Quantifizierung der ökologischen Mikroorganismen und Viren mit qPCR

Das Aufkommen der quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) hat es ermöglicht, die Menge eines Mikroorganismus in einer Umweltprobe quantitativ zu bestimmen.

Wie die Standard-PCR identifiziert die qPCR Mikroorganismen, indem sie das Vorhandensein oder Fehlen von DNA-Sequenzen nachweist, die für die interessierenden Organismen spezifisch sind. Dies ermöglicht den Nachweis von Mikroben, die nicht im Labor kultiviert werden können, und ermöglicht die Untersuchung eines viel breiteren Spektrums von Umweltorganismen. Darüber hinaus ermöglicht die qPCR die quantitative Bestimmung der DNA-Menge. Gleichzeitig weisen PCR-Methoden jedoch die DNA aller toten oder lebendigen Organismen nach, wodurch die Möglichkeit, nur nach aktiv wachsenden Mikroben in der Probe zu suchen, eingeschränkt wird.

In diesem Video werden die chemischen Innovationen vorgestellt, die qPCR von regulärer PCR unterscheiden, erklärt, wie qPCR zur quantitativen DNA-Messung verwendet werden kann, ein Protokoll für die Verwendung von qPCR zum Nachweis eines RNA-Virus aus Bodenproben demonstriert und schließlich gezeigt, wie qPCR heute in der Umweltmikrobiologie angewendet wird.

Die Grundprinzipien der qPCR sind die gleichen wie bei der regulären PCR - wiederholte Zyklen des Primerglühens zum Template, der Verlängerung des PCR-Produkts und der Denaturierung des Produkts vom Template, was zur exponentiellen Amplifikation einer Zielsequenz von Interesse, dem sogenannten Amplikon, aus einem Pool von Ausgangsmaterial führt.

Die Innovation der qPCR liegt in der Zugabe von fluoreszierenden Chemikalien in die Reaktion, die es ermöglicht, die Synthese des PCR-Produkts bei jedem Zyklus direkt in "Echtzeit" durch spezialisierte Thermocycler zu visualisieren, wodurch es möglich wird, die Menge der Template-Sequenz in der Originalprobe zu quantifizieren. Die Menge wird in der Regel anhand des Schwellenwertzyklus, abgekürzt Ct, gemessen, auch bekannt als Quantifizierungszyklus oder Cq, bei dem es sich um den PCR-Zyklus handelt, bei dem die Menge der fluoreszierenden Produkte den Hintergrundwert überschreitet.

Die Quantifizierung kann relativ sein, wobei der Ct-Wert einer Sequenz mit dem einer anderen Standard- oder Kontrollsequenz verglichen wird. Die relative Menge ist gleich zwei, hoch der Differenz in Ct. Alternativ, wenn eine Reihe von DNA bekannter Menge neben den Proben in der Reaktion ausgeführt wird, kann eine Standardkurve erzeugt werden, die den Fluoreszenzwert mit der DNA-Menge vergleicht, und ermöglicht es, die Proben-DNA absolut zu quantifizieren.

Es gibt zwei große Arten von fluoreszierenden Molekülen, die in der qPCR verwendet werden. In einem Fall sind Fluoreszenzfarbstoffe, die spezifisch an doppelsträngige DNA binden, in die Reaktion einbezogen. Der Farbstoff fluoresziert nur, wenn er an DNA gebunden ist, so dass die Menge des doppelsträngigen DNA-Produkts quantifiziert werden kann.

Bei der anderen Methode wird ein kurzer DNA-Abschnitt, der als Sonde bezeichnet wird, gegen eine bestimmte Zielsequenz von Interesse ausgelegt. Die Sonde ist chemisch an einen Fluoreszenzfarbstoff sowie ein "Quencher"-Molekül gebunden, das das Fluoreszenzsignal des Farbstoffs unterdrückt, wenn es sich in unmittelbarer Nähe befindet. Das Polymerase-Enzym, das das DNA-Produkt synthetisiert, hat eine DNA-abbauende Aktivität, die dazu führen würde, dass das fluoreszierende Molekül aus der Sonde "freigesetzt" wird, wodurch der Farbstoff vom Quencher getrennt wird und das Fluoreszenzsignal detektiert werden kann.

Nachdem Sie nun die Prinzipien der qPCR verstanden haben, schauen wir uns ein Protokoll für die Verwendung dieser Technik zur Identifizierung eines RNA-Virus an, das Pflanzen infiziert, des Pepper Mild Mottle Virus, aus Bodenproben.

Bei dieser Demonstration werden Proben aus der Rhizosphäre entnommen, der Zone des Bodens um die Pflanzenwurzeln herum, die von den Wurzeln und ihren symbiotischen Mikroorganismen beeinflusst wird.

Um Rhizosphärenerde zu sammeln, ziehen Sie zuerst die gewünschte Pflanze vorsichtig aus dem Boden und schlagen Sie darauf, um so viel überschüssige Erde wie möglich zu entfernen. Verpacken Sie die Pflanze für die Weiterverarbeitung im Labor.

Nachdem Sie die Proben zurück ins Labor gebracht haben, verwenden Sie einen sterilen Spatel, um die gewünschte Erde in ein Auffanggefäß zu zerkleinern. Sammeln Sie dann das Virus aus dem Boden und extrahieren Sie die RNA.

Sobald RNA aus der Probe entnommen wurde, wandeln Sie sie durch reverse Transkription in komplementäre oder cDNA um. Einzelheiten zu diesem Verfahren finden Sie im JoVE SciEd Video zur reversen Transkriptions-PCR.

Wenn Sie bereit sind, die qPCR durchzuführen, tauen Sie gefrorene Reagenzien bei Raumtemperatur in einer speziellen Laminar-Flow-Haube auf und legen Sie sie nach dem Auftauen auf Eis. Reagenzkomponenten, die das Enzym DNA-Polymerase enthalten, sollten immer auf Eis aufbewahrt werden.

Tauen Sie die cDNA der Probe und eine Positivkontroll-DNA auf, z. B. ein kreisförmiges DNA-Stück, das als Plasmid bekannt ist und in das das gewünschte Amplikon kloniert ist.

Bevor Sie die Reaktionen in einer 96-Well-qPCR-Platte assemblieren, bereiten Sie eine 96-Zell-Tischvorlage auf Papier vor und markieren Sie jede Zelle mit der Reaktion, die in die Platte geladen wird. Die Reaktionen für jede Probe und jeden Standard sind in dreifacher Ausfertigung sowie für die Positiv- und Negativkontrolle, wie z. B. eine No-DNA-Reaktion, anzugeben.

Berechnen Sie die Reagenzienvolumina, die für einen Reaktions-"Mastermix" benötigt werden, der alle Reagenzien enthält, die in den Reaktionen konstant sind. Bereiten Sie genügend Mastermix für dreifache Reaktionen für alle Proben plus Kontrollen und weitere 10 % vor, um Pipettierfehler zu berücksichtigen.

Sobald die Reagenzien aufgetaut sind, montieren Sie den Mastermix in einem 1,5-ml-Mikrofuge-Röhrchen mit geringer Adsorption. Zu diesem Zweck zerkleinern Sie jedes Reagenz kurz, um es gründlich zu vermischen, sammeln Sie die Flüssigkeit an der Seite der Röhrchen mit einer Mini-Zentrifuge und pipettieren Sie das Reagenz in das Mikrofuge-Röhrchen. Achten Sie darauf, für jede Reaktionskomponente neue Pipettenspitzen zu verwenden. Nachdem alle Reagenzien hinzugefügt wurden, zum Mischen und Zentrifugieren vortexen. Aliquotieren Sie dann die entsprechende Menge Mastermix in die dafür vorgesehenen Vertiefungen auf der PCR-Platte.

Als nächstes zentrifugieren und zentrifugieren Sie jedes Röhrchen mit Proben- und Kontroll-DNA und pipettieren Sie die entsprechende Menge in die entsprechenden Wells auf der PCR-Platte. Sobald die Proben hinzugefügt wurden, verschließen Sie die Platte mit einer Siegelfolie und verwenden Sie das Siegelwerkzeug, um die Dichtung vollständig zu glätten und alle Luftblasen herauszudrücken. Reißen Sie die nicht klebenden Laschen vorsichtig von den Enden der Dichtung ab.

Um das Reaktionsgemisch vollständig im Boden der Vertiefungen zu sammeln, setzen Sie die Reaktionsplatte in eine Zentrifuge mit einem Plattenhalter ein und balancieren Sie den Rotor mit einer Gegengewichtsplatte richtig aus. Zentrifugieren Sie die Platte pulsiv auf 1.000 U/min und lassen Sie die Zentrifuge dann langsam und ohne Bremsen zum Stillstand kommen.

Setzen Sie die Reaktionsplatte in die qPCR-Maschine ein. Stellen Sie das PCR-Programm gemäß den Herstellerangaben ein und stellen Sie die Schmelztemperatur entsprechend dem verwendeten Primerpaar ein. Stellen Sie das Reaktionsprogramm auf Ausführung ein.

Sobald das qPCR-Programm abgeschlossen ist, wird die Software in der Lage sein, die bekannten Konzentrationen der Positivkontrolle zu verwenden, um die Menge an cDNA in jeder Reaktion zu berechnen. Anschließend kann die Virusmenge in der Originalprobe berechnet werden.

Sobald das qPCR-Programm abgeschlossen ist, wird die Software in der Lage sein, die bekannten Konzentrationen der Positivkontrolle zu verwenden, um die Menge an cDNA in jeder Reaktion zu berechnen.

Mit den Ergebnissen aus der qPCR, dem in die Vertiefungen überführten Volumen, der Extraktion aus dem Boden und dem Faktor aus der reversen Transkription kann die Anzahl der Viren in der ersten Bodenprobe berechnet werden.

Nachdem Sie nun wissen, wie die qPCR durchgeführt wird, schauen wir uns an, wie sie zur Analyse verschiedener Umweltproben verwendet werden kann.

qPCR kann verwendet werden, um die Menge an Viren zu quantifizieren, die aus vielen verschiedenen Arten von Proben gewonnen wurden. In dieser Anwendung wurden zwei verschiedene Arten von Adenoviren aus Wasserproben mit einer Reihe unterschiedlicher Methoden konzentriert. Anschließend wurde die DNA aus den Viren extrahiert und einer qPCR unterzogen, um die relative Effizienz der Konzentrationsmethoden zu bewerten.

Eine weitere Anwendung für die qPCR-basierte mikrobielle Zählung ist die Quantifizierung des Bakteriengehalts in Lebensmitteln und landwirtschaftlichen Proben - in diesem Beispiel Kot- und Einstreuproben aus Hühnerfarmen. Anstatt auf einzelne Spezies abzuzielen, führten die Wissenschaftler eine qPCR mit Primern gegen ein hochkonserviertes Gen durch, das in allen Bakterien vorkommt, und quantifizierten die gesamte Bakteriengemeinschaft in den Proben.

Wie bereits erwähnt, besteht ein Nachteil der traditionellen qPCR-Methode darin, dass lebende und tote Mikroben nicht unterschieden werden können. Durch die Zugabe einer Chemikalie namens Propidiummonoazid (PMA), die nur dort in tote Zellen eindringen kann, wo sie an die DNA bindet, um nachfolgende enzymatische Reaktionen wie PCR zu hemmen, konnten die Forscher hier zwischen lebenden und toten Kulturen von E. coli O157:H7 unterscheiden, einem häufigen pathogenen Stamm, der in kontaminierten Lebensmitteln und Wasser vorkommt.

Sie haben gerade die Einführung von JoVE in die Quantifizierung von Mikroorganismen und Viren aus der Umwelt mittels qPCR gesehen. Sie sollten nun verstehen, wie qPCR funktioniert, wie man qPCR verwendet, um die Menge einer Mikrobe in einer Umweltprobe zu messen, und einige Anwendungen dieser Technik. Danke fürs Zuschauen!