغيرات المسببة للأمراض في معظم الأمراض المندلية. اليوم ، مع انخفاض تكلفة التسلسل ، من المتوقع أن يصبح WGS أداة مهمة في أبحاث الجينوم ويمكن استخدامه على نطاق واسع في الكشف عن المتغيرات المسببة للأمراض في الجينوم.
كما تم استخدام تقنية WES في اعتلال عضلة القلب الموروث لتحديد المتغيرات المسببة للأمراض لزيادة توضيح المسببات. تشير الأدلة الناشئة إلى أن الجينات التي تشفر طفرات جينات البروتين الهيكلي للساركومير ، مثل MYH7 10 و MYH6 11 و MYBPC3 12 و MYL2 13 و MYL314 و TNNT2 15 و TNNI3 16 و TNNC1 17 وTPM1 18 مسؤولة عن المسببات الوراثية ل HCM. الوعي بالمتغيرات المسببة للأمراض في الجينات النادرة المسببة للأمراض (على سبيل المثال ، الغموض ، الكالمودولين الهيكلي الخلوي و RhoGEF المتفاعل مع التيتان (OBSCN ، OMIM: 608616) 19 ، التمثيل ألفا 2 (ACTN2 ، OMIM: 102573) 20 ، والسيستين والبروتين الغني بالجليكاين 3 (CSRP3 ، OMIM: 600824) 21) ارتبط أيضا ب HCM. حددت الدراسات الجينية الحالية العديد من المتغيرات المسببة للأمراض المتميزة في جين البروتين الساركوميري في حوالي 40٪ -60٪ من مرضى HCM ، وكشفت الاختبارات الجينية في مرضى HCM أن معظم المتغيرات المسببة للأمراض تحدث في سلسلة الميوسين الثقيلة (MYH7) والبروتين C المرتبط بالميوسين (MYBPC3). ومع ذلك ، فإن الأساس الجيني ل HCM لا يزال بعيد المنال. لا يزال استكشاف إمراضية هذه الاختلافات التي تكمن وراء مرضى HCM من البشر يمثل تحديا كبيرا22.
في هذه الدراسة ، أبلغنا عن متغير ممرض في MYH7 في عائلة هان صينية مع HCM بواسطة WES. من أجل التحقق من إمراضية هذا البديل ، أنشأنا فئران C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E) باستخدام نظام CRISPR / Cas9. نناقش أيضا الآليات المعقولة لهذا البديل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على تاريخ العائلات من خلال إجراء مقابلات مع أفراد الأسرة. تمت الموافقة على الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى مقاطعة قوانغدونغ للطب الصيني (رقم 2019074). تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من جميع أفراد الأسرة. يتم التعامل مع جميع الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية لمستشفى مقاطعة قوانغدونغ للطب الصيني (قوانغتشو ، الصين).
1. مواضيع الدراسة
ملاحظة: طلب Proproand III-3 المشورة الطبية في قسم جراحة القلب والأوعية الدموية في مستشفى مقاطعة قوانغدونغ للطب الصيني في يوليو 2019.
- الحصول على التاريخ الطبي العائلي المفصل للبروباند. قم بإخطار واستدعاء جميع أفراد عائلة الفرقة الموسيقية. خضع جميع أفراد الأسرة لفحوصات بدنية دقيقة.
- إجراء مراجعة منهجية لجميع البيانات السريرية ، بما في ذلك السجلات الطبية ، وتخطيط القلب ، وتخطيط صدى القلب ، وتقارير قسطرة القلب.
- إعادة تأكيد الأنماط الظاهرية للقلب في جميع المرضى أثناء التدخل أو الجراحة.
- حدد ما مجموعه 174 عنصر تحكم صحي قائم على السكان من قاعدة البيانات المحلية. جمع ما يقرب من 4.0 مل من الدم الوريدي المحيطي من كل مريض.
2. استخراج الحمض النووي
ملاحظة: يتم استخراج الحمض النووي باستخدام مجموعة دم تجارية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- تحلل خلايا الدم بمنظف أنيوني في وجود مثبت الحمض النووي باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.
- أضف 10 ميكرولتر من محلول RNase A إلى محلول الخلية واخلطه عن طريق قلب الأنبوب 25 مرة. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة إلى 1 ساعة.
- إزالة البروتينات عن طريق ترسيب الملح. استخدم محلول ترسيب البروتين (0.25 مجم من ألبومين مصل الأبقار المذاب في 25 مل من الماء المقطر) و 100٪ إيزوبروبانول لترسيب البروتينات. ثم, استخدم 200 ميكرولتر من الإيثانول 70٪ وقم بإجراء الطرد المركزي عند 12,000 × جم / دقيقة عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة لغسل حبيبات الحمض النووي.
- استعادة الحمض النووي الجينومي عن طريق الترسيب مع 500 ميكرولتر من الإيثانول 70 ٪. جهاز طرد مركزي بسرعة 12000 × جم لمدة 30 ثانية. نضح ثم قم بإذابة الحبيبات في محلول ترطيب (1 مللي متر EDTA ، 10 مللي متر تريس · Cl ، درجة الحموضة 7.5).
- استخدم مقياس الطيف الضوئي (على سبيل المثال ، NanoDrop 2000) لتحديد النقاء. عادة ما يكون للحمض النووي المنقى نسبة A260 / A280 بين 1.7 و 1.9 ويصل حجمها إلى 200 كيلو بايت.
- قم بتخزين الحمض النووي لفترة طويلة عند 2-8 أو -20 أو -80 درجة مئوية.
3. تسلسل الإكسوم الكامل وتحليل المتغيرات
ملاحظة: للبحث بشكل منهجي عن الطفرات الجينية المسببة للمرض، تم إجراء تسلسل الإكسوم في الأفراد المصابين (II-5 وII-7 وIII-3 وIII-7 وIII-8 وIII-9 وIV-3) والأفراد غير المصابين (III-2 وIII-5 وIV-4).
- استخدم مسبار الإكسوم وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لإجراء التقاط الإكسوم.
- قم بتطبيق المكتبات المؤهلة على تسلسل النهاية المزدوجة 2 × 150 نقطة أساس على منصة HiSeq X-ten. يرجى الاطلاع على الملف التكميلي 1.
- قم بمحاذاة ملفات FASTQ مع الجينوم المرجعي البشري (hg19 / GRCh37) مع BWA v0.7.1318,19. قم بفرز الملفات المحاذية (ملفات تنسيق sam / bam) باستخدام samtools ، ثم ضع علامة على التكرارات باستخدام Picard. يرجى الاطلاع على الملف التكميلي 1.
- استخدم GATK ، وأعد محاذاة القراءات محليا وأعد معايرة الصفات الأساسية. يرجى الاطلاع على الملف التكميلي 1.
- قم بإنشاء إحصائيات رسم الخرائط التي تتضمن التغطية والعمق من الملفات المعاد معايرتها بواسطة BEDTools والبرامج النصية perl / python الداخلية.
- متغيرات النمط الجيني (SNVs و indels) من ملفات BAM المعاد معايرتها باستخدام وضع المعالجة متعدد العينات لأداة HaplotypeCaller من GATK.
- استخدم VQSR (إعادة معايرة نقاط جودة المتغير) لتقليل الإيجابيات الخاطئة لمكالمات المتغير.
- قم بالتعليق على SNVs و indels باستخدام برنامج ANNOVAR 21 مقابل قواعد بيانات متعددة ، بما في ذلك اتحاد تجميع Exome (ExAC) (http://exac.broadinstitute.org) ، ومشروع تسلسل Exome (ESP) (https://esp.gs.washington.edu) ، و 1000 G (http://www.1000genomes.org). تفسير إمراضية متغيرات التسلسل وفقا لإرشادات ACMG.
4. تسلسل سانجر
- قم بإجراء تسلسل سانجر لتأكيد المتغيرات المسببة المحتملة وتحديد فصل المتغيرات في العائلة باستخدام جهاز تسلسل ABI 350023.
- صمم تسلسلات أولية للمتغير في جين MYH7 (NM_000257) على النحو التالي: 5'-TTCAAACACAGAGACCTGCAGG-3' و 5'- CGGACTTCTCTAGCGCCTCTT -3'.
- قم بتأكيد متغير ، افحص جميع أفراد الأسرة المتاحين لتحديد فصل المتغير داخل العائلة23.
5. جيل من الفئران C57BL / 6N-MYH7em1 (G823E)
- استخدم نظام CRISPR / Cas9 لتوليد فئران C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E). جين الفأر Myh7 (رقم انضمام GenBank: NM_001361607.1; Ensembl: ENSMUSG00000053093) يقع على كروموسوم الفأر 14 ويحتوي على 41 إكسون. كودون بدء ATG في exon 4 وكودون إيقاف TAG في exon 41 ، ويقع G823E في exon 23. حدد exon 23 كموقع الهدف.
- صمم تسلسل متجه استهداف gRNA وقلة المتبرعين (مع تسلسل استهداف ، محاطا بتسلسلات متماثلة 134 bp مجتمعة على كلا الجانبين).
- قم بتسجيل الدخول إلى موقع NCBI وانقر على وظيفة تصميم BLAST عبر الإنترنت التمهيدي على اليمين.
- انقر على وظيفة التمهيدي-BLAST في أسفل الصفحة لتصميم الاشعال.
- الصق رقم التسلسل المرجعي MYH7 NCBI NM_000257.4 في مربع قالب PCR.
- قم بتضخيم الجزء المستهدف (MYH7 cDNA exon 23 والإكسونات المجاورة له) لذا صمم التمهيدي المنبع على exon 21 (2392-2528) والتمهيدي المصب على exon 25 (3205-3350). أدخل رقم exon للبادئات الأولية والمصب في مربع النطاق الأيمن.
- انقر فوق الزر Get Primers في الجزء السفلي لإنشاء أزواج متعددة من البادئات تلقائيا.
- أدخل جين MYH7 في قاعدة بيانات ZFIN ، وأدخل موقع طفرة p.g823e (GGG إلى GAG) في قليل النوكليوتيد المانح والطفرة الصامتة p.r819 (AGG إلى CGA) في إكسون 23. تمنع الطفرة الصامتة ربط وإعادة قطع التسلسل بواسطة gRNA بعد الإصلاح الموجه بالتماثل.
- تصميم gRNA وفقا للتسلسل العام ، فإن التسلسلات في كلا الطرفين هي TAATACGACTCACTATA- و -GTTTTAGAGCTA. منتصف التسلسل هو الموقع المستهدف المذكور أعلاه.
- شارك في حقن Cas9 mRNA و gRNA الناتج عن النسخ في المختبر و oligo المانحة في البيض المخصب لإنتاج فأر KI.
- استخدم مجموعة الكشف عن كفاءة الهدف Cas9 / gRNA لنسخ هدف gRNA المصمم إلى gRNA في المختبر واكتشاف نشاط النص (انظر تعليمات مجموعة VK007 لطرق الكشف المحددة) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- قم بإذابة مكونات مجموعة T7 ARCA mRNA ، واخلطها ، وقم بتدوير النبض في جهاز صغير لجمع الحلول إلى قيعان الأنابيب. قم بتجميع التفاعل في درجة حرارة الغرفة بالترتيب التالي: مزيج 2x ARCA / NTP إلى 10 ميكرولتر ، 1 ميكروغرام من قالب الحمض النووي ، 2 ميكرولتر من مزيج بوليميراز T7 RNA ، والماء الخالي من النيوكلياز إلى 20 ميكرولتر.
- تخلط جيدا وتدور النبض في microfuge. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- قم بإزالة قالب الحمض النووي عن طريق إضافة 2 ميكرولتر من DNase I ، واخلطه جيدا ، واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة للحصول على mRNA.
- قم بإجراء الحقن داخل الصفاق لموجهة الغدد التناسلية في المصل وموجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية في الفئران الإناث C57BL / 6 المعدة مسبقا في عمر 4 أسابيع تقريبا باستخدام حقنة 0.5 مل بجرعة 5 U تقريبا لكل فأر مع فاصل زمني بين الحقنتين 48 ساعة.
- بعد ثمانية عشر ساعة من الجرعات ، ضحي بفئران C57BL / 6 وفأر ذكر C57BL / 6 يبلغ من العمر 8-12 أسبوعا عن طريق خلع عنق الرحم بعد حقن الهرمون. اجمع البويضات والحيوانات المنوية بشكل منفصل.
- يتم تكديس الحيوانات المنوية في سائل السعة. خذ وأسقط الحيوانات المنوية على حافة السائل في خلايا البويضة قصيرة العمر للتخصيب في المختبر لمدة 3-4 ساعات.
- قم بتخفيف gRNA المنسوخ بنجاح و Cas9 mRNA في المختبر بالماء الخالي من RNase إلى 25 نانوغرام / ميكرولتر و 50 نانوغرام / ميكرولتر. أدخل في السيتوبلازم من البيض المخصب الفئران عن طريق الحقن المجهري. زرع البويضات المخصبة في حالة جيدة في قناة البيض المتضخمة للفئران الإناث. شارك في قفص مع ذكور الفئران المربوطة.
- النمط الوراثي للجراء بواسطة PCR. استخدم شروط تفاعل البوليميراز المتسلسل التالية: 94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، و 35 دورة من 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 60 درجة مئوية لمدة 35 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 35 ثانية ؛ 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. اتبع مع تحليل التسلسل.
- قطع ذيول الفئران البالغة من العمر 4 أشهر بالمقص ووضعها في أنبوب EP سعة 1.5 مل. أضف 180 ميكرولتر من Buffer GL ، و 20 ميكرولتر من Proteinase K ، و 10 ميكرولتر من RNase A لكل قطعة ذيل (2-5 مم) في أنبوب طرد مركزي دقيق. احرص على عدم قطع الكثير من الذيل.
- احتضان الأنبوب عند 56 درجة مئوية طوال الليل.
- تدور في أنبوب الطرد المركزي الدقيقة في 1000 × غرام لمدة 2 دقيقة لإزالة الشوائب.
- أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت GB و 200 ميكرولتر من الكحول الإيثيلي المطلق مع خلط كاف.
- ضع عمود الدوران في أنبوب تجميع. ضع العينة على الدوران وأجهزة الطرد المركزي بسرعة 1000 × جم لمدة 2 دقيقة. تخلص من التدفق من خلال.
- أضف 500 ميكرولتر من Buffer WA إلى عمود الدوران وأجهزة الطرد المركزي بسرعة 1000 × جم لمدة دقيقة واحدة. تخلص من التدفق من خلال.
- أضف 700 ميكرولتر من Buffer WB إلى عمود الدوران وأجهزة الطرد المركزي بسرعة 1000 × جم لمدة دقيقة واحدة. تخلص من التدفق من خلال.
ملاحظة: تأكد من أن Buffer WB قد تم خلطه مسبقا بالإيثانول بنسبة 100٪. عند إضافة Buffer WB ، أضفه إلى جدار الأنبوب لغسل الملح المتبقي. - كرر الخطوة 5.5.7.
- ضع عمود الدوران في أنبوب تجميع وأجهزة طرد مركزي بسرعة 1000 × جم لمدة 2 دقيقة.
- ضع عمود الدوران في أنبوب جديد سعة 1.5 مل. أضف 50-200 ميكرولتر من الماء المعقم أو محلول الشطف إلى مركز غشاء العمود واترك العمود يقف لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: تسخين المياه المعقمة أو الشطف العازلة حتى 65 درجة مئوية يمكن أن يزيد من إنتاجية الشطف. - لاستخلاص الحمض النووي ، قم بجهاز طرد مركزي للعمود عند 1000 × جم لمدة 2 دقيقة. لزيادة إنتاجية الحمض النووي ، أضف التدفق و / أو 50-200 ميكرولتر من الماء المعقم أو الشطف المؤقت إلى مركز غشاء عمود الدوران واترك العمود يقف لمدة 5 دقائق. جهاز طرد مركزي عند 1000 × جم لمدة 2 دقيقة.
- تحديد الحمض النووي الجينومي المستخلص عن طريق الرحلان الكهربائي.
6. تقييم مورفولوجيا القلب ووظيفته
ملاحظة: تطبيق تخطيط صدى القلب في الوضع M لتقييم مورفولوجيا القلب ووظيفة الفئران C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E).
- ضع الفئران في صندوق أكريليك مغلق متصل بجهاز التخدير واضبط الواجهة ثلاثية الاتجاهات للسماح للأيزوفلوران (التركيز: 3٪) بالتدفق إلى صندوق الأكريليك. بعد توقف الفئران عن التحرك بشكل مستقل ، قم بإزالة الفئران القوية.
- ضع الفئران المدمرة بشكل مسطح على منصة مراقبة الحياة لآلة تخدير الحيوانات الصغيرة ، وتخدير الاستنشاق المستمر الممزوج بالأكسجين (التدفق: 0.8 لتر / دقيقة) وإيزوفلوران (التركيز: 3٪). ضع مادة تشحيم العين على الفئران المخدرة لمنع جفاف القرنية.
- إصلاح الفئران تدق أفقيا على المنصة. قم بإمالة المنصة 30 درجة ذيلية إلى الماوس القاضي. إزالة الشعر على جدار الصدر الأمامي للفأر يطرق باستخدام كريم مزيل الشعر.
- ضع المسبار عموديا بحيث يواجه النتوء رأس الحيوان. ثم قم بتدوير المسبار عكس اتجاه عقارب الساعة ، حوالي 45 درجة.
- في عرض المحور الطويل شبه القصري ، قم بتدوير المسبار 90 درجة في اتجاه عقارب الساعة لمراقبة عرض المحور القصير شبه القصي. بعد تدوير المسبار 90 درجة ، اضبط إزاحة المحور ص للحصول على الشريحة الصحيحة.
- راقب صورة المحور الطويل للقلب (الشكل 1C) ، ثم حدد بيانات قياس الوضع M.
- الحصول على بيانات الموجات فوق الصوتية من وجهات نظر المحور الطويل شبه القصية للفئران (الشكل 1). يتم قياس معدل ضربات القلب (HR) ، وجزء طرد البطين الأيسر (LVEF) ، والنتاج القلبي (CO) ، والبعد الانبساطي لنهاية البطين الأيسر (LVDd) ، والبعد الانقباضي نهاية البطين الأيسر (LVSd) ، والحاجز بين البطينين (IVS) ، والجدار الخلفي للبطين الأيسر (LVPW).
- بعد القياس ، زود الفئران بالأكسجين ، ووضعها مرة أخرى في أقفاصها الخاصة عندما تستعيد نشاطها المستقل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الملف السريري للعائلات
تم الحصول على نسب عائلة HCM وتظهر في الشكل 2. تم تشخيص جميع أفراد الأسرة الموثقين ب HCM عند التسجيل.
في الأسرة (الشكل 2 أ) ، كان الاحتمال هو المريض III-7 ، الذي تم تشخيصه ب HCM وانسداد مجرى تدفق البطين الأيسر (LVOTO) في سن 46 عاما وخضع لعملية جراحية في القلب. كان لدى المريض III-3 HCM بسيط لا يتطلب علاجا جراحيا. كان لدى المريض IV-3 أيضا HCM بسيط ، والذي كان مشابها لوالده ، المريض III-3. كان المريض II-5 يعاني من HCM وخضع لعملية جراحية لإصلاح العيب في سن 51 بسبب LVOTO. توفي المريض I-1 والمريض II-2 بسبب حوادث قلبية في سن 57 و 46 عاما على التوالي. لم يكن التاريخ الطبي للمريض I-1 متاحا. قدم المريض II-7 والمريض III-9 مع ضيق في التنفس وتم تشخيص HCM.
تحليل تسلسل الإكسوم وفصل المتغيرات
في هذه العائلة ، أنتج تسلسل الإكسوم للأفراد الخمسة متوسطا يبلغ مجموعه 19,978,731 زوجا من القراءات المتسلسلة بمتوسط طول قراءة يبلغ 125 نقطة أساس. في المجموع ، اجتاز 98.72٪ من القراءات المتسلسلة تقييم الجودة وتم تعيينها إلى 98.66٪ من الجينوم المرجعي البشري. حتى بعد التصفية ، تمت مشاركة أكثر من 42 متغيرا (بما في ذلك بدائل النوكليوتيدات المفردة و indels) من قبل هؤلاء المرضى الأربعة. من بين هؤلاء ، كان 27 SNVs غير منطقي ، وكان من المتوقع أن يغير 15 الربط. أخيرا ، وفقا لإرشادات تصنيف ACMG ، فإن c.G2468A غير متجانسة ؛ لوحظ متغير p.G823E من MYH7 (NM_0002571) في proband III-7 بالإضافة إلى المرضى الثلاثة الآخرين.
تحديد الطفرة المسببة للأمراض
أكد تسلسل سانجر نفس متغير MYH7 p.G823E في جميع المرضى ولكن ليس في الأفراد الأصحاء في العائلات و 174 ضابطا (الشكل 2 ب). تم فصل MYH7 p.G823E غير المتجانس تماما في هذه العائلة. في هذه العائلة ، ورث المرضى IV-3 الذين آووا هذا البديل من المريض III-3. حمل المرضى III-7 و III-8 نفس البديل الموروث من والدهم. لم تكن المعلومات الخاصة بالمريض III-9 متاحة.
لم يتم الإبلاغ عن هذا المتغير ، الموصوف سابقا في HCM من قبل مريض متقطع24 ، في قواعد بيانات 1000 G أو ESP6500 أو ExAC أو HGMD أو ClinVar أو موضوعات التحكم. يتم حفظ بقايا الجلايسين عند الكودون 823 في منطقة مجال الرقبة في MYH7 بشكل كبير في جميع تسلسلات الميوسين الفقارية المتاحة (الشكل 2C). MYH7 هو جين معروف مسبب ل HCM ويلعب دورا مهما في نمو القلب أو هيكله / وظيفته. استنادا إلى معايير وإرشادات ACMG ، كان من المتوقع أن يكون متغير MYH7 p.G823E متغيرا مسببا للأمراض (PVS1 + PS3 + PS4 + PM2). مجتمعة ، تدعم هذه النتائج أن هذا المتغير ضار ويساهم في التسبب في HCM في هذه العائلات.
C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E) أصيبت الفئران المدمرة بتضخم القلب الحاد
لمزيد من التحقق من التسبب في MYH7 p.G823E ، نقوم بتوليد فئران C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E). C57BL / 6N-MYH7em1 (G823E) أصيبت الفئران بتضخم القلب المعتمد على العمر بعد الولادة (الشكل 2 أ ، ب). كشف تخطيط صدى القلب أن IVS و LVPW تطوروا مع زيادة الموارد البشرية في الفئران C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E) (الجدول 1). تم التحقق من صحة هذه النتائج أيضا من خلال التحليل النسيجي (الشكل 3). لم تكن هناك فروق واضحة في LVDd أو LVDs أو EF أو CO بين الفئران من النوع البري والفئران غير المتجانسة (الجدول 1).
الشكل 1: الحصول على بيانات الموجات فوق الصوتية. (أ) يقع المسبار على المحور الطويل للقص. (ب) يقع المسبار على المحور القصير للقص. (ج) صورة الموجات فوق الصوتية في الوضع M لمنظر المحور الطويل لعظم القص. يشير السهم الأصفر إلى موقع الحاجز بين البطينين. يشير السهم الأحمر إلى الصمام العائم. (د) صورة الموجات فوق الصوتية في الوضع M لمنظر المحور القصير للقص. يشير السهم الأصفر إلى موقع العضلة الحليمية الأمامية ، والانتفاخ أدناه هو العضلة الحليمية الخلفية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: العائلة الكبيرة التي تحمل متغير MYH7 G823E غير المتجانس الزيجوت . (أ) يرمز إلى المجس بسهم. تشير الدوائر والمربعات الكاملة والمفتوحة إلى الأفراد المتأثرين والعاديين ، على التوالي. (ب) تم تأكيد متغير G823E في MYH7 بواسطة تسلسل سانجر. (ج) حفظ موقع MYH7 G823E في أنواع مختلفة. يمثل السهم الأصفر موقع G823E في تسلسل الأحماض الأمينية للأنواع المختلفة ، وهو محفوظ للغاية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: التغيرات المرضية في أنسجة عضلة القلب. (أ) ألياف عضلة القلب مرتبة ترتيبا منظما، ولا يوجد فرق كبير بين كل جزء. (ب) يتركز تضخم الألياف العضلية البطينية، والترتيب المضطرب، والآفات بشكل أساسي في الجدار الخلفي للبطين الأيسر والحاجز بين البطينين. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E) مجموعة الفئران تدق | المجموعة الضابطة | ||
| (ن = 4) | (ن = 6) | ||
| الموارد البشرية (/دقيقة) | 451.25 ± 25.786 | 413.83 ± 12.77 | ف = 0.015 |
| LVDd (مم) | 4.12 ± 0.33 | 3.95 ± 0.20 | ف = 0.330 |
| LVDs (مم) | 2.95 ± 0.44 | 2.85 ± 0.20 | ف = 0.626 |
| إي أف (٪) | 55.02 ± 9.52 | 54.31 ± 5.11 | ف = 0.881 |
| ثاني أكسيد الكربون (مل) | 18.46 ± 3.05 | 15.30 ± 2.39 | ف = 0.102 |
| IVS (مم) | 1.13 ± 0.20 | 0.67 ± 0.07 | ف = 0.001 |
| LVPW (مم) | 1.40 ± 0.60 | 0.70 ± 0.06 | ف = 0.000 |
الجدول 1: التشكل وتحليل الوظيفة ل p.G823E والنوع البري. تم تحليل البيانات باستخدام SPSS. يتم التعبير عن المتغيرات المستمرة كمتوسط ± الانحراف المعياري (SD). اختبارات مجموع رتبة t أو Wilcoxon للطالب للمتغيرات المستمرة. اعتبرت قيم P أقل من 0.05 ذات دلالة إحصائية.
الملف التكميلي 1. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه الدراسة ، وصفنا إحدى عائلات الهان الصينية المصابة ب HCM. كشف التحليل الوراثي أن طفرة MYH6 غير المتجانسة p.G823E تفصل مع المرض في أفراد الأسرة الذين يعانون من الوراثة الجسدية السائدة. للتحقق من صحة إمراضية طفرة G823E ومناقشة الآليات الأساسية ، أنشأنا نموذج ماوس C57BL / 6N مع G823E في موضع الماوس Myh7 بواسطة هندسة الجينوم بوساطة CRISPR / Cas9.
تم تقييم خصائص النمط الظاهري للفئران C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E) عن طريق تخطيط صدى القلب. تم العثور على ترابيق متعدد ونسبة أعلى من طبقة عضلة القلب غير المضغوطة إلى المضغوطة في الفئران C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E) مقارنة بالضوابط. أظهرت الفئران المعدلة وراثيا أيضا تضخم LVPW و IVS وزيادة في الموارد البشرية. ومع ذلك ، لم تظهر وظيفة القلب أي تغيير كبير بين المجموعتين. أشارت هذه النتائج إلى أن زيادة الموارد البشرية قد تظهر تأثيرا تعويضيا على وظيفة البطين أثناء إعادة تشكيل القلب. هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لمراقبة وتحليل مورفولوجيا ووظيفة القلب.
ينتمي Myosin-7 (MYH7) إلى عائلة البروتينات الهيكلية لعضلة القلب. MYH7 المشفرة بواسطة جين MYH7 (14q11.2; OMIM: 160760) ، والذي يوجد في أول جين ممرض مرتبط ب HCM في عام 1990. حتى الآن ، تم ربط أكثر من 300 متغير في جين MYH7 ب HCM25,26. ومع ذلك ، فإن إمراضية الغالبية العظمى من الاختلاف لا تزال بعيدة المنال. باستخدام هذا البروتوكول ، أنشأنا الفئران النموذجية بنجاح. عند تخطيط وتصميم الماوس النموذجي ، هناك ثلاث قضايا رئيسية قيد الدراسة. أولا ، تسلسل الأحماض الأمينية لبروتين الماوس MYH7 متماثل للغاية مع الإنسان. ثانيا ، يتم التعبير عن MYH7 بشكل كبير في البطينين ، وكذلك MYH7 في البشر. يتم حفظ بقايا الجلايسين في الكودون 823 في MYH7 بشكل كبير في جميع تسلسلات الميوسين المتاحة.
يحتوي MYH7 على مجال محرك رأس محفوظ في N-terminus ، والذي يربط الأكتين ويحتوي على Mg المنشط بالأكتين · نشاط ATPase ومنطقة الرقبة ، بالإضافة إلى ذيل الميوسين ، الذي يحتوي على منطقة ملفوفة (CC) في المحطة C. تشير بقايا الجلايسين عند الكودون 823 في منطقة مجال الرقبة في MYH7 إلى أن هذا الاختلاف قد يؤثر على دوران ذراع الرافعة في الانكماش27،28،29،30.
يركز WES بشكل أساسي على إكسونات الجينات ، والتي تمثل فقط 1.5٪ 8 من إجمالي الحمض النووي للجينوم. ومع ذلك ، فإن معظم الأمراض الوراثية البشرية التي تم تحديدها مرتبطة بالإكسونات31. هذا يجعل WES معترف بها على نطاق واسع وتطبيقها في الممارسة السريرية. هناك بعض القضايا الأخلاقية مع التطبيق الواسع النطاق ل WES. غالبا ما تنطوي دراسة هذا النوع من الأمراض الوراثية البشرية على مناقشات عبر الحدود. على الرغم من أن الباحثين يحاولون إزالة معلومات التعريف الشخصية قدر الإمكان ، إلا أن المعلومات الضخمة الموجودة في الحمض النووي لا يزال بإمكانها إعادة تحديد هوية أفراد البحث ، وحتى عائلاتهم. ولا يمكن ضمان التطبيق الرشيد لمشروع دعم المياه والبيئة إلا بتدابير موحدة لتبادل المعلومات. في المستقبل ، يعد WES ذا أهمية كبيرة للاستراتيجيات الطبية لطفرات جينية محددة والتشخيص الفردي وتدابير العلاج لأمراض متعددة.
باختصار ، حددنا متغير MYH7 غير متجانس الزيجوت ، p.G823E ، في عائلة هان صينية كبيرة مع HCM باستخدام WES. تم العثور على الفئران C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E) لديها IVS و LVPW أكثر سمكا ، وأسرع HR من الفئران البرية. قد يضعف متغير p.G823E دوران ذراع الرافعة ، مما يشير إلى أن هذه الطفرة تلعب دورا مهما في HCM العائلي. يوسع عملنا المعلومات حول طيف الطفرات لجين MYH7 المرتبط ب HCM ويوفر وضوحا أفضل في التشخيص المناسب والاستشارة الوراثية للعائلات المصابة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح المالية يعلنونه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من خلال مشروع صندوق البحوث الطبية لمقاطعة قوانغدونغ (A2022363) والمشروع الرئيسي للجنة قوانغدونغ للعلوم والتكنولوجيا ، الصين (منحة رقم 2022).
نود أن نشكر Qingjian Chen من جامعة ماريلاند ، كوليدج بارك على المساعدة أثناء إعداد هذه المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5×TBE | Shanghai Sangon | ||
| 2× Taq Master Mix (Dye Plus) | Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Agarose | Regu | ||
| Anesthesia machine for small animals | Reward Life Technology Co., Ltd. | R500 | |
| BEDTools | 2.16.1 | ||
| Cas9 in vitro digestion method to detect gRNA target efficiency kit | Viewsolid Biotechnology Co., Ltd. | VK007 | |
| DNA Marker | Thermo Fisher Scientific | ||
| DNA stabilizer | Shanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd. | DNAstable LD | prevent DNA degradation |
| Electric paraffin microtome | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-S7220-B | |
| GATK | v3.5 | ||
| Gentra Puregene blood kit | Santa Clara | ||
| Glass slide, coverslip | Jiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Hematoxylin staining solution, Eosin staining solution | Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. | C0107-500ml, C0109 | |
| HiSeq X-ten platform | Illumina | perform sequencing on the captured libraries | |
| Injection of chorionic gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Injection of pregnant mare serum gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Isoflurane | Local suppliers | inhalation anesthesia | |
| Microinjection microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000 | |
| Paraffin Embedding Machine | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-B7126-B | |
| Picard | (2.2.4) 20 | ||
| Proteinase K | Merck KGaA | ||
| samtools | 1.3 | ||
| Sequencer | Applied Biosystems | ABI 3500 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ745T | |
| SureSelect Human All Exon V6 | Agilent Technology Co., Ltd. | exome probe | |
| T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs, Inc. | NEB-E2065S | |
| Temperature box | BINDER GmbH | KBF-S Solid.Line | |
| Trizma Hydrochloride Solution | Sigma, Merck KGaA | No. T2663 | |
| Veterinary ultrasound system | Royal Philips | CX50 |
References
- Toepfer, C. N., et al. Myosin sequestration regulates sarcomere function, cardiomyocyte energetics, and metabolism, informing the pathogenesis of hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 141 (10), 828-842 (2020).
- Writing Committee Members et al. 2020 AHA/ACC guideline for the diagnosis and treatment of patients with hypertrophic cardiomyopathy: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Joint Committee on Clinical Practice Guidelines. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 162 (1), 23-106 (2021).
- Elliott, P., McKenna, W. J.
- Maron, B. J., Maron, M. S.
- Inoue, T., Orgel, L. E. A nonenzymatic RNA polymerase model. Science. 219 (4586), 859-862 (1983).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Sachidanandam, R., et al. A map of human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms. Nature. 409 (6822), 928-933 (2001).
- Ng, S. B., et al. Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes. Nature. 461 (7261), 272-276 (2009).
- Wong, K. M., Hudson, T. J., McPherson, J. D. Unraveling the genetics of cancer: genome sequencing and beyond. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 12, 407-430 (2011).
- Mattivi, C. L., et al. Clinical utility of a phenotype-enhanced MYH7-specific variant classification framework in hypertrophic cardiomyopathy genetic testing. Circulation. Genomic and Precision Medicine. 13 (5), 453-459 (2020).
- Jiang, J., Wakimoto, H., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Allele-specific silencing of mutant Myh6 transcripts in mice suppresses hypertrophic cardiomyopathy. Science. 342 (6154), New York, N.Y. 111-114 (2013).
- Hayashi, T., et al. Genetic background of Japanese patients with pediatric hypertrophic and restrictive cardiomyopathy. Journal of Human Genetics. 63 (9), 989-996 (2018).
- Gil, W. S., Ávila Vidal, L. A., Vásquez Salguero, M. A., Cajiao, M. B., Peña, C. V. Genetic variant affecting the myosin light chain 2 related to familial hypertrophic cardiomyopathy. Intractable & Rare Diseases Research. 9 (4), 229-232 (2020).
- Berge, K. E., Leren, T. P.
- McNamara, J. W., Schuckman, M., Becker, R. C., Sadayappan, S. A novel homozygous intronic variant in TNNT2 associates with feline cardiomyopathy. Frontiers in Physiology. 11, 608473 (2020).
- Wang, W., et al. Comparative transcriptome analysis of atrial septal defect identifies dysregulated genes during heart septum morphogenesis. Gene. 575, 303-312 (2016).
- Andersen, P. S., et al. Diagnostic yield, interpretation, and clinical utility of mutation screening of sarcomere encoding genes in Danish hypertrophic cardiomyopathy patients and relatives. Human Mutations. 30 (3), 363-370 (2009).
- Nakashima, Y., et al. Lifelong clinical impact of the presence of sarcomere gene mutation in Japanese patients with hypertrophic cardiomyopathy. Circulation Journal. 84 (10), 1846-1853 (2020).
- Hu, L. R., Kontrogianni-Konstantopoulos, A. Proteomic analysis of myocardia containing the Obscurin R4344Q mutation linked to hypertrophic cardiomyopathy. Frontiers in Physiology. 11, 478 (2020).
- Girolami, F., et al. Novel alpha-actinin 2 variant associated with familial hypertrophic cardiomyopathy and juvenile atrial arrhythmias: a massively parallel sequencing study. Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (6), 741-750 (2014).
- Salazar-Mendiguchia, J., et al. The p.(Cys150Tyr) variant in CSRP3 is associated with late-onset hypertrophic cardiomyopathy in heterozygous individuals. European Journal of Medical Genetics. 63 (12), 104079 (2020).
- Teekakirikul, P., Zhu, W., Huang, H. C., Fung, E. Hypertrophic cardiomyopathy: An overview of genetics and management. Biomolecules. 9 (12), 878 (2019).
- Crossley, B. M., et al. Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).
- Song, L., et al. Mutations profile in Chinese patients with hypertrophic cardiomyopathy. Clinica Chimica Acta. 351 (1-2), 209-216 (2005).
- Marian, A. J., Braunwald, E. Hypertrophic cardiomyopathy: Genetics, pathogenesis, clinical manifestations, diagnosis, and therapy. Circulation Research. 121 (7), 749-770 (2017).
- Cann, F., et al. Phenotype-driven molecular autopsy for sudden cardiac death. Clinical Genetics. 91 (1), 22-29 (2017).
- Lafreniere-Roula, M., et al. Family screening for hypertrophic cardiomyopathy: Is it time to change practice guidelines. European Heart Journal. 40 (45), 3672-3681 (2019).
- Winkelmann, D. A., Forgacs, E., Miller, M. T., Stock, A. M. Structural basis for drug-induced allosteric changes to human beta-cardiac myosin motor activity. Nature Communications. 6, 7974 (2015).
- García-Giustiniani, D., et al. Phenotype and prognostic correlations of the converter region mutations affecting the β myosin heavy chain. Heart (British Cardiac Society). 101 (13), 1047-1053 (2015).
- Moore, J. R., Leinwand, L., Warshaw, D. M. Understanding cardiomyopathy phenotypes based on the functional impact of mutations in the myosin motor. Circulation Research. 111 (3), 375-385 (2012).
- Majewski, J., Schwartzentruber, J., Lalonde, E., Montpetit, A., Jabado, N. What can exome sequencing do for you. Journal of Medical Genetics. 48 (9), 580-589 (2011).
