Quantifizierung der ökologischen Mikroorganismen und Viren mit qPCR

Das Aufkommen der quantitative Polymerase-Kettenreaktion oder qPCR, machte es möglich, die Menge jeder Mikroorganismus in einer ökologischen Probe quantitativ zu bestimmen.

Wie standard-PCR identifiziert qPCR Mikroorganismen durch den Nachweis für das Vorhandensein oder Fehlen von DNA-Sequenzen, die spezifisch für die Organismen von Interesse. Dies ermöglicht die Erkennung von Mikroben, die im Labor, die es ermöglichen, ein viel breiteres Spektrum von Umweltorganismen assay kultiviert werden kann nicht. QPCR ermöglicht darüber hinaus die Menge von DNA quantitativ bewertet werden. Aber zur gleichen Zeit erkennen PCR Methoden DNA von allen Organismen tot oder lebendig, denen die Fähigkeit zu suchen nur aktiv wachsende Mikroben in der Probe.

Dieses Video wird die chemische Innovationen, die regulären PCR qPCR unterscheiden, erklären wie qPCR verwendet werden kann, um DNA, quantitativ zu messen überprüfen zeigen ein Protokoll für die Verwendung von qPCR eine RNA-Virus aus Bodenproben zu erkennen, und zu guter Letzt zeigen wie qPCR Umweltmikrobiologie heute angewendet wird.

Die grundlegenden Prinzipien hinter qPCR sind dasselbe wie regelmäßige PCR – wiederholte Zyklen der Grundierung glühen, Vorlage, Dehnung des PCR-Produktes und Denaturierung des Produkts aus Vorlage, führt zu die exponentielle Amplifikation des einer Zielsequenz von Interesse, bekannt als der Amplifikate aus einem Pool von Ausgangsmaterial.

Die Innovation der qPCR macht zusätzlich fluoreszierende Chemikalien in der Reaktion, die die Synthese von PCR-Produkt bei jedem Zyklus direkt in “Real Time” durch spezialisierte Thermocycler visualisiert werden kann, möglich, die Höhe der Vorlage Sequenz in der ursprünglichen Probe zu quantifizieren es. Die Menge ist in der Regel gemessen an der Schwelle-Zyklus, abgekürzt C_t, auch bekannt als die Quantifizierung Zyklus oder C,_Q, das die PCR-Zyklus ist bei dem fluoreszierenden Produkte die Hintergrundkonzentration übersteigt.

Quantifizierung kann relativ, sein, wo der C-_t -Wert von einer Sequenz mit der einer anderen Norm oder Control Sequence verglichen wird; die relative Menge entspricht zwei potenziert mit der Differenz in C_t. Alternativ eine Reihe von DNA der bekannten Menge neben den Proben in der Reaktion ausgeführt wird, eine Standardkurve Fluoreszenz Wert auf DNA-Menge verglichen hergestellt werden kann, und ermöglicht die Probe DNA, absolut quantitated.

Es gibt zwei Arten von fluoreszierenden Molekülen in qPCR verwendet. In einem Fall fluoreszierende Farbstoffe, die speziell an die doppelsträngige DNA binden ist enthalten in der Reaktion. Der Farbstoff fluoresziert nur, wenn Sie gebunden an der DNA, so dass die Höhe der doppelsträngigen DNA-Produkt zu quantitated werden.

Bei der anderen Methode soll ein kurzes Stück DNA, bekannt als Sonde, gegen eine bestimmte Ziel-Sequenz von Interesse. Die Sonde ist chemisch verbunden ein fluoreszierender Farbstoff sowie ein “Durstlöscher” Molekül, das unterdrückt das Fluoreszenzsignal von der Farbstoff in der Nähe. Die Polymerase-Enzym, das welches das Produkt DNA synthetisiert, hat eine DNA-abbauenden Aktivität, die das fluoreszierende Molekül “freigegeben” werden von der Sonde, so trennt des Farbstoffs aus dem Quencher und ermöglicht das Fluoreszenzsignal erkannt werden verursachen würde.

Nun, da Sie die Prinzipien hinter qPCR zu verstehen, betrachten wir ein Protokoll für die Verwendung dieser Technik zu identifizieren eine RNA-Virus, der Pflanzen, die Paprika mild Mottle Virus aus Bodenproben infiziert.

In dieser Demo werden Probe aus der Rhizosphäre, die Zone des Bodens ca. 7 mm rund um Pflanzenwurzeln gesammelt, die von den Wurzeln und ihre symbiotischen Mikroorganismen beeinflusst wird.

Rhizosphäre Boden zu sammeln, zunächst sorgfältig die Anlage von Interesse aus dem Boden zu extrahieren und traf es, so viel überschüssige Masse entfernen Boden wie möglich. Verpacken Sie die Pflanze für die weitere Verarbeitung im Labor.

Nach bringen die Proben zurück ins Labor, mit einem sterilen Spatel, den gewünschten Boden in ein Auffanggefäß abzuschaffen. Dann das Virus aus dem Boden zu sammeln und die RNA zu extrahieren.

Sobald die Probe RNA entnommen wird, umwandeln Sie es in komplementären oder cDNA über reverse Transkription. Entnehmen Sie bitte der Jupiter-SciEd video-on-reverse Transkription-PCR Einzelheiten dieses Verfahrens.

Wenn Sie bereit sind, die qPCR durchzuführen, Auftauen von gefrorenem Reagenzien bei Raumtemperatur in einer dedizierten Laminar-Flow-Kapuze, und auf Eis einmal aufgetaut. Reagenz-Komponenten, die das Enzym DNA-Polymerase enthalten sollte immer auf Eis gehalten werden.

Tauen Sie die Probe cDNA und eine Positivkontrolle DNA, wie z. B. ein rundes Stück DNA, bekannt als ein Plasmid, das der Amplifikate Interesse hinein geklont hat.

Vor der Montage der Reaktionen in einer 96-Well qPCR-Platte, Vorbereiten einer 96-Zelle Tabellenvorlage auf Papier und beschriften Sie jede Zelle mit der Reaktion, die in die Platte geladen wird. Schließen Sie Reaktionen für jede Probe und Standard in dreifacher Ausfertigung sowie für die positive Kontrolle und Negativkontrolle, wie eine keine-DNA Reaktion.

Berechnen Sie die Reagenz Bände für eine Reaktion “master-Mix”, die alle Reagenzien umfasst, die konstant unter die Reaktionen sind erforderlich. Bereiten Sie genügend master-Mix für dreifacher Reaktionen für alle Proben sowie Kontrollen und zusätzlich 10 % zu pipettieren Fehler ausmachen.

Einmal die Reagenzien aufgetaut sind, montieren Sie den master-Mix in einem 1,5 mL niedrig-Adsorption Microfuge Rohr. Dies zu tun, kurz Wirbel jedes Reagenz mischen, sammeln Sie keine Flüssigkeit auf der Seite der Röhrchen mit einer Mini-Zentrifuge, und pipette das Reagenz in das Microfuge Rohr. Achten Sie darauf, neue Pipettenspitzen für jede Reaktion-Komponente verwenden. Nachdem alle Reagenzien sind hinzugekommen, Wirbel zu mischen und Zentrifugieren. Dann aliquoten die entsprechende Menge an master-Mix in die dafür vorgesehenen Vertiefungen auf der PCR-Platte.

Als nächstes Wirbel Zentrifuge jedes Rohr mit Probe und Kontrolle DNA und pipette den entsprechenden Betrag in die jeweiligen Vertiefungen auf der PCR-Platte. Nachdem Proben hinzugefügt wurden, Dichtplatte mit eine Siegelfolie, und verwenden Sie das Siegelwerkzeug zu vollständig glätten das Siegel und eventuelle Luftblasen herausdrücken. Reißen Sie die nichtklebenden Registerkarten von den Enden der Dichtung vorsichtig.

Um das Reaktionsgemisch vollständig in den Boden der Näpfchen zu sammeln, die Reaktion Platte in einer Zentrifuge mit einem Kennzeichenhalter und richtig balancieren des Rotors mit einem Gegengewicht Teller. Puls-Zentrifuge die Platte bis zu 1.000 u/min, dann lassen Sie die Zentrifuge kommen langsam zum Stillstand ohne Bremsen.

Platzieren Sie die Reaktion-Platte in die qPCR-Maschine. Stellen Sie das PCR-Programm entsprechend den Herstellerangaben, Einstellung der Schmelztemperatur nach der Primerpaar verwendet wird. Stellen Sie die Reaktion Programm laufen ein.

Sobald das qPCR-Programm abgeschlossen ist, wird die Software die bekannten Konzentrationen der Positivkontrolle verwenden, um die Menge der cDNA in jeder Reaktion berechnen können. Die Menge des Virus in der ursprünglichen Probe kann dann berechnet werden.

Sobald das qPCR-Programm abgeschlossen ist, wird die Software die bekannten Konzentrationen der Positivkontrolle verwenden, um die Menge der cDNA in jeder Reaktion berechnen können.

Mit den Ergebnissen aus der qPCR, die Lautstärke in den Brunnen, die Extraktion aus dem Boden und aus der reversen Transkription Faktor übertragen kann die Anzahl der Viren in der ersten Bodenprobe berechnet werden.

Nun, Sie wissen, wie qPCR durchgeführt wird, schauen wir wie es verwendet werden, um verschiedenen Umweltproben zu analysieren.

qPCR kann verwendet werden, um die Menge an Viren erholte sich von vielen verschiedenen Arten von Proben zu quantifizieren. In dieser Anwendung wurden zwei verschiedene Arten von Adenoviren konzentriert von Wasserproben durch eine Reihe von verschiedenen Methoden. DNA wurde dann extrahiert von den Viren und qPCR, ausgesetzt, um die relative Effizienz der Konzentration Methoden zu bewerten.

Eine weitere Anwendung für qPCR-basierten mikrobielle Aufzählung ist zu quantifizieren Bakteriengehalt in Lebensmitteln und landwirtschaftlichen Proben – in diesem Beispiel, fäkale und Proben von Hühnerfarmen Wurf. Anstatt auf einzelne Arten, die Wissenschaftler durchgeführt qPCR mit Primer gegen ein hoch konservierte gen in allen Bakterien gefunden und quantifiziert die gesamte Bakteriengemeinschaft in den Proben gefunden.

Schließlich, wie bereits erwähnt, ist ein Nachteil der traditionellen qPCR Methodik, dass lebende und Tote Mikroben unterschieden werden können. Jedoch konnten Forscher hier durch das Hinzufügen einer Chemikalie bekannt als Propidium Monoazide oder PMA, die nur abgestorbene Zellen eingeben können, wo es an DNA bindet, nachfolgende enzymatische Reaktionen wie PCR hemmen, Unterscheidung zwischen lebenden und Toten Kulturen von E. Coli O157: H7, einen gemeinsamen pathogenen Stamm gefunden in kontaminierte Lebensmittel und Wasser.

Sie habe nur Jupiters Einführung zur Quantifizierung der ökologischen Mikroorganismen und Viren mit qPCR beobachtet. Sie sollten jetzt verstehen, wie qPCR funktioniert, wie qPCR verwenden, um die Menge an eine Mikrobe in einem ökologischen Probe und einige Anwendungen dieser Technik messen. Danke fürs Zuschauen!